JPH01168282A - 化学修飾されたリパーゼおよびそれを用いる酵素反応 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は化学修飾されたリパーゼおよびそれを用いる酵
素反応に関するものである。

（従来技術とその問題点） 一般に、酵素は耐有機溶剤性に欠け、有機溶剤下では変
性して酵素活性を失い易い。そのため、水溶液中で酵素
反応を行わせるのが得策であるが、例えば、油脂の加水
分解と合成を可逆的に触媒するリパーゼ等の酵素におい
ては大部分の基質が水不溶性であるため、水−有機溶剤
の二相系又は有機溶剤下で酵素活性を失わないように改
善する必要がある。そこで、水−有機溶剤系で安定性の
高い酵素を得るために、 アクロモバクタ−・プロテアーゼについては、ポリアル
キレングリコールで架橋重合させて化学修飾する方法（
特開昭６０−１２０９８５号）、リポキシゲナーゼにつ
いては、 式：　Ｏ （式中、Ｒは炭素数１〜２２のアルキル基又は未置換も
しくは置換の芳香族基を示す）で表される化合物を用い
て化学修飾する方法（特開昭６２−９６０８４号）が提
案されている。

他方、化学修飾されたリパーゼの存在下にエステル合成
および交換を行う方法として、末端に疎水性基を有する
ポリアルキレングリコールの活性誘導体で化学修飾した
リパーゼを用いる方法（特開昭６０−１５６３９５号）
、２．４−ビス（Ｏ−メトキシエチレングリコール）−
Ｓ−トリアジンで化学修飾したリパーゼを用いる方法（
特開昭６２−１９０８９号）等が提案されている。　し
かしながら、化学修飾された酵素を利用する工業的エス
テル合成および交換反応を実現するためには、化学修飾
が簡単で、かつ有機溶剤中においても高い活性を有する
必要がある。

（発明の目的） そこで、本発明は簡単に製造可能で、耐有機溶剤性の高
い化学修飾されたリパーゼを提供するとともに、かかる
化学修飾されたリパーゼを用いて効率の高い加水分解反
応およびエステル合成反応を可能とすることを目的とす
る。

（発明の構成） 本発明者はリパーゼを化学修飾するにあたり、種々の化
学修飾剤を検討した結果、意外にも製紙工業において反
応性サイズ剤として用いられているアルケニルコハク酸
無水物（ＡＳＡ）およびアルキルケテンダイマー（ＡＫ
Ｄ）がリパーゼの化学修飾剤として優れ、かつ高い耐有
機溶剤性を示すごとを見出し、本発明を完成するに至っ
た。叩ち、本発明の要旨とするところは、 「式：　　　　　　　　　０ （式中、Ｒ１及びＲ２は炭素数ｌＯ〜２０のアルキルま
たはアルケニル基） で示されるアルケニルコハク酸無水物、又はＯ−Ｃ＝Ｏ （式中、Ｒ３及びＲ４は炭素数１０〜２０のアルキルま
たはアルケニル基） で示されるアルキルケテンダイマーで酵素中のアミノ基
を修飾され、耐有機溶剤性に優れることを特徴とする化
学修飾されたリパーゼ」にある。

本発明に係る化学修飾されたリパーゼは高い耐有機溶剤
性を有するため、水−有機溶剤二相系の加水分解反応に
おいて高い相対活性を維持することができる。したがっ
て、本発明は、かかる化学修飾されたリパーゼを用いて
加水分解反応を行わせることを特徴とする酵素反応を提
供するものでもある。

さらに、本発明に係る化学修飾されたリパーゼは水−有
機溶剤二相系のみならず、有機溶剤系においてエステル
合成が可能である。したがって、本発明はかかる化学修
飾されたリパーゼを用いてエステル合成を行わせること
を特徴とする酵素反応を提供するものでもある。

本発明において用いるアルケニルコハク酸無水物は 一般式二　　　　　　　　　　〇 ＩＩ （式中、Ｒ１及びＲ２は炭素数１０〜２ｏのアルキルま
たはアルケニル基） で示され、一般市販物は炭素数１６〜１８のオレフィン
オリゴマーと無水マレイン酸を２１０℃で５時間反応さ
せて製造される。

（ｌｈ方、アルキルケテンダイマーは Ｏ−Ｃ＝Ｏ （式中、Ｒ１及びＲ４は炭素数ｌＯ〜２ｏのアルキルま
たはアルケニル基） で示され、下記反応式で示すように、ヘンゼン等を溶媒
として、脂肪酸ハライドに第三アミンと３５〜５０℃で
数時間反応させて製造される。

２　Ｃ＋７１１１ｙＣＯＣＬ　＋　２　（Ｃｚ　ｌ罰）
３Ｎかかるアルケニルコハク酸無水物またはアルキルケ
テンダイマーを用いてリパーゼを化学修飾するにあたっ
ては、次の点に留意するのが肝要である。

（１）リパーゼの酵素活性を低下させる事のないｐＨ１
温度で修飾反応を行う。

＋２１　Ａ　Ｓ　ＡまたはＡＫＤを適当な乳化剤（例え
ば特開昭６０−９９０９８や特開昭５７−１６７４９２
に記載の乳化剤）を用いて酵素水溶液に良く乳化分散さ
せて反応させる。

また、本発明に係る化学修飾されたリパーゼを用いて加
水分解を行うにあたっては次の点に留意する必要がある
。

（１１通常のリパーゼによる油脂等の加水分解と特に変
わるところはないが、反応を円滑に行うために水相と基
質を含む溶剤相との接触界面を極力多くするべく、攪拌
等に留意する。

（２）加水分解の温度条件において、液状の基質であれ
ば特に溶剤に溶解することもなく、そのまま反応に供し
うる。

更に、本発明に係る化学修飾されたリパーゼを用いてエ
ステル合成やエステル交換を行うにあたっては次の点に
留意する必要がある。

（１）エステル合成においては、反応平衡を合成側に傾
けて合成率を高めるべく反応によって生成する水を脱水
剤等の使用により、反応系外に除去することが望ましい
。

（２）基質混合物が反応温度で液状であれば、特に有機
溶媒を使用することなく反応することもできる。

以下、本発明を実施例に基づき、具体的に説明すること
にする。

（実施例１） （アルケニルコハク酸無水物による化学修飾）原料： リパーゼ：リパーゼＰ「アマノ」　（大野製薬）Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、起源 アルケニルコハク酸無水物： ハーサイズＡＮ−１８０（種層化成） バッファ：　０．４Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８）製法： ■アルケニルコハクｆＩ！無水物１２２ｍｇにバッファ
１０ｍ１を加え、超音波で１分間乳化を行う。

■他方、リパーゼ２００ｍｇ蛋白質（６，４ＩＩ　ｍｏ
ｌ）をバッファｌｏ＋１に懸濁させ、■の乳化液を加え
る。

■次いで、両者を３７℃の恒温槽中で１〜２４時間往復
振とうを行う。

■遠心分Ｍ　（３５００ｒｐｍ、　１０分）を行い、上
層の未反応アルケニルコハク酸無水物およびその加水分
解物より成る油層を除去する。

■上記反応液を限外濾過（ＴＯＹＯＵＫ−１０：分画分
子量１０，０００）によって濃縮し、凍結乾燥したもの
をＡＳＡ修飾リパーゼとする。

ＯＨＣ１１１ １？、　　　　０ １！１ 酵素蛋白中の遊離アミノ基のどれだけが修飾を受けたか
を％で表し、修飾率とした。

（試験例１） （修飾リパーゼの耐有機溶剤性試験） 修飾しないリパーゼＰと実施例１で得られた化学修飾さ
れたリパーゼ（修飾率７０％）蛋白質として１ｍｇを栓
付試験管に取り、これに各種溶媒、ヘキサン、アセトニ
トリル、クロロホルム、第三ブチルアルコール、アセト
ン、ベンゼン、水を２ｍｌ加え、３７℃で２４時間振と
うした後、残存活性を国土等の加水分解活性測定方法（
油化学２３　（２）　、第９８頁、　１９７４）により
評価した。結果を下記第１表に示す。

第１表 有機溶媒処理による残存活性 （試験例２） （修飾リパーゼの加水分解活性） 基質として５％ｗｔ／ｖｏｌオリーブ油乳化Ｉ’ＶＡエ
マルジョン５ｍ１（ｐＨ７）にＯ，１Ｍ　ＫＰＢバッフ
ァ４ｍｊ！と実施例１で得た下記種々の修飾率の酵素溶
液Ｉｆｆｌｊ７（１ｍｇ蛋白質／ｂｎｊ！水）を加え、
３７℃、３０分間往復振とうし、次いで酵素を失活（ｌ
（ＳＯ）させ、国土。

等の加水分解活性測定方法によりＯ，ＩＮのＭａｉｌ（
にて滴定してオリーブ油の分解率（酵素活性）を評価し
た。結果を下記第２表に示す。

第２表 オリーブ油分解率相対活性 （実施例２） （有機溶剤中でのエステル合成） 基質として０．３Ｍオレイン酸と０．４５Ｍオレイルア
ルコールの水飽和ベンゼン溶液１１Ｉｌｌに実施例１で
調整した下記種々の修飾率の酵素粉末蛋白質としてｌｌ
ｌ１ｇ加え、３７℃で往復塩とうし、ＴＬＣ−ＦＩＤ（
イヤトロキャン）によりオレイルオレエートを定量して
２４．４１．５７時間後の合成率を検討した。結果を第
３表に示す。

第３表 オレイルオレエート合成率 （実施例３） （有機溶剤中でのエステル合成） 基質として０．３Ｍオレイン酸と０．４５Ｍオレイルア
ルコールの各種有機溶媒溶液ｉｎ＋１に未修飾または実
施例で調整した修飾率７０％の酵素粉末をそれぞれ蛋白
質として１＋ｎｇ加え、３７℃で往復塩とうし、ＴＬＣ
−Ｆ［Ｄ（イヤトロスキャン）によりオレイルオレエー
トを定量して２４．４８時間後の合成率を検討した。結
果を第４表に示す。

第４表 有機溶媒中でのエステル合成率（％） （実施例４） （有機溶剤中でのエステル合成） ０．３Ｍオレインｆｍ−０，３Ｍセチルアルコールまた
は０．３？Ｉオレイン酸−０，３Ｍゲラニオールまたは
０．３Ｍガプリル酸−０．３Ｍゲラニオールを含乙′ベ
ンゼン１ａ＋Ｎに未修飾または実施例１で調整した修飾
酵素粉末（収線率７０％）を蛋白質としてｌｓ＋ｇ加え
、３７℃で２４時間撮とうした。

第５表 合成率（％） （実施例５） （アルキルケテンダイマーによる化学修飾）修飾試剤を
アルキルケテンダイマー（種層化成製バーサイズへに−
７２５）に替えた以外すべて実施例１と同様にしてＡＫ
Ｄ修飾修飾リパーゼ間整した。

（試験例３） （ＡＫＤ修飾修飾リパーゼ間有機溶剤性試験）実施例５
で調整した修飾率６５％の八にＤ修飾リパーゼＰの耐有
機溶剤性試験を、試験例１と全く同様にして実施した。

第６表 有機溶媒処理による残存活性 （試験例４） （ＡＮＤ修飾リパすゼＰの加水分解活性）八に０修飾リ
パーゼＰの加水分解活性を試験例２と全く同様にして評
価した。

第７表 オリーブ油分解率相対活性 （実施例６） （有機溶剤中でのエステル合成） ０．３Ｍオレイン酸−０，３Ｍオレイルアルコールまた
は０．３Ｍカプリル酸−〇、３門ゲラニオールを含むベ
ンゼン１ｍｌに未修飾または実施例５で調整したＡＫＤ
修飾修飾リパーゼ量白質としてｌｌｌ１ｇ加え、脱水剤
としてモレキュラーシブス４Ａ　（半井化学製）０．１
ｇを添加して３７℃で２４．４８時間振とうした。

第８表 合成率（％） （実施例７） 酵素としてリパーゼＯＦ　（名糖産業製、Ｃａｎｄｉｄ
ａｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ起源）を使用し、実施例１と
全く同様に祁＾修飾を行った。

（実施例８） （水−有機溶剤二相系での加水分解） 米ぬかろう０．５ｇをヘキサン５ｍｌ１に溶解し、未修
飾または実施例７で得た修飾率５８％のＡＳＡ修飾リパ
すゼＯＦを蛋白質として１ｍｇを０．０５Ｍリン酸曖衡
液（ｐＨ７，０）　５ｍ　ｌに溶解した酵素溶液を加え
、４０℃で５　ｈｒｌ辰とうした。加水分解率は未修飾
酵素を用いた場合５．２％、修飾酵素で１２．３％であ
った。

（実施例９） （水−有機溶剤二相系でのエステル合成）コレステロー
ル０．７７　ｇとオレイン酸１．４３ｇをシクロヘキサ
ン１０＋ｎｊ！に溶解し、蛋白質として１０ｍｇの未修
飾または実施例７で得た修飾率５８％のＡＳＡ（ｌ：５
　ｆｉｌリパーゼＯＦを溶解した０、０５Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ６、０）５ｍ　／ｌを加え、３７℃で１７ｈｒ
Ｊ辰とうした。エステル合成率は未修飾酵素を用いた場
合５３．２％、修飾酵素で９５．８％であった。

（実施例１０） （有機溶剤中でのエステル合成） ０．３Ｍ才レインＭ−０，３Ｍオレイルアルコールまた
は０．３Ｍカプロン酸−０，３Ｍゲラニオールを含むシ
クロヘキサン１ｍｌに未修飾または実施例７で得た修飾
率５８％の＾ＳＡ修飾リパすゼＯＦを蛋白質として１ｍ
ｇ加え、脱水剤としてモレキュラーシーブス４Ａ０．１
ｇを添加して３７℃で２４．４８時間振とうした。

第９表 合成率（％） （実施例１１） （有機溶剤中でのエステル合成） コレステロール３０ｍｇとオレインＭ６ｋｇをシクロヘ
キサン２ｍ６に溶解し、蛋白質として１ｍｇの未修飾ま
たは実施例７で得た修飾率５８％のＡＳＡ（［！飾りパ
ーゼＯＦを加え、３７℃で２０時間振とうした。エステ
ル合成率は未修飾酵素を用いた場合９．６％、修飾酵素
で９６．２％であった。

（発明の効果） 以上の説明で明らかなように、本発明によれば、従来製
紙工業において反応性サイズ剤として用いられていたア
ルケニルコハク酸無水物（ＡＳＡ）およびアルキルケテ
ンダイマー（Ａ　Ｋ　Ｄ）を用いて高い耐有機溶剤性を
示す化学修飾されたリパーゼを提供することができるの
で、化学修飾されたリパーゼの大量生産が可能で、コス
トの低減が図れる利点がある。

また、本発明に係る化学修飾されたリパーゼを用いると
、水−有機溶媒二相系で高い相対活性を保持しつつ加水
分解およびエステル合成を行うことができる。しかも、
本発明に係る化学修飾されたリパーゼは有機溶媒中にお
いてもエステル合成が可能であるから、酵素反応後の反
応生成物の分離が容易であり、リパーゼ酵素反応の工業
化が可能となる利点を有する。

特許出願人　播磨化成工業株式会社 代理人　弁理士　石　井　久　夫

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１及びＲ＿２は炭素数１０〜２０のアルキ
   ルまたはアルケニル基） で示されるアルケニルコハク酸無水物、又は式：▲数式
   、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿３及びＲ＿４は炭素数１０〜２０のアルキ
   ルまたはアルケニル基） で示されるアルキルケテンダイマーで酵素中のアミノ基
   を修飾され、耐有機溶剤性に優れることを特徴とする化
   学修飾されたリパーゼ。 ［２］式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１及びＲ＿２は炭素数１０〜２０のアルキ
   ルまたはアルケニル基） で示されるアルケニルコハク酸無水物、又は式：▲数式
   、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿３及びＲ＿４は炭素数１０〜２０のアルキ
   ルまたはアルケニル基） で示されるアルキルケテンダイマーで酵素中のアミノ基
   を修飾されたリパーゼの存在下、油脂や脂肪酸エステル
   類の加水分解反応を行わせることを特徴とする酵素反応
   。 ［３］式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１及びＲ＿２は炭素数１０〜２０のアルキ
   ルまたはアルケニル基） で示されるアルケニルコハク酸無水物、又は式：▲数式
   、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿３及びＲ＿４は炭素数１０〜２０のアルキ
   ルまたはアルケニル基） で示されるアルキルケテンダイマーで酵素中のアミノ基
   を修飾されたリパーゼの存在下、水−有機溶剤又は有機
   溶剤中でエステル化反応を行わせることを特徴とする酵
   素反応。