JPH07502889A - 初乳フラクション、その製造方法および細胞培養培地補充物質としてのその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

初乳フラクション、その製造方法および細胞培養培地補充物質としてのその使用 方法 金型Ω分野 本発明は初乳フラクション、その製造方法、および細胞培養培地の補充物質とし てのその使用方法に関する。本発明による初乳フラクショ／は内毒素、タンパク 質および免疫グロブリン濃度が低く、そして前処理した初乳の限外濾過によって 製造される。 発咀９背景 試験管における哺乳動物細胞の培養では、基礎培地に哺乳動物の而ｔｎを補うの か慣例であり、これはいくつかの部分的に未知の細胞成長促進剤、例えば成長因 子、ビタミン、微量元素、ホルモン、結合タンパク質および付着因子を含む。た いていの目的に適した血清はウシ胎児血清であり、その価格は近年の需要の増加 につれて非常に高くなってきた。高価格の別の理由は、十分に純粋な血清の人手 に限界かあることである。高価格であるという以外の、血清についての別の問題 は、組成が複雑であり、そして特にタンパク質濃度が高いことである。これは生 成された物質を培養培地から単離する妨げとなる。また、血清を培地の補充物質 として使用すると、汚染のリスクが高くなる。技術的にも、経済的にも、単クロ ーン性抗体の製造は動物細胞培養技術の重要な部分を形成している。単クローン 性抗体は様々な臨床的および科学的目的のために大量に製造されている。半クロ ーン性抗体の大規模な製造では、適した培養培地を使用することが重要である。 抗体の製造は連続的かつ再現的でなければならない：プロセスコストはできるだ け低くしなければならない、抗体は容易に精製することができなければならない 、そして微生物および内毒素による汚染は避けなければならない。同じことは、 遺伝学的に処理した動物細胞の培養によって臨床目的に製造した成長因子、ホル モンおよびワクチンのような他の生物物質の製造にも当てはまる。しかしながら 、ウシ胎児血清を細胞培養補充物質として使用すると、これらの要件を満たすの は非常に困難である。 従って、各種基礎培地および血清代替物を開発することによって血清の使用に代 わるものを見いたす試みかなされてきた。これらには、生物学的合成により製造 されたまたは生物物質から直接１ｉ離された完全または不完全に精製されノこ成 長促進剤かある。そのような成長促進剤、例えばインシュリンおよびインシュリ ン類似成長因子（ＩＧＦ−１およびＩＧｌ”２）のような各種ペプチド成長因子 は血清ばかりでなくウシの初乳にも存在する。成長因子の合成、単離および精製 を行うのはｈ通難しく、文献では大規模生産に適した方法について何も教示して いない。精製成長因子を使用することは、コストが高いことでさらに制限され、 これは胎児血清のコストよりも高くなる。 牛乳およびチーズを製造する際に副生成物として得られる乳漿フラクションを、 Ｕ＋＋胞培養培地の補充物質として使用することは、文献から公九である。しか しなから、牛乳の成長促進活性は子を産んた後、急に減少し、出産して３日経つ やいなや並びにその後の乳の分泌段階では非常に低く、はとんど無視できる程度 となる。他方、牛乳は他の細胞成長促進剤、栄養物等を含んでいることが予想さ れ、これらが細胞の成長を促進する。 ウシの初乳およびそのフラクションはまた、試験官内の哺乳動物細胞の成長を促 進することも知られている。しかしながら、ウシの初乳には、細胞成長に必須な 多数の成分の他に、多量の免疫グロブリン、主にＩｇＧ、および他のタンパク質 、例えばカゼインミセル、α−ラク）・アルブこノ、β−ラクトグロブリンおよ びアルブミンか含まれる。乳の分泌直後のＩ　ｇＧｉｊ１度は４０−６０ｇ、／ ′ｌもの高い濃度である。初乳をそのままハイブリトーマ培養に用いると、バイ ブリド′−７生成物の単離および精製をさらに難しくするので不利なことは明ら かである。 別の重大な問題は、好冷栄養微生物、主に、貯蔵中の牛乳を腐敗させる最も一般 的な微生物であるグラム陰性バクテリアに関するものである。微生物によって製 造されるリボ多糖類（内毒素）は、グラム陰性ハタテリアによる感染症を伴う多 くの病聾生理学的作用の原因となる。すなわち、内毒素は極めて有害な汚染物質 であり、それらの除去は、細胞培養で製造される物質をヒトに用いようとすると き、特に必須のことであるっ リンデン等のヨーロッパ特許出願第２］９　３７２号には、特定の分子−盪を有 する普通の牛乳のフラクション、それ・）の製造および細胞培養培地における使 用についての記載がある。この特許は、牛乳をまず、大規模精製のために行うに は技術的に難しい超遠心分離を行うことを教示している。分別自体はその後、物 質によって分子刀イズカ撰なることに基つ（低い分離能力の限外濾過によって行 っている。従、）て、最終生成物のタンパク質濃度は成長促進活性に比べて非常 に高い。発明者等はまたチーズの製造の際の副生成物として得られる乳漿または 乳漿フラクションを哺乳動物細胞の培養に使用することも記載している（Ｂ　ｉ 　ｏ　ｔ　ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２（１９８８）、ｐ、 ２５３−２５８、Ｄａｍｅ　ｒｄｈ　ｊ　ｉ　ｉ等およびＬａ１ｔ　７０　（１ ９９０）、ｐ、３１３−３２４、Ｄｅｒｏｕｉｃｈｅ等）。ここでの問題はまた 非常に高いクン／ぐり質濃度並びに化学的および微生物学的汚染物質のリスクで ある。 ヨーロッパ特許出願第３１３　５１５弓、Ｂｒｋ、　Ｒ，Ｒ，＆　Ｃｏｘ、　Ｄ 。 には、牛乳中のポリペプチド成長因子、牛乳および乳製品からのその分離および 精製、並びに薬学的飲食物添加剤および細胞培養培地補充物質としてのその使用 か記載されている。この特許の方法は、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水 性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびポリアク リルアミドゲル電気泳動よりなる。上ですでに述べたように、牛乳の成長促進活 性は出産後、急に減少する。しかしながら、初乳およびその処理についてはこの 特許では触れていない。 クラゲスプランの米国特許第４，４４０，８６０号には、牛乳または初乳および フィブロネクチンを含有する細胞培養培地およびそのような培地の製造について の記載がある。フラクションは大規模生産に適さないゲル濾過および等電点電気 泳動によって製造されることが記されている。この特許には、最終生成物の微生 物学的純度をどのように確保するかについての記載はない。この特許に記載のフ ラクションの成長促進活性は、細胞培養培地に使用される最も一般的な種類の血 清であるウシ胎児血清と比較する代わりに、活性がそれよりかなり低い子ウシ血 清と比較している。フラクションの内毒素濃度については全く述べられていない 。さらに、この特許では、異なる種類の哺乳動物の初乳の成長因子フラクション は類似のものであると仮定し、ていることに注目すべきである。しかしながら、 後続の研究では、例えばウシおよびヒトの初乳の主な成長因子は、これらが同じ 方法で単離できない程度に互いに異なっていることを示している（Ｅｎｄｏｃｒ ｉｎｏｌｏｇｙ　１１５　（１９８４）、ｐ、２７３−２８２、シンク、Ｙ、　 Ｗ。 ＆　Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｍ）６ Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１４６巻、バーンス　Ｄ、およ びシルバスク、Ｄ、Ａ、編で、シンク等は陽イオン交換、等電点電気泳動および 高分解υ［除クロマトグラフィーに基づくウン初乳成長因子Ｌ：ＢＣＧＦ）の精 製方法を記載している。この方法は工業規模での成長因子の単離には適していな い。　７ランシス等はインシュリン類似成長因子ＩＧＦ−弓およびＩＧＦ−２を 、Ｂｉｏｃｂｅｍ、Ｊ、２５１　（１９８８）、ｐ、９５−１０３に記載の方法 によって、ウシ初乳から単離し、特性を示した。これらの成長因子は分子量かそ れぞれ８，０００および７，０ＯＯＤであり、構造は相当するヒト成長因子とほ ぼ同じである。この複雑な方法は、いくつかの陽イオン交換クロマトグラフィー および逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ工程のような多くの工程からなり、そのため大規模生産 には適していない。 従って、公知の方法はいずれも多くの工程からなり、実施が難しく、そして大規 模生産に適していない。複雑で時間のかかる精製操作もまた生産コストを増大さ せる。また、引用の文献に、最終生成物の微生物学的精製をどのように確実に行 うかについての記載がないことにも注目すべきである。これらは最終生成物の内 毒素濃度についても述べていない。引用文献には内毒素およびこれらによって生 じる問題についての記載はなく、従って、いずれもこれらの問題解決を示唆する ものではない。 初乳をこのような培養培地補充物質として使用するときの大きな欠点は、初乳の タンパク質およびＩｇ（４度が高く、そして普通、内毒素濃度が高いことである 。初乳中に存在するウィルスもまた細胞成長を妨げたり、あるいは細胞を殺した りする。初乳が高タンパク質濃度であることおよびこれに含まれる不溶性沈殿物 も初乳の処理を妨げ、そしてこれが不可能であると、ミクロフィルターを通して の例えば脱脂初乳の滅菌が難しくなる。多量の脱脂初乳を細胞培養培地に加える と、培地中に沈殿が生じるであろう。 介肌省柩！ 本発明の目的は、上記の難点を解消することであり、そしてタンパク質、内毒素 および免疫グロブリン濃度の低い成長促進活性を有する初乳フラクションを提供 することである。 本発明の別の目的は、上記初乳フラクションの製造方法を提供することである。 本発明の方法は前処理した初乳の限外濾過を用いるものであり、そしてまた大規 模生産に適したものである。 本発明はまた、上記初乳フラクションの細胞培養培地の補充物質としての使用方 法、および上記初乳フラクションを含有する細胞培養培地を提供するものである 。 凹面ｑ厘里薩逸盟 図１は、限外濾液（Ａ）、乳漿（Ｂ）および脱脂初乳（Ｃ）を補った培地での連 続培養時間の関数としての生存ＬＰＣＩ細胞数を示すものである。初期補充濃度 ：１％（・）、５％（マ）、１０％（■）、１５％（ム）および２０％（ｘ）。 乳漿および初乳は使用前に０．８および０．　２μｍフィルターで連続的に濾過 した。　図２は、１０％ＦＢＳ　（・）、実施例１て製造した１０％限外濾液（ ■）および実施例２で製造した１０％限外濾液（マ）中の連続培養時間の関数と しての生存ＬＰＣＩ細胞数を示すものである。 図３は、以下のように補充を行った培地におけるＬＦＣＩ、ＬＦＣ６およびＬＰ ＣＩハイブリドーマ成長の成長曲線を示す二１０％ＦＢＳ　＜・）、１０％限外 濾液（０）における、または５ｍｇ／Ｉのトランスフェリンのみを含む基礎培地 におけるＬＰＣｌ；１０％ＦＢＳ　（マ）または１０％限外濾液（）におけるＬ ＰＣＩ、および１０％ＦＢＳ　（■）または１０％限外濾液（ロ）中で培養した ＬＦＣ６゜ 図４は、】０％ＦＢＳ　（・）または１０％限外濾ｉｆ　（０）中で培養したＬ ＦＣｌ、および１０％ＦＢＳ　（■）または１０％限外濾液（ロ）中で培養した ＬＦＣ６によって製造されたＩｇＧの濃度を示すものである。 図５は、亜セレン酸ナトリウムの細胞成長・＼の影響を示す図である。ＬＰＣＩ 細胞を、０．　４μＭ　（０）　、２μＭ（△）、６μＭ（ロ）および２０μＭ （）亜セレン酸ナトリウムを補った１０％限外濾液中で培養した。（・）および （マ）はそれぞれ、亜セレン酸ナトリウムを含まない１０％ＦＢＳおよび１０％ 限外濾液中で培養したＬＰＧ１１ｍ胞を表す。 図６は、β−メルカプトエタノールの細胞成長に及はす影響をかす図である。 ＬＰ（ｌ細胞を、５μＭ（０）、１５μＭ（△）、５０μＭ（ロ）および１００ μＭ（）のβ−メルカプトエタノールを補った１０％限外濾液中で培養した。 （・）および（マ）はそれぞれ、β−メルカプトエタノールを含まない１０％Ｆ ＢＳおよび１０％限外濾液中で培養したＬＰＣＩ細胞を表す。 企灰の詳縄ρ逸叫 タンパク質および免疫グロブリン濃度か非常に低くそして内毒素濃度か無視てき る程：τのフラクションを、本特許出願の方法によってウシの初乳から製造しう ろことを意外にも見いだした。最終生成物は成長因子、微量元素、ビタミンおよ び初乳中に存在する細胞増殖に必須の他の低分子化合物を全て含む。それどころ か、牛乳に含まれる有害な内毒素か処理中になくなる。含まれると予想されるウ ィルス粒−トもおおかたなくなり、細胞培養最終生成物の汚染の恐れが自然にな くなる。　従って、本発明は内毒素、タンパク質および免疫グロブリンａ度が低 い初乳フラクションに関するものである。 本発明による初乳フラクションは、本発明の方法によって製造することができ、 この方法は１１１ｊ処理した初乳を］００，０００のカットオフを有する膜を使 用することによって限外濾過し、そしてｉｆｌを回収することよりなる方法であ る。 従って、本発明の方法は限外濾過に基づくものである。初乳は前処理して、脂肪 および含まれると予想される細胞破片を除去する。好ましいならば、乳漿溶液は 、例えば酸または酵素沈殿によりカゼインを除去することによって脱脂初乳にし てもよい。得られた脱脂初乳または乳漿を次に１００，０００のカットオフを有 する膜を用いることによって限外濾過し、そして濾液を回収する。従来の方法と 較へると、本発明の方法は大規模生産に極めて適しており、そして最終生成物の 純粋性は例えば滅菌濾過によってｌｉｔ実なものにすることができる。 カゼイン沈殿を行わない別の方法は、簡単でありかつ低コストで実施することが できるのでよりａ利である。他方、カゼ１′ン沈殿を行うと、これよりいくらか すぐれた生成物が得られる。すなわち、タンパク質および免疫グロブリン濃度が より低い限外ＮＧが得られる。 本発明による初乳フラクションはそれ自体でまたは他の補充物質を補うと、細胞 培養培地に広く使用されるウシ胎児血清に部分的にまたは完全に置き換わるもの として極めて有用なものである。亜セレン酸ナトリウム、インシュリン、エタノ ールアミン、β−メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン等のような１種以 上の補充物質を加えることによってフラクションの効果を向上させることができ る。 本発明による初乳フラクションはウシの初乳から製造される。原料は、出産後２ ０以内に搾った初乳が好ましい。初乳は処理する前、農場で冷凍してもよい。 脂肪および予想される細胞破片を、例えば、遠心分離、一般的な酪農用分離機ま たは濾過によって、まず初乳から除去する。 好ましければ、脱脂初乳を異なるサイズの１つまたはいくつかのミクロフィルタ ーに通して濾過することよりなる初乳の滅菌濾過処理を行う。滅菌濾過は必ずし も必要ではないが、これは限外濾過をスピードアップし、そしてフラクションの バクテリア含汀量を減少させる。 好ましければ、脱脂初乳をさらに処理してもよい。例えば、混合物のｐＨを下げ ることによる酸沈澱によって、カゼインを除去することができる。沈殿は例えば 塩化水素または酢酸によって行い、ｐＨは約４．５に下げる。沈殿を高温で行う と、微生物学的汚染物質を減少することかできる。沈殿はまた酵素によって行う こともできる。沈殿物は、遠心分離または接線膜濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　 ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｆ１１ｔｅｒ＞のような様々な方法によって分離することが できる。沈殿物を分離した後、混合物を中和し、そして得られた沈殿物を除去す る。このようにして、初乳乳漿を得る。 好ましければ、得られた淡黄色の初乳乳漿を上記のように滅菌濾過する。 次に、生成物を呼称分子量限度がｉｏｏ、ｏｏｏの膜を使用することによって限 外濾ｉし、膜を通過したａ液を回収する。 好ましければ、限外濾過フラクションを濃縮し、滅菌濾過および／または凍結乾 燥してもよい。好ましければ、フラクションをさらに精製してもよい。 使用する場合、本発明の初乳フラクションを培養培地に加える。フラクションの 最適濃度は約５−１５％であるが、これより少ない量でも使用することができる 。非常に高い濃度では、フラクションは細胞の成長を抑制する効果かある。好ま しければ、フラクションに添加剤または成長促進剤を補う。使用する薬剤および それらの濃度は細胞の種類によって変わる。例えば、ＬＰＣ１ハイブリドーマ細 胞を、亜セレン酸ナトリウムを補充した１０％の初乳フラクション中で成長させ るとき、亜セレン酸ナトリウｌ、の最適濃度は約０．４−２μＭであるが、３Ｔ ３細胞の場合の最適濃度は約０．４−１０１）μＭである。細胞を低い細胞濃度 （例えば、１５，０００細胞／ｍ１）で接種しても、ハイブリドーマはどのよう な適応工程もなしに、細胞培養培地に加えることができる。 ウシ胎児血清と比較して、本発明の初乳フラクションを補った培養培地において 得られる最高細胞濃度はより低い。しかしながら、経済的には本フラクションは ウシ血清と十分に競うものである。より良好な結果は、成長条件を最適なものに することによって得ることができる。本フラクションのタンパク質濃度が低いた め、培養細胞によって製造されたタンパク質、例えば屯クローン性抗体は、血清 を補った培養培地で得られたものより容易に精製することができる。治療用タン パク質の精製は、限外濾液の内毒素濃度が低いことによりさらに容易になる。 タンパク質および内毒素濃度が低いということは、確実に、製造されたタンパク 質を健康を損なうことなく人間に投与できるということである。 本発明を次の実施例によって説明するが、これらの実施例は本発明を限定するも のではない。トランスフエ１ルは、限外濾過を用いる上記の０ずれの細胞培養に も存在させた（５ｍｇ／′ｍｌ）。 失施刺上 ウシの初乳からのフラクションの製造 ウシの初乳を５つの異なる農場の１６頭の雌牛から集めた。１す・・ツタ−の初 乳試料を、乳を分泌し始めた直後の各雌牛の最初の５回の搾乳のそれぞれ力）ら 集め、直ちに冷凍した。５回の搾乳のそれぞれからの同量の初乳を混合するこ１ と１こよって８０リツターのハツチを製造した。この初乳を１１ルンターのアリ コート（こ分け、その後の処理のために一２０℃で貯蔵した。 初乳を解凍し、６０分間１０，０００ｇで遠心分離した。脂肪を含有する上層並 びに細胞破片および他の不溶性物質を含有する低部層を捨てた。２Ｍ−ＨＣｌを 添加することによってｐＨを４．６に調整してカゼインを沈殿させた。、昆合物 を１時間撹拌１１、次に沈殿物を４℃および６０分間１０，０００ｇで遠心分離 することによって除去した。乳漿は４℃で一晩インキユベートし、次１こ４Ｍの ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整した。沈殿物は上記のように室温で遠心分離する ことによって除去した。きれいにした乳漿を０．　８μｍおよび０．２２μｍフ ィルター（ミリボアー社、米国マサチューセッツ州べ・ンドフォード）で連続約 ６こ濾過し、濾液を呼称分子量限度が１００，０００のポリスルホン限外濾過プ レートを使用してミニタン装置（ミリポアー社）でさらに限外濾過した。限外濾 液を０．２２μｍフィルターで濾過し、−２０℃で貯蔵した。 ズ施彰主 ウシの初乳からのフラクションの製造、別の処理ノー法実施例１のように製造し た初乳フラクションを解凍し、脂肪、細胞破片および他の不溶性物質を分離器で 分離した。得られた脱脂初乳フラクションを０．８／Ａｍおよび０．２２μｍフ ィルター（ミリポアー社、米国マサチューセ・ソツ州へ・ソドフォード）で連続 的に濾過し、濾液を呼称分子量限度が１．００，０００のポリスルホン限外濾過 プレートを使用してミニタン装置（ミリボアー社）で限外濾過した。限外濾液を ０．２２μロフイルターで濾過し、−２０℃で貯蔵した。 友旌剋エ フラクションおよび中間　の特性決定 実施例１および２て得られた最終生成物および中間体のタン／′８り質濃度（よ 、ウシノ免疫プロプリンを基準として、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、７２　（１ ９７６’）　、ｐ、２４８−２５４に記載の方法によって測定した。単クローン 性抗体濃度は、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、１１４　（１９８８）、ｐ、１ ７５−１８０に記載のように、精製したマウスＩｇＧ−１を基準として、Ｐｒｏ Ａｎａ　（商標）Ｍａｌ）ＳタンパクｉＧカラム（ベルストルプ・７＜イオリテ イカ社、スエーデン　ル、ド）を使用して、ＦＰＬＣ（ファルマシア社、スエー デン、ウプサラ）によって測定した。得られた生成物の全タン／＜り質濃度およ びＩｇ（４度

【よ以下の表１に示す。 紅 ウシの初乳、乳漿および限外濾液のタンパク　およびＩ　Ｇａ度紙試料　１ｇＧ 　全タン７々り質 ｆよとｍ−［／１］ 脱脂初乳　２２，５±１．　０　６７、　１±７．５乳漿　１２．８±１．　１ 　１９．　６±０．３５限外濾液　０．２４±０．０１　１．１５±０．０２７ （実施例１） 限外濾液　０．８３０±０．３４１　３．４８±０．８８（実施例２） 内毒素はＢｕｌｌ、Ｊｏｈｎ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ　１１５　（ １９６４Ｌ　ｐ、２６５−２７４に記載のＬｉｍｕｌｕｓ　Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｃ　（ＬＡＬ）ゲル−クロット法によって測定し、試験キ・ソトはラ イティカー・バイオプロダクツ社（米国メリーランド州つォーカースビ／ｌ、） 力）ら入手した。内毒素標準はＥ、ｃｏｌｉ菌株０５５・Ｂ５からのものであっ た。対照標学内毒素（Ｃ３Ｅ）はｌ０ＥＵ／ｎｇであり、溶解産物の感度は０． ０６ＥＵ／ｍｌであった。分析は製造業者の指示に従って行った。希釈に使用し た水は発熱物質を含まないものであり（フィンランド　チュルクのＬｅｉｒａｓ 　０７社）、希釈は無菌状態で行った。内毒素のレベルは、溶解産物感度によっ て内毒素がプラスの終点となっｔ：試験溶液の最大希釈度の逆数を掛けることに よって計算した。既知濃度の内毒素のプラスの対照および発熱物質を含まない水 のマイナスの対照を各試験に用いた。生成物の内毒素濃度は表２に示す。 表１ ウシの初乳、乳　および限外濾液の内毒素濃度試料　内毒素濃度 ［ＥＵ／ｍｌ］ 脱脂初乳　７．７±５．５ 乳漿　０．６６±０．３６ 限外濾液　＜０．２４ （実施例］） 限外濾液　〈４６ （実施例２） 実施例１のように製造した限外濾液は０．２４ＥＵ／ｍ１未満の内毒素を含有し ていた。実施例２で製造した生成物はより高い内毒素濃度を示したが、血清を用 いて製造した生成物よりは高くなかった。限外濾液および初乳はＬＡＬ試験の妨 害剤をいくらか含んでいたが、それらの影響は試料を希釈１．（１：２Ｌそして １００℃で約２分間加熱することによって解消することができた。 犬施珂土 フラクションのハイブリドーマ細胞培養における使用ハイブリドーマの製造 Ｂａ１ｂ／ｃマウスに２００ｇｇのラクトフェリ７（シグマ・ケミカル社、米国 ミズリー州セントルイス）または２００ｇｇのラクトペルオキシダーゼ（シグマ 社）のいずれかを３週間毎に腹腔的投与して免疫化した。最初のブーストおよび 次の２つのブーストはそれぞれ完全および不完全７０インドアジユバントに加え て与えた。最後のブーストはリン酸塩バッファー食塩水（ＰＢＳ）に加えて与え た。細胞出合のために、最後のブーストの３日後に各動物の膵臓を集めた。Ｍｅ ｔ、ｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　７３　（１９７５）、ｐ、３−４６に記載のよ うに、膵臓リンパ球をＸ６３．Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞と融合し、Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 ａｎｄＭｏｌｃ＋：ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（バートン　Ｒ，Ｈ，およびニラ ペンバーブ　ＰＨ１編、エルセピア・サイエンス出版、オランダ、アムステルダ ム）に記載のように抗ラクトフェリンおよび抗うクトペルオキシダーセ抗体を生 じるハイブリッド細胞を酵素結合イムノソルベント分析ＣＥＬＩＳＡ）によって スクリーニングした。抗体のサブクラスは市販のキット（マウスータイパーサブ アイソタイピングキ・ソト、バイオ−ラッド社、米国カルフォルニア州すッチモ ンドおよび七ロチツク社、英国オックスフォードンを使用して製造業者の指示に 従って測定した。クローンＬＦＣ６およびＬＦＣｌはサブクラスＴｇＧ−１の抗 ラクトフェリン抗体から製造され、そしてＬＰＣＩは同しサブクラスの抗ラクト ペルオキシダーゼ抗体から製造された。 ハイブリドーマの培養 ４ｍＭのグルタミン、１００　Ｕ、、’ｍ　Ｉのペニシリンおよび１００μｇ／ ｍ＋のストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭ培地（ダルベツコの変性イーグル基 礎培地、フロー・ラボラトリーズ社、英国スコツトランド）（基礎培地）で細胞 を成長させた。ストック培養物を、７％ウシ胎児血清（フロー社）を補った７５ ｃｍ２のプラスチックフラスコ（コスタ−社、米国マサチューセッツ州ケンブリ ッン）中で維持した。継代培養の場合、指数段階で成長している細胞を５分間４ ００ｇで遠心分離ｊ−だ。上澄み液を捨て、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。次に 、細胞を、ヒトトランスフェリン５ｍｇ／Ｉ（シグマ社）を補った既知濃度（０ −２０％）のウシ胎児血清、脱脂ウン初乳、乳漿または限外濾液を含有する培地 に懸濁した。試験培地中の細胞を６穴マイクロタイタープレート（コスタ−肚） に１５゜０００細胞／ｍｌの濃度で移植し、培地を変えずに１−１２日間培養し た。細胞のカウントは細胞生存率を測定するためにトリパンブルー排除を用いる 血球計で２回行った。 結果は図１にグラフで示す。生存ＬＰＣＩ細胞の数を、限外濾液（Ａ）、乳漿（ Ｂ）および脱脂初乳（Ｃ）を補った培地での連続培養時間の関数として示す。 実施例１のように製造した補充物質を次の量で培地に加えた＝１％（・）、５％ （マ）、１０％（■）、１５％（ム）および２０％（×）。１０％の限外濾液を 使用したときに、最高細胞濃度５．　３１　Ｘ　１０”ｙ’ｍ　ｌが得られた（ 図ｉＡ）。 脱脂初乳では、１％の初乳を使用したときに、最高細胞数４．　６１　ｘ　］　 ０’／ｍｌか得られた（図ＩＣ）。全ての乳漿濃度で、細胞濃度は低いままであ った（図ＩＢ）。 図２では、ＬＰＣ１細胞の成長を１０％０％ウシ胎清（・）、実施例１のように 製造した１０％限外濾液（■）および実施例２のように製造した１０９＜限外濾 液（マ）において比較する。 異なる方法で補った培地におけるＬ　Ｆ　Ｃ１、ＬＦＣ６およびＬＰＣ１ハイブ リドーマの成長曲線を図３に示す。ハイブリドーマＬＰＣ１は】０％ウシ胎児血 清く・）、１０％限外′ｔａ液（０）および５ｍｇ／ｍｌのトランスフェリンだ けを補った基礎培地（ム）で成長させた。ハイブリドーマＬＦＣ１は１０％０％ ウシ胎清（マ）および１０％限外濾液（）で成長させ、ハイブリドーマＬＦＣ６ は１０％０％ウシ胎清（■）および１０％限外濾液（ロ）で成長させた。 細胞系の成長特性に変化は観察されなかった。最高ハイブリドーマ細胞濃度は１ ０％０％ウシ胎清での１３．６−１５．８ｘｌＯ’／ｍｌおよび１０％限外濾液 での５．１２−５．６４ｘ１０６／ｍｌであった。従って、限外濾液で得られた 最高細胞濃度は、胎児血清で得られたものの約３５−４０％であった。ハイブリ ドーマの倍加時間は胎児血清および限外濾液でそれぞれ約１７時間および約３５ 時間であった。基礎培地をトランスフェリンのみて補うと、ハイブリドーマ成長 は無視できる程度しかなかった。他方、限外濾液はトランスフェリンの不在下で はハイブリドーマの増殖を促進することができなかった。 単クローン性抗体の製造 図４は、それぞれ１０％のウシ胎児血７ｉ　（Ｆ　Ｂ　Ｓ）および１０％の限外 濾液（ＵＦ　＞を含有する培地でのＬＦＣ１およびＬＦＣ６ハイブリトーマ細胞 の抗体製造を示す［ＬＦＣｌ　：ＦＢＳ　（・）　、ＦＵ　（０）；　ＬＦＣ６ ：　ＦＢＳ　（■）、ＵＦぐ口）］。１１２日の連続培養の後、１０％限外濾液 の抗体濃度はそれぞれ、１０％胎児血清（ＬＰＣＩの場合は８３．５ｍｇ／］、 そしてＬＦＣ６の場合は７２．０ｍｇ７／ｌ）を使用したとき得られた抗体濃度 の４０％（ＬＦＣＩ）および４２％（ＬＦＣ６）であった。 実施例１のように製造したフラクションの他の細胞成長への影響を、３つの異な る種類の細胞を用いることによって調べた。Ｖｅｒｏ　（アフリカミドリザル、 Ｃｃｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ　ａｅｔｈｉｏｐｓ、の腎臓細胞系、ＡＴＣＣＣＣ Ｌ　８］）、Ｃｌｌ０−Ｋｉ　（チャイニーズハムスター、Ｃｒ　ｉｃｅ　ｔｕ 　ｌｕｓｇｒｉｓｅｕｓ、の卵巣細胞系、ＡＴＣＣＣＣＬ　６１）および３Ｔ３ （７ウスの胎児の線維芽細胞系、ＡＴＣＣＣＣＬ　９２）細胞を、様々な量の限 外濾液を含有する基礎培地で成長させた。ストック培養物を１０％０％ウシ胎清 中で貯蔵した。継代培養物を得るために、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、そして様 々なＩ’Ｘ１（０−２０％）の限外濾液および５ｒｎｇ／ｍｌのトランスフェリ ンを補った基礎培地に懸濁した。試験培地中の細胞を２４穴マイクロタイタープ レート（コスタ−社）に２０，０００生存細胞／ｍ＋の濃度で移植し、培地を変 えることなく７１−１間培養した。細胞のカウントはトリパンブルー排除によっ て血球討て２回行った。結果は表３に示す。 限外濾液　細胞／ｍｌ 濃度　Ｖｃ　ｒｏ　ＣＨＯ−Ｋ　ｉ　３Ｔ３２０％　２６，０００　１３，００ ０　４６，０００１５％　＋１６．０００　１７，０００　］０８，０００１０ ％　１３３，０００　１６，０００　８＋、０００５％　５１．０００　７，８ ００　４７．０００１％　１１．　０００　０　？、８０ＱＯ％　１９，０００ 　５，６００　２．２００結果から、限外濾液は全ての細胞系の成長を促進する が、種類の異なる細胞は異なる方法で反応することが分かる。１％の低い限外濾 液濃度ですでに効果があり、５−１５％の濃度で有利であり、１０−４５％の濃 度で特に有利である。 実施例Ａ フラクションの補充 本発明の限外濾液生成物は常にトう〉スフニリンを含有している。さらに、その 成長促進性は様々な補充で向上させることができる。亜セレン酸ナトリウムおよ びβ−メルカプトエタノールを加えたときの３７３細胞・＼の影響を以下の方法 で調べた。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、そして１５％の限外濾液、５ｍｇ／ｍｌ のトランスフェリンおよび様々な量の亜セレン酸ナトリウムまたはβ−メルカプ トエタノールを捕った基礎培地に懸濁した。細胞の培養およびカウントは実施例 ４および５のようにして行った。結果は表４に示す。 １竺に４丸１已じ僅４４ブｆニム火丸エトとＬ什プ」１ヒ力班外濾液の細胞成　 への５ β−ＭｅＯＨ細胞／ｍｌ　Ｎａ−亜セレン酸塩　細胞／ｍｌ−ユＬＭＬ−−［ｎ Ｍ） ０　６９、　０００　０　６９．　００００．５　６１．ｏｏｏ　０．４　１１ １，０００１．０　１５９，０００　４．０　１２８，０００５．０　１４７， ０００　４０　１０９，０００１０　１３０．０００　１００　１３６，０００ ２０　９０．０００　３００　？４，０００図５および６はそれぞれ、亜セレン 酸ナトリウムおよびβ−メルカプトエタノールのＬＰＣＩハイブリトーマ細胞の 成長への好ましい影響を示す図である。細胞は０．４μＭ（０）、２μＭ（△） 、６μＭ（ロ）および２０μＭ（）の亜セレン酸ナトリウム（図５）および５μ Ｍ（０）、１５μＭ（△）、５０μＭ（ロ）および１００μＭ（）のβ−メルカ プトエタノール（図６）を補った１０％限外濾液中で成長させた。（・）および （マ）はそれぞれ、上記化合物を加えない１０％ウシ胎児血清および１０９６限 外濾液てのＬＰＣＩ細胞の成長を示す。 結宋から、補充の効果および有用な濃度範囲は細胞の種類で異なることが分かる 。例えば、亜セレン酸ナトリウムは非常に少＠（す、ノモルレヘル）でも促進効 果を有するのに対し、β−メルカプトエタノールはミクロモルレベルでのみ効果 が得られる。 ＦＩＧ、　１Ａ　ＦＩＧ、　１Ｂ 培養時間（Ｄ）　培養時間（Ｄ） ＦＩＧ、　ＩＣＦＩＧ、　２ ＦＩ０．３ 培養時間（Ｄ） 培養時間（Ｄ） ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、　６ 培養時間（Ｄ） 培養時間（Ｄ） ＦＩＧ、５ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　６年　４月１ｓｌｌＴｈ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．内毒素、タンパク質および免疫グロブリン濃度の低い初乳フラクション。
2. ２．前処理したウシの初乳の限外濾液によって製造される、請求項１の初乳フラ クション。
3. ３．１００，０００のカットオフを有する膜を使用することによって前処理した 初乳を限外濾過し、そして濾液を回収することよりなる、初乳フラクションの製 造方法。
4. ４．初乳の前処理が脂肪および含まれると予想される細胞破片を従来の方法で除 去することよりなる、請求項３の方法。
5. ５．前処理がさらにカゼインを沈殿によって除去することを含む、請求項４の方 法。
6. ６．請求項１の初乳フラクションを細胞培養培地の補充物質として使用する方法 。
7. ７．その効果を他の補充物質も加えることによって向上させる、請求項６の初乳 フラクションの使用方法。
8. ８．亜セレン酸ナトリウムまたはβ−メルカプトエタノールを初乳フラクション に加える、請求項７の初乳フラクションの使用方法。
9. ９．請求項１の初乳フラクションを含有する細胞培養培地。
10. １０．請求項３の方法によって製造される初乳フラクション。