JPH01153085A - ハイブリドーマ増殖用培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｂｍ＃ｔハイブリドーマの無血清増殖および
モノクローナル抗体のインビトロ産生に対し、種々の細
胞の初代培養物または無限増殖系からの無血清馴化培地
中に含有される細胞増殖因子の使用に関する。

１９７５年にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌａｔｅｉｎ　（
Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７）はミエローマ細
胞と免疫牌臓細胞を融合させて予め定められた特異性を
有する抗体を分泌する無限増殖細胞を生成させることに
ついて報告している。ハイブリドーマと呼ばれるこれら
細胞系はそれぞれ、単一の無限増殖化されたＢ細胞クロ
ーンの産物である単一の同種の抗体を産生ずる。以前に
は全動物のインビボ免疫化に由来するポリクローナル抗
血清のみしか得られなかった。ポリクローナル抗血清は
大抵の場合多くの異なるＢ細胞クローンから産生された
抗体の異種混合物を含有する。

Ｍｉｌａｔｅｉｎ氏の概説論文（５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
　Ａｍｅｒｉｃａｎ２４５ｔ６６−７４．１９８０）に
は、モノクローナル抗体の長所を実験動物で生成させた
従来のポリクローナル抗体に比較してまとめである。

モノクローナル抗体を産生ずる細胞系はその細胞系を腹
腔内に注射して腹水腫瘍を生成させることによシインビ
ボで増殖されうる。腹水液はモノクローナル抗体の豊富
な供給源であるが（通常１−１０！／ｇｇ）、しかし不
都合々ことに非特異的なポリクローナルイムノグロブリ
ン分子ならびに他のタンパク質をも高濃度で含有する。

モノクローナル抗体のもう一つの生成法はバイプリドー
マ細胞系のインビトロ培養である。血清含有培地（代表
的にはウシ胎児血清１０−２０％含有）の使用が細胞増
殖および抗体産生にとって通常必要とされる。しかしな
がら、培地中に血清を使用すると問題のイムノグロブリ
ンから除去される必要のある血清タン／Ｊ！り質が高濃
度となる。血清の非存在下にＢ！Ｉｌｌ胞八イプリへ−
マ細胞系を増殖させうる培地（ｆｉ血清培地）の種々の
配合は記載されてお１７）　（Ｍｕｒａｋａｍｉ氏他、
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ　７９　：　１１５１Ｂ−１１６２（１９８２）およ
びｐｆｉｒｆ１８ｒ氏他、ｈｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ　
。

１３８：２８７−２９５（Ｈ’８２）　）そして商業的
に入手しうる。

ハイブリドーマ用の無血清培地のための種々の配合物は
インシュリン、トランスフェリン、エタノールアミンお
よび脂肪酸連結ＢｓＡ　（前記文献参照）のような他の
増殖支持成分をも含有している。これら培地のタンパク
質濃度はしばしば非常に高くて例えば７５０μＩ／ｌｄ
もある。かかる高いタンパク質濃度は、１０％ウシ胎児
血清（ｙｃｓ＞を補添した培地のそれよシはるかに低く
はあるが、なお精製に問題を生じている。

抗体産生用ハイブリドーマ細胞を増殖させるのに無血清
培地を使用する目的は、抗体の精製を閏単にするために
培地のタンノ９り質濃度をできるだけ低レベルに抑える
ことにある。異なるミエローマｍ胞系を用いて当初に炸
裂されたハイブリドーマ細胞を増殖させるには異なる培
地配合物がしばしば必要とされる。へイプリドーマＡｆ
ｆａ系のランダムな選択物を増殖させる現在入手しうる
無血清培地配合物はタンパク含量が高い。これと対照的
に、タンパクレベルの低い（５０μｍ１／−をこえない
）無血清培地配合物はハイブリドーマ細胞系のランダム
なサンプルを高率に増殖させることはない。

加えて、ハイブリドーマ細胞系用の現在入手しうる無血
清培地配合物は、それらが高レベルのタンパク質を含有
していようと低レベルのタンパク質を含有していようと
、血清含有培地から無血清培地まで１Ｉｌｌ胞を段階的
に適応させることを必要とする。この段階的適応には、
漸増濃度の無血清対血清含有培地を含有する培地によっ
て細胞を連続継代する仁とが包含される。この適応は６
週間まで要して時間がかかシ、そして特定のハイブリド
ーマ細胞系には時としてうまくゆかない。段階的適応は
タンノぞり含量の低い無血清培地配合物では特ｋａ！ｌ
ｉ！とされる。

血清含有培地中における融合混合物のコロニー形成率を
改善するため、およびハイブリドーマ細胞系のクローニ
ング効率を高めるために支持細ａ（例えば内皮細胞、腹
腔マクロファージ、ｙ＃臓細胞）を使用することは記載
されている（　Ｌｅｒｎｈａｒｄｔ氏他、Ｔｈｐ　Ｃｅ
１ｌ　Ｒｅｓ、　１１１　：　５０９（１９７８）およ
びＦａｚｅｋａｓ　ｄｏ　Ｓｔ、　Ｇｒｏｔｈ氏他、Ｊ
、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｏｔｈ、　５５　：　１　（１
９８０）　）ｏ　支持細胞の性質の一つは可溶性の細胞
増殖因子を産生および分泌することである。これらの因
子（類）はいわゆる馴化培地から粗製形で得られうる。

これらの支持細胞は馴化培地中で増殖し、そして次に馴
化培地から除去される。内皮細胞からの馴化培地（Ａａ
ｔａｌｄｉ氏他、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２５　：
１４１１（１９８０））　　および単球／マクロファー
ジ細胞からの馴化培地（８ｕｇａｓａｗａｒａ氏他、Ｊ
。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、７９：２６５−２７５（
１９８５）およびＲａｔｈｊｅｎ氏他、Ｈｙｂｒｉｄｏ
ｍａ　５　：　２５５−２６１（１９８６））　　はこ
の点で有用であることが判明している。

西ドイツ特許出願ＤＥ　３，５２３，２０２ＡＩ号には
１血清含有培地に補添するためにマウス牌朦または９２
７２節細胞、あるいは胸腺リンパ球のような適当な細胞
で馴化された無翻飽、血清含有（５−１０％ウシ胎児血
清）培地を使用してハイブリドーマ特にヒトハイブリド
ーマのクローニング効率と増殖を高めることが記載され
ている。ここに開示される血清含有培地中には高レベル
のタンパク質が存在するのでこれらの培地は前記と同じ
欠点を伴う。

馴化培地がハイブリドーマ細胞の増殖に及はす有益な作
用は支持細胞によシ泗胞増殖因子（タンパク質）が分泌
されることである。ハイブリドーマ増殖因子（ＨＧＦ）
と呼ばれる、マウス７９２２球から分泌されるタンパク
質は精製されそしてアミン末端アミノ酸配列が決定され
ている（　Ｖａｎ　５ｎｉｃｋ氏他、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、　　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｕ３Ａ３３：９６７９ｐ１９８６）。このタン
パク質は血清含有培地中である種のハイブリドーマの増
殖を刺激することが示されている。ミエローマ（Ｂ細胞
へイプリドーマの産生に親の一方として用いられるＢ細
胞腫劫）のインビトロ増殖を刺激するタンパク質も連続
性単球／マクロファージ細胞系から精製されている（　
Ｎｏｒｄａｎ氏他、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３９　
：　８１５．１９８７）。このマクロファージ由来細胞
増殖因子のアミノ末端配列はＴｉｎ因子のそれと同一で
はないが類似している。さらに、ヒトインターフェロン
β−２はヒトＢ細胞刺激因子−２（ＢＳＦ−２）と同一
であることおよび血清含有培地中においてハイブリドー
マおよびミエローマに対し細胞増殖因子活性を有するこ
とが示されている（　Ｖａｎ　Ｄａｍｎｓ氏他、Ｊ、　
Ｒｉｐ、　Ｍｅｄ、　１６５　：　９１４．１９８７）
。

今日まで、ＢａＪ胞八イへリドーマの無血清増殖を支持
するために精製された形態においてもあるいは無血清馴
化培地中においても細胞増殖因子を使用することは記載
されていない。

ここに記載される本発明は、Ｂ細胞ハイブリドーマ細胞
を増殖させるために、およびモノクローナル抗体のイン
ビトロ産生に、ハイブリドーマ細胞系を無血清培地に予
め適応させることなくタンパク含筺の低い無血清培地の
成分として細胞増殖因子を使用することについて記載す
るものである。

これらａ胞増殖因子は天然の供給源から組換えタンパク
質としてｍ製された形態で、あるいは無血清馴化培地の
形態で提供されつる。

図面は本発明の培地中で増殖されたハイブリドーマから
得られた抗体のゲル電気泳動を示す写真である。

細胞増殖因子の伴在下では細胞系を低タンパク無血清培
地に適応させる必要がないということが予想外にも見出
されたので本発明の改良された低タンパク無血清培地は
Ｂ細胞へイプリドーマ細胞系の増殖にとって有用である
。

利用すべき細胞増殖因子は天然に存在するハイブリドー
マ増殖因子の精製によるような天然の供給源から精製さ
れた形態で得られうる。この細胞増殖因子はまた組換え
ＤＮＡによシ産生されたタンパク質であることもできる
し、または無血清馴化培地の形態で供給されることもで
きる。「馴化培地」とは細胞増殖因子は含有するがしか
し細胞増殖因子を産生ずる細胞を含有しない培地を意味
する。

ハイブリドーマの増殖に有用な低タンパク無血清培地を
得るのに本発明で好都合に使用される無血清馴化培地は
支持細胞を無血清培地中で（それが必要ならば）適当な
誘導剤と共にインキュベーションし、続いて遠心分離お
よび／ｉたは滅菌濾過により細胞および細胞層を除去す
ることによりｇ製されうる。支持細胞のインキュベーシ
ョンは、その多くが商業的に入手しうるものである低タ
ンパク無血清培地中で適当な刺激（「誘導」）剤の存在
下に２４〜４８時間行われつる。必要な場合はかかる刺
激剤は支持細胞を刺激して細胞増殖因子を生成させ分泌
させることができる。

壜球／マクロファージ細胞系にとって好ましい誘導剤は
ダラム陰性細菌の細胞壁から抽出された細菌性リボ多糖
類（ＬＰＳ）である。（単球／マクロファージｍ胞系と
は単球／マクロファージ特性、例えばマウスＭａｃ１、
Ｍへｃ２またはＭａｃ　３細胞表面マーカーを有する細
胞系である。）ホルボールミリステートアセテートまた
は他のホルボールエステルおよびムラミルジはプチド（
ＭＤＰ）のよう表他の誘導剤も単球／マクロファージ細
胞系にとって有効である。単球／マクロファージのみな
らず他の細胞ｌに対する他のあ４剤の有効性は実施例に
記載されるアッセイを用いて確認されつる。

単球／マクロファージｍ胞系は本発明で有用な細胞増殖
因子の産生に好ましい支持細胞であるが、しかじ内皮細
胞マたは牌臓細胞のような他の細胞もそれら自身が低タ
ンパク無血清培地中で増殖して細胞増殖因子を生成しう
るならば、使用されうる。

ね々の細胞系または初代培養物がｍ胞増殖因子を生成す
る能力は、細胞を低タンパク無血清培地中でインキュベ
ーションしそして次にこの培地が添加物として用いられ
た場合に低タンパク無血清培地中におけるハイブリドー
マ細胞の増殖を促進させる能力について測定する実際的
な方法によシ容易にアッセイされる。もしハイブリドー
マ細胞の増殖が促進された場合は、その細胞系は本発明
の改良培地の調製に有用な無血清馴化培地の調製に利用
されうる。

−旦調製されると、馴化培地は低タンパク無血清基礎培
地に添加物として添加でき、この培地にはインシュリン
、トランスフェリン、およびエタノールアミンも添加さ
れうる。血清含有培地中で通常維持される大部分のマウ
スハイブリドーマ細胞系は（そのハイブリドーマを低タ
ンパク無血清培地中に予め適応させることなく）本発明
の前記調製された培地に直接移すことができ、そこでこ
の細胞系は増殖して慣用の血清含有培地中で産生された
ものに匹敵する量のイムノグロブリン（抗体）を産生じ
よう。本発明の培地はＩｇＧまたはＩｇＭ抗体を産生し
うる細胞系を増殖させるのに有用である。

本発明の低タンパク改良培地は約５０μｍ／／ｍｌまた
はそれ以下しかタンパク質を含有せずそして種々の量、
しかし好ましくは約５％ＣＶ／Ｖ）　またはそれ以下の
馴化培地を改良された無血清基礎培地（タンパク含量が
低い）に添加することによシ通常調製される。これら低
タンパク培地の多くは商業的に入手しうる、例えばＮｕ
ｔｒｉｄＯｍａ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ　）　、ＨＢ　３０１（Ｈａｎａ　Ｂｉｏ−１ｏｇ
ｉｃｓ　）　、ＨＬ−１（Ｖｅｎｔｒｅｘ）、およびＧ
ＩＴ（ＩＣＮＢｉｏｃｈｅｍｌｃａｌｓ）である。基礎
培地はインシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸、
エタノールアミンおよび脂肪酸のようなｌ々の化学物質
を用いて修正されうる。本発明で有用な非常に効果的な
無血清配合物は５０％のＤＭＥ　（ダルベツフ改良イー
グル培地）および５０％のＦ−１２（バンクＦ−１２培
地）で基礎塩および栄養分となしこれＫ　２．４　ｍＭ
のＬ−グルタミン、５μｇ／ゴのウシインシュリン、３
０μｉ／ｍｔ　　のヒトトランスフェリン、２．６ｎｇ
／ｄの亜セレン酸ナトリウム、２０μＭのエタノールア
ミンおよび０．５％（ｖ／ｖ　）の馴化培地が添加され
る。

以下の実施例によシ本発明を説明する。

実施例 モノクローナル抗体のインビトロ調装 Ａ、ハイブリドーマ増殖因子産生についてのアッセイ 馴化培地の調製に有用な適肖な細胞系のみならずある場
合には予め生成に必要な誘導剤を確認するには、低タン
パク無血清培地中でハイブリドーマｆｍｆＭｌを非適応
増殖させうる！１ｌｌｌ化培地中における細胞増殖因子
（類）を検出するための定量的アッセイを確立すること
が必要であった。

再現性かあ）、感受性が高く、半自動的アッセイが考察
されそれによシ、ハイブリドーマ増殖因子を含有すると
思われる多数のサンプルを無血清培地中におけるハイブ
リドーマ増殖促進活性についてアッセイすることができ
るようになった。初めにハイブリドーマ細胞系を、低タ
ンパク血清代替物を添加した無タンパク基鍵組織培地中
に低密度で培養した。次に細胞増殖因子を含有する馴化
培地のサンプルを加え、そして約４８−７２時間インキ
ュベーションしたのち増殖および／または活性化を以下
に記載されるようにして測定し、そして何ら馴化培地を
添加しなかった対照細胞と比較した。

馴化培地を調製するには、初めに５０％ＤＭＥ（ダルベ
ツコ改良イーグル培地、Ｈａｚｅｌｔｏｎ−Ｄｕｔｃｈ
ｌａｎｄ　）および５０％Ｆ１２（バンクＦ−１２培地
、Ｈａｚｅｌｔｏｎ−Ｄｕｔｃｈｌａｎｄ）に２．４　
ｍＭＬ−グルタミン、５μｍ／／ｒｄウシインシュリン
（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　、３０　ｐｉ／
−ヒトトランＸ７ｍリン（Ｓｉｇｍａ）　、および２．
６ｎ１／／−の亜セレン騒ナトリウムを補添した低タン
パク無血清培地（ＳＭ）中にＲＡＷ　２６４．７（ＡＴ
ＣＣ’ｒより　７１　）細胞を適応させて増殖させた。

ｍ胞はかかる培地中で数回継代増殖させることにより８
Ｍ中で適応増殖させるとその時点で増殖率は１０％ＦＣ
８を含有する培地中で得られたそれの約８０−９’０％
であった。細胞なはＩミ集密となるまで増殖させ（細胞
７−１０Ｘ１０５個／ｒｎｔ）そしてＬＰＳ（Ｅ、ｃｏ
ｌｉ０５５：Ｂ５Ｗ、Ｄｉｒｃｏ）　　を最終濃度０．
１μｇ／−となるまで加えた。４８時間インキュベーシ
ョンしたのち、上清を分離しそして細胞および細胞層を
４８，０００Ｘｐで１５分間遠心分離することによシ除
去した。さらに比較的小さい屑も除去しそして溶液を１
２２ミクロンの滅菌フィルターを通すことによシ無−ｊ
とした。この馴化培地は分割して一７０°Ｃで冷凍する
かまたは４°Ｃで数週間貯蔵できた。

用いられたアッセイはＤｅｎｉｚｏｔ氏他のテトラゾリ
ウム染料法（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　８
９：　２７１−２７９（１９８６））と゛実質的に同じ
である。増殖に＠して試験する細胞〔免疫原としてｐｓ
ｕ　（卵胞刺激ホルモン）を用いて標準的なＫｏｈｌｅ
ｒ　　およびＭｉｌｓｔｅｉｎ　　プロトコルによ）生
成されたハイブリドーマ系統４１１／４７．２）　　を
第１表に示されるようにして培養しそして９６ウエルプ
レート全域セル（Ｃｏ５ｔａｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
　）中湿度８１１節されたＣＯ２インキュベーター中３
７℃で４８時間増殖させた。用いられた培地は１％Ｎｕ
ｔｒｉｄＯｍａＳＰ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ　）　　を補添したイスコープ培地（ｌ５ｃ
ｏｖｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ　）に第１表で示されるよう
にして馴化培地を添加したものであった。アッセイ直前
に、培地を８−チャンネル真空マニホルドを用いて分離
した。次に１００μｌのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチ
ルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラ
ゾリウムプＯｆｆイド）　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃ○イスコープ培地中１ｖ／ｙ）を各ウェルに加
えた。この９６ウエルプレートを湿度調節されたＣ０２
インキユベーター中３７°Ｃで時々穏やかに振盪しなが
らさらに３時間インキュベーションした。インキュベー
ションの終）に９６ウエルプレートを８００×ｇで５分
間遠心分離しそして培地を８−チャンネルマニホルドを
用いてウェルから吸引した。

０．０４Ｎ　　ＨＣＩを含有する１００％イソゾロパノ
ール１００μｌを加え、そしてプレートを６０秒間はげ
しく振盪して生存能力のある細胞によシＭＴＴから生成
されたホルマザン染料’ｋ　ＩＪＴ溶化させた。プレー
トウェル中の染料溶液の光学濃度（０，０，）を自動式
プレート読取シ器上試験波長５７０　ｎｆｆ１および標
準波長６９０　ｎｍで測定して得られたデータを第１表
Ｋまとめた。

０　　　　１２５０　　　　　．０１８１０　　　　　
　／／　　　　　　　、０２３２０　　　　　　＃　　
　　　　　　、０２８３０　　　　　　　　　　　　．
０４３４０　　　　　　＃　　　　　　　、０４１５０
　　　　　　＃　　　　　　　、０４１１００　　　　
　１　　　　　　．０？１８０　　　　２５００　　　
　　．０３３１０　　　　　　＃　　　　　　　、０５
７２０　　　　　　　　　　　　．０６５３０　　　　
　　＃　　　　　　　、０８０４０　　　　　　Ｎ　　
　　　　　、０７７５０　　　　　　＃　　　　　　　
、０７７１００　　　　　１　　　　　　．０７７０　
　　　５０００　　　　　．０３５１０　　　　　　＃
　　　　　　　、０９１２０　　　　　１　　　　　　
．１０５５０　　　　　１　　　　　　．１３１４０　
　　　　　＃　　　　　　　、１５９５０　　　　　　
＃　　　　　　　、１３９１００　　　　　　＃　　　
　　　　、１５９第１表の結果は、馴化培地の量を約５
０−４０μｊまで増大させると、ハイブリドーマの増殖
を高めてＭＴＴ変換を増大させることを示している。

ホルマザン染料へのＭＴＴ変換は各ウェル中に存在する
細胞数に比例する。同じ濃度の馴化培地を標的の細１１
によシ多く添加すると、ハイブリドーマ増殖が１は正比
例して増大した。

Ｂ細胞増殖のインデイケータ−として（ＭＴＴの代シに
）アルカリホスファターゼを用いＨａｓｉｍｏ切氏他の
プロトコル（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ。

９０：９７−１０５（１９８６））に便って操作すると
同様の結果が得られた。アルカリホスファターゼアッセ
イは幾らか感度が劣るが、結果はＭＴＴアッセイで得ら
れたものと同様であった。

Ｂ、ハイブリドーマ増殖因子を産生ずる細胞系の誘導 ハイブリドーマ増殖因子の産生な含めた単球／マクロフ
ァージ特性を有する細胞系をマウス牌臓細胞長期培養物
から誘導した。Ｂａ１ｂ／ｃ　　系マウスからの牌臓を
外科的にとシ出しそしてメツシュの小さなスクリーンに
通して単離ｉａ浮遊液を調製した。各牌臓な、ヒボキサ
ンチン（１６，Ｓ１９／−）、チミジン（９，１２Ｍ９
／＊）、グルタミン（２４ｍＭ）、２−メルカプトエタ
ノール（５Ｘ１０−’Ｍ）、および１０　％　（ｖ／ｖ
）　Ｆｅ２を含有するイスコープ培地２０−を含有する
Ｔ−７５７ラスコ中に入れた。約１日間インキュベーシ
ョンしたのち、フラスコを穏やかに揺すって大部分の赤
血球およびその他の非付着細胞を除去し、次に培地を吸
引して除去して２０−２５−の新たな培地ととシ代えた
。５−７日目、１４−１８８日目よび２４−２８８日目
培地１０ゴをとシ出して新たな培地をカロえた。３００
日目６０日目の間に、それぞれの牌臓細胞培養の如何に
応じて、迅速に分裂する細胞が観察された。１０−１４
日後に細Ｆｉ系を限界希釈法によシタ６ウエルプレート
中でクローンさせた。外からの増殖因子を添加すること
なく培養しても無限増殖しかつ８Ｍ中での増殖に６易に
適応しうるクローンが多数得られた。これらのａｔ胞は
単球／マクロファージ系統の特徴であるＭａｃ　−１、
ｌムＣ−２、およびＭＢ、Ｃ−５のような表面抗原を発
現した。

もとの細胞系の一つ８ＰＬ−４の限界希釈物を培養する
ことによシ得られた一連のクローンである５ＰＬ−４，
１，４，２，４，３および４．１をｏ、１１ＩＩＩ／−
のＬＰ８（８，ｔ　　ｈｉｍｕｒｉｕｍ　Ｒｅ　５９５
．ＲＩＢＩ）の存在下に８Ｍ中で４８時間増殖させ、遠
心分離しそして得られた馴化培地をＭＴＴアッセイ（８
０００２４Ｈ７５細胞／クエル）によシイ８時間アッセ
イしてハイブリドーマ増殖因子の産生に関して検査した
。得られたデータを第２表にまとめる。

０　　　　　、０１４　　、０１８　　．０１５　　　
、００９５　　　　．０７３　．０２４　　．１０３　
　．０４９１０　　　　．１０２　．０２４　．１００
　　．０９７２０　　　　　、０８０　　、０３１　　
．１０５　　　、０８８第２表に見られるとお、９．５
ＰＬ４．２を除くすべてのこれら細胞系が本発明の培地
中でハイブリドーマの増殖を刺激しうる細胞増殖因子を
産生じた。

Ｃ６低タンパク無血清培地中におけるモノクローナル抗
体の産生 指示される免疫原を用い標準的なＫｏｈｌｅｒ　　およ
びＭｉｌｓｔｅｉｎ　　氏のプロトコルによシ、本実施
例で用いられるＩｇＧ類またはＩｇＭ類産生用のハイブ
リドーマ細胞系を得た。

ハイブリドーマ　　免疫原 ２４Ｅ／３　　　　　ＮＳ−メチルテトラヒドロ７オレ
ー）−ＫＬＨ２４Ｅ７８　　　　　ＮＳ−メチルテトラ
ヒドロ７オレートーＫＬＨ２４Ｅ／１０　　　　ＮＳ−
メチルテトラヒドロ７オレートーＫＬＨ３６１／１５．
１．２　　　　黄体形成ホルモン（Ｉ、Ｈ）８５Ｊ／３
４　　　　フェニトイン−ＫＬＨ２９Ａ／４６．１　　
　　β−ガラクトシダーゼ（Ｋ、　ｃｏｌｉから）ラン
ダムに選択された種々のへイブリドーマクローンによシ
分泌されたＩｇＧ　ｉ］ｉを３８１の異なる培地で比較
した。すなわち 低タンパク無血清培地（イスコープ基礎培地十Ｎｕｔｒ
ｉｄｏｍａ　）、 １０％ＦＣＢを補添した同じ基礎培地、および本発明の
培地（イスフープ培地＋Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ　＋馴化培
地）。

集密となるまで増殖した培養物によシ分泌されたＩｇＧ
量を、ミエローマタンパク質ＭＯＰＣ１４１（Ｌｉｔｔ
ｏｎ　Ｂｌｏｎｅｔｉｃｓ）を用いて検量したＥＬＩＳ
Ａアッセイで測定した。

幾つかのハイブリドーマ細胞系を前記した３種の異なる
培地中で増殖させた。細胞は５Ｘ１０’個／ｄで接種し
、次に４−７日間増殖させて集密状とさせたのちそれぞ
れの培地に関し上清のＩｇＧ含量を下記ＥＬＩ８Ａで測
定した。

ＥＬＩ　８Ａアツセイには、イムロン（Ｉｍｍｕｌｏｎ
）　ｌｌ９６ウエルプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を蒸
留水で洗浄しそして次に−７，４のＰＨ１（Ｓｉｇｍａ
）中で調製されたウサギの抗マウスＩｇＧ　（ガンマ鎖
特異的、Ｚｙｍ１３ｄ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　
）の５０μｍ１／ｒｄ溶液を１ウエル当シ１００μｌず
つ被後した。４℃で−夜被ｍさせたのち、プレートを洗
浄緩衝液（０，１５ＭＮａＣ／　１０．０１　Ｍ　Ｎａ
Ｈ２ＰＯ４、ｐＨ７，８）１５回１５１１Ｌそして吸取
紙で乾燥した。各ウェルを洗浄緩衝液中の６％（ｗ／ｖ
　）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２００μｉ／ウエル
を用いてブロックした。プレートを再び洗浄鰻衝液で５
回洗いそして吸取紙で乾燥した。工ｇＧに関してアッセ
イすべきハイブリドーマ培養上清は２倍希釈法でプレー
ト全体にわたシ各希釈物５０μｌずつを加えることによ
り滴定した。プレートをパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌ
ｍ）ワックスのシートで扱い、３７°Ｃで１時間インキ
ュベーションした。次にプレートをｐＨ７，８の洗浄緩
衝液で６回洗った。１％（ｗ／ｖ）　Ｂ　Ｓ　Ａ　を含
有する−７．８の洗浄緩衝液中に１：４００に希釈した
ビオチニル化つサギ抗−マウスＩｇＧ　（ガンマ９１特
崇的、Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）の１
００μｊずつを各ウェルに加えそして被覆されたプレー
トを室温でインキュベーションした。次にプレートを−
１７，８の洗浄緩衝液中で６回洗い、そしてｐＨ７，８
の洗浄緩衝液（１％ＢＳＡ含有）中１＝１０００に希釈
したストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ接合
体（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１００μ
ｌずつを各ウェルに加えた。室温で１時間インキュベー
ションしたのち、プレートをｐＨ７，８の洗浄緩衝液で
１２回洗った。基質ａ衝液（０，１Ｍジェタノールアミ
ン、…１α３）中に溶解したｐ　−＝　）　ｏ　７　ｘ
　二ｋ　ホスヘ−）　（ＰＮＰＰ）１００ｓＩを各ウェ
ルに加え、室温で２０分間インキュベーションしそこで
４０５ｎｍでの光学濃度を自動式プレート読取り器（Ｍ
Ｒ６００、Ｄｙｎａｔｅｃｈ　）で読取った。その光学
濃度値をＭＯＰＣ１４１ＩｇＧ　　ミエローマタンパク
質（Ｌｉｔｔｏｎ　Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ）　　を用いた
標準曲線と比較し、そして各細胞系／培地に関するＩｇ
Ｇ濃度を標準曲線から測定した。得られたデータを下記
第３表にまとめる。

４１１／４７．２　　基礎培地＋１％Ｎｕｔｒｉｄｏｍ
ａ　　　　　２．５〃　　　基礎培地＋１０％ＦＣ８６
０ ２４ｇ／８　　　基礎培地（のみ）　　　　　　　　　
１１　　　　基礎培地＋１％Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ　　　
　２．５１　　　　基礎培地＋１０％ＦＣ８５０１基礎
培地＋１％Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ　　　　５５＋５％ＲＡ
Ｗ　２６４．７ 〃　　　　基礎培地＋１％Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ　　　　
５５＋５％　８ＰＬ−４ ２４Ｅ／１０　　基礎培地＋１％Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ　
　　　５Ｉ　　　　基礎培地＋１０％ＦＣ８４５１基礎
培地＋１％Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ　　　　１０＋５％ＲＡ
Ｗ　２６４，７ （１）　　ＲＡＷ　２６４．７によシ産生された細胞増
殖因子を含有する馴化培地（Ｖ／Ｖ　’）。

（２）　　８ＰＬ−４によシ産生された細胞増殖因子を
含有する馴化培地（ｖ／ｖ　’）。

他の細胞系のいくつかを同じ増殖条件下に試験して、大
部分が単球／マクロファージＣＭ中に存在する増殖因子
に増殖およびＩｇＧまたはＩｇＭ産生の点で応答した。

１例（２４Ｅ／１０　＋１％Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ　＋　
５％ＲＡＷ　２６４．７）を除き、すべての場合に、工
ｇＧまたはＩｇＭレベルは１０％ＦＣＢを含有する培地
で得られたレベルと大ざつはに−致した。２４Ｅ／１０
＋増殖因子（ＲＡｗ２４６７）の場合においてすらも、
工ｇＧ含量は増殖因子なしの場合に見出される値の２倍
であった。種々の商業的に入手しうる低タンパク無血清
培地配合物も、単球／マクロファージによシ生成された
増殖因子が存在する場合にハイブリドーマ増殖を促進し
うるかどうか検べた。満足できるＩｇＧ産生が観察され
、そして製造者により低タンパク無血清配合物に一般に
推奨される予備的な細胞系の適応はいずれの場合も必要
なかった。一般に、増殖因子を含有しない無血清低タン
パク培地はへイブリドーマの増殖を促進しなかった。

（数例において、何ら予備適応を必要とせずかつ増殖因
子を添加しない低タンパク無血清培地中で高レベルのＩ
ｇＧを産生じたいくつかの細胞系、特にインビトロで長
期継代された細胞系が観察されたことは留意されるべき
である。）本発明の低タンパク無血清培地中でマルチプ
ル継代のために増殖された細路系は継続して増殖しそし
て高濃度で抗体を産生ずる。

第３表に示されるデータは、従来法の血清含有高タンパ
ク培地中で産生されるＩｇＧ　ｉ！　、および本発明の
低タンパク無血清培地中で産生される量がほぼ等しいこ
とを示している。

さらに、産生されたＩｇＧの抗原特異的力価をｇＬＩ８
Ａによ）測定すると、前記したＩｇＧ濃度と広く一致す
ることが判明し、このことから種々の増殖条件下に産生
された抗体が抗原結合性に関して同様の機能的能力を有
するという結論に達した。

Ｄ１種々の増殖条件下に産生されたｒｇＧの純度種々の
へイブリドーマ系を本発明の低タンパク無血清培地〔２
０μＭのエタノールアミンおよびクローン５ＰＬ−４，
５からのＬＰＳ−誘導（０，１Ｗ、／ｌ　　Ｓ、ｍ１ｎ
ｎｅｓｏｔａ　Ｒｅ　　５９５＊Ｒ１ｂｉ　　Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｈｅ　−ｍｉｃａｌｓ）上清α５％（ｖ／ｖ　）
を含有するＳＭ）を用いて集密となるまで増殖させた。

培地を除去して遠心分離し、細胞を含まない上清をＭｉ
ｎｉｃｏｎ使い捨て濃縮装置（Ａｍ１ｃｏｎ製）を用い
て５０Ｘに濃縮し、そしてサンプルをＳＤＢサンプル緩
衝液（最終濃度０．０６２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　
ｐｉ（＆８．１．０５％ＳＤＳ、１０％グリセリンおよ
び５％２−メルカプトエタノール）を用いて１：４また
は１：８に希釈した。サンプル１μノを１０−１５％５
Ｄ８ＰＡＧＥグラジエントゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製
）にかけ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐｈａｓｔ　Ｓｙｓｔ
ｅｍを用いて操作した。

電気泳動に続き、ゲルをこれもＰｈａｓｔゲルシステム
を用いてクマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓ
ｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ　）　Ｒ２５０で
染色した。乾燥したゲルをコダック（Ｋｏｄａｋ）　Ｅ
ＤＰシステムを用いて写真にとってクマシープルーによ
シ染色されたゲルを可視化した。

添付の図面で、レーン１および８は低分子量マーカーを
含有しており、上から順にホスホリラーゼｂ、９４，０
００ダルトン：ウシ血清アルブミン、６７．０００ダル
トン：卵アルブミン、４５，０００ダルトン；カルボニ
ツクアンヒドラーセ、３０，０００タルトン；大豆トリ
プシンインヒビター、２０．１（）Ｏダルトン；および
ラクトアルブミン、１４．４００ダルトンである。レー
ン２．３．４および５はそれぞれ細胞系３６１／１３．
１．２上清の１＝４希釈物、細胞系８５Ｊ／３４上清の
１：４希釈物、ｈａ胞系２９Ａ／４６．１上清の１＝４
希釈物、およびに」抱系１ｉｎｅ　４６／６７上清の１
：８希釈物の５０倍濃縮物を含有する。レーン６はエタ
ノールアミン、および５０×濃縮そして１：４ｇ５ｚさ
几た５ＰＬ４．３上清（０，５％ｖ／ｖ）を補添したＳ
Ｍを含有する。レーン７はタンパク質Ａカラムを用いて
腹水（濃度０．２■／−）から精製したＩｇＧ　（１６
７３１０，２）を含有する。

図面で判るとおり、本発明の培地中で増殖したハイブリ
ドーマから産生されたＩｇＧの純度が優れている。合成
培地（レーン６参照）からのトランスフェリンのみがＩ
ｇＧに加え認められうるほどの濃度で存在する（　Ｉｇ
Ｇの重鎮および軽鎖参照、レーン７参照）、示されては
いないが、ＰＣＢが用いられた場合は、主成分としてウ
シ血清アルブミンを用いると多数のバンドが存在した。

１０％ＦＣ８を含有する培地中で増殖した細胞からの上
清の電気泳動では、工ｇＧはＷ１認されさえしなかった
。

本発明の態様を要約して示せば次のとおシである。

１）細胞増殖因子の存在を改良点とする、ハイブリドー
マ増殖用の低タンパク無血清培地。

２）細胞増殖因子が無血清馴化培地の形態で添加される
ことからなる前記１項記載の培地０３）細胞増殖因子が
精製された形態で添加されることからなる前記１項記載
の培地。

４）細胞増殖因子が組換えタンパク質であることからな
る前記１項記載の培地。

５）タンパク含量が５０μｇ／−以下であることからな
る前記１項記載の培地。

６）細胞増殖因子が単球／マクロファージ特性を備えた
細胞系によシ産生されることからなる前記１項記載の培
地。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の培地中で増殖されたハイブリドーマから
得られた抗体のゲル電気泳動を示す写真である。 レ　　− 曽１ 響 嘲ｐ ｉ 嘲− 響 嘲−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 細胞増殖因子の存在を改良点とする、ハイブリドーマ増
   殖用の低タンパク、無血清培地。