JPH01119754A - 生理活性物質の分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 皮栗上皇肌朋公立 本発明は生理活性物質に対する抗原抗体反応を利用して
、抗体が電極表面に結合された免疫センサを用いて生理
活性物質の存在量を検知、分析する方法に関する。

従来Ω肢歪 生理活性物質は少量であっても大きな生理活性を有し、
生体等に対して特異な作用を及ぼすところから、微量の
生理活性物質の検知や定量のための分析法が種々提案さ
れている。

このような微量の生理活性物質の分析に当って抗原抗体
反応を利用する方法があるが、分析しようとする生理活
性物質に対して特異的に結合する抗体に蛍光物質などを
結合しておくかまたは放射性元素などで標識しておき、
該生理活性物質と結合した抗体の量を検知分析する方法
や、基材上に固定した抗体に対して抗原である生理活性
物質が結合することにより基材の表面の物理的性質が変
化することを利用した免疫センサ法などがある。

このうち基材表面の電位変化によって固定抗体に対する
抗原の結合量を検知しようとする免疫センサ法において
は、抗体を固定した単位電極をセンサとして用いる方法
や抗体を固定した電界効果トランジスタをセンサとして
用いる方法が考えられるが、これら従来の免疫センサ法
はいづれも感度が低く、測定の再現性が乏しいため実用
化されるに至っていない。

万”ン１しようとする。ト、占 そこで本発明は、抗体を固定した電極を有する免疫セン
サを用いて、抗原となる生理活性物質の存在量を高精度
で検知することができる改良された分析方法を提供しよ
うとするものである。

〔発明の構成〕

、１′″占を”ンするための 前述のような本発明の目的は、存在量を検知しようとす
る生理活性物質を抗原とする免疫抗体を電極表面に共有
結合によって直接に結合固定してなる免疫センサを用い
て分析を行なうに当って、別途に該生理活性物質と荷電
を有する物質とを結合させて得た電荷量の制御された荷
電抗原が所定濃度で含まれた比較溶液を準備し、一方、
該荷電抗原を濃度未知の該生理活性物質の溶液に対して
該所定濃度となるよう添加した測定溶液を得、次いで、
該免疫センサの電極面に該測定溶液の充分量を接触させ
て得た測定出力値と同様にして該比較溶液の充分量を接
触させて得た比較出力値とを比較することを特徴とする
分析方法によって達成される。

本発明において用いられる免疫センサは、生理活性物質
を抗原とする免疫抗体を電極表面に共有結合によって直
接に結合固定してなるものであり、かかる免疫センサは
、電極表面上に水酸基が表面に生成し得る金属の層を形
成し、次いで該金属の層の表面を酸化して水酸基を生成
させ、該表面にエポキシ基を含存するシラン化合物を接
触させて該水酸基と該シラン化合物とを反応させ、更に
免疫抗体溶液を反応条件下に接触させて該エポキシ基と
該免疫抗体とを共有結合させることにより製造できる。

本発明で用いられる電極たとえば電界効果トランジスタ
（ＦＥＴ）のゲート電極はたとえばシリコンウェハなど
を用いて、従来公知のイオン打込み、蒸着、フォトエツ
チングなどの半導体製造技術によって製作することがで
きる。もちろん、基板はシリコン金属のみならず、ゲル
マニウムなどであってもよく、またガリウム・ヒ素など
の化合物半導体材料であってもよい。かかる電極たとえ
ばＦＥＴ等は、製作の最終的段階においては、電極面と
くにゲート電極面が金属層によって被覆されるが、かか
る金属化電極面は酸化して水酸基を生成するものである
ことが必要で、たとえばシリコンやゲルマニウムなどが
用いられる。電極の表面が金属シリコンで形成されてい
るときには、表面に含湿空気を接触させることにより水
酸基が容易に生成する。

電極表面に免疫抗体を共有結合によって固定するには、
表面に存在する水酸基に対してエポキシ基とケイ素原子
に結合した反応活性な水素、アルキル基、アルコキシ基
などの基とを有しているシラン化合物を反応させて電極
面にエポキシ基を固定し、次いでこれに免疫抗体を接触
させることによりエポキシ基と免疫抗体の中のアミノ基
とを反応させて共有結合を生成させる方法を用いること
ができる。

このように免疫抗体を固定するに用いられるシラン化合
物は、電極表面の水酸基と反応活性な基とが反応して５
ｉ−０結合を生成するに当って未反応のままで残るエポ
キシ基を少なくとも１個以上有するものがよく、たとえ
ばγ−グリシドキシプロピル・トリメトキシシランなど
が好ましく用いられる。このようなシラン化合物は、そ
のまま、または適宜の溶剤で希釈して水酸基を有する電
極表面と接触させ、必要な時間保持することによって反
応させる。このようにして反応性のエポキシ基を表面に
固定した電極上に所望の免疫体抗体を固定するには、た
とえば適当な値のｐＨを有する緩衝溶液に溶解した免疫
抗体または免疫抗体を結合したペプチド化合物等を電極
面に接触させ、必要な時間保持することによって免疫抗
体等のアミン基と電極上のエポキシ基とを反応させる。

また、免疫センサを得るために用いられる免疫抗体は、
センサによって検知しようとする物質の免疫活性構造に
対して相補的な、抗原抗体結合部位を有しているものを
選択して用いることが必要であり、かかる抗体としてた
とえばマウスに抗原となる物質を注射し、それにより増
殖したリンパ球が産生ずる免疫グロブリンを分離、精製
して用いることができる。こうして得た免疫抗体を電極
上に共有結合により固定した免疫センサは、特定の抗原
物質とのみ選択的に結合し他種の物質とは全く結合しな
い特性をそなえている。

このようにして得られた免疫センサは、抗原を含む水溶
液と接触するとき特定のｐＨ条件下で定量的に抗原と結
合し、また、抗体の抗原認識部位の構造が変化するよう
なｐＨ条件の洗浄液を用いて洗浄することにより抗原と
の結合を解くことができるから、繰返して使用できるも
のであり、抗体が電極表面に共有結合によって固定され
ているから抗原が有している電荷の量に対応する電気出
力が精度よく得られる。

このような特性を有する免疫センサを用いて抗原物質の
分析を行なうに当っては、荷電を有する物質を抗原に結
合させた荷電抗原を別途に準備しておくことが必要であ
る。かかる荷電を有する物質としては、前述の抗原抗体
反応がおこるｐｌ（条件下において安定した高い荷電状
態にあり、かつ抗原抗体反応を阻害することなく抗原と
容易に結合できる物質を選択することが必要で、たとえ
ば塩基性蛋白質であるアビジン（分子ｆｆｉ　：　６６
．０００、等電点：Ｉｏ、５）などが用いられる。

このような荷電を有する物質を抗原に結合させるに当っ
ては、これらを直接に化学反応により共有結合させても
よいが、適宜の化合物による架橋結合を利用してもよい
。たとえば抗原がペプチド化合物であるときは、たとえ
ばアビジンと特異的に結合する性質を有するビオチンを
あらかじめ該抗原とアミド結合させてビオチン化ペプチ
ド化合物を得、ついでこれとアビジンとを結合させるこ
とによりアビジン結合ビオチン化抗原を得る方法を用い
ることができる。

こうして得られた荷電抗原は、充分に精製したのち濃度
既知の溶液として準備されることが必要であり、これを
薄めて所定濃度ｘ０の荷電抗原を含む比較溶液を得る。

この比較溶液を前記の免疫センサの電極面に接触させる
と、電極面上に結合固定された抗体には比較溶液中の荷
電抗原が結合して飽和するから、免疫センサの出力は一
定値ｙ０に収斂する。

次に、濃度未知の抗原を含む溶液を用いて前記の荷電抗
原溶液を薄め、荷電抗原の濃度が前記の比較溶液の濃度
ｘ０と一致するような測定溶液を得る。この測定溶液に
は濃度ｘ０の荷電抗原と濃度Ｘの抗原とが含まれている
ので、前記の免疫センサの電極に測定溶液を接触させた
ときの免疫センサの出力値ｙは、前記の出力値Ｙｏより
小となる。従って、かかる出力値ｙと抗原濃度Ｘとの関
係をあらかじめ求めておくことにより、未知の抗原濃度
を知ることができるものである。

参　　１）　（＝　のれ−１）） 生血端アルブミン１００ｍｇをｐＨ７，５の０．１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝溶液１０−に溶解し、ダンシルクロ
リド２ｍｇを含むアセトン溶ン’ｐｉ　Ｑ、５　ｍｌを
ン昆合して、４℃で１昼夜反応させた。得られた反応生
成物を、ｐＨ７，２の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶
液で１週間透析して低分子量物質を除去し、ダンシル化
牛血清アルブミン溶液を得た。

参　　１２　（−〇Ｗ 上記のダンシル化牛血清アルブミンを抗原としてマウス
に注射した後、細胞融合法により得たダンシルに対する
モノクローン抗体を産生ずる雑種細胞をマウス腹腔内に
１０７個接挿し、３週間乃至１ケ月後に蓄積した腹水を
採取し、遠心分離にかけて上澄液を得た。一方、ＩｇＧ
タイプの抗体と特異的に結合するプロティンＡをセファ
ロース上に固定した充填剤を充填し、あらかじめｐＨ７
，２の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝生理食塩水で膨潤
させておいたカラムに対し、腹水上澄液を通してその中
に含まれている免疫グロブリン（抗体）を吸着分離し、
次いで０．１　Ｍ酢酸（ｐＨ３，１）で溶出して抗体を
脱離回収した。得られた抗体の溶液は、同量のｐＨ６，
５の０．５　Ｍリン酸ナトリウム緩衝溶液と混合してｐ
ｔ＋を７．２に調整した。

参−１３（センサの　１） Ｐ型シリコンウェーハを用い、公知のＮＭＯ３製造技術
を適用して、チップ寸法が７．２　Ｘ　３．６　＋ｎの
ＦＥＴを製造した。この際、ソース、ドレンおよびゲー
ト上にはＣＶＤ法によりポリシリコン層を設け、ソース
およびドレン電極にはアルミニウムの配線を蒸着したの
ち、厚さ１．２μｍの窒化シリコンの絶縁層で被覆し、
その後ゲート電極上の窒化シリコン層を除去して１．５
　Ｘ　３　龍の窓を形成した。ゲート電極上のポリシリ
コンの表面を、室内の空気に暴露することにより、水酸
基を形成した。

このシリコンチップのソースおよびトーレン電極にリー
ド線を取り付けたのちに、ゲート電極の窓を残してすべ
てを覆うようにシリコーンゴムの防水被膜を付けた。

これをトリクロルエチレン、アセトン、エタノールを用
いて順次洗浄し、乾燥したのちＴ−グリシドキシプロピ
ル・トリメトキシシランを表面上に滴下し、９０℃の恒
温器中で１５分反応させ、エポキシ化電極を得た。

次に、参考例２で得た抗体溶液をｐｌ＋９．５の１Ｍ炭
酸ナトリウム緩衝溶液に混合して抗体濃度０．２■／−
の溶液を調製し、これを前記のエポキシ化電極上に滴下
し、湿度１００％の雰囲気内で室温で１６時間反応し、
その後生血清アルブミンの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝生理食塩水中１％溶液に１時間浸漬して未反応のエポ
キシ基を封鎖した。さらに未反応のペプチドなどを１０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝生理食塩水で５回洗浄するこ
とにより除去し、抗体固定ＦＥＴを得た。

また、同様にして抗体溶液を電極上に接触させることを
省略して牛血清アルブミンの１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝生理食塩水中１％溶液に１時間浸漬し、エポキシ化
電極上に牛血清アルブミンだけを固定した対照ＦＥＴを
得た。

このようにして得た抗体固定ＦＥＴと対照ＦＥＴは、１
組として差動型電圧増幅回路の入力に接続し、免疫セン
サとして次の実施例において使用した。

実Ｊ１舛 （１）荷電抗原の調整 参考例１で得たダンシル化牛血清アルブミンを０．１Ｍ
炭酸水素ナトリウム溶液中に１ｍｇ／ｍｆとなるように
希釈し、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で１日間透析
してリン酸イオン等を除去し精製溶液とした。又別に調
製したビオチンのＮ−サクシニミドエステルの１■／　
ｍｌのジメチルスルホキシド溶液を、前記のダンシル化
牛血清アルブミンの精製溶液１容に対して０．０６容の
割合で混合し、室温で４時間反応させた。得られた反応
生成物をｐＨ７，２の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶
液で３日間透析して溶剤その他の低分子量物質および他
種の塩類を除去して精製した。

続いて、アビジンをｐＨ７，４の２ｍＭ）リス（Ｔｒｉ
ｓ）緩衝溶液に溶解したものの中へ、前記のビオチン結
合ダンシル化牛血清アルブミン溶液をビオチンのモル量
がアビジンのモル量より少くなるように加え、室温で３
０分反応させ、その生成物をｐＨ７，２の１０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝溶液で３日間透析して溶剤その他の不
純物を除去し、アビジンがビオチンを介して結合してい
る荷電抗原の精製溶液を得た。

得られた荷電抗原は、ビオチン１個に対してアビジンが
１個だけ結合したものであった。

（２）免疫センサの出力と抗原濃度の関係ｐＨ７，４の
２ｍＭ）リス緩衝ン容ン夜５０ｍ１中にアビジンとして
２μＭとなるように荷電抗原を加え、２５℃に保って、
参考例３によって得た免疫センサを浸漬してその出力を
測定した。

また、同様にアビジンとして２μＭの荷電抗原を加える
と共に参考例１で得た抗原をそれぞれ、０．０９．０．
１．０．２５．１μＭの濃度となるように加えた前記同
様のトリス緩衝溶液各５０−を用意し、同様にして免疫
センサの出力を測定した。

なお、各測定を行なったのちに、免疫センサをｐＨ３，
０の０．１　Ｍグリシン−ＨＣ１溶液に浸漬し、次いで
ｐＨ７，２の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝生理食塩水
溶液で洗浄することを反復して、電極上の抗体に結合し
た抗原を除去して免疫センサの再生を行ない、次の測定
を実施した。得られた出力値を第１表に示すが、誤差範
囲内で良好な再現性を有するものであった。

第　　１　　表 抗原濃度　　　０　０．０９　　０．１　０．２５　　
１μＭ／ｄ センサ出力　　１　０．８５　　０．５　０．３　　０
．２（相対値） 以上の結果から、濃度未知の抗原を含む溶液を用いて同
様の測定を行なうことにより、免疫センサの出力から抗
原の濃度を知ることが可能であることがわかる。

（発明の効果） 本発明の生理活性物質の分析方法は、該生理活性物質を
抗原とする抗体を電極表面に直接に固定した免疫センサ
を用いると共に、抗原抗体の結合反応に対して好適なρ
ＩＩ環境下において大きな電荷を持つ、たとえばアビジ
ンのような物質をたとえばビオチン等を介して該生理活
性物質と結合させて得た荷電抗原を準備し、このような
荷電抗原を抗原と共存させた状態で免疫センサの出力を
測定することによって抗原の存在量を検知するようにし
たものである。従って、微量の抗原物質をその種類によ
らず高感度で検出分析することができ、しかも再現性が
よく他の共存物質の妨害を受けることがないという特長
を有するものである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）生理活性物質を抗原とする免疫抗体を電極表面に
   共有結合によって直接に結合固定してなる免疫センサを
   用いて該生理活性物質の存在量を検知するに当り、別途
   に該生理活性物質と荷電を有する物質とを結合させて得
   た電荷量の制御された荷電抗原が所定濃度で含まれた比
   較溶液を準備し、一方、該荷電抗原を濃度未知の該生理
   活性物質の溶液に対して該所定濃度となるよう添加した
   測定溶液を得、次いで、該免疫センサの電極面に該測定
   溶液の充分量を接触させて得た測定出力値と同様にして
   該比較溶液の充分量を接触させて得た比較出力値とを比
   較することを特徴とする、生理活性物質の分析方法。
2. （２）荷電抗原が、生理活性物質に対してビオチンを介
   してアビジンを結合して得られたものである、特許請求
   の範囲第１項記載の分析方法。