JP2853706B2 - 塩基配列決定方法 - Google Patents
塩基配列決定方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡあるいはＲＮＡの
塩基配列決定方法及び塩基配列決定装置に係わり、特に
測定時間の短縮に好適な方法及び装置に関する。
塩基配列決定方法及び塩基配列決定装置に係わり、特に
測定時間の短縮に好適な方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、ＤＮＡなどの塩基配列決定はＤＮ
Ａ断片を放射性元素で標識し、長さに応じてゲル電気泳
動分離したパターンをオートラジオグラフイーで写真に
転写し、ＤＮＡバンドパターンを読み取ることによりな
されていた。これは手間と時間のかかる難点があった。
そこで放射性標識に代わり、蛍光標識を用いて、実時間
でＤＮＡ断片を分離検出して塩基配列を決定する手法が
発展してきた。このような蛍光標識を用いた実時間検出
法及びこれに用いる光検出型電気泳動装置については、
例えば、ジャーナル オブ バイオケミカル アンド
バイオフイジカルメソーズ １３（１９８６）３１５−
３２３（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ
１３（１９８６）３１５−３２３）、あるいはネーチ
ャー ３２１，１２，６月，１９８６，第６７４頁−第
６７９頁（Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．３２１ １２ Ｊｕ
ｎｅ １９８６）に記載されている。
Ａ断片を放射性元素で標識し、長さに応じてゲル電気泳
動分離したパターンをオートラジオグラフイーで写真に
転写し、ＤＮＡバンドパターンを読み取ることによりな
されていた。これは手間と時間のかかる難点があった。
そこで放射性標識に代わり、蛍光標識を用いて、実時間
でＤＮＡ断片を分離検出して塩基配列を決定する手法が
発展してきた。このような蛍光標識を用いた実時間検出
法及びこれに用いる光検出型電気泳動装置については、
例えば、ジャーナル オブ バイオケミカル アンド
バイオフイジカルメソーズ １３（１９８６）３１５−
３２３（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ
１３（１９８６）３１５−３２３）、あるいはネーチ
ャー ３２１，１２，６月，１９８６，第６７４頁−第
６７９頁（Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．３２１ １２ Ｊｕ
ｎｅ １９８６）に記載されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記従来技術では、泳
動開始から測定終了までに５〜１０時間もの長時間を要
する難点があった。このような長時間泳動を必要とする
原因はゲル電気泳動現象の詳細が知られていないこと、
実時間検出法ではオートラジオグラムを目視してバンド
を読み取る時の位置分解能よりも光検出の位置分解能が
悪く、長い泳動路を必要とすること、それにもかかわら
ずオートラジオグラフイーと同じような通常８％程度の
高いアクリルアミド濃度の泳動分離器で測定を行なって
いることなどによる。本発明の課題はこの難点を解決
し、短時間で測定を終了しえるＤＮＡあるいはＲＮＡの
塩基配列決定方法及び装置を提供することにある。
動開始から測定終了までに５〜１０時間もの長時間を要
する難点があった。このような長時間泳動を必要とする
原因はゲル電気泳動現象の詳細が知られていないこと、
実時間検出法ではオートラジオグラムを目視してバンド
を読み取る時の位置分解能よりも光検出の位置分解能が
悪く、長い泳動路を必要とすること、それにもかかわら
ずオートラジオグラフイーと同じような通常８％程度の
高いアクリルアミド濃度の泳動分離器で測定を行なって
いることなどによる。本発明の課題はこの難点を解決
し、短時間で測定を終了しえるＤＮＡあるいはＲＮＡの
塩基配列決定方法及び装置を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】そこで上記短時間計測と
いう目的は、ゲル電気泳動の諸条件を最適化することに
より達成される。具体的には、電気泳動分離器に用いる
ゲルのポリアクリルアミド濃度Ｃを２％〜６％とするこ
とで達成される。より詳細には、測定上支障のない電界
強度及び温度Ｔの下で、隣接するＤＮＡバンドを識別す
ると共に泳動に要する時間ｔをできるだけ小さくするよ
うなゲル濃度Ｃ、及び泳動開始点からレーザ照射部まで
の泳動距離（泳動路長）Ｌを選ぶ。
いう目的は、ゲル電気泳動の諸条件を最適化することに
より達成される。具体的には、電気泳動分離器に用いる
ゲルのポリアクリルアミド濃度Ｃを２％〜６％とするこ
とで達成される。より詳細には、測定上支障のない電界
強度及び温度Ｔの下で、隣接するＤＮＡバンドを識別す
ると共に泳動に要する時間ｔをできるだけ小さくするよ
うなゲル濃度Ｃ、及び泳動開始点からレーザ照射部まで
の泳動距離（泳動路長）Ｌを選ぶ。
【０００５】
【作用】塩基長ＮのＤＮＡ断片の泳動速度Ｖ（Ｎ）を用
いると泳動路長Ｌを泳動するに要する時間ｔは（数１）
と表示できる。
いると泳動路長Ｌを泳動するに要する時間ｔは（数１）
と表示できる。
【０００６】
【数１】 ｔ＝Ｌ／Ｖ（Ｎ） …（数１） Ｖ（Ｎ）はゲル中の電界強度Ｅに比例し、Ｖ（Ｎ）＝Ｅ
・Ｖ0（Ｎ，Ｃ，Ｔ）と表され、比例係数Ｖ0（Ｎ，Ｃ，
Ｔ）は、ＤＮＡ断片の塩基数即ち塩基長Ｎ、ポリアクリ
ルアミドの濃度Ｃ、及び温度Ｔの関数である。
・Ｖ0（Ｎ，Ｃ，Ｔ）と表され、比例係数Ｖ0（Ｎ，Ｃ，
Ｔ）は、ＤＮＡ断片の塩基数即ち塩基長Ｎ、ポリアクリ
ルアミドの濃度Ｃ、及び温度Ｔの関数である。
【０００７】
【数２】 ｔ＝Ｌ／｛Ｅ・Ｖ0（Ｎ，Ｃ，Ｔ）｝ …（数２） 電界強度Ｅを高くすると泳動に要する時間ｔは小さくで
きるが、ジュール熱が発生してゲル板の温度Ｔが高くな
りＤＮＡバンドの分離に支障をきたす。測定上支障のな
い電界強度Ｅ及び温度（Ｔ）の下で、ＤＮＡバンドを識
別すると共に泳動に要する時間ｔをできるだけ小さくす
るようなゲル濃度Ｃ及び泳動路長Ｌを選ぶことにより短
時間計測を実現できる。
きるが、ジュール熱が発生してゲル板の温度Ｔが高くな
りＤＮＡバンドの分離に支障をきたす。測定上支障のな
い電界強度Ｅ及び温度（Ｔ）の下で、ＤＮＡバンドを識
別すると共に泳動に要する時間ｔをできるだけ小さくす
るようなゲル濃度Ｃ及び泳動路長Ｌを選ぶことにより短
時間計測を実現できる。
【０００８】
【実施例】以下、本発明の一実施例を図１〜図５を用い
て説明する。図１は本発明による光検出型電気泳動装置
の一例である。レーザー源３１から得た励起用レーザー
１はレンズ２を通して側面から電気泳動ゲル４に入る。
電気泳動ゲル４は石英板３に保持されている。蛍光標識
ＤＮＡなどの試料３２は、例えばゲル４の上端部を泳動
開始点として泳動分離されながらゲル４の下端部に向か
つて進んでゆく。泳動開始点から一定距離の所をレーザ
ー１は照射し、そこを通過する蛍光標識ＤＮＡからの蛍
光をフイルタ５付きレンズ６で集光し、イメージ増幅器
７で増幅しリレーレンズ８を通した後ビジコンカメラ９
で検出する。得られた信号は計算機１０で処理され出力
される。レーザーを側面から入れる代わりに前面から一
定路上をスキャンして照射してもよい。泳動時間は（数
２）からわかるように泳動開始点からレーザ照射部まで
の距離（泳動距離）Ｌ、ポリアクリルアミドゲルの濃度
Ｃ、ゲル板の上下両端に加える電圧ｖ（あるいはゲル中
での電界強度Ｅ）に依存する。
て説明する。図１は本発明による光検出型電気泳動装置
の一例である。レーザー源３１から得た励起用レーザー
１はレンズ２を通して側面から電気泳動ゲル４に入る。
電気泳動ゲル４は石英板３に保持されている。蛍光標識
ＤＮＡなどの試料３２は、例えばゲル４の上端部を泳動
開始点として泳動分離されながらゲル４の下端部に向か
つて進んでゆく。泳動開始点から一定距離の所をレーザ
ー１は照射し、そこを通過する蛍光標識ＤＮＡからの蛍
光をフイルタ５付きレンズ６で集光し、イメージ増幅器
７で増幅しリレーレンズ８を通した後ビジコンカメラ９
で検出する。得られた信号は計算機１０で処理され出力
される。レーザーを側面から入れる代わりに前面から一
定路上をスキャンして照射してもよい。泳動時間は（数
２）からわかるように泳動開始点からレーザ照射部まで
の距離（泳動距離）Ｌ、ポリアクリルアミドゲルの濃度
Ｃ、ゲル板の上下両端に加える電圧ｖ（あるいはゲル中
での電界強度Ｅ）に依存する。
【０００９】図２は種々のゲル濃度ＣにおけるＤＮＡ断
片の泳動時間ｔを示したものである。ＤＮＡ断片の泳動
時間ｔは、泳動速度Ｖ（Ｎ）が電界強度Ｅに比例するこ
と及び図２から（数２）と表示できる。なお、Ｖ
0（Ｎ，Ｃ，Ｔ）＝ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ｇ（Ｔ）である。
片の泳動時間ｔを示したものである。ＤＮＡ断片の泳動
時間ｔは、泳動速度Ｖ（Ｎ）が電界強度Ｅに比例するこ
と及び図２から（数２）と表示できる。なお、Ｖ
0（Ｎ，Ｃ，Ｔ）＝ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ｇ（Ｔ）である。
【００１０】
【数３】 ｔ＝（Ｌ／Ｅ）｛ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ｇ（Ｔ）｝ …（数３） 即ち、泳動時間ｔは、泳動距離Ｌ、ゲル中での電解強度
Ｅの逆数（１／Ｅ）に比例する。ここで、ｆ（Ｃ，Ｔ）
及びｇ（Ｔ）はポリアクリルアミドの濃度Ｃ、及び温度
Ｔの関数である。塩基長Ｎを零に漸近した時の泳動時間
ｔ0は（数３）のＬ・ｇ（Ｔ）／Ｅに等しく、ｔ0＝Ｌ・
ｇ（Ｔ）／Ｅであり、ｔ0はＬに比例し、ｇ（Ｔ）、Ｅ
に依存するが、濃度Ｃによらない（（数３）はこのｔ0
を用いて、ｔ＝（Ｌ／Ｅ）ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ｔ0とな
る）。図２からｔ0≒２７分である。
Ｅの逆数（１／Ｅ）に比例する。ここで、ｆ（Ｃ，Ｔ）
及びｇ（Ｔ）はポリアクリルアミドの濃度Ｃ、及び温度
Ｔの関数である。塩基長Ｎを零に漸近した時の泳動時間
ｔ0は（数３）のＬ・ｇ（Ｔ）／Ｅに等しく、ｔ0＝Ｌ・
ｇ（Ｔ）／Ｅであり、ｔ0はＬに比例し、ｇ（Ｔ）、Ｅ
に依存するが、濃度Ｃによらない（（数３）はこのｔ0
を用いて、ｔ＝（Ｌ／Ｅ）ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ｔ0とな
る）。図２からｔ0≒２７分である。
【００１１】（数１）及び（数３）からＶ（Ｎ）は（数
４）と表示できる。
４）と表示できる。
【００１２】
【数４】 Ｖ（Ｎ）＝Ｅ／｛ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ｇ（Ｔ）｝ …（数４） 時間ｔだけ泳動した時の隣接したバンドの間隔ｄは（数
５）となる。
５）となる。
【００１３】
【数５】 ｄ＝｛Ｖ（Ｎ）−Ｖ（Ｎ＋１）｝ｔ ＝Ｌ／｛Ｎ＋（ｇ（Ｔ）／ｆ（Ｃ，Ｔ））｝ …（数５） この（数５）からバンド間隔ｄは塩基長Ｎの値が大きい
時、ポリアクリルアミドの濃度Ｃにあまり依存せず、Ｌ
／Ｎに近くなることがわかる。例えば、Ｌ＝２２０ｍｍ
とする時、Ｎ＝１００、２００、３００、４００塩基に
対して、Ｌ／Ｎ＝２．２、１．１、０．７３、０．５５
となる。
時、ポリアクリルアミドの濃度Ｃにあまり依存せず、Ｌ
／Ｎに近くなることがわかる。例えば、Ｌ＝２２０ｍｍ
とする時、Ｎ＝１００、２００、３００、４００塩基に
対して、Ｌ／Ｎ＝２．２、１．１、０．７３、０．５５
となる。
【００１４】図３は実測のバンド間隔の濃度依存性を種
々の塩基長Ｎについて示したものである。泳動距離は２
２ｃｍである。塩基長Ｎが１００程度と短い時にはゲル
濃度Ｃを上げるとバンド間隔ｄも大きくなるが、塩基長
Ｎが２００以上、とくに３００あるいは４００になって
くるとゲル濃度Ｃ、６％ではバンド間隔はほぼ一定にな
り、６％以上のゲルの使用は単に泳動時間の増大を招く
だけであることがわかる。一方、ＤＮＡバンド幅ωはゲ
ル濃度Ｃにほとんど依存せず、√Ｌにほぼ比例すること
が実験から確認できた。そこで、ωは（数６）で表わす
ことができる。
々の塩基長Ｎについて示したものである。泳動距離は２
２ｃｍである。塩基長Ｎが１００程度と短い時にはゲル
濃度Ｃを上げるとバンド間隔ｄも大きくなるが、塩基長
Ｎが２００以上、とくに３００あるいは４００になって
くるとゲル濃度Ｃ、６％ではバンド間隔はほぼ一定にな
り、６％以上のゲルの使用は単に泳動時間の増大を招く
だけであることがわかる。一方、ＤＮＡバンド幅ωはゲ
ル濃度Ｃにほとんど依存せず、√Ｌにほぼ比例すること
が実験から確認できた。そこで、ωは（数６）で表わす
ことができる。
【００１５】
【数６】 ω＝ω0（Ｎ，Ｔ）√Ｌ …（数６） 図４は種々の塩基長Ｎの泳動時間のポリアクリルアミド
ゲル濃度依存性を示したものである（図２では塩基長Ｎ
に対する泳動時間ｔの変化を示したが、図２を書きかた
図４は、ポアクリルアミド濃度Ｃに対する泳動時間ｔの
変化を示し、濃度Ｃを零に漸近した時の泳動時間は図２
に示すｔ0であり、濃度Ｃによらない）。濃度Ｃのほぼ
２乗に比例して泳動時間が増大することがわかる。温度
Ｔを一定にした時、泳動時間ｔは泳動路長Ｌとゲル濃度
Ｃの函数である。二つの隣接バンドを識別するには少な
くともｄ≧ωである必要がある。そこでｄ＝ωとおい
て、泳動時間ｔをゲル濃度Ｃだけの函数にして、泳動時
間ｔを最小にするゲル濃度Ｃを求めた。ｄ＝ω、（数
５）、（数６）から（数７）のようにＬを求め、（数
３）に代入して（数８）を得る。
ゲル濃度依存性を示したものである（図２では塩基長Ｎ
に対する泳動時間ｔの変化を示したが、図２を書きかた
図４は、ポアクリルアミド濃度Ｃに対する泳動時間ｔの
変化を示し、濃度Ｃを零に漸近した時の泳動時間は図２
に示すｔ0であり、濃度Ｃによらない）。濃度Ｃのほぼ
２乗に比例して泳動時間が増大することがわかる。温度
Ｔを一定にした時、泳動時間ｔは泳動路長Ｌとゲル濃度
Ｃの函数である。二つの隣接バンドを識別するには少な
くともｄ≧ωである必要がある。そこでｄ＝ωとおい
て、泳動時間ｔをゲル濃度Ｃだけの函数にして、泳動時
間ｔを最小にするゲル濃度Ｃを求めた。ｄ＝ω、（数
５）、（数６）から（数７）のようにＬを求め、（数
３）に代入して（数８）を得る。
【００１６】
【数７】 Ｌ＝ω0 2（Ｎ，Ｔ）｛Ｎ＋（ｇ（Ｔ）／ｆ（Ｃ，Ｔ））｝2 …（数７）
【００１７】
【数８】 ｔ＝ω0 2（Ｎ，Ｔ）｛ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ｇ（Ｔ）｝3／｛Ｅｆ2（Ｃ，Ｔ）｝ …（数８） （数８）を用い（ｄｔ／ｄＣ）＝０からＣを変化させた
時にｔを極小とするＣ値が求めるゲル濃度である。
時にｔを極小とするＣ値が求めるゲル濃度である。
【００１８】
【数９】 （ｄｔ／ｄＣ）＝｛ω0 2（Ｎ，Ｔ）／（Ｅｆ4（Ｃ，Ｔ））｝× ｛３（ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ｇ（Ｔ））2ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ−２（ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ ｇ（Ｔ））3｝ｆ（Ｃ，Ｔ）｛ｄｆ（Ｃ，Ｔ）／ｄＣ｝＝０ …（数９） （数９）より、ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＝２ｇ（Ｔ）を得る。即
ち図４上で （ｔ−ｔ0）＝（Ｌ／Ｅ）ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＝（Ｌ／Ｅ）２ｇ（Ｔ）＝２ｔ0 となるゲル濃度Ｃがｔを最小にするもので、塩基長Ｎが
１００、２００、３００及び４００の時、それぞれ６．
２％、４．３％、３．２％及び２．６％である。なお、
ｔの最小値ｔminは、（数３）のｔ＝（Ｌ／Ｅ）｛ｆ
（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ｇ（Ｔ）｝にｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＝２ｇ
（Ｔ）を代入して、ｔ＝（Ｌ／Ｅ）｛３ｇ（Ｔ）｝を得
て、さらにｔ0＝Ｌ・ｇ（Ｔ）／Ｅを用いると、ｔmin＝
３ｔ0≒３×２７＝８１（分）となり、図４においてｔ
minに対応する濃度Ｃを読み取れば上記のｔを最小にす
るゲル濃度Ｃとなる。実際の分析では２００〜３００塩
基長の分析をすることが多い。二つの隣接バンドを識別
して分離に必要なゲル泳動路長Ｌ（＝Ｌ*）は、（数
７）にｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＝２ｇ（Ｔ）を代入して求めるこ
とができる。
ち図４上で （ｔ−ｔ0）＝（Ｌ／Ｅ）ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＝（Ｌ／Ｅ）２ｇ（Ｔ）＝２ｔ0 となるゲル濃度Ｃがｔを最小にするもので、塩基長Ｎが
１００、２００、３００及び４００の時、それぞれ６．
２％、４．３％、３．２％及び２．６％である。なお、
ｔの最小値ｔminは、（数３）のｔ＝（Ｌ／Ｅ）｛ｆ
（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ｇ（Ｔ）｝にｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＝２ｇ
（Ｔ）を代入して、ｔ＝（Ｌ／Ｅ）｛３ｇ（Ｔ）｝を得
て、さらにｔ0＝Ｌ・ｇ（Ｔ）／Ｅを用いると、ｔmin＝
３ｔ0≒３×２７＝８１（分）となり、図４においてｔ
minに対応する濃度Ｃを読み取れば上記のｔを最小にす
るゲル濃度Ｃとなる。実際の分析では２００〜３００塩
基長の分析をすることが多い。二つの隣接バンドを識別
して分離に必要なゲル泳動路長Ｌ（＝Ｌ*）は、（数
７）にｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＝２ｇ（Ｔ）を代入して求めるこ
とができる。
【００１９】
【数１０】 Ｌ*＝（９／４）Ｎ2ω0 2（Ｎ，Ｔ） …（数１０） ω0（Ｎ，Ｔ）は、（数６）より泳動路長Ｌ0の時のバン
ド幅の実測値ωobsからωobs／√Ｌ0により求めること
ができ、Ｌ*＝（９／４）Ｎ2ωobs 2／Ｌ0となる。ゲル
板厚さを０．３ｍｍとし、電界強度５０Ｖ／ｃｍの時に
泳動時間を最小とするポリアクリルアミド濃度Ｃと泳動
路長Ｌ（＝Ｌ*）及びその時の泳動時間（ｔ）を、以下
に、｛塩基長Ｎ：ポリアクリルアミド濃度Ｃ（％）：泳
動路長Ｌ（＝Ｌ*）（ｃｍ）：泳動時間ｔ（分）｝とし
て示す。図２（図４）の結果を得たときの泳動路長を
Ｌ’とするとき、ｔ0＝Ｌ’・ｇ（Ｔ）／Ｅ≒２７分で
あるから、ｇ（Ｔ）／Ｅ＝２７／Ｌ’となり、ｔ0が
Ｌ’に比例するから、泳動路長Ｌ*を泳動するに要する
泳動時間３ｔ0は、３ｔ0＝（８１／Ｌ’）Ｌ*から得ら
れる（なお、以下の結果を与えるＬ’は約２２ｃｍであ
る）。
ド幅の実測値ωobsからωobs／√Ｌ0により求めること
ができ、Ｌ*＝（９／４）Ｎ2ωobs 2／Ｌ0となる。ゲル
板厚さを０．３ｍｍとし、電界強度５０Ｖ／ｃｍの時に
泳動時間を最小とするポリアクリルアミド濃度Ｃと泳動
路長Ｌ（＝Ｌ*）及びその時の泳動時間（ｔ）を、以下
に、｛塩基長Ｎ：ポリアクリルアミド濃度Ｃ（％）：泳
動路長Ｌ（＝Ｌ*）（ｃｍ）：泳動時間ｔ（分）｝とし
て示す。図２（図４）の結果を得たときの泳動路長を
Ｌ’とするとき、ｔ0＝Ｌ’・ｇ（Ｔ）／Ｅ≒２７分で
あるから、ｇ（Ｔ）／Ｅ＝２７／Ｌ’となり、ｔ0が
Ｌ’に比例するから、泳動路長Ｌ*を泳動するに要する
泳動時間３ｔ0は、３ｔ0＝（８１／Ｌ’）Ｌ*から得ら
れる（なお、以下の結果を与えるＬ’は約２２ｃｍであ
る）。
【００２０】 ｛Ｎ＝１００：Ｃ＝６．２％：Ｌ*＝ ６ｃｍ：ｔ＝ ２２分｝ ｛Ｎ＝２００：Ｃ＝４．３％：Ｌ*＝１５ｃｍ：ｔ＝ ５６分｝ ｛Ｎ＝３００：Ｃ＝３．２％：Ｌ*＝２８ｃｍ：ｔ＝１０６分｝ ｛Ｎ＝４００：Ｃ＝２．６％：Ｌ*＝４１ｃｍ：ｔ＝１５６分｝ ここで示した値は１つの目安であり、泳動電圧、泳動ゲ
ルの濃度、ゲルの厚さなどで若干変化する。しかし、長
い塩基長のＤＮＡ断片を含む試料を、少なくともｄ≧ω
として、二つの隣接バンドを識別する好適なバンド間隔
で高速に電気泳動分離するには、ポリアクリルアミド濃
度が２％〜６％のゲルの使用が好適であることがわか
る。この濃度範囲は、従来使用されていた濃度よりはは
るかに低い濃度である。
ルの濃度、ゲルの厚さなどで若干変化する。しかし、長
い塩基長のＤＮＡ断片を含む試料を、少なくともｄ≧ω
として、二つの隣接バンドを識別する好適なバンド間隔
で高速に電気泳動分離するには、ポリアクリルアミド濃
度が２％〜６％のゲルの使用が好適であることがわか
る。この濃度範囲は、従来使用されていた濃度よりはは
るかに低い濃度である。
【００２１】ここで得た条件は約１．５時間で３００塩
基までの計測を行なうことができる。 図５には３％ゲ
ルを用いて泳動路長２２ｃｍで測定した結果を示す。泳
動路長が２８ｃｍよりも短いので分離は十分ではない
が、３００塩基近傍の塩基が識別できることがわかる。
３００塩基長のＤＮＡ断片の泳動時間は７７分であっ
た。
基までの計測を行なうことができる。 図５には３％ゲ
ルを用いて泳動路長２２ｃｍで測定した結果を示す。泳
動路長が２８ｃｍよりも短いので分離は十分ではない
が、３００塩基近傍の塩基が識別できることがわかる。
３００塩基長のＤＮＡ断片の泳動時間は７７分であっ
た。
【００２２】
【発明の効果】本発明によれば従来５〜１０時間を必要
としていたＤＮＡ断片の測定が１時間余で行なうことが
でき、塩基配列決定に必要な時間を飛躍的に短縮できる
という効果がある。また、蛍光計測ではゲルからの散乱
光や蛍光が背景光となり検出下限を決めていたが、低い
ゲル濃度ではこれら背景光も低下するので高感度検出が
できる利点もある。
としていたＤＮＡ断片の測定が１時間余で行なうことが
でき、塩基配列決定に必要な時間を飛躍的に短縮できる
という効果がある。また、蛍光計測ではゲルからの散乱
光や蛍光が背景光となり検出下限を決めていたが、低い
ゲル濃度ではこれら背景光も低下するので高感度検出が
できる利点もある。
【図１】本発明による光検出型電気泳動装置の１実施例
の概念図。
の概念図。
【図２】本発明の実施例での種々のポリアクリルアミド
ゲル濃度における塩基長と泳動時間の関係を示す図。
ゲル濃度における塩基長と泳動時間の関係を示す図。
【図３】本発明の実施例での種々の塩基長のバンド間隔
のゲル濃度依存性を示す図。
のゲル濃度依存性を示す図。
【図４】本発明の実施例での各塩基長の泳動時間のゲル
濃度依存性を示す図。
濃度依存性を示す図。
【図５】本発明の実施例での３％ポリアクリルアミドゲ
ル（泳動路長２２ｃｍ）を用いて得たＤＮＡ断片スペク
トルを示す図。
ル（泳動路長２２ｃｍ）を用いて得たＤＮＡ断片スペク
トルを示す図。
１…レーザ、２…レンズ、３…石英板、４…ゲル板、５
…フイルター、６…結像レンズ、７…イメージ増幅器、
８…リレーレンズ、９…ビジコンカメラ、１０…計算
機、１１〜１６…それぞれ２％、３％、４％、５％、６
％、８％ポリアクリルアミドゲルを用いた時の泳動時間
と塩基長の関係、１７〜２０…１００、２００、３００
及び４００塩基のＤＮＡ断片のバンド間隔あるいは泳動
時間のゲル濃度による変化、１６…末端がグアニン
（Ｇ）で終わる断片群のスペクトル、１７’…末端がチ
ミン（Ｔ）で終わる断片群のスペクトル、３１…レーザ
ー源、３２…試料。
…フイルター、６…結像レンズ、７…イメージ増幅器、
８…リレーレンズ、９…ビジコンカメラ、１０…計算
機、１１〜１６…それぞれ２％、３％、４％、５％、６
％、８％ポリアクリルアミドゲルを用いた時の泳動時間
と塩基長の関係、１７〜２０…１００、２００、３００
及び４００塩基のＤＮＡ断片のバンド間隔あるいは泳動
時間のゲル濃度による変化、１６…末端がグアニン
（Ｇ）で終わる断片群のスペクトル、１７’…末端がチ
ミン（Ｔ）で終わる断片群のスペクトル、３１…レーザ
ー源、３２…試料。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−173158（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−21556（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−62843（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−263458（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−188763（ＪＰ，Ａ) 青木幸一郎、永井裕編集「最新電気泳 動法」廣川書店（昭和61年10月25日発 行）ｐ．378−386，ｐ．409 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 27/447
Claims (7)
- 【請求項１】核酸試料の蛍光標識された断片を泳動媒体
を用いて電気泳動し、前記泳動媒体の泳動開始点から所
定の距離にある光照射部にレーザ光を照射し、分離され
た前記断片の前記蛍光標識から発生した蛍光を検出して
前記断片のスペクトルを得て前記核酸試料の塩基配列を
決定する塩基配列決定方法であって、前記泳動媒体中の
ポリアクリルアミド濃度が２％から６％であり、前記塩
基配列を決定すべき塩基長に対応して前記ポリアクリル
アミド濃度及び前記所定の距離が決定され、前記塩基長
の長又は短に対応して前記ポリアクリルアミド濃度が低
又は高濃度に設定され、前記塩基長の長又は短に対応し
て前記所定の距離が長又は短距離に設定され、前記塩基
長が３００以下であることを特徴とする塩基配列決定方
法。 - 【請求項２】核酸試料の蛍光標識された断片を泳動媒体
を用いて電気泳動し、前記泳動媒体の泳動開始点から所
定の距離にある光照射部にレーザ光を照射し、分離され
た前記断片の前記蛍光標識から発生した蛍光を検出し、
前記核酸試料の塩基配列を決定する塩基配列決定方法で
あって、前記所定の距離がＬ 0 である時の前記断片の実
測のバンド幅をω obs 、前記塩基配列を決定すべき塩基
長をＮ’とする時、前記所定の距離がＬ’＝（３ω obs
Ｎ’／２） 2 ／Ｌ 0 に設定され、前記泳動媒体中のポリア
クリルアミド濃度が２％から６％の範囲にあり、前記塩
基長Ｎ’の長又は短に対応して前記ポリアクリルアミド
濃度Ｃが低又は高濃度に設定されることを特徴とする塩
基配列決定方法。 - 【請求項３】核酸試料の蛍光標識された断片を泳動媒体
を用いて電気泳動し、前記泳動媒体の泳動開始点から所
定の距離にある光照射部にレーザ光を照射し、分離され
た前記断片の前記蛍光標識から発生した蛍光を検出して
前記断片のスペクトルを得て前記核酸試料の塩基配列を
決定する塩基配列決定方法であって、前記泳動媒体中の
ポリアクリルアミド濃度が２％から６％であり、前記塩
基配列を決定すべき塩 基長に対応して前記ポリアクリル
アミド濃度及び前記所定の距離が決定されることを特徴
とする塩基配列決定方法。 - 【請求項４】核酸試料の蛍光標識された断片を泳動媒体
を用いて電気泳動し、前記泳動媒体の泳動開始点から所
定の距離にある光照射部にレーザ光を照射し、分離され
た前記断片の前記蛍光標識から発生した蛍光を検出し、
前記核酸試料の塩基配列を決定する塩基配列決定方法に
おいて、塩基長Ｎの前記断片が前記所定の距離を泳動し
前記蛍光が検出されるまでの泳動時間ｔを、前記泳動媒
体中のポリアクリルアミド濃度Ｃ、及び前記塩基長Ｎを
変化させて計測して、前記ポリアクリルアミド濃度Ｃを
パラメータとして前記泳動時間ｔと前記塩基長Ｎとの関
係を示す複数の関係線を含む第１のグラフと、前記塩基
長Ｎをパラメータとして前記泳動時間ｔと前記塩基長Ｎ
との関係を示す複数の関係線を含む第２のグラフとを求
め、前記第１のグラフにおいて前記塩基長Ｎを０に漸近
させるか、又は前記第２のグラフにおいて前記ポリアク
リルアミド濃度Ｃを０に漸近させて、前記塩基長Ｎ、及
び前記ポリアクリルアミド濃度Ｃに依存しない泳動時間
ｔ 0 を求め、前記塩基配列を決定すべき塩基長に対応す
る前記パラメータをもつ前記第２のグラフの前記関係線
を用いて、前記泳動時間ｔが３ｔ 0 に対応する前記ポリ
アクリルアミド濃度を前記泳動媒体中のポリアクリルア
ミド濃度とすることを特徴とする塩基配列決定方法。 - 【請求項５】請求項４に記載の塩基配列決定方法におい
て、前記泳動媒体中のポリアクリルアミド濃度が２％か
ら６％の範囲にあることを特徴とする塩基配列決定方
法。 - 【請求項６】請求項４に記載の塩基配列決定方法におい
て、前記塩基配列を決定すべき前記塩基長の長又は短に
対応して前記ポリアクリルアミド濃度が低又は高濃度に
設定されることを特徴とする塩基配列決定方法。 - 【請求項７】請求項４に記載の塩基配列決定方法におい
て、前記泳動媒体中のポリアクリルアミド濃度が２％か
ら６％の範囲にあり、前記塩基配列を決定すべき前記塩
基長 の長又は短に対応して前記ポリアクリルアミド濃度
が低又は高濃度に設定されることを特徴とする塩基配列
決定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9130668A JP2853706B2 (ja) | 1997-05-21 | 1997-05-21 | 塩基配列決定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9130668A JP2853706B2 (ja) | 1997-05-21 | 1997-05-21 | 塩基配列決定方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63039385A Division JP2804038B2 (ja) | 1988-02-24 | 1988-02-24 | 塩基配列決定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1048182A JPH1048182A (ja) | 1998-02-20 |
| JP2853706B2 true JP2853706B2 (ja) | 1999-02-03 |
Family
ID=15039767
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9130668A Expired - Fee Related JP2853706B2 (ja) | 1997-05-21 | 1997-05-21 | 塩基配列決定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2853706B2 (ja) |
-
1997
- 1997-05-21 JP JP9130668A patent/JP2853706B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 青木幸一郎、永井裕編集「最新電気泳動法」廣川書店（昭和６１年１０月２５日発行）ｐ．３７８−３８６，ｐ．４０９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH1048182A (ja) | 1998-02-20 |
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