JPH0617893B2

JPH0617893B2 - 生理活性物質の分析方法

Info

Publication number: JPH0617893B2
Application number: JP62277367A
Authority: JP
Inventors: 善博熊谷
Original assignee: LIFE TECH KENKYUSHO
Current assignee: LIFE TECH KENKYUSHO
Priority date: 1987-11-04
Filing date: 1987-11-04
Publication date: 1994-03-09
Anticipated expiration: 2009-03-09
Also published as: JPH01119754A

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の目的〕産業上の利用分野本発明は生理活性物質に対する抗原抗体反応を利用し
て、抗体が電極表面に結合された免疫センサを用いて生
理活性物質の存在量を検知、分析する方法に関する。

従来の技術生理活性物質は少量であっても大きな生理活性を有し、
生体等に対して特異な作用を及ぼすところから、微量の
生理活性物質の検知や定量のための分析法が種々提案さ
れている。

このような微量の生理活性物質の分析に当って抗原抗体
反応を利用する方法があるが、分析しようとする生理活
性物質に対して特異的に結合する抗体に蛍光物質などを
結合しておくかまたは放射性元素などで標識しておき、
該生理活性物質と結合した抗体の量を検知分析する方法
や、基材上に固定した抗体に対して抗原である生理活性
物質が結合することにより基材の表面の物理的性質が変
化することを利用した免疫センサ法などがある。このう
ち基材表面の電位変化によって固定抗体に対する抗原の
結合量を検知しようとする免疫センサ法においては、抗
体を固定した単位電極をセンサとして用いる方法や抗体
を固定した電界効果トランジスタをセンサとして用いる
方法が考えられるが、これら従来の免疫センサ法はいづ
れも感度が低く、測定の再現性が乏しいため実用化され
るに至っていない。

解決しようとする問題点そこで本発明は、抗体を固定した電極を有する免疫セン
サを用いて、抗原となる生理活性物質の存在量を高精度
で検知することができる改良された分析方法を提供しよ
うとするものである。

〔発明の構成〕

問題点を解決するための手段前述のような本発明の目的は、存在量を検知しようとす
る生理活性物質を抗原とする免疫抗体を電極表面に共有
結合によって直接に結合固定してなる免疫センサを用い
て分析を行なうに当って、別途に該生理活性物質と荷電
を有する物質とを結合させて得た電荷量の制御された荷
電抗原が所定濃度で含まれた比較溶液を準備し、一方、
該荷電抗原を濃度未知の該生理活性物質の溶液に対して
該所定濃度となるよう添加した測定溶液を得、次いで、
該免疫センサの電極面に該測定溶液の充分量を接触させ
て得た測定出力値と同様にして該比較溶液の充分量を接
触させて得た比較出力値とを比較することを特徴とする
分析方法によって達成される。

本発明において用いられる免疫センサは、生理活性物質
を抗原とする免疫抗体を電極表面に共有結合によって直
接に結合固定してなるものであり、かかる免疫センサ
は、電極表面上に水酸基が表面に生成し得る金属の層を
形成し、次いで該金属の層の表面を酸化して水酸基を生
成させ、該表面にエポキシ基を含有するシラン化合物を
接触させて該水酸基と該シラン化合物とを反応させ、更
に免疫抗体溶液を反応条件下に接触させて該エポキシ基
と該免疫抗体とを共有結合させることにより製造でき
る。

本発明で用いられる電極たとえば電界効果トランジスタ
（ＦＥＴ）のゲート電極はたとえばシリコンウエハなど
を用いて、従来公知のイオン打込み、蒸着、フォトエッ
チング半導体製造技術によって製作することができる。
もちろん、基板はシリコン金属のみならず、ゲルマニウ
ムなどであってもよく、またガリウム・ヒ素などの化合
物半導体材料であってもよい。かかる電極たとえばＦＥ
Ｔ等は、製作の最終的段階においては、電極面とくにゲ
ート電極面が金属層によって被覆されるが、かかる金属
化電極面は酸化して水酸基を生成するものであることが
必要で、たとえばシリコンやゲルマニウムなどが用いら
れる。電極の表面が金属シリコンで形成されているとき
には、表面に含湿空気を接触させることにより水酸基が
容易に生成する。

電極表面に免疫抗体を共有結合によって固定するには、
表面に存在する水酸基に対してエポキシ基とケイ素原子
に結合した反応活性な水素、アルキル基、アルコキシ基
などの基とを有しているシラン化合物を反応させて電極
面にエポキシ基を固定し、次いでこれに免疫抗体を接触
させることによりエポキシ基と免疫抗体の中のアミノ基
とを反応させて共有結合を生成させる方法を用いること
ができる。

このように免疫抗体を固定するに用いられるシラン化合
物は、電極表面の水酸基と反応活性な基とが反応してSi
−Ｏ結合を生成するに当って未反応のままで残るエポキ
シ基を少なくとも１個以上有するものがよく、たとえば
γ−グリシドキシプロピル・トリメトキシシランなどが
好ましく用いられる。このようなシラン化合物は、その
まま、または適宜の溶剤で希釈して水酸基を有する電極
表面と接触させ、必要な時間保持することによって反応
させる。このようにして反応性のエポキシ基を表面に固
定した電極上に所望の免疫体抗体を固定するには、たと
えば適当な値のpHを有する緩衝溶液に溶解した免疫抗体
または免疫抗体を結合したペプチド化合物等を電極面に
接触させ、必要な時間保持することによって免疫抗体等
のアミノ基と電極上のエポキシ基とを反応させる。

また、免疫センサを得るために用いられる免疫抗体は、
センサによって検知しようとする物質の免疫活性構造に
対して相補的な、抗原抗体結合部位を有しているものを
選択して用いることが必要であり、かかる抗体としてた
とえばマウスに抗原となる物質を注射し、それにより増
殖したリンパ球が産生する免疫グロブリンを分離、精製
して用いることができる。こうして得た免疫抗体を電極
上に共有結合により固定した免疫センサは、特定の抗原
物質とのみ選択的に結合し多種の物質とは全く結合しな
い特性をそなえている。

このようにして得られた免疫センサは、抗原を含む水溶
液と接触するとき特定のpH条件下で定量的に抗原と結合
し、また、抗体の抗原認識部位の構造が変化するような
pH条件の洗浄液を用いて洗浄することにより抗原との結
合を解くことができるから、繰返して使用できるもので
あり、抗体が電極表面に共有結合によって固定されてい
るから抗原が有している電荷の量に対応する電気出力が
精度よく得られる。

このような特性を有する免疫センサを用いて抗原物質の
分析を行なうに当っては、荷電を有する物質を抗原に結
合させた荷電抗原を別途に準備しておくことが必要であ
る。かかる荷電を有する物質としては、前述の抗原抗体
反応がおこるpH条件下において安定した高い荷電状態に
あり、かつ抗原抗体反応を阻害することなく抗原と容易
に結合できる物質を選択することが必要で、たとえば塩
基性蛋白質であるアビジン（分子量：66,000、等電点：
１０．５）などが用いられる。

このような荷電を有する物質を抗原に結合させるに当っ
ては、これらを直接に化学反応により共有結合させても
よいが、適宜の化合物による架橋結合を利用してもよ
い。たとえば抗原がペブチド化合物であるときは、たと
えばアビジンと特異的に結合する性質を有するビオチン
をあらかじめ該抗原とアミド結合させてビオチン化ペブ
チド化合物を得、ついでこれとアビジンとを結合させる
ことによりアビジン結合ビオチン化抗原を得る方法を用
いることができる。

こうして得られた荷電抗原は、充分に精製したのち濃度
既知の溶液として準備されることが必要であり、これを
薄めて所定濃度ｘ_ｏの荷電抗原を含む比較溶液を得る。
この比較溶液を前記の免疫センサの電極面に接触させる
と、電極面上に結合固定された抗体には比較溶液中の荷
電抗原が結合して飽和するから、免疫センサの出力は一
定値ｙ_ｏに収斂する。

次に、濃度未知の抗原を含む溶液を用いて前記の荷電抗
原溶液を薄め、荷電抗原の濃度が前記の比較溶液の濃度
ｘ_ｏと一致するような測定溶液を得る。この測定溶液に
は濃度ｘ_ｏの荷電抗原と濃度ｘの抗原とが含まれている
ので、前記の免疫センサの電極に測定溶液を接触させた
ときの免疫センサの出力値ｙは、前記の出力値ｙ_ｏより
小となる。従って、かかる出力値ｙと抗原濃度ｘとの関
係をあらかじめ求めておくことにより、未知の抗原濃度
を知ることができるものである。

参考例１（抗原の調製）牛血清アルブミン１００mgをpH7.５の0.１Ｍリン酸ナト
リウム緩衝溶液１０ｍに溶解し、ダンシルクロリド２
mgを含むアセトン溶液0.５ｍを混合して、４℃で１昼
夜反応させた。得られた反応生成物を、pH7.２の１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝溶液で１週間透析して低分子量
物質を除去し、ダンシル化牛血清アルブミン溶液を得
た。

参考例２（抗体の調製）上記のダンシル化牛血清アルブミンを抗原としてマウス
に注射した後、細胞融合法により得たダンシルに対する
モノクローン抗体を産生する雑種細胞をマウス腹腔内に
１０^７個接種し、３週間乃至１ケ月後に蓄積した腹水を
採取し、遠心分離にかけて上澄液を得た。一方、ＩｇＧ
タイプの抗体と特異的に結合するプロテインＡをセファ
ロース上に固定した充填剤を充填し、あらかじめpH7.２
の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝生理食塩水で膨潤させ
ておいたカラムに対し、腹水上澄液を通してその中に含
まれている免疫グロブリン（抗体）を吸着分離し、次い
で0.1Ｍ酢酸（pH3.１）で溶出して抗体を脱離回収し
た。得られた抗体の溶液は、同量のpH6.5の0.5Ｍリン酸
ナトリウム緩衝溶液と混合してpHを7.２に調整した。

参考例３（免疫センサの作成）Ｐ型シリコンウェーハを用い、公知のＮＭＯＳ製造技術
を適用して、チップ寸法が7.２×3.６mmのＦＥＴを製造
した。この際、ソース、ドレンおよびゲート上にはＣＶ
Ｄ法によりポリシリコン層を設け、ソースおよびドレン
電極にはアルミニウムの配線を蒸着したのち、暑さ1.２
μｍの窒化シリコンの絶縁層で被覆し、その後ゲート電
極上の窒化シリコン層を除去して1.５×３mmの窓を形成
した。ゲート電極上のポリシリコンの表面を、室内の空
気に暴露することにより、水酸基を形成した。

このシリコンチップのソースおよびドレン電極にリード
線を取り付けたのちに、ゲート電極の窓を残してすべて
を覆うようにシリコーンゴムの防水被膜を付けた。

これをトリクロルエチレン、アセトン、エタノールを用
いて順次洗浄し、乾燥したのちγ−グリシドキシプロピ
ル・トリメトキシシランを表面上に滴下し、９０℃の恒
温器中で１５分反応させ、エポキシ化電極を得た。

次に、参考例２で得た抗体溶液をpH9.５の１Ｍ炭酸ナト
リウム緩衝溶液に混合して抗体濃度0.２mg／ｍに溶液
を調製し、これを前記のエポキシ化電極上に滴下し、湿
度１００％の雰囲気内で室温で１６時間反応し、その後
牛血清アルブミンの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝生理
食塩水中１％溶液に１時間浸漬して未反応のエポキシ基
を封鎖した。さらに未反応のペプチドなどを１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝生理食塩水で５回洗浄することによ
り除去し、抗体固定ＦＥＴを得た。

また、同様にして抗体溶液を電極上に接触させることを
省略して牛血清アルブミンの１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝生理食塩水中１％溶液に１時間浸漬し、エポキシ化
電極上に牛血清アルブミンだけを固定した対照ＦＥＴを
得た。

このようにして得た抗体固定ＦＥＴと対照ＦＥＴは、１
組として差動型電圧増幅回路の入力に接続し、免疫セン
サとして次の実施例において使用した。

実施例 (1)荷電抗原の調製参考例１で得たダンシル化牛血清アルブミンを0.１Ｍ炭
酸水素ナトリウム溶液中に１mg／ｍとなるように希釈
し、0.１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で１日間透析してリ
ン酸イオン等を除去し精製溶液とした。又別に調製した
ビオチンのＮ−サクシニミドエステルの１mg／ｍのジ
メチルスルホキシド溶液を、前記のダンシル化牛血清ア
ルブミンの精製溶液１容に対して0.０６容の割合で混合
し、室温で４時間反応させた。得られた反応生成物をpH
7.２の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液で３日間透析
して溶剤その他の低分子量物質および他種の塩類を除去
して精製した。

続いて、アビジンをpH7.４の２ｍＭトリス(Tris)緩衝溶
液に溶解したものの中へ、前記のビオチン結合ダンシル
化牛血清アルブミン溶液をビオチンのモル量がアビジン
のモル量より少くなるように加え、室温で３０分反応さ
せ、その生成物をpH7.２の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝溶液で３日間透析して溶剤その他の不純物を除去し、
アビジンがビオチンを介して結合している荷電抗原の精
製溶液を得た。

得られた荷電抗原は、ビオチン１個に対してアビジンが
１個だけ結合したものであった。

(2)免疫センサの出力と抗原濃度の関係 pH7.４の２ｍＭトリス緩衝溶液５０ｍ中にアビジンと
して２μＭとなるように荷電抗原を加え、２５℃に保っ
て、参考例３によって得た免疫センサを浸漬してその出
力を測定した。

また、同様にアビジンとして２μＭの荷電抗原を加える
と共に参考例１で得た抗原をそれぞれ、0.０９、0.１、
0.２５、１μＭの濃度となるように加えた前記同様のト
リス緩衝溶液各５０ｍを用意し、同様にして免疫セン
サの出力を測定した。

なお、各測定を行なったのちに、免疫センサをpH3.０の
0.１Ｍグリシン−ＨＣｌ溶液に浸漬し、次いでpH7.２の
１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝生理食塩水溶液で洗浄す
ることを反復して、電極上の抗体に結合した抗原を除去
して免疫センサの再生を行ない、次の測定を実施した。
得られた出力値を第１表に示すが、誤差範囲内で良好な
再現性を有するものであった。

以上の結果から、濃度未知の抗原を含む溶液を用いて同
様の測定を行なうことにより、免疫センサの出力から抗
原の濃度を知ることが可能であることがわかる。

（発明の効果）本発明の生理活性物質の分析方法は、該生理活性物質を
抗原とする抗体を電極表面に直接に固定した免疫センサ
を用いると共に、抗原抗体の結合反応に対して好適なpH
環境下において大きな電荷を持つ、たとえばアビジンの
ような物質をたとえばビオチン等を介して該生理活性物
質と結合させて得た荷電抗原を準備し、このような荷電
抗原を抗原と共存させた状態で免疫センサの出力を測定
することによって抗原の存在量を検知するようにしたも
のである。従って、微量の抗原物質をその種類によらず
高感度で検出分析することができ、しかも再現性がよく
他の共存物質の妨害を受けることがないという特長を有
するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｕ 8310−2Ｊ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生理活性物質を抗原とする免疫抗体を電極
表面に共有結合によって直接に結合固定してなる免疫セ
ンサを用いて該生理活性物質の存在量を検知するに当
り、別途に該生理活性物質とアビジンとをビオチンを介
して結合させて得た電荷量の制御された荷電抗原が所定
濃度で含まれた比較溶液を準備し、一方、該荷電抗原を
濃度未知の該生理活性物質の溶液に対して該所定濃度と
なるよう添加した測定溶液を得、次いで、該免疫センサ
の電極面に該測定溶液の充分量を接触させて得た測定出
力値と同様にして該比較溶液の充分量を接触させて得た
比較出力値とを比較することを特徴とする、生理活性物
質の分析方法。