JPH01214752A - 光検出電気泳動装置 - Google Patents
光検出電気泳動装置Info
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- JPH01214752A JPH01214752A JP63039385A JP3938588A JPH01214752A JP H01214752 A JPH01214752 A JP H01214752A JP 63039385 A JP63039385 A JP 63039385A JP 3938588 A JP3938588 A JP 3938588A JP H01214752 A JPH01214752 A JP H01214752A
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
- G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はＤＮＡあるいはＲＮＡの塩基配列決定装置に係
り、特に測定時間の短縮に好適な光検出電気泳動装置に
関する。
り、特に測定時間の短縮に好適な光検出電気泳動装置に
関する。
従来、ＤＮＡなどの塩基配列決定はＤＮＡ断片を放射性
元素で標識し、長さに応じてゲル電気泳動分離したパタ
ーンをオートラジオグラフィーで写真に転写し、ＤＮＡ
バンドパターンを読み取ることによりなされていた。こ
れは手間と時間のかかる難点があった。そこで放射性標
識に代わり、蛍光標識を用いて、実時間でＤＮＡ断片を
分離検出して塩基配列を決定する手法が発展してきた。
元素で標識し、長さに応じてゲル電気泳動分離したパタ
ーンをオートラジオグラフィーで写真に転写し、ＤＮＡ
バンドパターンを読み取ることによりなされていた。こ
れは手間と時間のかかる難点があった。そこで放射性標
識に代わり、蛍光標識を用いて、実時間でＤＮＡ断片を
分離検出して塩基配列を決定する手法が発展してきた。
このような蛍光標識を用いた実時間検出法及びこれに用
いる光検出電気泳動装置については、例えば、ジャーナ
ル オブ バイオケミカル アンドバイオフィジカル
メソーズ、１３ （１９８６）３１５−３２３第３１５
頁〜第３２３頁（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ １３（１９８６）３１５−３２３ ｐ ３１５
〜ｐ ３２３）、あるいはホーチャー３２１，１２．６
月、１９８６．第６７４頁〜第６７９頁（Ｎａｔｕｒｅ
ＶｏＱ、３２１１２ Ｊｕｎｅ １９８６）に記載さ
れている。
いる光検出電気泳動装置については、例えば、ジャーナ
ル オブ バイオケミカル アンドバイオフィジカル
メソーズ、１３ （１９８６）３１５−３２３第３１５
頁〜第３２３頁（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ １３（１９８６）３１５−３２３ ｐ ３１５
〜ｐ ３２３）、あるいはホーチャー３２１，１２．６
月、１９８６．第６７４頁〜第６７９頁（Ｎａｔｕｒｅ
ＶｏＱ、３２１１２ Ｊｕｎｅ １９８６）に記載さ
れている。
上記従来技術では、泳動開始から測定終了までに５〜１
０時間もの長時間を要する難点があった。
０時間もの長時間を要する難点があった。
このような長時間泳動を必要とする原因はゲル電気泳動
現象の詳細が知られてない事、実時間検出法ではオート
ラジオグラムを目視してバンドを読み取る時の位置分解
能よりも光検出の位置分解能が悪く、長い泳動路を必要
とすること、それにもかかわらずオートラジオグラフィ
ーと同じような通常８％程度の高いアクリルアミド濃度
の泳動分離器で測定を行なっている事などによる。
現象の詳細が知られてない事、実時間検出法ではオート
ラジオグラムを目視してバンドを読み取る時の位置分解
能よりも光検出の位置分解能が悪く、長い泳動路を必要
とすること、それにもかかわらずオートラジオグラフィ
ーと同じような通常８％程度の高いアクリルアミド濃度
の泳動分離器で測定を行なっている事などによる。
本発明の課題はこの難点を解決し、短時間で測定を終了
しえる光検出電気泳動装置を提供することにある。
しえる光検出電気泳動装置を提供することにある。
そこで上記短時間計測という目的はゲル電気泳動の諸条
件を最適化することにより達成される。
件を最適化することにより達成される。
具体的には電気泳動分離器に用いるゲルのポリアクリル
アミド濃度を２〜６％とすることで達成される。
アミド濃度を２〜６％とすることで達成される。
塩基長ＮのＤＮＡ断片の泳動速度ｖ（Ｎ）を用いると泳
動路長Ｑを泳動するのに要する時間ｔはｔ＝ｎ／ｖ（Ｎ
） ・・・（１）と表示でき
る。ｖ（Ｎ）は電界強度に比例し、比例係数ｖ ｏ （
Ｎ 、 Ｃ、Ｔ ）は゛ＤＮＡ断片中の塩基数すなわち
塩基長Ｎ、アクリルアミドの濃度Ｃ１および温度Ｔの関
数である。
動路長Ｑを泳動するのに要する時間ｔはｔ＝ｎ／ｖ（Ｎ
） ・・・（１）と表示でき
る。ｖ（Ｎ）は電界強度に比例し、比例係数ｖ ｏ （
Ｎ 、 Ｃ、Ｔ ）は゛ＤＮＡ断片中の塩基数すなわち
塩基長Ｎ、アクリルアミドの濃度Ｃ１および温度Ｔの関
数である。
ｔ ＝ （１／ Ｅ−ｖｏ（Ｎ、Ｃ，Ｔ）
−（２）電界強度を高くするとｔは小さくできるが、
シュ挑 一ル轟が発生してゲル板の温度が高くなりＤＮＡバンド
の分離に支障をきたす。測定上支障のない電界強度およ
び温度下で、ＤＮＡバンドを識別すると共にｔをできる
だけ小さくするようなゲル濃度および泳動路長Ｑを選ぶ
事により短時間計測を実現できる。
−（２）電界強度を高くするとｔは小さくできるが、
シュ挑 一ル轟が発生してゲル板の温度が高くなりＤＮＡバンド
の分離に支障をきたす。測定上支障のない電界強度およ
び温度下で、ＤＮＡバンドを識別すると共にｔをできる
だけ小さくするようなゲル濃度および泳動路長Ｑを選ぶ
事により短時間計測を実現できる。
以下本発明の一実施例を第１〜５図を用いて説明する。
第１図は本発明による光検出電気泳動装置の一例である
。レーザー源３１から得た励起用レーザー１はレンズ２
を通して側面から電気泳動ゲル４に入る。電気泳動ゲル
は石英板３に保持されている。蛍光Ｓ識ＤＮＡなどの試
料３２は、例えばゲル４の上端部を泳動始点として泳動
分離されながらゲル４の下端部に向かって進んでゆく、
泳動始点から一定距離の所をレーザー１は照射し、そこ
を通過する蛍光標識ＤＮＡからの蛍光をフィルタ５付レ
ンズ６で集光し、イメージ増幅器７で増幅しリレーレン
ズ８を通した後ビジコンメラ９で検出する。得られた信
号は計算機１０で処理され出力される。レーザーを側面
から入れる代わりに前面から一定路上をスキャンして照
射してもよい。
。レーザー源３１から得た励起用レーザー１はレンズ２
を通して側面から電気泳動ゲル４に入る。電気泳動ゲル
は石英板３に保持されている。蛍光Ｓ識ＤＮＡなどの試
料３２は、例えばゲル４の上端部を泳動始点として泳動
分離されながらゲル４の下端部に向かって進んでゆく、
泳動始点から一定距離の所をレーザー１は照射し、そこ
を通過する蛍光標識ＤＮＡからの蛍光をフィルタ５付レ
ンズ６で集光し、イメージ増幅器７で増幅しリレーレン
ズ８を通した後ビジコンメラ９で検出する。得られた信
号は計算機１０で処理され出力される。レーザーを側面
から入れる代わりに前面から一定路上をスキャンして照
射してもよい。
泳動時間は式（２）かられかるように泳動始点からレー
ザ照射部までの距離ａ、ポリアクリルアミドゲルの濃度
Ｃ，ゲル板の上下両端に加える電気Ｖ（あるいはゲル中
での電界強度Ｅ）に依存する。
ザ照射部までの距離ａ、ポリアクリルアミドゲルの濃度
Ｃ，ゲル板の上下両端に加える電気Ｖ（あるいはゲル中
での電界強度Ｅ）に依存する。
第２図は種々のゲル濃度におけるＤＮＡ断片の泳動時間
ｔを示したものである。泳動速度が電界強度Ｅに比例す
る事および図から ｔ ＝（ｆ （Ｃｅ Ｔ ） Ｎ ＋ ｇ （Ｔ ））
・・・（３）と表示できる。ここでｆ（
Ｃ：、Ｔ）およびｇ（Ｔ）はポリアクリルアミド濃度Ｃ
および温度Ｔの関数である。塩基長を零に漸近した時の
泳動時間ｔｏは式（３）のρ・ｇ（Ｔ）／Ｅｏと等しく
、′ａ度Ｃによらない。
ｔを示したものである。泳動速度が電界強度Ｅに比例す
る事および図から ｔ ＝（ｆ （Ｃｅ Ｔ ） Ｎ ＋ ｇ （Ｔ ））
・・・（３）と表示できる。ここでｆ（
Ｃ：、Ｔ）およびｇ（Ｔ）はポリアクリルアミド濃度Ｃ
および温度Ｔの関数である。塩基長を零に漸近した時の
泳動時間ｔｏは式（３）のρ・ｇ（Ｔ）／Ｅｏと等しく
、′ａ度Ｃによらない。
式（１）および（３）からｖ（Ｎ）は
と表示できる。
時間ｔだけ泳動した時の臨接したバンドの間隔ｄは
ｄ ＝（ｖ（Ｎ）−ｖ（Ｎ＋ １））ｔ＝Ｑ／（Ｎ＋ｇ
（Ｔ）／ｆ、（Ｃ，Ｔ）） ・・・（５）とな
る。この式からバンド間隔ｄは塩基長Ｎの値が大きい時
、ポリアクリルアミドゲル濃度Ｃにあまり依存せず、Ｑ
／Ｎに近くなる事がわかる。
（Ｔ）／ｆ、（Ｃ，Ｔ）） ・・・（５）とな
る。この式からバンド間隔ｄは塩基長Ｎの値が大きい時
、ポリアクリルアミドゲル濃度Ｃにあまり依存せず、Ｑ
／Ｎに近くなる事がわかる。
第３図は実測のバンド間隔の濃度依存性を種々の塩基長
について示したものである。泳動距離は２２のである。
について示したものである。泳動距離は２２のである。
塩基長が１００程度と短かい時にはゲル濃度Ｃを上げる
とバンド間隔ｄも大きくなるが、塩基長が３００あるい
は４００になってくるとゲル濃度Ｃが４％以上ではバン
ド間隔はほぼ一定になることがわかる。一方、ＤＮＡバ
ンド幅立はゲル濃度にほとんど依存せず、１丁にほぼ比
例する事が実験から確認できた。そこで、ω＝ωｏ（Ｎ
＋’ｒ）、−／”ｉ ・・・（６
）と表示することができる。
とバンド間隔ｄも大きくなるが、塩基長が３００あるい
は４００になってくるとゲル濃度Ｃが４％以上ではバン
ド間隔はほぼ一定になることがわかる。一方、ＤＮＡバ
ンド幅立はゲル濃度にほとんど依存せず、１丁にほぼ比
例する事が実験から確認できた。そこで、ω＝ωｏ（Ｎ
＋’ｒ）、−／”ｉ ・・・（６
）と表示することができる。
第４図は種々の塩基長の泳動時間のポリアクリルアミド
ゲル濃度依存性を示したものである。濃度Ｃのほぼ２乗
に比例して泳動時間が増加する事がわかる。温度を一定
にした時、泳動時間ｔは泳動路長Ｑとゲル濃度Ｃの１数
である。二つの臨接バンドを識別するには少なくともｄ
） （，１である必要がある。そこでｄ＝ωとおいて
、泳動時間ｔをゲル濃度だけの凶数にして、泳動時間ｔ
を最小にするゲル濃度を求めた。
ゲル濃度依存性を示したものである。濃度Ｃのほぼ２乗
に比例して泳動時間が増加する事がわかる。温度を一定
にした時、泳動時間ｔは泳動路長Ｑとゲル濃度Ｃの１数
である。二つの臨接バンドを識別するには少なくともｄ
） （，１である必要がある。そこでｄ＝ωとおいて
、泳動時間ｔをゲル濃度だけの凶数にして、泳動時間ｔ
を最小にするゲル濃度を求めた。
ｄ＝≠および（６）式から
Ｑ＝ｃ、＋ｏ２（Ｎ、Ｔ）（Ｎ＋ｇ（Ｔ）／ｆ（Ｃ，Ｔ
））２−（７）とＱを求め（３）式に代入して（８）を
得る。
））２−（７）とＱを求め（３）式に代入して（８）を
得る。
を極小とするＣ値が求めるゲル濃度である。
ｄｔ ωｏ”（Ｎ、Ｔ） ３（ｆ（Ｃ９Ｔ）Ｎ＋ｇ（Ｔ
））”ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ”−２（ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ｇ（Ｔ
））δｄＣＥ
ｆ（Ｃ，Ｔ）番Ｃ より、ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＝２ ｇ（Ｔ）を得る。
））”ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ”−２（ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ｇ（Ｔ
））δｄＣＥ
ｆ（Ｃ，Ｔ）番Ｃ より、ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＝２ ｇ（Ｔ）を得る。
すなわち第４図上で
となるゲル濃度Ｃがｔを最小とするもので塩基長が１０
０，２００，３００および４ｏＯの時それぞれ６．２％
、４．３％、３．２％および２．６％である。実際の分
析では２００〜３００塩基長の分析をする事が多い。
０，２００，３００および４ｏＯの時それぞれ６．２％
、４．３％、３．２％および２．６％である。実際の分
析では２００〜３００塩基長の分析をする事が多い。
分離に必要なゲル泳動路長Ｑは式（７）にｆ （Ｃ，Ｔ
）＝ ２ ｇ （Ｔ）を代入して求める事ができる。
）＝ ２ ｇ （Ｔ）を代入して求める事ができる。
Ｑ ＝−Ｎ２ωｏ２（Ｃ，Ｔ）
・＝（１０）ωｏ （Ｃ、Ｔ ）は式（６）より泳
動路長ＱＯの時のバンド幅の実測値ωＯｂｓからωｏ
ｂ ｓ ／ ／／’；πにより求める事ができる。
・＝（１０）ωｏ （Ｃ、Ｔ ）は式（６）より泳
動路長ＱＯの時のバンド幅の実測値ωＯｂｓからωｏ
ｂ ｓ ／ ／／’；πにより求める事ができる。
ゲル板の厚さを０．３＋＋ｍ とし、電界強度５０Ｖ／
ａｎの時に泳動時間を最小とするポリアクリルアミド濃
度Ｃと泳動路長Ｑおよびその時の泳動時間を表１に示し
た。
ａｎの時に泳動時間を最小とするポリアクリルアミド濃
度Ｃと泳動路長Ｑおよびその時の泳動時間を表１に示し
た。
表１．塩基長、アルリルアミド濃度、泳動路長、泳動時
間の関係ここで表示した値は１つの目安であり、泳′Ｉ
ｊＪ電圧、泳動ゲルの温度、ゲルの厚さなどで若干変化
する。しかし、高速泳動の実現にはポリアクリルアミド
濃度が２〜６％と従来よりもずっと低い領域が優れてい
ることがわかる。
間の関係ここで表示した値は１つの目安であり、泳′Ｉ
ｊＪ電圧、泳動ゲルの温度、ゲルの厚さなどで若干変化
する。しかし、高速泳動の実現にはポリアクリルアミド
濃度が２〜６％と従来よりもずっと低い領域が優れてい
ることがわかる。
ここで得た条件下では約１．５時間で３００塩基までの
計測を行なうことができる。
計測を行なうことができる。
第５図に３％ゲルを用いて泳動路長２２ａ１１で測定し
た結果を示す、泳動路長が２８ｃｍよりも短いので分離
は十分でないが、３００塩基近傍の塩基が識別できる事
がわかる。３００塩基長のＤＮＡ断片の泳動時間は７７
分であった。
た結果を示す、泳動路長が２８ｃｍよりも短いので分離
は十分でないが、３００塩基近傍の塩基が識別できる事
がわかる。３００塩基長のＤＮＡ断片の泳動時間は７７
分であった。
本発明によれば従来５〜１０時間を必要としていたＤＮ
Ａ断片の測定が１時間余で行なう事ができ、光検出電気
泳動装置の測定に必要な時間を飛羅的に短縮できるとい
う効果がある。
Ａ断片の測定が１時間余で行なう事ができ、光検出電気
泳動装置の測定に必要な時間を飛羅的に短縮できるとい
う効果がある。
また、蛍光計測ではゲルからの散乱光や蛍光が背景光と
なり検出下限を決めているが、低いゲル濃度ではこれら
も低下するので高感度検出ができる利点もある。
なり検出下限を決めているが、低いゲル濃度ではこれら
も低下するので高感度検出ができる利点もある。
第１図は本願発明による光検出器気泳動装置の１実施例
の概念図、第２図は種々ポリアクリルアミドゲル濃度に
おける塩基長と泳動時間の関係を示すグラフ、第３図は
種々塩基長のバンド間隔のゲル濃度依存性を表わすグラ
フ、第４図は各塩基長の泳動時間のゲル濃度依存性を示
すグラフ、第５図は３％ポリアクリルアミドゲル（泳動
路長２２１）を用いて得たＤＮＡ断片スペクトルを表わ
すグラフである。 １・・・レーザ、２・・・レンズ、３・・・石英板、４
・・・ゲル板、５・・・フィルター、６・・・結像レン
ズ、７・・・イメージ増幅器、８・・・リレーレンズ、
９・・・ビジコンカメラ、１０・・・計算機、１１〜１
６・・・それぞれ２％。 ３％、４％、５％、６％、８％ポリアクリルアミドゲル
を用いた時の泳動時間と塩基長の関係。 １７〜２０・・・１００，２００，３００および４００
塩基のＤＮＡ断片のバンド間隔あるいは泳動時間のゲル
濃度による変化、１６・・・末端ガグアニン（Ｇ）で終
わる断片群のスペクトル、１７・・・末端ガチミン（Ｔ
）で終わる断片群のスペクトル。 第 １ 図 ’Ｉ’ｌｌ 図 ／１／ＤＯ腿ＤＮＡ断乃 ／３２０θ ″ ／９３００ Ｉｌ ２θ４θθ 〜 ′￥１４ 図
の概念図、第２図は種々ポリアクリルアミドゲル濃度に
おける塩基長と泳動時間の関係を示すグラフ、第３図は
種々塩基長のバンド間隔のゲル濃度依存性を表わすグラ
フ、第４図は各塩基長の泳動時間のゲル濃度依存性を示
すグラフ、第５図は３％ポリアクリルアミドゲル（泳動
路長２２１）を用いて得たＤＮＡ断片スペクトルを表わ
すグラフである。 １・・・レーザ、２・・・レンズ、３・・・石英板、４
・・・ゲル板、５・・・フィルター、６・・・結像レン
ズ、７・・・イメージ増幅器、８・・・リレーレンズ、
９・・・ビジコンカメラ、１０・・・計算機、１１〜１
６・・・それぞれ２％。 ３％、４％、５％、６％、８％ポリアクリルアミドゲル
を用いた時の泳動時間と塩基長の関係。 １７〜２０・・・１００，２００，３００および４００
塩基のＤＮＡ断片のバンド間隔あるいは泳動時間のゲル
濃度による変化、１６・・・末端ガグアニン（Ｇ）で終
わる断片群のスペクトル、１７・・・末端ガチミン（Ｔ
）で終わる断片群のスペクトル。 第 １ 図 ’Ｉ’ｌｌ 図 ／１／ＤＯ腿ＤＮＡ断乃 ／３２０θ ″ ／９３００ Ｉｌ ２θ４θθ 〜 ′￥１４ 図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、蛍光標識した試料を電気泳動分離する電気泳動分離
器と、上記試料を励起させるための励起光源と、励起さ
れた上記試料から生ずる蛍光を検出する検出手段とを有
し、上記試料の塩基配列を決定する光検出電気泳動装置
において、電気泳動分離器にポリアクリルアミド濃度が
２〜６％のゲル板を用いた事を特徴とする光検出電気泳
動装置。 ２、上記試料はＤＭＡあるいはＲＮＡであることを特徴
とする請求項１記載の光検出電気泳動装置。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63039385A JP2804038B2 (ja) | 1988-02-24 | 1988-02-24 | 塩基配列決定方法 |
| US07/310,645 US4971677A (en) | 1988-02-24 | 1989-02-15 | Fluorescence detection type electrophoresis apparatus |
| DE68923193T DE68923193T2 (de) | 1988-02-24 | 1989-02-20 | Elektroforesevorrichtung mit Fluoreszenz-Messung. |
| EP89102908A EP0330120B1 (en) | 1988-02-24 | 1989-02-20 | Fluorescence detection type electrophoresis apparatus |
| CN89101129A CN1019860B (zh) | 1988-02-24 | 1989-02-23 | 荧光检测型电泳装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63039385A JP2804038B2 (ja) | 1988-02-24 | 1988-02-24 | 塩基配列決定方法 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9009164A Division JP2914333B2 (ja) | 1997-01-22 | 1997-01-22 | 塩基配列決定方法 |
| JP9130668A Division JP2853706B2 (ja) | 1997-05-21 | 1997-05-21 | 塩基配列決定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01214752A true JPH01214752A (ja) | 1989-08-29 |
| JP2804038B2 JP2804038B2 (ja) | 1998-09-24 |
Family
ID=12551541
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63039385A Expired - Fee Related JP2804038B2 (ja) | 1988-02-24 | 1988-02-24 | 塩基配列決定方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4971677A (ja) |
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