JPH0552852A - タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法 - Google Patents
タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法Info
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- JPH0552852A JPH0552852A JP21743791A JP21743791A JPH0552852A JP H0552852 A JPH0552852 A JP H0552852A JP 21743791 A JP21743791 A JP 21743791A JP 21743791 A JP21743791 A JP 21743791A JP H0552852 A JPH0552852 A JP H0552852A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 酵素を用いることなく、簡便な操作でタンパ
ク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決
定する。 【構成】 タンパク質あるいはペプチドに一般式、ＣＦ
3 −（ＣＦ2 ）ｎ−ＣＯＯＨ（ｎは０以上の整数）で表
される有機酸を含む蒸気を作用させ、その結果生じた反
応混合物を質量分析装置にかけることにより質量スペク
トルを得て、反応混合物に含まれる各化学種の質量を測
定するか、またはアミノ酸分析装置にかけることによ
り、タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端から
のアミノ酸配列を決定する。
ク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決
定する。 【構成】 タンパク質あるいはペプチドに一般式、ＣＦ
3 −（ＣＦ2 ）ｎ−ＣＯＯＨ（ｎは０以上の整数）で表
される有機酸を含む蒸気を作用させ、その結果生じた反
応混合物を質量分析装置にかけることにより質量スペク
トルを得て、反応混合物に含まれる各化学種の質量を測
定するか、またはアミノ酸分析装置にかけることによ
り、タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端から
のアミノ酸配列を決定する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、タンパク質あるいはペ
プチドの１次構造解析法に関する。
プチドの１次構造解析法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、タンパク質あるいはペプチドのカ
ルボキシ末端（Ｃ末端）からのアミノ酸配列を決定する
ためには、図２に示すようにタンパク質あるいはペプチ
ドにカルボキシペプチダーゼを反応させ、反応液を経時
的に１部ずつ採取し、その反応液をアミノ酸分析装置で
分析して遊離されたアミノ酸を定量する方法が用いられ
てきた。（日本生化学会編、生化学実験講座第１巻、タ
ンパク質の化学II２０３−２１１ページ、１９７６年発
行）また、その反応液を質量分析装置にかけてＣ末端側
のアミノ酸を失ったタンパク質あるいはペプチドの質量
を測定する方法も報告されている。（A. Tsugita,R. va
n den Broek, M. Pyzybylski, FEBS. Lett. 137, 19(19
82)）さらに、図３に示すようにＣ末端を無水酢酸で活
性化し、トリメチルシリルイソチオシアネート（ＴＭＳ
−ＩＴＣ）を結合させた後に、塩酸で切断するという一
連の操作を繰り返すことを利用した配列分析法も報告さ
れている。（D. H.Hawke, H-. W. Lahm,J. E. Shively,
C. W. Todd, Anal. Biochem. 166, 298(1987））
ルボキシ末端（Ｃ末端）からのアミノ酸配列を決定する
ためには、図２に示すようにタンパク質あるいはペプチ
ドにカルボキシペプチダーゼを反応させ、反応液を経時
的に１部ずつ採取し、その反応液をアミノ酸分析装置で
分析して遊離されたアミノ酸を定量する方法が用いられ
てきた。（日本生化学会編、生化学実験講座第１巻、タ
ンパク質の化学II２０３−２１１ページ、１９７６年発
行）また、その反応液を質量分析装置にかけてＣ末端側
のアミノ酸を失ったタンパク質あるいはペプチドの質量
を測定する方法も報告されている。（A. Tsugita,R. va
n den Broek, M. Pyzybylski, FEBS. Lett. 137, 19(19
82)）さらに、図３に示すようにＣ末端を無水酢酸で活
性化し、トリメチルシリルイソチオシアネート（ＴＭＳ
−ＩＴＣ）を結合させた後に、塩酸で切断するという一
連の操作を繰り返すことを利用した配列分析法も報告さ
れている。（D. H.Hawke, H-. W. Lahm,J. E. Shively,
C. W. Todd, Anal. Biochem. 166, 298(1987））
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来のカルボキシペプ
チダーゼを用いる方法は、酵素の基質特異性や活性がＣ
末端アミノ酸あるいはそれに隣接するアミノ酸によって
さまざまであること、そして他の酵素の混在があること
から正確な分析が困難になることがあり、また酵素の自
己消化性によってアミノ酸が遊離されるため高感度分析
には適していなかった。
チダーゼを用いる方法は、酵素の基質特異性や活性がＣ
末端アミノ酸あるいはそれに隣接するアミノ酸によって
さまざまであること、そして他の酵素の混在があること
から正確な分析が困難になることがあり、また酵素の自
己消化性によってアミノ酸が遊離されるため高感度分析
には適していなかった。
【０００４】また、ＴＭＳ−ＩＴＣを用いる方法は３種
類の試薬を繰り返し作用させる必要があり操作が煩雑で
ある。そこで本発明は、酵素を用いることなく、簡便な
操作でタンパク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミ
ノ酸配列を決定する方法を提供しようとするものであ
る。
類の試薬を繰り返し作用させる必要があり操作が煩雑で
ある。そこで本発明は、酵素を用いることなく、簡便な
操作でタンパク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミ
ノ酸配列を決定する方法を提供しようとするものであ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明においては、上記
の欠点を克服しＣ末端からのアミノ酸の配列分析を実行
するために、タンパク質あるいはペプチドに一般式、Ｃ
Ｆ3 −（ＣＦ2 ）ｎ−ＣＯＯＨ（ｎは０以上の整数）で
表される有機酸、例えばトリフルオロ酢酸（ｎ＝０）、
ペンタフルオロプロピオン酸（ｎ＝１）あるいはヘプタ
フルオロ酪酸（ｎ＝２）を作用させた。
の欠点を克服しＣ末端からのアミノ酸の配列分析を実行
するために、タンパク質あるいはペプチドに一般式、Ｃ
Ｆ3 −（ＣＦ2 ）ｎ−ＣＯＯＨ（ｎは０以上の整数）で
表される有機酸、例えばトリフルオロ酢酸（ｎ＝０）、
ペンタフルオロプロピオン酸（ｎ＝１）あるいはヘプタ
フルオロ酪酸（ｎ＝２）を作用させた。
【０００６】
【作用】上記手段により、酵素を用いることなく、簡便
な操作でタンパク質あるいはペプチドのＣ末端からのア
ミノ酸配列を決定することが可能になった。
な操作でタンパク質あるいはペプチドのＣ末端からのア
ミノ酸配列を決定することが可能になった。
【０００７】
【実施例】以下実施例に基づいて本発明を詳細に説明す
る。 （実施例１）ここでは実験方法の詳細を述べる。図１は
本発明の分析方法を示す工程図である。タンパク質ある
いはペプチドにＴＦＡ，ＰＦＰＡあるいはＨＦＢＡを作
用させＣ末端からのペプチド鎖の逐次切断反応を生じさ
せる。この反応混合物をファーストアトムボンバードメ
ント質量分析装置（ＦＡＢ−ＭＳ）あるいは、エレクト
ロスプレーイオン化質量分析装置（ＥＳＩ−ＭＳ）にか
けて質量スペクトルを得るか、またはアミノ酸分析装置
にかける。
る。 （実施例１）ここでは実験方法の詳細を述べる。図１は
本発明の分析方法を示す工程図である。タンパク質ある
いはペプチドにＴＦＡ，ＰＦＰＡあるいはＨＦＢＡを作
用させＣ末端からのペプチド鎖の逐次切断反応を生じさ
せる。この反応混合物をファーストアトムボンバードメ
ント質量分析装置（ＦＡＢ−ＭＳ）あるいは、エレクト
ロスプレーイオン化質量分析装置（ＥＳＩ−ＭＳ）にか
けて質量スペクトルを得るか、またはアミノ酸分析装置
にかける。
【０００８】本発明の分析手順は以下のとおりである。
まずタンパク質あるいはペプチドを含む試料溶液１を小
試験管２に入れた後乾燥させる。この試験管を、あらか
じめトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ペンタフルオロプロ
ピオン酸（ＰＦＰＡ）あるいはヘプタフルオロ酪酸（Ｈ
ＦＢＡ）の水溶液３を入れておいた試験管４に入れる。
この際、その水溶液には還元剤５を加えておく（図４
（Ａ））。還元剤を有機酸の水溶液に添加しておく代わ
りに、別の小試験管に入れ、タンパク質あるいはペプチ
ド１の入った小試験管２と一緒に有機酸の水溶液３を入
れた試験管４に入れておくこともできる（図４
（Ｂ））。
まずタンパク質あるいはペプチドを含む試料溶液１を小
試験管２に入れた後乾燥させる。この試験管を、あらか
じめトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ペンタフルオロプロ
ピオン酸（ＰＦＰＡ）あるいはヘプタフルオロ酪酸（Ｈ
ＦＢＡ）の水溶液３を入れておいた試験管４に入れる。
この際、その水溶液には還元剤５を加えておく（図４
（Ａ））。還元剤を有機酸の水溶液に添加しておく代わ
りに、別の小試験管に入れ、タンパク質あるいはペプチ
ド１の入った小試験管２と一緒に有機酸の水溶液３を入
れた試験管４に入れておくこともできる（図４
（Ｂ））。
【０００９】次いで、この外側の試験管を減圧下で封管
する。そしてこの２重になった試験管を加熱する。この
後、封管をあけて内側の試験管を取り出して乾燥させ
る。乾燥された試料を酢酸の水溶液で溶解し、更にグリ
セロールトリグリセロールとの混合物と混合した後、Ｆ
ＡＢ−ＭＳによって分析する。ＥＳＩ−ＭＳによって分
析する場合には、試料を酢酸を含むメタノール溶液に溶
解して装置に導入する。
する。そしてこの２重になった試験管を加熱する。この
後、封管をあけて内側の試験管を取り出して乾燥させ
る。乾燥された試料を酢酸の水溶液で溶解し、更にグリ
セロールトリグリセロールとの混合物と混合した後、Ｆ
ＡＢ−ＭＳによって分析する。ＥＳＩ−ＭＳによって分
析する場合には、試料を酢酸を含むメタノール溶液に溶
解して装置に導入する。
【００１０】各々の質量分析の条件は以下のとおりであ
る。 ＦＡＢ−ＭＳ 装置本体：日本電子製 ＨＸ１００型 データ処理システム：日本電子製 ＤＡ１０００型 加速電圧：１０ｋＶ イオン化ガス：キセノン ＥＳＩ−ＭＳ 装置本体：日本電子製 ＳＸ−１０１ 加速電圧：１０ｋＶ イオン化ガス：窒素 アミノ酸分析装置によって分析する場合には、試料をpH
2.2のクエン酸緩衝溶液に溶解して装置に導入する。ニ
ンヒドリン法を用いたイオン交換クロマトグラフによる
アミノ酸分析には、医理化機器製Ａ−５５００を用い
た。
る。 ＦＡＢ−ＭＳ 装置本体：日本電子製 ＨＸ１００型 データ処理システム：日本電子製 ＤＡ１０００型 加速電圧：１０ｋＶ イオン化ガス：キセノン ＥＳＩ−ＭＳ 装置本体：日本電子製 ＳＸ−１０１ 加速電圧：１０ｋＶ イオン化ガス：窒素 アミノ酸分析装置によって分析する場合には、試料をpH
2.2のクエン酸緩衝溶液に溶解して装置に導入する。ニ
ンヒドリン法を用いたイオン交換クロマトグラフによる
アミノ酸分析には、医理化機器製Ａ−５５００を用い
た。
【００１１】（実施例２）本発明を説明するために、こ
こでは配列番号１のヘキサペプチド、Leu-Trp-Met-Arg-
Phe-Ala を試料ペプチドとして選び実験を行った。以下
の説明においては、例えばLeu-Trp-Met はペプチド1-３
のように呼ぶこととする。
こでは配列番号１のヘキサペプチド、Leu-Trp-Met-Arg-
Phe-Ala を試料ペプチドとして選び実験を行った。以下
の説明においては、例えばLeu-Trp-Met はペプチド1-３
のように呼ぶこととする。
【００１２】図５は、ＴＦＡ（図５（Ｂ））、ＰＦＰＡ
（図５（Ｃ），（Ｅ））、そしてＨＦＢＡ（図５
（Ｄ），（Ｆ））を含む蒸気をそれぞれ作用させた反応
混合物をＦＡＢ−ＭＳによって分析した結果を示したも
のである。この際の加熱温度は９０℃、各有機酸溶液の
濃度は９０％である。図５（Ａ）は有機酸を作用させて
いないペプチドを分析した結果を示したものである。Ｔ
ＦＡを含む蒸気を４時間作用させた場合、ペプチド1-6
と、それぞれＣ末端からのアミノ酸を順次失ったペプチ
ド1-5 、1-4 、1-3 が検出された。但しこの場合には、
Ｃ末端からの逐次的な分解以外の非特異的なペプチド鎖
内部の分解反応の結果生じたペプチド4-6 、3-5 、3-6
も検出されている。
（図５（Ｃ），（Ｅ））、そしてＨＦＢＡ（図５
（Ｄ），（Ｆ））を含む蒸気をそれぞれ作用させた反応
混合物をＦＡＢ−ＭＳによって分析した結果を示したも
のである。この際の加熱温度は９０℃、各有機酸溶液の
濃度は９０％である。図５（Ａ）は有機酸を作用させて
いないペプチドを分析した結果を示したものである。Ｔ
ＦＡを含む蒸気を４時間作用させた場合、ペプチド1-6
と、それぞれＣ末端からのアミノ酸を順次失ったペプチ
ド1-5 、1-4 、1-3 が検出された。但しこの場合には、
Ｃ末端からの逐次的な分解以外の非特異的なペプチド鎖
内部の分解反応の結果生じたペプチド4-6 、3-5 、3-6
も検出されている。
【００１３】一方、ＰＦＰＡ（図５（Ｃ））およびＨＦ
ＢＡ（図５（Ｄ））を４時間作用させた場合には、ペプ
チド1-6 とＣ末端からの逐次的なペプチド鎖の分解の結
果生成したペプチド1-5 、1-4 、1-3 が主に検出されて
おり、この結果からＣ末端からのアミノ酸配列が決定さ
れることがわかる。次に、ＰＦＰＡ（図５（Ｅ））、そ
してＨＦＢＡ（図５（Ｆ））を２４時間作用させた場合
に得られた結果を示した。この場合も４時間作用させた
際と同様に、Ｃ末端からの逐次的なペプチド鎖の分解の
結果生成したペプチドが検出されている。但し、４時間
作用させた場合に見られなかったペプチド1-2 も検出さ
れており、有機酸を長時間作用させることによって、よ
り長い配列分析が可能となることがわかる。
ＢＡ（図５（Ｄ））を４時間作用させた場合には、ペプ
チド1-6 とＣ末端からの逐次的なペプチド鎖の分解の結
果生成したペプチド1-5 、1-4 、1-3 が主に検出されて
おり、この結果からＣ末端からのアミノ酸配列が決定さ
れることがわかる。次に、ＰＦＰＡ（図５（Ｅ））、そ
してＨＦＢＡ（図５（Ｆ））を２４時間作用させた場合
に得られた結果を示した。この場合も４時間作用させた
際と同様に、Ｃ末端からの逐次的なペプチド鎖の分解の
結果生成したペプチドが検出されている。但し、４時間
作用させた場合に見られなかったペプチド1-2 も検出さ
れており、有機酸を長時間作用させることによって、よ
り長い配列分析が可能となることがわかる。
【００１４】（実施例３）更にこの結果を配列番号２の
ノナペプチドArg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu を
用いて確かめた。図６（Ａ）は、有機酸を作用させてい
ないペプチドを分析した結果を示したものである。９０
％のＨＦＢＡを９０℃で４時間作用させた場合（図６
（Ｂ））、ペプチド1-9 、1-8 、1-7 が検出されてお
り、Ｃ末端から２残基の配列がわかる。２４時間作用さ
せた場合（図６（Ｃ））には、ペプチド1-9 、1-8 、1-
7 、1-6 、1-5 、1-4 、1-3 が検出されており、Ｃ末端
から６残基の配列がわかる。
ノナペプチドArg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu を
用いて確かめた。図６（Ａ）は、有機酸を作用させてい
ないペプチドを分析した結果を示したものである。９０
％のＨＦＢＡを９０℃で４時間作用させた場合（図６
（Ｂ））、ペプチド1-9 、1-8 、1-7 が検出されてお
り、Ｃ末端から２残基の配列がわかる。２４時間作用さ
せた場合（図６（Ｃ））には、ペプチド1-9 、1-8 、1-
7 、1-6 、1-5 、1-4 、1-3 が検出されており、Ｃ末端
から６残基の配列がわかる。
【００１５】（実施例４）ここでは作用させる有機酸の
濃度を変化させた場合の結果を示す。図７は、ＰＦＰＡ
の濃度を５０％から９８％まで変化させ９０℃で４時間
作用させた場合に得られた反応混合物をＦＡＢ−ＭＳに
よって分析した結果を示したものである。試料には配列
番号１のヘキサペプチド、Leu-Trp-Met-Arg-Phe-Alaを
用いた。図７（Ａ）は有機酸を作用させていないペプチ
ドを分析した結果を示したものである。図７（Ｂ）はＰ
ＦＰＡの濃度を５０％とした場合の結果を示したもので
あり、以下同様に図７（Ｃ）は７０％、図７（Ｄ）は９
０％、図７（Ｅ）は９８％とした場合の結果を示したも
のである。ＰＦＰＡの濃度を５０％とした場合には、Ｃ
末端からの逐次的な分解以外の非特異的なペプチド鎖内
部の分解反応の結果生じたペプチド4-6 、3-5 、3-6 、
も検出されている。有機酸の濃度を９０％とした場合
に、最もＣ末端からの逐次的なペプチド鎖の切断が特異
的に起きていることがわかる。
濃度を変化させた場合の結果を示す。図７は、ＰＦＰＡ
の濃度を５０％から９８％まで変化させ９０℃で４時間
作用させた場合に得られた反応混合物をＦＡＢ−ＭＳに
よって分析した結果を示したものである。試料には配列
番号１のヘキサペプチド、Leu-Trp-Met-Arg-Phe-Alaを
用いた。図７（Ａ）は有機酸を作用させていないペプチ
ドを分析した結果を示したものである。図７（Ｂ）はＰ
ＦＰＡの濃度を５０％とした場合の結果を示したもので
あり、以下同様に図７（Ｃ）は７０％、図７（Ｄ）は９
０％、図７（Ｅ）は９８％とした場合の結果を示したも
のである。ＰＦＰＡの濃度を５０％とした場合には、Ｃ
末端からの逐次的な分解以外の非特異的なペプチド鎖内
部の分解反応の結果生じたペプチド4-6 、3-5 、3-6 、
も検出されている。有機酸の濃度を９０％とした場合
に、最もＣ末端からの逐次的なペプチド鎖の切断が特異
的に起きていることがわかる。
【００１６】図８は、ＨＦＢＡの濃度を５０％から９８
％まで変化させ９０℃で４時間作用させた場合に得られ
た結果を示したものである。試料には配列番号３のオク
タペプチド、His-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr を用い
た。図８（Ａ）は有機酸を作用させていないペプチドを
分析した結果を示したものである。図８（Ｂ）はＨＦＢ
Ａの濃度を５０％とした場合の結果を示したものであ
り、以下同様に図８（Ｃ）は７０％、図８（Ｄ）は９０
％、図８（Ｅ）は９８％とした場合の結果を示したもの
である。ＨＦＢＡの濃度を５０％とした場合には、ＰＦ
ＰＡを用いた場合と同様にＣ末端からの逐次的な分解以
外の非特異的なペプチド鎖内部の分解反応の結果生じた
ペプチド4-8 、3-6 も検出されている。
％まで変化させ９０℃で４時間作用させた場合に得られ
た結果を示したものである。試料には配列番号３のオク
タペプチド、His-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr を用い
た。図８（Ａ）は有機酸を作用させていないペプチドを
分析した結果を示したものである。図８（Ｂ）はＨＦＢ
Ａの濃度を５０％とした場合の結果を示したものであ
り、以下同様に図８（Ｃ）は７０％、図８（Ｄ）は９０
％、図８（Ｅ）は９８％とした場合の結果を示したもの
である。ＨＦＢＡの濃度を５０％とした場合には、ＰＦ
ＰＡを用いた場合と同様にＣ末端からの逐次的な分解以
外の非特異的なペプチド鎖内部の分解反応の結果生じた
ペプチド4-8 、3-6 も検出されている。
【００１７】（実施例５）ここではＥＳＩ−ＭＳを用い
て反応混合物を分析した例を示す。図９，図１０は、試
料として配列番号４のトリコサペプチド、Gly-Ile-Gly-
Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Gly-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Ph
e-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Lys-Ser を用いＰＦＰＡの濃度
を９０％として９０℃で２時間処理した場合の反応混合
物をＥＳＩ−ＭＳを用いて分析した結果を示したもので
ある。図９はマススペクトログラムであり、図１０はそ
こで得られたデータをまとめたものである。図９中の番
号は図１０中のそれに対応している。図１０中におい
て、例えば(8-23) 2+ は２価に荷電されたペプチド8-23
を示している。ＥＳＩ−ＭＳの特徴として様々な電荷を
帯びたイオンが検出されている。ここでは、特に３価に
荷電されたイオンを検出したことによって（(1-23) 3+
から(1-15) 3+ ）Ｃ末端から８残基のアミノ酸配列が分
析されている。
て反応混合物を分析した例を示す。図９，図１０は、試
料として配列番号４のトリコサペプチド、Gly-Ile-Gly-
Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Gly-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Ph
e-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Lys-Ser を用いＰＦＰＡの濃度
を９０％として９０℃で２時間処理した場合の反応混合
物をＥＳＩ−ＭＳを用いて分析した結果を示したもので
ある。図９はマススペクトログラムであり、図１０はそ
こで得られたデータをまとめたものである。図９中の番
号は図１０中のそれに対応している。図１０中におい
て、例えば(8-23) 2+ は２価に荷電されたペプチド8-23
を示している。ＥＳＩ−ＭＳの特徴として様々な電荷を
帯びたイオンが検出されている。ここでは、特に３価に
荷電されたイオンを検出したことによって（(1-23) 3+
から(1-15) 3+ ）Ｃ末端から８残基のアミノ酸配列が分
析されている。
【００１８】（実施例６）ここではアミノ酸分析装置を
用いて反応混合物を分析した例を示す。図１１は、実施
例２と同様に配列番号１のヘキサペプチド、Leu-Trp-Me
t-Arg-Phe-Ala を試料ペプチドとして選び、ＰＦＰＡを
含む蒸気をそれぞれ４時間（図１１（Ｂ））、および２
４時間（図１１（Ｃ））作用させた反応混合物をアミノ
酸分析装置によって分析した結果を示したものである。
他の反応条件も実施例２と同様であり、加熱温度は９０
℃、各有機酸溶液の濃度は９０％である。図１１（Ａ）
は有機酸を作用させていないペプチドを分析した結果を
示したものである。図１１（Ｂ）において得られた各ア
ミノ酸のピークの強度の順から、Ｃ末端側のアミノ酸配
列は-Arg-Phe-Alaであることがわかる。さらに、図１１
（Ｃ）において得られた各アミノ酸のピークの強度の順
から、Ｃ末端側のアミノ酸配列は-Met-Arg-Phe-Alaであ
ることがわかる。
用いて反応混合物を分析した例を示す。図１１は、実施
例２と同様に配列番号１のヘキサペプチド、Leu-Trp-Me
t-Arg-Phe-Ala を試料ペプチドとして選び、ＰＦＰＡを
含む蒸気をそれぞれ４時間（図１１（Ｂ））、および２
４時間（図１１（Ｃ））作用させた反応混合物をアミノ
酸分析装置によって分析した結果を示したものである。
他の反応条件も実施例２と同様であり、加熱温度は９０
℃、各有機酸溶液の濃度は９０％である。図１１（Ａ）
は有機酸を作用させていないペプチドを分析した結果を
示したものである。図１１（Ｂ）において得られた各ア
ミノ酸のピークの強度の順から、Ｃ末端側のアミノ酸配
列は-Arg-Phe-Alaであることがわかる。さらに、図１１
（Ｃ）において得られた各アミノ酸のピークの強度の順
から、Ｃ末端側のアミノ酸配列は-Met-Arg-Phe-Alaであ
ることがわかる。
【００１９】以上述べてきた結果をまとめると次のよう
になる。乾燥されたペプチドに還元剤を含む５０−９８
％の一般式、ＣＦ3 −（ＣＦ2 ）ｎ−ＣＯＯＨ（ｎは０
以上の整数）で表される有機酸を含む水溶液を気化させ
た結果生じた蒸気を作用させ、その反応混合物をＦＡＢ
−ＭＳあるいはＥＳＩ−ＭＳにかけることにより、試料
としたペプチド及びそのペプチドのＣ末端のアミノ酸が
逐次分解反応によって切断されたペプチドを示す質量ス
ペクトルを得ることができる。これを解析することによ
って、試料としたペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列
を決定することができる。また反応混合物をアミノ酸分
析装置にかけて得られたデータを解析することによって
も、試料としたペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を
決定することができる。
になる。乾燥されたペプチドに還元剤を含む５０−９８
％の一般式、ＣＦ3 −（ＣＦ2 ）ｎ−ＣＯＯＨ（ｎは０
以上の整数）で表される有機酸を含む水溶液を気化させ
た結果生じた蒸気を作用させ、その反応混合物をＦＡＢ
−ＭＳあるいはＥＳＩ−ＭＳにかけることにより、試料
としたペプチド及びそのペプチドのＣ末端のアミノ酸が
逐次分解反応によって切断されたペプチドを示す質量ス
ペクトルを得ることができる。これを解析することによ
って、試料としたペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列
を決定することができる。また反応混合物をアミノ酸分
析装置にかけて得られたデータを解析することによって
も、試料としたペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を
決定することができる。
【００２０】
【発明の効果】本発明の重要な点は、タンパク質あるい
はペプチドに一般式、ＣＦ3 −（ＣＦ2 ）ｎ−ＣＯＯＨ
（ｎは０以上の整数）で表される有機酸、例えばトリフ
ルオロ酢酸（ｎ＝０）、ペンタフルオロプロピオン酸
（ｎ＝１）あるいはヘプタフルオロ酪酸（ｎ＝２）を作
用させることにより、酵素を用いることなく簡便な操作
でタンパク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミノ酸
配列を決定することが可能になったことである。
はペプチドに一般式、ＣＦ3 −（ＣＦ2 ）ｎ−ＣＯＯＨ
（ｎは０以上の整数）で表される有機酸、例えばトリフ
ルオロ酢酸（ｎ＝０）、ペンタフルオロプロピオン酸
（ｎ＝１）あるいはヘプタフルオロ酪酸（ｎ＝２）を作
用させることにより、酵素を用いることなく簡便な操作
でタンパク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミノ酸
配列を決定することが可能になったことである。
【００２１】よって、本発明によるタンパク質あるいは
ペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定す
る方法はその工業的価値が大である。 （配列表） 配列番号：１ 配列の長さ：６ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：２ 配列の長さ：９ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：３ 配列の長さ：８ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：４ 配列の長さ：２３ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Gly Lys Phe Gly Lys Ala Phe 1 5 10 15 Val Gly Glu Ile Met Lys Ser 20
ペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定す
る方法はその工業的価値が大である。 （配列表） 配列番号：１ 配列の長さ：６ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：２ 配列の長さ：９ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：３ 配列の長さ：８ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：４ 配列の長さ：２３ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Gly Lys Phe Gly Lys Ala Phe 1 5 10 15 Val Gly Glu Ile Met Lys Ser 20
【図１】本発明の分析方法を示す工程図である。
【図２】カルボキシペプチダーゼを用いた場合の従来の
分析方法の工程図である。
分析方法の工程図である。
【図３】トリメチルシリルイソチオシアナートを用いた
場合の従来の分析方法の工程図である。
場合の従来の分析方法の工程図である。
【図４】還元剤を、有機酸の水溶液に加えた場合（図４
（Ａ））と、タンパク質あるいはペプチドのはいった小
試験管とは別の小試験管に入れた場合（図４（Ｂ））の
実験方法を示したものである。
（Ａ））と、タンパク質あるいはペプチドのはいった小
試験管とは別の小試験管に入れた場合（図４（Ｂ））の
実験方法を示したものである。
【図５】配列番号１のヘキサペプチドにＴＦＡ（図５
（Ｂ））、ＰＦＰＡ（図５（Ｃ））、そしてＨＦＢＡ
（図５（Ｄ））を含む蒸気をそれぞれ４時間、更にＰＦ
ＰＡ（図５（Ｅ））、そしてＨＦＢＡ（図５（Ｆ））を
２４時間作用させた反応混合物をＦＡＢ−ＭＳによって
分析した結果を示したものである。図５（Ａ）は有機酸
を作用させていないペプチドを分析した結果を示したも
のである。
（Ｂ））、ＰＦＰＡ（図５（Ｃ））、そしてＨＦＢＡ
（図５（Ｄ））を含む蒸気をそれぞれ４時間、更にＰＦ
ＰＡ（図５（Ｅ））、そしてＨＦＢＡ（図５（Ｆ））を
２４時間作用させた反応混合物をＦＡＢ−ＭＳによって
分析した結果を示したものである。図５（Ａ）は有機酸
を作用させていないペプチドを分析した結果を示したも
のである。
【図６】配列番号２のノナペプチドにＨＦＢＡを含む蒸
気をそれぞれ４時間（図６（Ｂ））、そして２４時間
（図６（Ｃ））を作用させた反応混合物をＦＡＢ−ＭＳ
によって分析した結果を示したものである。図６（Ａ）
は有機酸を作用させていないペプチドを分析した結果を
示したものである。
気をそれぞれ４時間（図６（Ｂ））、そして２４時間
（図６（Ｃ））を作用させた反応混合物をＦＡＢ−ＭＳ
によって分析した結果を示したものである。図６（Ａ）
は有機酸を作用させていないペプチドを分析した結果を
示したものである。
【図７】ＰＦＰＡの濃度を５０％から９８％まで変化さ
せ９０℃で４時間作用させた場合に得られた結果を示し
たものである。図７（Ａ）は有機酸を作用させていない
ペプチドを分析した結果を示したものである。図７
（Ｂ）はＰＦＰＡの濃度を５０％とした場合の結果を示
したものであり、以下同様に図７（Ｃ）は７０％、図７
（Ｄ）は９０％、図７（Ｅ）は９８％とした場合の結果
を示したものである。試料として配列番号１のヘキサペ
プチドを用いた。
せ９０℃で４時間作用させた場合に得られた結果を示し
たものである。図７（Ａ）は有機酸を作用させていない
ペプチドを分析した結果を示したものである。図７
（Ｂ）はＰＦＰＡの濃度を５０％とした場合の結果を示
したものであり、以下同様に図７（Ｃ）は７０％、図７
（Ｄ）は９０％、図７（Ｅ）は９８％とした場合の結果
を示したものである。試料として配列番号１のヘキサペ
プチドを用いた。
【図８】ＨＦＢＡの濃度を５０％から９８％まで変化さ
せ９０℃で４時間作用させた場合に得られた結果を示し
たものである。図８（Ａ）は有機酸を作用させていない
ペプチドを分析した結果を示したものである。図８
（Ｂ）はＨＦＢＡの濃度を５０％とした場合の結果を示
したものであり、以下同様に図８（Ｃ）は７０％、図８
（Ｄ）は９０％、図８（Ｅ）は９８％とした場合の結果
を示したものである。試料として配列番号３のオクタペ
プチドを用いた。
せ９０℃で４時間作用させた場合に得られた結果を示し
たものである。図８（Ａ）は有機酸を作用させていない
ペプチドを分析した結果を示したものである。図８
（Ｂ）はＨＦＢＡの濃度を５０％とした場合の結果を示
したものであり、以下同様に図８（Ｃ）は７０％、図８
（Ｄ）は９０％、図８（Ｅ）は９８％とした場合の結果
を示したものである。試料として配列番号３のオクタペ
プチドを用いた。
【図９】配列番号４のトリコサペプチドにＰＦＰＡを２
時間作用させた場合の反応混合物をＥＳＩ−ＭＳを用い
て分析した結果を示すマススペクトログラムである。
時間作用させた場合の反応混合物をＥＳＩ−ＭＳを用い
て分析した結果を示すマススペクトログラムである。
【図１０】分析で得られたデータをまとめたものであ
る。
る。
【図１１】配列番号１のヘキサペプチドにＰＦＰＡを含
む蒸気をそれぞれ４時間（図１１（Ｂ））、および２４
時間（図１１（Ｃ））作用させた反応混合物をアミノ酸
分析装置によって分析した結果を示したものである。図
１１（Ａ）は有機酸を作用させていないペプチドを分析
した結果を示したものである。
む蒸気をそれぞれ４時間（図１１（Ｂ））、および２４
時間（図１１（Ｃ））作用させた反応混合物をアミノ酸
分析装置によって分析した結果を示したものである。図
１１（Ａ）は有機酸を作用させていないペプチドを分析
した結果を示したものである。
１ タンパク質またはペプチド ３ 有機酸の水溶液 ５ 還元剤
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年４月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００７】
【実施例】以下実施例に基づいて本発明を詳細に説明す
る。 （実施例１）ここでは実験方法の詳細を述べる。図１は
本発明の分析方法を示す工程図である。タンパク質ある
いはペプチドにトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ペンタフ
ルオロプロピオン酸（ＰＦＰＡ）あるいはヘプタフルオ
ロ酪酸（ＨＦＢＡ）を作用させＣ末端からのペプチド鎖
の逐次切断反応を生じさせる。この反応混合物をファー
ストアトムボンバードメント質量分析装置（ＦＡＢ−Ｍ
Ｓ）あるいは、エレクトロスプレーイオン化質量分析装
置（ＥＳＩ−ＭＳ）にかけて質量スペクトルを得るか、
またはアミノ酸分析装置にかける。
る。 （実施例１）ここでは実験方法の詳細を述べる。図１は
本発明の分析方法を示す工程図である。タンパク質ある
いはペプチドにトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ペンタフ
ルオロプロピオン酸（ＰＦＰＡ）あるいはヘプタフルオ
ロ酪酸（ＨＦＢＡ）を作用させＣ末端からのペプチド鎖
の逐次切断反応を生じさせる。この反応混合物をファー
ストアトムボンバードメント質量分析装置（ＦＡＢ−Ｍ
Ｓ）あるいは、エレクトロスプレーイオン化質量分析装
置（ＥＳＩ−ＭＳ）にかけて質量スペクトルを得るか、
またはアミノ酸分析装置にかける。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】本発明の分析手順は以下のとおりである。
まずタンパク質あるいはペプチドを含む試料溶液１を小
試験管２に入れた後乾燥させる。この試験管を、あらか
じめＴＦＡ，ＰＦＰＡあるいはＨＦＢＡの水溶液３を入
れておいた試験管４に入れる。この際、その水溶液には
還元剤５を加えておく（図４（Ａ））。還元剤を有機酸
の水溶液に添加しておく代わりに、別の小試験管に入
れ、タンパク質あるいはペプチド１の入った小試験管２
と一緒に有機酸の水溶液３を入れた試験管４に入れてお
くこともできる（図４（Ｂ））。
まずタンパク質あるいはペプチドを含む試料溶液１を小
試験管２に入れた後乾燥させる。この試験管を、あらか
じめＴＦＡ，ＰＦＰＡあるいはＨＦＢＡの水溶液３を入
れておいた試験管４に入れる。この際、その水溶液には
還元剤５を加えておく（図４（Ａ））。還元剤を有機酸
の水溶液に添加しておく代わりに、別の小試験管に入
れ、タンパク質あるいはペプチド１の入った小試験管２
と一緒に有機酸の水溶液３を入れた試験管４に入れてお
くこともできる（図４（Ｂ））。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】次いで、この外側の試験管を減圧下で封管
する。そしてこの２重になった試験管を加熱する。この
後、封管をあけて内側の試験管を取り出して乾燥させ
る。乾燥された試料を酢酸の水溶液で溶解し、更にグリ
セロールとチオグリセロールとの混合物と混合した後、
ＦＡＢ−ＭＳによって分析する。ＥＳＩ−ＭＳによって
分析する場合には、試料を酢酸を含むメタノール溶液に
溶解して装置に導入する。
する。そしてこの２重になった試験管を加熱する。この
後、封管をあけて内側の試験管を取り出して乾燥させ
る。乾燥された試料を酢酸の水溶液で溶解し、更にグリ
セロールとチオグリセロールとの混合物と混合した後、
ＦＡＢ−ＭＳによって分析する。ＥＳＩ−ＭＳによって
分析する場合には、試料を酢酸を含むメタノール溶液に
溶解して装置に導入する。
Claims (4)
- 【請求項１】 タンパク質あるいはペプチドに一般式、
ＣＦ3 −（ＣＦ2 ）ｎ−ＣＯＯＨ（ｎは０以上の整数）
で表される有機酸を含む蒸気を作用させることを特徴と
したタンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端から
のアミノ酸配列を決定する方法。 - 【請求項２】 タンパク質あるいはペプチドに作用させ
る上記有機酸を含む蒸気は、上記有機酸の５０−９８％
水溶液を気化させたものであることを特徴とした請求項
１記載のタンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端
からのアミノ酸配列を決定する方法。 - 【請求項３】 タンパク質あるいはペプチドに上記有機
酸を作用させた反応混合物を質量分析装置にかけること
により質量スペクトルを得て、反応混合物に含まれる各
化学種の質量を測定することを特徴とした請求項１記載
のタンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からの
アミノ酸配列を決定する方法。 - 【請求項４】 タンパク質あるいはペプチドに上記有機
酸を作用させた反応混合物をアミノ酸分析装置にかける
ことにより、反応混合物に含まれる各化学種を測定する
ことを特徴とした請求項１記載のタンパク質あるいはペ
プチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する
方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3217437A JP2686505B2 (ja) | 1991-08-28 | 1991-08-28 | タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法 |
| US07/931,931 US5521097A (en) | 1991-08-28 | 1992-08-18 | Method of determining amino acid sequence of protein or peptide from carboxy-terminal |
| EP92114531A EP0529604B1 (en) | 1991-08-28 | 1992-08-26 | Method of analysing a protein or a peptide |
| DE69214571T DE69214571T2 (de) | 1991-08-28 | 1992-08-26 | Verfahren zur Analyse von einem Protein oder einem Peptid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3217437A JP2686505B2 (ja) | 1991-08-28 | 1991-08-28 | タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0552852A true JPH0552852A (ja) | 1993-03-02 |
| JP2686505B2 JP2686505B2 (ja) | 1997-12-08 |
Family
ID=16704219
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3217437A Expired - Fee Related JP2686505B2 (ja) | 1991-08-28 | 1991-08-28 | タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2686505B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003081255A1 (fr) * | 2002-03-25 | 2003-10-02 | Nec Corporation | Procede d'analyse d'un peptide visant a determiner une sequence d'acides amines c-terminaux |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56125669A (en) * | 1980-03-07 | 1981-10-02 | Univ Osaka | Analytical method for peptide mixture using fd mass spectrometer |
| JPS6391564A (ja) * | 1986-10-06 | 1988-04-22 | Agency Of Ind Science & Technol | ペプチドのアミノ酸配列推定方法 |
| JPH01235600A (ja) * | 1988-03-15 | 1989-09-20 | Mitsubishi Kasei Corp | カルボキシル末端ペプチドの分取方法 |
| JPH0377854A (ja) * | 1989-08-18 | 1991-04-03 | Seiko Instr Inc | タンパク質あるいはペプチドを加水分解する装置 |
| JPH03160370A (ja) * | 1989-11-17 | 1991-07-10 | Seiko Instr Inc | タンパク質の加水分解方法 |
-
1991
- 1991-08-28 JP JP3217437A patent/JP2686505B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56125669A (en) * | 1980-03-07 | 1981-10-02 | Univ Osaka | Analytical method for peptide mixture using fd mass spectrometer |
| JPS6391564A (ja) * | 1986-10-06 | 1988-04-22 | Agency Of Ind Science & Technol | ペプチドのアミノ酸配列推定方法 |
| JPH01235600A (ja) * | 1988-03-15 | 1989-09-20 | Mitsubishi Kasei Corp | カルボキシル末端ペプチドの分取方法 |
| JPH0377854A (ja) * | 1989-08-18 | 1991-04-03 | Seiko Instr Inc | タンパク質あるいはペプチドを加水分解する装置 |
| JPH03160370A (ja) * | 1989-11-17 | 1991-07-10 | Seiko Instr Inc | タンパク質の加水分解方法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003081255A1 (fr) * | 2002-03-25 | 2003-10-02 | Nec Corporation | Procede d'analyse d'un peptide visant a determiner une sequence d'acides amines c-terminaux |
| US7384790B2 (en) | 2002-03-25 | 2008-06-10 | Nec Corporation | Method of analyzing peptide for determining C-terminal amino acid sequence |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2686505B2 (ja) | 1997-12-08 |
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