JPH01235600A - カルボキシル末端ペプチドの分取方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ポリペプチドからそのカルボキシル末端ペプ
チドを簡便に分取する方法に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題点〕

／９！；０年にＥｄｍａｎにより、ペプチドのアミノ末
端からの逐次アミノ酸残基配列決定法が開発されて（Ｐ
、　Ｅｄｍａｎ、　Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ、　５ｃａｎｄ
、　、　’ｌ。

２ｇＪ（／９３０））以来、現在に至るまでに種々の工
夫がなされ、今や、Ｎ末端配列分析は自動化されたシー
ケンサ−を用いて、ピコモルのオーダーの極微量試料で
可能となった（゛続生化学実験講座２タンパク質の化学
上”、Ｐ、２１１７〜Ｐ、、？？、？日本生化学金輪、
１９ｇ’）、東京化学同人）。

一方、近年遺伝子工学技術の登場により、メツセンジャ
ーＲＮＡに相補的なりＮＡの塩基配列を決定することに
より、ポリペプチドのアミノ酸全配列を予測することが
常法となってきた。

しかしながら、この場合にも、所望のポリペプチドのア
ミノ酸配列の一部を知り、それに基づいて作成したオリ
ゴヌクレオチドをプローブとして相補的ＤＮＡを検索す
るのが一般的であり、その際、ポリペプチドのカルボキ
シル末端に近い部分のアミノ酸配列に相当するプローブ
を用いることができれば、検索がしやすくなる。また、
現実に存在するポリペプチドは、プロセッシングを受け
ている可能性があり、メソセンジャーＲＮＡにコードさ
れているアミノ酸配列のすべてを含まない場合が応々に
しであることから、ポリペプチドのアミノ末端とカルボ
キシル末端を決定することは極めて重要である。

現在、カルボキシル末端の分析法としては、ヒドラジン
分解法、トリチウム標識法、カルボキシペプチダーゼ法
が用いられている（″続金輪学実験講座コタンパク質の
化学上”、ｐ、２３０゜日本生化学会編、／９ｇ７．東
京化学同人）。

このうち、ヒドラジン分解法とトリチウム標識法は、カ
ルボキシル最末端の一アミノ酸残基のみを決定する方法
であり、グローブ作成の情報源となりえないとともに、
メツセンジャーＲＮＡにコードされたアミノ酸残基の位
置を特定する上でも確度の低い情報を与えるのみである
。カルボキシペプチダーゼ法は、種々のカルボキシペプ
チダーゼがポリペプチドのカルボキシル末端から順次ペ
プチド結合を切断してゆ（ことを利用したものであるが
、その切断の経時変化を追跡することによって配列を決
定するものであることから、（１）操作が煩雑で、（２
）所要サンプル量も比較的多く、（３）配列決定に不確
定性が生ずるほか、（４）比較的長鎖のポリペプチドに
適さない等の欠点がある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、これらのカルボキシル末端アミノ酸分析
法の欠点を克服して、アミノ末端配列分析と同程度の極
微量のサンプルから、多くの確実な情報を与えるカルボ
キシル末端アミノ酸配列分析法を鋭意探求する過程にお
いて、本発明に到達したものである。

すなわち、本発明は、ポリペプチドを、該ポリペプチド
中のリジン残基とそれに続くカルボキシル末端側のアミ
ノ酸残基との間のペプチド結合を特異的に切断処理し、
得られろペプチド混合物を、表面に遊離のアミノ基と反
応して共有結合を形成しつる官能基を有する固体と反応
させ、次いで、各ペプチドのアミノ末端残基とそれに隣
接する残基との間のペプチド結合を、酸処理により切断
することにより、遊離してくるペプチドを採取すること
を特徴とする、カルボキシル末端ペプチドの分取方法に
関するものである。

以下、本発明をさらに詳細に説明する。本発明は、カル
ボキシル末端ペプチドはそのアミノ末端のα−アミノ基
でのみ後述のような固体と結合するのに対し、他のペプ
チドは、アミノ末端のアミノ基のほか、リジン残基のε
−アミノ基でも固体と結合し、このペプチド・固体結合
物を適切な条件のもとで、適切な酸によって処理すると
、アミノ末端残基と隣接する残基との間のペプチド結合
のみが切断されることから、カルボキシル末端ペプチド
はアミノ最末端の残基を固体に残して反応溶液中に遊離
し、他のペプチドは固体に結合したまま残ることを利用
するものである。

ポリペプチドをそのポリペプチド中のリジン残基とそれ
に続（カルボキシル末端側のアミノ酸残基との間のペプ
チド結合を特異的に切断する方法として、最も有用な方
法はアクロモバクタ−・リティクスブロテアーゼＩ〔リ
シルエンドペプチダーゼ（ＥＣ３，！１．．２　／、り
Ｏ）、以下ＡＰＩと略す〕を作用させることである。本
酵素は、Ｌｙｓ−Ｘ結合（Ｘはアミノ酸残基を表わす。

）の切断にきわめて特異的であり、非特異的な切断例は
非常に少ない（″続金輪学実験講座コタンパク質の化学
上”、Ｐ、２６２日本生化学会編、／９１７．東京化学
同人）ので、本発明への適用において特に好適である。

ＡＰＩは安定性の高い酵素であるので、切断反応の条件
に対する制約は少なく、ｐｉ−（４〜／ｌ好ましくはｆ
ｆ　Ｓ−／θＪ、温度ｑ〜ＳＯ℃好ましくはコＯ〜ｙｓ
℃で、切断すべきポリペプチドに対し、モル比で、／／
２θ〜／／２０００好ましくは／　／　、２　ｏ　。

〜／／１，００を添加して、／〜ＳＯ時間好ましくは９
〜３時間作用させればよい。緩衝液としては、生化学実
験で汎用される種々の緩衝液が使用可能であるが、後続
の操作へ及ぼす影響を考慮すると、遊離のアミノ基を有
さない緩衝液カ好マシク、特にエドマン分解時に多用さ
れているＮ−メチルモルフォリンは好適である。また、
切断反応を円滑に進行させるためには、ＡＰＩの活性を
低下させずにポリペプチドの高次構造を緩めることも好
ましく、そのために、例えば、ダルＳモル濃度の尿素を
添加してもよい。

ＡＰＩのほか、リゾバクター・エンザイモゲネスの産生
ずるエンドプロティナーゼＬｙｓ−Ｃ（商品名、ペーリ
ンガー・マンハイム社）も用いることが出来る。

また、トリプシンは、リジン及びアルギニン残基に特異
的な酵素であり、従って、予めポリペプチド中のアルギ
ニン残基を、例えば、”　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ
　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ”Ｇ、
　Ａｌ　ｆｅｎ、　Ｐ、　！；　７〜！；ざ、　／　９
　ｇ　／、　Ｎｏｒｔｈ　−Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ
　：Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄに記載の方法によ
ってシクロヘキサン−／、２−ジオン等で修飾した後に
、ＡＰＩと同様にしてトリプシンを作用させろことによ
っても本発明を実施することができろ。

遊離のアミノ基と反応して共有結合を形成しうる官能基
としては、イミド基、イソ尿素、アルデヒド基、シアン
基、アセチル基、サクシニル基、マレイル基、アセトア
セチル基、ジニトロフェニル基、トリニトロベンゼンス
ルホン酸基、インチオシアナート基等、数多（挙げるこ
とができるが、アミノ基のみと反応し、又、エドマン分
解が進行する酸処理条件下でも、ε−アミノ基との間の
結合が安定であるインチオシアナート基が本発明には好
適である。インチオシアナート基等の官能基を有する固
体の調製は、例えばＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ”Ｇ、　Ａ１
１ｅｎ、　ｐ、コＯｇ、　／　ｑｇ　／　、　Ｎｏｒｔ
ｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐ
ａｎｙ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　：　ＮｅｗＹｏｒｋ・
０ｘｆｏｒｄに記載の方法に準じて行うことができる。

固体担体としては多孔性ガラス、シリカゲル、ポリスチ
レン等が挙げられろ。細孔径の揃った多孔性ガラスは、
反応が制御しやすく、又、親水性であることから特に好
ましいが、疎水性担体であるポリスチレンの場合も、イ
ンチオシアナート基にさらに、グルコサミノーヤ基を導
入するなどして親水性を高め（岩永ら、蛋白質、核酸、
酵素−（１０）１０３２（／９７０））使いやすくする
ことも出来る。官能基を有する固体とペプチド混合液と
のカップリング反応４１ｐ８７〜１２好ましくはｔ〜／
ｌ更に好ましくはデ、Ｓ〜１０．５、温度ｑ−３０℃好
ましくＧま１ｏ−ｂｏ℃でＳ分〜３時間行なうが、この
際、液を窒素で置換して、酸素を除（・ておくこと力を
好ましい。カンプリング反応の終了後、適切な揮発性溶
媒、例えばアセトニトリル、ブロノ（ノール等の溶媒で
洗浄し、乾燥したのち、酸処理に移る。すなわち、乾燥
したペプチド・固体結合物が浸り切る程度の少量の酸を
添加し、窒素雰囲気下で、２０〜ｇｏ℃、好ましく＆１
３０〜６０℃でＳ分〜１時間反応させる。酸として＆ま
、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロ酪酸や塩酸飽和酢
酸等を用いることが出来るが、副反応の少ない、トリフ
ルオロ酢酸が最適である。反応終了後、０．／％トリフ
ルオロ酢酸を含むアセトニトリル、グロパノール等、ペ
プチド溶解性の揮発性溶媒を添加してから、固相を分離
・除去することにより、所望のカルボキシル末端ペプチ
ドが液相中に分取される。かくして分取されたカルボキ
シル末端ペプチドは、常法にしたがい、アミノ酸組成分
析、アミノ酸配列分析を行なうことにより構造が決定出
来、又、その他の所望の目的に使用することが出来る。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ポリペプチドからそのカルボキシル末
端ペプチドを簡便に分取することができ、そのポリペプ
チドのカルボキシル末端の構造決定を容易に行５ことが
できる。

〔実施例〕

以下に本発明の実施例を示す。

実施例／ 卵白リゾチームを常法に従い、β−メルカプトエタノー
ルで還元後モノヨード酢酸と反応させて、システィン残
基のチオール基をカルボキシメチル化した。このカルボ
キシメチル化リゾチーム−ナノモルをＳモル濃度の尿素
を含む、５０ミリモル濃度のＮ−エチルモルフィリン−
酢酸緩衝液（ｐＨ９，Ｏ）に溶解し、１０ピコモルのＡ
ＰＩを添加して３７℃で６時間反応させた。反応終了後
、ｓｏミリモル濃度のＮ−エチルモルフィリン水溶液を
添加してｐＨを７０．０に調整し、これに５ｏｎｙのＤ
ＩＴＣ−ＣＰＧ　（：ｌＩントロールドポアーグラスに
フェニレンジイソシアネートを結合させたもの、シグマ
社製）を添加し、反応系を窒素置換して、室温で１時間
、振盪しつつ、カップリング反応を行った。反応終了後
０．７％トリフルオロ酢酸を含む３０％アセトニトリル
ｅ２−プロパツール混液（体積比３／７）で洗浄し、真
空中で乾燥した。乾燥後、ＳＯμｌのトリフルオロ酢酸
を添加し、ａＯ℃で１５分間、窒素雰囲気下でインキエ
ペードした。これに、０．７％トリフルオロ酢酸を含む
５０％アセトニトリル・λ−グロパノール混液（体積比
３／７）を添加したのち、遠心分離によって上清部を採
取し、真空中で乾燥した。こうして得られたカルボキシ
ル末端ペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィーによ
り分析した。

ｐ、ｂ　Ｈｌ　９１６Ｘ　２！ｆｏ　ＨｌのＢａｋｅ　
ｒｂｏｎｄ社０ｃｔｙｌカラムを使用し、０．７％トリ
フルオロ酢酸を含むアセトニトリル水溶液を溶媒として
、アセトニトリルＯ％から１０％へのグラデイエンド溶
出を／Ｉｎｇ／ｍｉｎの流速で行った。得られたクロマ
トグラムは図１のＢ）に示すようであり、ビークｂはア
ミノ酸組成分析にンヒドリン法）及びアミノ酸配列分析
（自動エドマン分解法）の結果（表１）、期待されたカ
ルボキシル末端ペプチドと一致した。（該ペプチドのア
ミノ末端残基は予想されたように存在しなかった。）な
お、ビークａ及びビークＣは分析の結果アミノ酸は検出
されずペプチドではないことが分った。また図／のＡ）
＋よ、ＡＰＩ消化後のペプチド混合液のクロマトグラム
である。

表　　／ ”　：　Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ
として測定実施例２ ヒト血清アルブミンＯ０Ｓナノモルを実施例／と同様に
してＡＰＩ消化し、以後、実施例／と同様にしてカルボ
キシル末端ペプチドを分取した。分取ペプチドの分析も
実施例／と同様にして行ったが、その結果図２Ｂ）のビ
ークＣを分析し、期待したアミノ酸組成値及びアミノ酸
配列を示した。ビークａ、ｂ、ｄ及びｅはいずれもペプ
チドではなかった。

表コ

【図面の簡単な説明】

図１及び図２は、夫々実施例Ｉ及び実施例二で処理した
ペプチドの逆相高液体クロマトグラフィーのチャートを
示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ポリペプチドを、該ポリペプチド中のリジン残基
   とそれに続くカルボキシル末端側のアミノ酸残基との間
   のペプチド結合を特異的に切断処理し、得られるペプチ
   ド混合物を、表面に遊離のアミノ基と反応して共有結合
   を形成しうる官能基を有する固体と反応させ、次いで、
   各ペプチドのアミノ末端アミノ酸残基と隣接するアミノ
   酸残基との間のペプチド結合を酸処理により切断するこ
   とにより、遊離してくるペプチドを採取することを特徴
   とするカルボキシル末端ペプチドの分取方法。