JP7846621B2 - 核酸を送達するための脂質ナノ粒子 - Google Patents

核酸を送達するための脂質ナノ粒子

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Description

本発明は、ｍＲＮＡベースのワクチンとして有用なｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子に関する。さらに、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を含む組成物、ならびに例えば感染性疾患、腫瘍もしくはがん疾患、アレルギーまたは自己免疫疾患の予防または処置に使用するための、医薬組成物、特にワクチンを調製するためのｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子または組成物の使用に関する。本発明はさらに、上記疾患の処置または予防の方法を記載する。
遺伝子治療および遺伝子ワクチン接種は、近代医学の最も有望で急速に発達している方法に属する。これらは、多種多様な疾患の治療に高度に特異的で個別的な選択肢を提供し得る。遺伝子ワクチン接種は、細菌表面、ウイルス粒子、腫瘍抗原などの特徴的な成分などの、選択された抗原に対する所望の免疫応答を引き起こすことを可能にする。一般的に、ワクチン接種は、近代医学の重要な成果の１つである。しかしながら、有効なワクチンは、現在、限られた数の疾患にしか利用可能でない。したがって、ワクチン接種によって防止可能ではない感染症が、依然として、毎年数百万人に発症している。
一般的に、ワクチンは、「第１」、「第２」および「第３」世代ワクチンに細分され得る。「第１世代」ワクチンは、典型的には、生物全体ワクチンである。これらは、生弱毒化病原体または死滅病原体、例えば、ウイルス、細菌などのいずれかに基づく。生弱毒化ワクチンの主な欠点は、生命を脅かす変異体への復帰のリスクである。よって、このような病原体は、弱毒化されているが、依然として予測不能なリスクを本質的に有し得る。死滅病原体は、特異的免疫応答をもたらすために望まれるほど有効となり得ない。これらのリスクを最小化するために、「第２世代」ワクチンが開発された。これらは、典型的には、病原体から誘導される、定義される抗原または組換えタンパク質成分からなる、サブユニットワクチンである。
遺伝子ワクチン、すなわち、遺伝子ワクチン接種用のワクチンは通常、「第３世代」ワクチンとして理解されている。これらは、典型的には、インビボで病原体または腫瘍抗原に特徴的なペプチドまたはタンパク質（抗原）断片の発現を可能にする遺伝子操作された核酸分子で構成される。遺伝子ワクチンは、患者に投与すると、標的細胞による取り込み後に発現される。投与された核酸分子の発現は、コードされたタンパク質の産生をもたらす。これらのタンパク質が患者の免疫系によって外来性と認識されると、免疫応答が誘引される。
ＤＮＡならびにＲＮＡは、遺伝子ワクチン接種の状況において投与するための核酸分子として使用され得る。ＤＮＡは比較的安定で、取り扱い易いことが知られている。しかしながら、ＤＮＡの使用は、障害のある遺伝子の機能の喪失などの変異原性イベントを潜在的にもたらす、患者のゲノムへの投与されたＤＮＡ断片の望まない挿入のリスクを有する。さらなるリスクとして、抗ＤＮＡ抗体の望まない産生が現れている。別の欠点は、得られたｍＲＮＡが翻訳され得る前に、ＤＮＡが転写されるために核に入らなければならないので、ＤＮＡ投与で達成可能なコードされるペプチドまたはタンパク質の発現レベルが限られることである。数ある理由の中でも、投与されたＤＮＡの発現のレベルは、ＤＮＡ転写を調節する特異的転写因子の存在に依存する。このような因子の非存在下では、ＤＮＡ転写は満足な量のＲＮＡを生じない。結果として、得られる翻訳されたペプチドまたはタンパク質のレベルが制限されることになる。
遺伝子ワクチン接種に、ＤＮＡの代わりにＲＮＡを使用することによって、望まないゲノム組み込みおよび抗ＤＮＡ抗体の産生のリスクが最小化または回避される。しかしながら、ＲＮＡは、ユビキタスＲＮアーゼによって容易に分解され得るかなり不安定な分子種であると考えられる。
プロタミンと複合体化した抗原コードｍＲＮＡを含むｍＲＮＡワクチンは先行技術においてすでに記載されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、および特許文献５）。特許文献６も、様々な抗原をコードするヌクレオシド修飾ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物を記載している。
過去数年間で多くの進歩を遂げたとしても、投与が抗原の早期分解によっても、細胞中のｍＲＮＡの不十分な放出によるｍＲＮＡの不十分な翻訳によっても重度に損なわれない、適応免疫応答を引き起こすことを可能にする、ｍＲＮＡワクチン接種のための効率的な方法を提供することが当技術分野において依然として必要とされている。さらに、潜在的な安全上の懸念を減少させ、ワクチンを第３世界で入手可能にするために、ｍＲＮＡワクチンの用量を減少させる緊急の必要性がある。
生物系において所望の応答をもたらすための核酸の送達に関連する多くの困難が存在する。ワクチンなどの核酸ベースの治療は非常に大きな可能性を有するが、この可能性を実現するためには、細胞または生物内の適切な部位への核酸のより有効な送達が必要とされる。
しかしながら、治療の状況における核酸の使用は現在、２つの課題に直面している。第１に、遊離ＲＮＡは血漿中でヌクレアーゼ消化を受けやすい。第２に、遊離ＲＮＡは、関連する翻訳機構が存在する細胞内区画へのアクセスを獲得する能力が限られている。カチオン性脂質と中性脂質、コレステロール、ＰＥＧ、ＰＥＧ化脂質などの他の脂質成分、およびオリゴヌクレオチドから形成される脂質ナノ粒子が、血漿中でのＲＮＡの分解を遮断し、オリゴヌクレオチドの細胞への取り込みを促進するために使用されてきた。
オリゴヌクレオチドを送達するための改善されたカチオン性脂質および脂質ナノ粒子が必要とされている。好ましくは、これらの脂質ナノ粒子は、最適な薬物：脂質比を提供し、核酸を血清中での分解およびクリアランスから保護し、全身または局所送達に適しており、核酸の細胞内送達を提供するだろう。さらに、これらの脂質－核酸粒子は、有効用量の核酸での患者の処置が、患者に対する許容されない毒性および／またはリスクを伴わないように、忍容性が高く、十分な治療指数を提供すべきである。本発明は、これらの利点および関連する利点を提供する。
欧州特許第１０８３２３２号明細書 国際公開第２０１０／０３７５３９号 国際公開第２０１２／１１６８１１号 国際公開第２０１２／１１６８１０号 国際公開第２０１５／０２４６６５号 国際公開第２０１６／１７６３３０号
ＰＭＩＤ：２７３３６８３０ ＰＭＩＤ：２３１５９８８２
一態様において、本発明は、生細胞（ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）への核酸の送達に有用な新規なカチオン性脂質に関する。カチオン性脂質は、式（Ｉ）による化合物：
Ｒａ－Ａ－Ｒｂ 式（Ｉ）
（式中、
Ｒａは、
－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４
から選択され；
Ｒｂは、
－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４、または
－Ｒ１－Ｎ（ＣＨ３）２
から選択され；
Ａは－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｓ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｓ－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－であり；
Ｒ１は場合により置換されたエタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、または２～８個の炭素原子を有する直鎖もしくは非分岐アルカンジイルであり；
Ｒ２は２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｒ３は任意選択であり、存在する場合、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、または－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｒ５－ＯＣ（Ｏ）－ＮＨ－、またはＲ５－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり；
Ｒ４は１２～３６個の炭素原子を有する親油性置換基であり；
Ｒ５は１～６個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｘは炭素または窒素原子であり；
全ての選択は互いに独立しており、
場合により、Ｒ１、Ｒ２およびＲ５が全てエタンジイルであり、ＡはＳ－Ｓ－であり、ＲａおよびＲｂが同一である場合、Ｒ４は、
ではない）
である。
この点について、アルカンジイルは（－ＣｎＨ２ｎ－）基についての用語であり；したがって、例えば、「２～８個の炭素原子を有するアルカンジイル」は、式－Ｃ２Ｈ４－、－Ｃ３Ｈ６－、－Ｃ４Ｈ８－、－Ｃ５Ｈ１０－、－Ｃ６Ｈ１２－、－Ｃ７Ｈ１４－、またはそれぞれ－Ｃ８Ｈ１６－を有するアルカンジイル基に等しい。換言すれば、アルカンジイルは、脂肪族炭化水素から誘導される一般式ＣｎＨ２ｎの一連の二価基（ｄｉｖａｌｅｎｔ ｒａｄｉｃａｌｓ）である。特に指定しない限り、このようなアルカンジイルには置換アルカンジイルが含まれる。
別の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ５が全てエタンジイルであり、ＡはＳ－Ｓ－であり、ＲａおよびＲｂが同一である場合、Ｒ４は
ではない、またはそれぞれ一実施形態において、式（Ｉ）による脂質は本明細書の表１に開示される脂質Ｃ２３ではなく、それぞれ本明細書において以下に記載される脂質ＳＳ－ＥＣではない（疑いを避けるために、すなわち、一部の選択された実施形態において、カチオン性脂質ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣは、式（Ｉ）によるカチオン性脂質に関連する実施形態から権利放棄される）。
別の態様において、本発明は、上に定義される新規なカチオン性脂質などのカチオン性脂質を組み込んだ新規な組成物を提供する。
カチオン性脂質および組成物は、生細胞への核酸の導入に特に有効であることが見出された。例えば、これらは、改善されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン、すなわち、ある特定の感染性疾患または腫瘍に対するｍＲＮＡベースのワクチンを可能にする。
さらなる態様において、本発明は、医薬、および特にワクチンとしてのカチオン性脂質および核酸化合物を組み込んだ組成物の使用、ならびにこれらのワクチンに基づくワクチン接種方法を提供する。
本発明の別の態様において、本発明はまた、本明細書に定義されるｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物と、少なくとも１つの本明細書に定義される式（Ｉ）または式（ＩＩ）による脂質とを含む、キット、特にパーツキット（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）を提供する。
定義
明確性および読みやすさのために、以下の科学背景情報および定義を提供する。本明細書で言及されるまたはそれによって開示されるいずれの技術的特徴も、本発明の各実施形態および全ての実施形態の一部となることができるか、または本発明の各実施形態および全ての実施形態で読まれ得る。追加の定義および説明を本開示の文脈で提供することができる。
特に定義しない限り、または具体的な文脈が要求しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語は、関連する技術分野における当業者によって一般的に理解される技術用語と同じ意味を有する。
文脈が別段の指示または要求をしない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語ならびに同様の表現は、本明細書および特許請求の範囲において「限定されるものではないが、～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」として、開いた包括的な意味で解釈されるべきである。
「一実施形態」、「実施形態」、「具体的な実施形態」などの表現は、それぞれの表現と組み合わせて言及される、特定の特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）、特性もしくは特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）、または特徴、特性もしくは特徴の特定の群もしくは組合せが、本発明の実施形態の少なくとも１つに存在することを意味する。本明細書の全体にわたる様々な場所でのこれらの表現の出現は、必ずしも同じ実施形態に言及するものではない。さらに、特定の特徴、特性または特徴を、１つまたは複数の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の言及を含むものとして理解されるべきである。
数の文脈におけるパーセンテージは、それぞれの項目の総数に対するものとして理解されるべきである。他の場合では、文脈が別段の指示をしない限り、パーセンテージは重量パーセンテージ（重量％）として理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、「化合物」は、本質的に同じ化学構造および特性を有する分子からなる材料である、化学物質を意味する。低分子化合物については、分子が、典型的にはその原子組成および構造配置に関して同一である。高分子またはポリマー化合物については、化合物の分子が極めて類似であるが、それらのうちの全てが必ずしも同一というわけではない。例えば、５０モノマー単位からなると指定されているポリマーのセグメントは、例えば４８または５３モノマー単位を有する個々の分子も含有し得る。
「分子」という用語は、「化合物」または個々の（すなわち、単一）分子の同義語として使用され得る。
生理的条件下でイオン化可能な官能基を有する化合物または部分へのいずれの言及も、それぞれの化合物または部分のイオン化形態を含むものとして理解されるべきである。逆もまた同様に、生理的条件下で非イオン化形態でも存在し得るイオン化官能基を有する化合物または部分へのいずれの言及も、それぞれの化合物または部分の非イオン化形態を含むものとして理解されるべきである。例えば、カルボキシル基を有する化合物の開示は、非イオン化カルボキシル基を有するか、またはイオン化カルボキシレート基を有するそれぞれの化合物に言及するものとして解釈されるべきである。
本明細書で使用される場合、「生理的条件」とは、細胞外条件と細胞内条件の両方を含む、ヒト生理学から公知のｐＨ範囲内にあるｐＨを有する水性環境を指す。このｐＨ範囲の近似は約ｐＨ１～約ｐＨ９である。文脈に応じて、生理的条件はまた、約ｐＨ５～約ｐＨ８．５、または約５．５～約ｐＨ８などのほぼ中性条件を指し得る。
リピドイド化合物は、単にリピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）とも呼ばれ、脂質様化合物、すなわち、脂質様物理特性を有する両親媒性化合物である。本発明の文脈において、脂質という用語は、リピドイドを包含すると考えられる。
本発明の文脈において、ある特定の要素の群（例えば、「Ａ、ＢおよびＣ」）が続く「～からなる群から選択される」という用語は、本発明の文脈内において、前記群に限定されないことを意図している。換言すれば、このような用語は、本開示が列挙されていない要素に閉ざされていることを示さない、すなわち、代わりの意味もこの用語に続く群内に含まれる。したがって、本発明の文脈において、ある特定の要素の群（例えば、「Ａ、ＢおよびＣ」）が続く「～からなる群から選択される」という用語は、他の構造的および機能的に関連するならびに関連せず、言及されていない要素も包含する「Ａ、ＢおよびＣから選択される」あるいは「Ａ、ＢまたはＣである」として理解されるべきである。
「約」という用語は、パラメータまたは値が必ずしも同一、すなわち、１００％同じである必要がない場合に使用される。したがって、「約」は、パラメータまたは値が０．１％～２０％、好ましくは０．１％～１０％；特に、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％逸脱し得ることを意味する。当業者であれば、例えばある特定のパラメータまたは値が、パラメータを決定した方法に基づいてわずかに変動し得ることが分かるだろう。例えば、ある特定のパラメータまたは値が、例えば「約１０００ヌクレオチド」の長さを有すると本明細書に定義される場合、その長さは０．１％～２０％、好ましくは０．１％～１０％；特に、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％逸脱し得る。したがって、当業者であれば、その具体例において、その長さが１～２００ヌクレオチド、好ましくは１～１００ヌクレオチド；特に５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ヌクレオチド逸脱し得ることが分かるだろう。
「カチオン性」という用語は、異なる意味が具体的な文脈から明らかでない限り、それぞれの構造が、永続的に、または永続的ではなく、例えばｐＨなどのある特定の条件に応じて、正の電荷を有することを意味する。よって、「カチオン性」という用語は、「永続的にカチオン性」と「カチオン化可能（ｃａｔｉｏｎｉｓａｂｌｅ）」の両方を網羅する。本明細書で使用される「カチオン化可能」という用語は、化合物、または基もしくは原子が、低ｐＨの環境で正に帯電しており、高ｐＨの環境で帯電していないことを意味する。ｐＨ値を決定することができない非水性環境においても、カチオン化可能化合物、基または原子は、高水素イオン濃度で正に帯電しており、低濃度または活性の水素イオンで帯電していない。これはカチオン化可能またはポリカチオン化可能化合物の個々の特性、特にそのｐＨまたは水素イオン濃度で帯電しているか、または帯電していない、それぞれのカチオン化可能基または原子のｐＫａに依存する。希釈水性環境においては、正の電荷を有するカチオン化可能化合物、基または原子の分率が、当業者に周知のいわゆるヘンダーソン・ハッセルバルヒの式を使用して推定され得る。例えば、化合物または部分がカチオン化可能である場合、約１～９、好ましくは４～９、５～８またはさらには６～８のｐＨ値、より好ましくは９以下、８以下、７以下のｐＨ値、最も好ましくは生理的ｐＨ値、例えば約７．３～７．４、すなわち生理的条件下、特にインビボでの細胞の生理的塩条件下でこれが正に帯電していることが好ましい。実施形態において、カチオン化可能化合物または部分が、生理的ｐＨ値、例えば約７．０～７．４で主に中性であるが、より低いｐＨ値で正に帯電することが好ましい。一部の実施形態において、カチオン化可能化合物または部分のｐＫａの好ましい範囲は約５～約７である。一部の実施形態において、プロトン化可能（ｐｒｏｔｏｎａｔａｂｌｅ）脂質は、約４～約１１の範囲のプロトン化可能基のｐＫａ、例えば約５～約７のｐＫａを有する。
異なる意味が具体的な文脈から明らかである場合を除いて、「カチオン性」という用語は、それぞれの構造が、永続的に、または永続的ではなく、ｐＨなどのある特定の条件に応じて、正の電荷を有することを意味する。よって、「カチオン性」という用語は、「永続的にカチオン性」と「カチオン化可能」の両方を網羅する。例えば、第１級、第２級または第３級アミノ基を有する化合物または部分は、生理的条件下で主に正に帯電した状態で存在し得るので、カチオン性であり、より具体的には、カチオン化可能である。
本明細書で使用される場合、「永続的にカチオン性」は、それぞれの化合物、または基もしくは原子が、その環境のいずれのｐＨ値または水素イオン活性でも正に帯電していることを意味する。多くの場合、正の電荷は第４級窒素原子の存在から生じる。化合物が複数のこのような正の電荷を有する場合、永続的にカチオン性のサブカテゴリーである、永続的にポリカチオン性と呼ばれ得る。
同様に、「アニオン性」、「アニオン化可能（ａｎｉｏｎｉｚａｂｌｅ）」および「永続的にアニオン性」という用語は、それぞれの化合物、基または原子の電荷が正ではなく負であることを除いて、「カチオン性」、「カチオン化可能」および「永続的にカチオン性」と類似の意味を有するものとして使用される。
「中性」という表現は、脂質もしくはステロイドなどの化合物、または基もしくは部分に適用される場合、それがカチオン性でもアニオン性でもない、例えば炭化水素などの、生理的条件下でイオン化可能な官能基を有さない化合物であること；またはそれが典型的な天然のホスファチジルコリンなどの、典型的な生理的条件下でカチオン性とアニオン性の両方、すなわち双性イオン性（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ）であることを意味する。
本明細書で使用される「脂質」は、脂肪酸の誘導体（例えば、エステル）であり、一般的に水に不溶性であるが、多くの有機溶媒に可溶性であることを特徴とする有機化合物の群を指す。脂質は通常、少なくとも３つのクラスに分けられる：（１）脂肪および油ならびにワックスを含む「単純脂質」；（２）リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質（ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｌｉｐｉｄｓ）」；および（３）ステロイドなどの「誘導脂質（ｄｅｒｉｖｅｄ ｌｉｐｉｄｓ）」。糖脂質に関して、ある特定の実施形態において、ＬＮＰが糖脂質（例えば、モノシアロガングリオシドＧＭ１）を含む。
この文脈において、接頭辞「ポリ（ｐｏｌｙ）－」は、化合物においてそれぞれの特性を有する複数の原子または基を指す。括弧内に入れる場合、複数の存在は任意選択である。例えば、（ポリ）カチオン性はカチオン性および／またはポリカチオン性を意味する。しかしながら、接頭辞の非存在は、複数を除外するなどと解釈されるべきではない。例えば、ポリカチオン性化合物もカチオン性化合物であり、そのように呼ばれ得る。
「核酸」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むか、またはそれらからなる任意の化合物を意味する。この用語はポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドに使用され得る。本明細書で特定のタンパク質および／またはペプチドをコードする核酸または核酸配列に言及する場合はいつでも、前記核酸または核酸配列はそれぞれ、好ましくは、適切な宿主、例えばヒトにおいて、その発現、すなわち、特定のタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列の転写および／または翻訳を可能にする制御配列も含む。
本発明の文脈において、「ヌクレオシド修飾」という用語は、天然ｍＲＮＡには通常存在しないヌクレオシド、好ましくは非天然ヌクレオシドを含むｍＲＮＡ化合物または分子などの核酸を指す。特に、この用語は、好ましくは、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルおよびチミン以外のｍＲＮＡヌクレオシドを指す。
「ヌクレオシド」という用語は、一般的に、糖、通常はリボースまたはデオキシリボース、およびプリンまたはピリミジン塩基からなる化合物を指す。「ヌクレオチド」という用語は、一般的に、糖に結合したリン酸基を含むヌクレオシドを指す。
「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結された少なくとも２つのアミノ酸モノマーのオリゴマーまたはポリマーを意味する。この用語は、アミノ酸のポリマー鎖の長さを限定しない。ペプチドは、例えば、５０モノマー単位未満を含有し得る。典型的には５０～６００モノマー単位、より具体的には５０～３００モノマー単位を有する、より長いペプチドはポリペプチドとも呼ばれる。
「タンパク質」は、生物機能を促進する、３次元形態に折り畳まれた１つまたは複数のポリペプチドを含むか、またはそれからなる。
「インフルエンザパンデミック（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｐａｎｄｅｍｉｃ）」または「パンデミックインフル（ｐａｎｄｅｍｉｃ ｆｌｕ）」は、非ヒト（新規）インフルエンザウイルスが効率的で持続性のヒトからヒトへの伝染能力を獲得し、次いで、世界的に蔓延すると起こり得る。パンデミックを引き起こす可能性を有するインフルエンザウイルスは、「パンデミックポテンシャル（ｐａｎｄｅｍｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を有するインフルエンザウイルス」または「パンデミックインフルエンザウイルス」と呼ばれる。
パンデミックポテンシャルを有するインフルエンザウイルスの例としては、２つの異なる「鳥インフル（ｂｉｒｄ ｆｌｕ）」ウイルスである、鳥インフルエンザＡ型（Ｈ５Ｎ１）および鳥インフルエンザＡ型（Ｈ７Ｎ９）が挙げられる。これらは非ヒトウイルスである（すなわち、これらはヒトの間では新規であり、世界の一部で鳥類において循環している）ので、人々の間ではこれらのウイルスに対する免疫がほとんどから全くない。これらのウイルスによるヒト感染症はめったに起こっていないが、これらのウイルスのいずれかが容易にヒトに感染し、人から人に容易に広がることができるように変化したら、インフルエンザパンデミックが生じ得る。
パンデミックインフルエンザ／インフル用のワクチンまたはパンデミックインフルエンザ／インフルワクチン：パンデミックインフルエンザウイルスに対して向けられたワクチンは、本明細書において、パンデミックインフルエンザ／インフル用のワクチンまたはパンデミックインフルエンザ／インフルワクチンと呼ばれる。
インフル／インフルエンザ流行期：インフル流行期は、インフルエンザ（インフル）の発生の流行を特徴とする毎年繰り返される期間である。流行期は各半球で寒候期の間に起こる。インフルエンザ活動は、時々、地理学的に予測され、さらには追跡され得る。各流行期における主なインフル活動の始まりは場所によって異なるが、いずれの具体的な場所でも、これらのマイナーな流行は通常、ピークまで約３週間かかり、有意に減少するのにさらに３週間かかる。インフル流行期の効果を減少させるためにインフルワクチン接種が使用されており；肺炎ワクチン接種がインフル流行期の効果および合併症をさらに減少させる。北半球および南半球では１年の異なる時期に冬があるので、実際には各年に２回のインフル流行期が存在する。
季節性インフルエンザ／インフル用のワクチンまたは季節性インフルエンザ／インフルワクチン：インフル流行期における季節性インフルエンザウイルスに対して向けられたワクチンは、本明細書において、「季節性インフルエンザ／インフル用のワクチンまたは季節性インフルエンザ／インフルワクチン」と呼ばれる。
免疫系：免疫系は、生物を感染から防御し得る。病原体が生物の物理的障壁を破り、この生物に侵入すると、自然免疫系が、即時であるが非特異的な応答をもたらす。病原体がこの自然応答を回避した場合、脊椎動物は防御の第２層である適応免疫系を備える。ここで、免疫系は、感染中に病原体の認識を改善するようその応答を適応させる。そのため、病原体が排除された後も、この改善された応答が免疫学的記憶の形態で保持され、適応免疫系が、この病原体に遭遇する度により速く、より強力な攻撃を開始することを可能にする。これによると、免疫系は自然免疫系および適応免疫系を含む。これらの２つの部分の各々が、いわゆる液性成分および細胞性成分を含有する。
免疫応答：免疫応答は、典型的には、特定の抗原に対する適応免疫系の特異的反応（いわゆる特異的もしくは適応免疫応答）または自然免疫系の非特異的反応（いわゆる非特異的もしくは自然免疫応答）のいずれかであり得る。本発明は、適応免疫系の特異的反応（適応免疫応答）のコアに関する。特に、本発明は、例えばインフルエンザウイルスなどのウイルスによる感染に対する適応免疫応答に関する。しかしながら、この特異的応答は、追加の非特異的反応（自然免疫応答）によって支持され得る。したがって、本発明はまた、効率的な適応免疫応答を引き起こすための自然免疫系と適応免疫系の同時刺激のための化合物に関する。
適応免疫系：適応免疫系は、病原性増殖を排除または防止する高度に専門化された全身細胞および工程で構成される。適応免疫応答は、脊椎動物免疫系に、具体的な病原体を認識および記憶し（免疫を生成する）、病原体に遭遇する度により強力な攻撃を開始する能力を提供する。この系は、体細胞超変異（体細胞変異の頻度が増加した工程）、およびＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子再構成（抗原受容体遺伝子セグメントの不可逆的遺伝子組換え）のために、高度に適合性である。この機序は、少数の遺伝子が膨大な数の異なる抗原受容体を生成することを可能にし、次いで、これらが各個々のリンパ球上でユニークに発現される。遺伝子再構成は各細胞のＤＮＡにおける不可逆的変化をもたらすので、その細胞の後代（子孫）の全てが、長寿命特異的免疫の鍵となるメモリーＢ細胞およびメモリーＴ細胞を含む、同じ受容体特異性をコードする遺伝子を受け継ぐ。免疫ネットワーク理論は、Ｔ細胞、Ｂ細胞の受容体の可変領域と可変領域を有するＴ細胞およびＢ細胞によって作られる分子との間の相互作用に基づいた、どのように適応免疫系が働くかについての理論である。
適応免疫応答：適応免疫応答は、典型的には抗原特異的であると理解される。抗原特異性は、具体的な抗原、病原体または病原体感染細胞に適合された応答の生成を可能にする。これらの適合された応答を開始する能力は、「メモリー細胞」によって体内に維持される。病原体が体に２回以上感染したら、これらの特異的メモリー細胞がこの病原体を迅速に排除するために使用される。この文脈において、適応免疫応答の第１の工程は、ナイーブ抗原特異的Ｔ細胞または抗原提示細胞によって抗原特異的免疫応答を誘導することができる異なる免疫細胞の活性化である。これは、ナイーブＴ細胞が絶えず通過するリンパ組織および器官で起こる。抗原提示細胞として働くことができる細胞型は、とりわけ、樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞である。これらの細胞の各々が、免疫応答の誘発において別個の機能を有する。樹状細胞は食作用およびマクロピノサイトーシスによって抗原を取り込み、例えば外来抗原との接触によって刺激されて局所リンパ組織に移動し、そこで成熟樹状細胞に分化する。マクロファージは、細菌などの粒子状抗原を摂取し、感染因子または他の適切な刺激によってＭＨＣ分子を発現するよう誘導される。Ｂ細胞がその受容体を介して可溶性タンパク質抗原に結合し、これらを内在化するユニークな能力もＴ細胞を誘導するのに重要となり得る。ＭＨＣ分子上での抗原の提示がＴ細胞の活性化をもたらし、それによってこれらの増殖および武装エフェクターＴ細胞（ａｒｍｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ）への分化が誘導される。エフェクターＴ細胞の最も重要な機能は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞による感染細胞の死滅および共に細胞媒介性免疫を構成するＴｈ１細胞によるマクロファージの活性化、および異なるクラスの抗体を産生し、よって、液性免疫応答を駆動するためのＴｈ２細胞とＴｈ１細胞の両方によるＢ細胞の活性化である。Ｔ細胞は、直接抗原を認識し、これに結合せず、代わりに、例えば、他の細胞の表面上のＭＨＣ分子に結合している、病原体誘導タンパク質抗原の短いペプチド断片を認識するＴ細胞受容体によって抗原を認識する。
細胞性免疫／細胞性免疫応答：細胞性免疫は、典型的にはマクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、および抗原に応じた様々なサイトカインの放出に関する。より一般的な方法では、細胞性免疫は、抗体に関連せず、免疫系の細胞の活性化に関連する。細胞性免疫応答は、例えばウイルス感染細胞、細胞内細菌を有する細胞、および腫瘍抗原を示すがん細胞などの、その表面上に抗原のエピトープを示す体細胞においてアポトーシスを誘導することができる抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化すること；マクロファージおよびナチュラルキラー細胞を活性化し、これらが病原体を破壊することができるようにすること；ならびに細胞を刺激して、適応免疫応答および自然免疫応答に関与する他の細胞の機能に影響を及ぼす様々なサイトカインを分泌させることを特徴とする。
液性免疫／液性免疫応答：液性免疫は、典型的には抗体産生およびこれに付随し得る補助的工程を指す。液性免疫応答は、典型的には、例えばＴｈ２活性化およびサイトカイン産生、胚中心形成およびアイソタイプスイッチ、親和性成熟およびメモリー細胞産生を特徴とし得る。液性免疫はまた、典型的には、病原体および毒素中和、古典的補体活性化、ならびに食作用のオプソニン促進および病原体排除を含む、抗体のエフェクター機能を指し得る。
自然免疫系：非特異的免疫系としても知られる、自然免疫系は、非特異的に宿主を他の生物による感染から防御する細胞および機序を含む。これは、自然系の細胞が一般的な方法で病原体を認識し、これに応答するが、適応免疫系とは異なり、宿主に持続性免疫も防御免疫も付与しないことを意味する。自然免疫系は、例えば病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）受容体、例えばＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のリガンド、またはリポ多糖、ＴＮＦ－アルファ、ＣＤ４０リガンド、もしくはサイトカイン、モノカイン、リンホカイン、インターロイキンもしくはケモカイン、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ベータ、ＩＦＮ－ガンマ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＬＴ－ベータ、ＴＮＦ－アルファ、成長因子、およびｈＧＨ、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０のリガンド、マウスＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２もしくはＴＬＲ１３のリガンド、ＮＯＤ様受容体のリガンド、ＲＩＧ－Ｉ様受容体のリガンド、免疫賦活性核酸、免疫賦活性ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）、ＣｐＧ－ＤＮＡ、抗菌剤、もしくは抗ウイルス剤などの他の補助物質によって活性化され得る。典型的には、自然免疫系の応答は、サイトカインと呼ばれる、専門化された化学伝達物質を含む化学因子の産生を通した、感染部位への免疫細胞の動員；補体カスケードの活性化；専門化された白血球による、器官、組織、血液およびリンパ中に存在する外来物質の識別および除去；抗原提示として知られる工程を通した適応免疫系の活性化；ならびに／あるいは感染因子に対する物理的および化学的障壁として作用することを含む。
アジュバント／アジュバント成分：アジュバントまたはアジュバント成分は、広義には、典型的には薬物またはワクチンなどの他の薬剤の有効性を修飾、例えば増強し得る（例えば、薬理学的または免疫学的）薬剤または組成物である。慣用的には、この用語は、本発明の文脈において、免疫原用の担体もしくは補助物質および／または他の薬学的に活性な化合物として働く化合物または組成物を指す。この用語は広義に解釈されるべきであり、当のアジュバントと共に組み込まれるまたは共投与される抗原の免疫原性を増加させることができる広範囲の物質を指す。本発明の文脈において、アジュバントは、好ましくは本発明の活性剤の特異的免疫原性効果を増強する。典型的には、「アジュバント」または「アジュバント成分」は同じ意味を有し、相互に使用され得る。アジュバントは、例えば免疫賦活薬、抗原性送達システムまたはさらにはこれらの組合せに分けられ得る。
「アジュバント」という用語は、典型的にはそれ自体が免疫を付与する薬剤を含まないと理解される。アジュバントは、例えば免疫系への抗原の提示または非特異的自然免疫応答の誘導を促進することによって抗原特異的免疫応答を増強するために、免疫系を非特異的に支援する。さらに、アジュバントは、好ましくは例えば支配的なＴｈ２ベースの抗原特異的応答をよりＴｈ１ベースの抗原特異的応答にシフトすることによって、またはその逆によって、抗原特異的免疫応答を調節することができる。したがって、アジュバントは、サイトカイン発現／分泌、抗原提示、免疫応答の種類等を有利に調節することができる。
免疫賦活性ＲＮＡ：本発明の文脈における免疫賦活性ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）は、典型的には自然免疫応答自体を誘導することができるＲＮＡであり得る。これは通常、オープンリーディングフレームを有さないので、ペプチド抗原も免疫原も提供しないが、例えば特異的な種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）または他の適切な受容体に結合することによって、自然免疫応答を誘発する。しかしながら、当然、オープンリーティングフレームを有し、ペプチド／タンパク質（例えば、抗原性機能）をコードするｍＲＮＡも自然免疫応答を誘導し得る。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、インタクト抗体と抗体断片の両方を含む。典型的には、インタクト「抗体」は、特定の抗原に特異的に結合する免疫グロブリンである。抗体は、ヒトクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＤのいずれかを含む、いずれかの免疫グロブリンクラスのメンバーであり得る。典型的には、インタクト抗体はテトラマーである。各テトラマーは、各ペアが「軽」鎖および「重」鎖を有する、ポリペプチド鎖の２つの同一のペアからなる。「抗体断片」は、抗体の抗原結合または可変領域などの、インタクト抗体の一部を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；トライブ（ｔｒｉｂｅ）；テトラ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。例えば、抗体断片は、単離された断片、重鎖可変領域および軽鎖可変領域からなる「Ｆｖ」断片、軽鎖可変領域および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ＳｃＦｖタンパク質」）、ならびに超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位を含む。抗体の抗原結合断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、断片Ｆｄ’、Ｆｄ断片および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。本発明の治療用ＲＮＡによってコードされ得る適切な抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体混合物もしくはカクテル、ヒトもしくはヒト化抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ断片、または二重特異性抗体が含まれる。本発明の文脈において、抗体は、本発明の組合せ／組成物の少なくとも１つの治療用ＲＮＡによって提供され得る。
本発明の文脈における「抗原」という用語は、典型的には免疫系によって、好ましくは適応免疫系によって認識され得、例えば適応免疫応答の一部としての抗体および／または抗原特異的Ｔ細胞の形成により、抗原特異的免疫応答を誘引することができる物質を指す。典型的には、抗原は、ＭＨＣによってＴ細胞に提示され得るペプチドもしくはタンパク質であり得るか、またはこれを含み得る。本発明の意味において、抗原は、提供された核酸分子、好ましくは本明細書に定義されるｍＲＮＡの翻訳の産物であり得る。この文脈において、少なくとも１つのエピトープを含むペプチドおよびタンパク質の断片、バリアントおよび誘導体も抗原として理解される。したがって、本明細書で使用される「抗原」という用語は、当業者によって認識および理解され、例えば免疫系、好ましくは適応免疫系によって認識され得、例えば適応免疫応答の一部としての抗体および／または抗原特異的Ｔ細胞の形成により、抗原特異的免疫応答を誘引することができる物質を指すことを意図している。典型的には、抗原は、ＭＨＣによってＴ細胞に提示され得るペプチドもしくはタンパク質であり得るか、またはこれを含み得る。少なくとも１つのエピトープを含む、例えばがん抗原から誘導されるペプチドまたはタンパク質の断片、バリアントおよび誘導体も抗原として理解され得る。本発明の文脈において、抗原は、提供された治療用ＲＮＡ（例えば、コードＲＮＡ、レプリコンＲＮＡ、ｍＲＮＡ）の翻訳の産物であり得る。「抗原性ペプチドまたはタンパク質」という用語は、当業者によって認識および理解され、例えば体の適応免疫系を刺激して適応免疫応答をもたらし得る（抗原性）タンパク質から誘導されるペプチドまたはタンパク質を指すことを意図している。したがって、「抗原性ペプチドまたはタンパク質」は、それが誘導されるタンパク質の少なくとも１つのエピトープまたは抗原（例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、原生動物抗原）を含む。本発明の文脈において、抗原は、本発明の組合せ／組成物の少なくとも１つの治療用ＲＮＡによって提供され得る。
核酸の文脈において、すなわち、（別の）核酸「から誘導される」核酸について、本明細書を通して使用される「から誘導される」という用語は、（別の）核酸から誘導される核酸が、例えばそれが誘導される核酸と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または約９９％の配列同一性を共有することを意味する。当業者であれば、配列同一性が、典型的には同じ種類の核酸について、すなわちＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列について計算されることに気づく。よって、ＤＮＡがＲＮＡ「から誘導される」場合、またはＲＮＡがＤＮＡ「から誘導される」場合、第１の工程で、ＲＮＡ配列が対応するＤＮＡ配列に変換される（特に、配列を通してＵをＴによって置換することによって）、または逆もまた同様で、ＤＮＡ配列が対応するＲＮＡ配列に変換される（特に、配列を通してＴをＵによって置換することによって）ことが理解される。その後、ＤＮＡ配列の配列同一性またはＲＮＡ配列の配列同一性が決定される。好ましくは、核酸「から誘導される」核酸はまた、例えばＲＮＡ安定性をなおさらに増加させるため、ならびに／あるいはタンパク質産生を延長および／または増加させるために、それが誘導される核酸と比較して修飾されている核酸を指す。アミノ酸配列の文脈において、「から誘導される」という用語は、（別の）アミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列が、例えばそれが誘導されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または約９９％の配列同一性を共有することを意味する。
エピトープ（「抗原決定基」とも呼ばれる）：本発明の文脈におけるタンパク質のＴ細胞エピトープまたは部分は、好ましくは約６～約２０またはさらに多いアミノ酸長を有する断片、例えば好ましくは約８～約１０、例えば８、９または１０（またはさらに１１または１２アミノ酸）のアミノ酸長を有する、ＭＨＣクラスＩ分子によって処理および提示される断片、または好ましくは約１３以上のアミノ酸長、例えば１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸長を有する、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって処理および提示される断片を含み得、これらの断片はアミノ酸配列の任意の部分から選択され得る。これらの断片は、典型的にはペプチド断片およびＭＨＣ分子からなる複合体の形態でＴ細胞によって認識される。
Ｂ細胞エピトープは、典型的には、抗体によって、すなわちその天然形態で認識され得る、好ましくは５～１５個のアミノ酸を有する、より好ましくは５～１２個のアミノ酸を有する、さらにより好ましくは６～９個のアミノ酸を有する、本明細書に定義される（天然）タンパク質またはペプチド抗原の外表面上に位置する断片である。
タンパク質またはペプチドのこのようなエピトープはさらに、このようなタンパク質またはペプチドの本明細書で言及されるバリアントのいずれかから選択され得る。この文脈において、抗原決定基は、本明細書に定義されるタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列において不連続であるが、単一ポリペプチド鎖で構成される３次元構造または連続もしくは直鎖状エピトープにまとめられる、本明細書に定義されるタンパク質またはペプチドのセグメントで構成される立体構造または不連続エピトープであり得る。
「ワクチン」という用語は、典型的には少なくとも１つの抗原または抗原性機能を提供する予防用または治療用材料であると理解される。抗原または抗原性機能は、体の適応免疫系を刺激して適応免疫応答をもたらさせることができる。
本発明の文脈における「抗原提供ｍＲＮＡ」という用語は、典型的にはそのｍＲＮＡを提供された細胞または生物によって翻訳され得る少なくとも１つのオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡであり得る。この翻訳の産物は、抗原、好ましくは免疫原として作用し得るペプチドまたはタンパク質である。産物はまた、２つ以上の免疫原で構成される融合タンパク質、例えば同じまたは異なるウイルスタンパク質から誘導される２つ以上のエピトープ、ペプチドまたはタンパク質からなる融合タンパク質であってもよく、エピトープ、ペプチドまたはタンパク質はリンカー配列によって連結され得る。
「人工ｍＲＮＡ」（配列）という用語は、典型的には天然には存在しないｍＲＮＡ分子であると理解され得る。換言すれば、人工ｍＲＮＡ分子は、非天然ｍＲＮＡ分子として理解され得る。このようなｍＲＮＡ分子は、その個々の配列（天然には存在しない）のために、および／または他の修飾、例えば天然には存在しないヌクレオチドの構造修飾のために非天然であり得る。典型的には、人工ｍＲＮＡ分子は、ヌクレオチドの所望の人工配列（異種配列）に対応する遺伝子操作法によって設計および／作製され得る。この文脈において、人工配列は通常、天然には存在し得ない配列である、すなわち、人工配列は少なくとも１個のヌクレオチドによって野生型配列と異なる。「野生型」という用語は、天然に存在する配列として理解され得る。さらに、「人工核酸分子」という用語は、「１つの単一分子」を意味するように制限されず、典型的には、同一分子のアンサンブルを含むと理解される。したがって、この用語は、アリコートに含有される複数の同一分子に関し得る。
核酸配列またはアミノ酸配列の文脈において本明細書を通して使用される「異種」または「異種配列」という用語は、当業者によって認識および理解される配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸）を指し、別の遺伝子、別の対立遺伝子、別の種から誘導される配列を指すことを意図している。２つの配列が同じ遺伝子または同じ対立遺伝子から誘導することができない場合、これらの配列は典型的には「異種」であると理解される。すなわち、異種配列は同じ生物から誘導することができてもよいが、例えば同じＲＮＡまたはタンパク質などの同じ核酸分子で天然に（自然に）存在しない。
バイ／マルチシストロン性ｍＲＮＡ：典型的には２つの（バイシストロン性）またはより多くの（マルチシストロン性）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（コード領域またはコード配列）を有し得る、ｍＲＮＡ。この文脈におけるオープンリーディングフレームは、ペプチドまたはタンパク質に翻訳され得るいくつかのヌクレオチドトリプレット（コドン）の配列である。このようなｍＲＮＡの翻訳は、２つの（バイシストロン性）またはより多くの（マルチシストロン性）別個の翻訳産物（ＯＲＦが同一ではない場合）をもたらす。真核生物における発現については、このようなｍＲＮＡが、例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含み得る。
モノシストロン性ｍＲＮＡ：モノシストロン性ｍＲＮＡは、典型的にはただ１つのオープンリーディングフレーム（コード配列またはコード領域）を含む、ｍＲＮＡであり得る。この文脈におけるオープンリーティングフレームは、ペプチドまたはタンパク質に翻訳され得るいくつかのヌクレオチドトリプレット（コドン）の配列である。
３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）：３’－ＵＴＲは、典型的にはｍＲＮＡのタンパク質コード領域（すなわち、オープンリーティングフレーム）とポリ（Ａ）配列との間に位置するｍＲＮＡの部分である。ｍＲＮＡの３’－ＵＴＲはアミノ酸配列に翻訳されない。３’－ＵＴＲ配列は、一般的に遺伝子発現工程中にそれぞれのｍＲＮＡに転写される遺伝子によってコードされる。ゲノム配列は最初に、任意選択のイントロンを含む、ｍＲＮＡ前駆体に転写される。次いで、ｍＲＮＡ前駆体が成熟工程で成熟ｍＲＮＡにさらにプロセシングされる。この成熟工程は、５’キャッピング、任意選択のイントロンを切除するためのｍＲＮＡ前駆体のスプライシング、ならびにｍＲＮＡ前駆体の３’末端のポリアデニル化および任意選択のエンド－またはエキソヌクレアーゼ切断等などの３’末端の修飾の工程を含む。本発明の文脈において、３’－ＵＴＲは、タンパク質コード領域の終止コドンに対して３’、好ましくはタンパク質コード領域の終止コドンに対して直ぐ３’に位置し、ポリ（Ａ）配列の５’側、好ましくはポリ（Ａ）配列に対して直ぐ５’のヌクレオチドまで伸長する成熟ｍＲＮＡの配列に対応する。「対応する」という用語は、３’－ＵＴＲ配列が、例えば３’－ＵＴＲ配列を定義するために使用されるｍＲＮＡにおける、ＲＮＡ配列、またはこのようなＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列であり得ることを意味する。本発明の文脈において、「アルブミン遺伝子の３’－ＵＴＲ」などの「遺伝子の３’－ＵＴＲ」という用語は、この遺伝子から誘導される成熟ｍＲＮＡ、すなわち、遺伝子の転写およびｍＲＮＡ前駆体の成熟によって得られるｍＲＮＡの３’－ＵＴＲに対応する配列である。「遺伝子の３’－ＵＴＲ」という用語は、３’－ＵＴＲのＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列を包含する。
５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）：５’－ＵＴＲは、典型的にはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の特定のセクションであると理解される。これはｍＲＮＡのオープンリーティングフレームの５’に位置する。典型的には、５’－ＵＴＲは、転写開始部位で始まり、オープンリーティングフレームの開始コドンの１ヌクレオチド前で終わる。５’－ＵＴＲは、調節エレメントとも呼ばれる、遺伝子発現を制御するためのエレメントを含み得る。このような調節エレメントは、例えば、リボソーム結合部位または５’末端オリゴピリミジントラクトであり得る。５’－ＵＴＲは、例えば５’キャップの付加によって、転写後修飾され得る。本発明の文脈において、５’－ＵＴＲは、５’キャップと開始コドンとの間に位置する成熟ｍＲＮＡの配列に対応する。好ましくは、５’－ＵＴＲは、５’キャップに対して３’に位置するヌクレオチド、好ましくは５’キャップに対して直ぐ３’に位置するヌクレオチドから、タンパク質コード領域の開始コドンに対して５’に位置するヌクレオチド、好ましくはタンパク質コード領域の開始コドンに対して直ぐ５’に位置するヌクレオチドまで伸長する配列に対応する。成熟ｍＲＮＡの５’キャップに対して直ぐ３’に位置するヌクレオチドは、典型的には転写開始部位に対応する。「対応する」という用語は、５’－ＵＴＲ配列が、例えば５’－ＵＴＲ配列を定義するために使用されるｍＲＮＡにおける、ＲＮＡ配列、またはこのようなＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列であり得ることを意味する。本発明の文脈において、「ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲ」などの「遺伝子の５’－ＵＴＲ」という用語は、この遺伝子から誘導される成熟ｍＲＮＡ、すなわち、遺伝子の転写およびｍＲＮＡ前駆体の成熟によって得られるｍＲＮＡの５’－ＵＴＲに対応する配列である。「遺伝子の５’－ＵＴＲ」という用語は、５’－ＵＴＲのＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列を包含する。
５’末端オリゴピリミジントラクト（ＴＯＰ）：５’末端オリゴピリミジントラクト（ＴＯＰ）は、典型的にはある特定のｍＲＮＡ分子の５’末端領域またはある特定の遺伝子の機能的実体、例えば転写された領域の５’末端領域などの、核酸分子の５’末端領域に位置するピリミジンヌクレオチドの伸長である。この配列は、通常は転写開始部位に対応する、シチジンで始まり、これに通常約３～３０個のピリミジンヌクレオチドの伸長が続く。例えば、ＴＯＰは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはさらに多くのヌクレオチドを含み得る。ピリミジン伸長、よって、５’－ＴＯＰは、ＴＯＰの下流に位置する最初のプリンヌクレオチドに対して１ヌクレオチド５’で終わる。５’末端オリゴピリミジントラクトを含有するメッセンジャーＲＮＡはしばしばＴＯＰ ｍＲＮＡと呼ばれる。したがって、このようなメッセンジャーＲＮＡを提供する遺伝子はＴＯＰ遺伝子と呼ばれる。ＴＯＰ配列は、例えば、ペプチド伸長因子およびリボソームタンパク質をコードする遺伝子およびｍＲＮＡに見られる。
ＴＯＰモチーフ：本発明の文脈において、ＴＯＰモチーフは、上に定義される５’－ＴＯＰに対応する核酸配列である。よって、本発明の文脈におけるＴＯＰモチーフは、好ましくは３～３０ヌクレオチド長を有するピリミジンヌクレオチドの伸長である。好ましくは、ＴＯＰモチーフは、少なくとも３個のピリミジンヌクレオチド、好ましくは少なくとも４個のピリミジンヌクレオチド、好ましくは少なくとも５個のピリミジンヌクレオチド、より好ましくは少なくとも６個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７個のヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも８個のピリミジンヌクレオチドからなり、ピリミジンヌクレオチドの伸長は、好ましくはその５’末端においてシトシンヌクレオチドで始まる。ＴＯＰ遺伝子およびＴＯＰ ｍＲＮＡにおいて、ＴＯＰモチーフは、好ましくはその５’末端において転写開始部位で始まり、前記遺伝子またはｍＲＮＡ中の最初のプリン残基に対して１ヌクレオチド５’で終わる。本発明の意味におけるＴＯＰモチーフは、好ましくは、５’－ＵＴＲを表す配列の５’末端、または５’－ＵＴＲをコードする配列の５’末端に位置する。よって、好ましくは、３個以上のピリミジンヌクレオチドの伸長が、本発明のｍＲＮＡ、本発明のｍＲＮＡの５’－ＵＴＲエレメント、または本明細書に記載されるＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲから誘導される核酸配列などのそれぞれの配列の５’末端に位置する場合、本発明の意味において「ＴＯＰ配列」と呼ばれる。換言すれば、５’－ＵＴＲまたは５’－ＵＴＲエレメントの５’末端に位置せず、５’－ＵＴＲまたは５’－ＵＴＲエレメント内のどこかに位置する３個以上のピリミジンヌクレオチドの伸長は、好ましくは「ＴＯＰモチーフ」と呼ばれない。
ＴＯＰ遺伝子：ＴＯＰ遺伝子は、典型的には５’末端オリゴピリミジントラクトの存在を特徴とする。さらに、ほとんどのＴＯＰ遺伝子は成長関連翻訳調節を特徴とする。しかしながら、組織特異的翻訳調節を有するＴＯＰ遺伝子も知られている。上に定義されるように、ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲは、好ましくは５’キャップに対して３’に位置するヌクレオチドから開始コドンに対して５’に位置するヌクレオチドまで伸長する、ＴＯＰ遺伝子から誘導される成熟ｍＲＮＡの５’－ＵＴＲの配列に対応する。ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲは、典型的にはいずれの開始コドンも、好ましくは上流ＡＵＧ（ｕＡＵＧ）も上流オープンリーティングフレーム（ｕＯＲＦ）も含まない。その中で、上流ＡＵＧおよび上流オープンリーティングフレームは、典型的には翻訳されるべきオープンリーティングフレームの開始コドン（ＡＵＧ）の５’に存在するＡＵＧおよびオープンリーティングフレームであると理解される。ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲは一般的にかなり短い。ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲの長さは、２０ヌクレオチド～最大５００ヌクレオチドの間で変動し得、典型的には約２００ヌクレオチド未満、好ましくは約１５０ヌクレオチド未満、より好ましくは約１００ヌクレオチド未満である。本発明の意味におけるＴＯＰ遺伝子の例示的な５’－ＵＴＲは、その開示を本願明細書に援用する、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１～１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１および配列番号１４２２による配列またはそのホモログもしくはバリアントにおける５位のヌクレオチドから開始コドン（例えば、ＡＴＧ）に対して直ぐ５’に位置するヌクレオチドまで伸長する核酸配列である。この文脈において、ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲの特に好ましい断片は、５’－ＴＯＰモチーフを欠くＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲである。「ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲ」という用語は、好ましくは天然に存在するＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲを指す。
核酸配列、特にｍＲＮＡの断片：核酸配列の断片は、完全長核酸配列の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す、断片の核酸配列の基礎である完全長核酸配列におけるヌクレオチドの連続伸長に対応するヌクレオチドの連続伸長からなる。本発明の意味における、このような断片は、好ましくは完全長核酸配列の機能的断片である。
本発明の文脈において、タンパク質またはペプチドの「断片」または「バリアント」は、このようなタンパク質またはペプチドの少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも７５個または少なくとも１００個のアミノ酸の伸長にわたって少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有し得る。より好ましくは、本明細書で使用されるタンパク質またはペプチドの「断片」または「バリアント」は、そのバリアントが誘導されるタンパク質またはペプチドと少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である。
核酸配列、特にｍＲＮＡのバリアント：核酸配列のバリアントは、核酸配列の基礎を形成する核酸配列のバリアントを指す。例えば、バリアント核酸配列は、そのバリアントが誘導される核酸配列と比較して１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、挿入、付加および／または置換を示し得る。好ましくは、核酸配列のバリアントは、そのバリアントが誘導される核酸配列と少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である。好ましくは、バリアントは機能的バリアントである。核酸配列の「バリアント」は、このような核酸配列の１０個、２０個、３０個、５０個、７５個または１００個のヌクレオチドの伸長にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％のヌクレオチド同一性を有し得る。
安定化核酸、好ましくはｍＲＮＡ：安定化核酸、好ましくは、ｍＲＮＡは、典型的にはインビボ分解（例えば、エキソ－もしくはエンド－ヌクレアーゼによる分解）および／またはエキソビボ分解（例えば、ワクチン投与前の製造工程による、例えば、投与されるワクチン溶液の調製の過程において）に対する耐性を増加させる修飾を示す。ＲＮＡの安定化は、例えば５’キャップ構造、ポリＡ尾部、または任意の他のＵＴＲ修飾を提供することによって達成され得る。これはまた、化学修飾または核酸のＧ／Ｃ含量の修飾によっても達成され得る。様々な他の方法が当技術分野で公知であり、本発明の文脈において考えられる。
ＲＮＡインビトロ転写：「ＲＮＡインビトロ転写」または「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡが無細胞系（インビトロ）で合成される工程に関する。ＤＮＡ、特にプラスミドＤＮＡがＲＮＡ転写産物を生成するための鋳型として使用される。ＲＮＡは、本発明によると、好ましくは直鎖状プラスミドＤＮＡ鋳型である、適切なＤＮＡ鋳型のＤＮＡ依存性インビトロ転写によって得られ得る。インビトロ転写を制御するためのプロモータは、任意のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモータであり得る。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの具体例にはＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼがある。インビトロＲＮＡ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にインビトロ転写されるそれぞれのＲＮＡに対応するｃＤＮＡをクローニングし、これをインビトロ転写のための適切なベクター、例えばプラスミドＤＮＡに導入することによって得ることができる。本発明の好ましい実施形態において、ＤＮＡ鋳型が、インビトロで転写される前に、適切な制限酵素により直線化される。ｃＤＮＡはｍＲＮＡの逆転写または化学合成によって得ることができる。さらに、インビトロＲＮＡ合成のためのＤＮＡ鋳型は、遺伝子合成によっても得ることができる。
インビトロ転写のための方法は当技術分野で公知である（例えば、ゲールら（Ｇｅａｌｌ ｅｔ ａｌ．）（２０１３）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（２）：１５２－１５９；ブリュネルら（Ｂｒｕｎｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．）（２０１３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５３０：１０１－１４参照）。前記方法で使用される試薬には、典型的には以下が含まれる：
１）バクテリオファージによってコードされるＲＮＡポリメラーゼなどのそれぞれのＲＮＡポリメラーゼに対する高い結合親和性を有するプロモータ配列を有する直線化ＤＮＡ鋳型；
２）４つの塩基（アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシル）についてのリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）；
３）場合により、上に定義されるキャップアナログ（例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍ７Ｇ））；
４）直線化ＤＮＡ鋳型内のプロモータ配列に結合することができるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）；
５）場合により、任意の汚染ＲＮアーゼを不活性化するためのリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）阻害剤；
６）場合により、転写を阻害し得るピロリン酸を分解するピロホスファターゼ；
７）ポリメラーゼのための補因子としてのＭｇ２＋イオンを供給するＭｇＣｌ２；
８）最適な濃度の抗酸化剤（例えば、ＤＴＴ）、および／またはスペルミジンなどのポリアミンを含有することもできる、適切なｐＨ値を維持するための緩衝剤。
完全長タンパク質：本明細書で使用される「完全長タンパク質」という用語は、典型的には天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列全体を実質的に含むタンパク質を指す。それにもかかわらず、タンパク質中の例えば突然変異によるアミノ酸の置換も完全長タンパク質という用語に包含される。
タンパク質の断片：本発明の文脈におけるタンパク質またはペプチドの「断片」は、典型的にはそのアミノ酸配列（またはそのコード核酸分子）に関して、元の（天然）タンパク質のアミノ酸配列（またはそのコード核酸分子）と比較してＮ末端および／またはＣ末端切断されている、本明細書に定義されるタンパク質またはペプチドの配列を含み得る。よって、このような切断は、アミノ酸レベルで、または対応して核酸レベルで存在し得る。したがって、本明細書に定義されるこのような断片に関する配列同一性は、好ましくは本明細書に定義されるタンパク質もしくはペプチド全体、またはこのようなタンパク質もしくはペプチドの（コード）核酸分子全体を指し得る。
遺伝子の核酸配列の文脈における「バリアント」という用語は、核酸配列バリアント、すなわち、参照（または「親」）核酸または遺伝子の参照（または「親」）核酸配列と少なくとも１個の核酸が異なる核酸配列を含む核酸配列または遺伝子を指す。よって、バリアント核酸または遺伝子は、好ましくはその核酸配列中に、それぞれの参照配列と比較して少なくとも１つの変異、置換、挿入または欠失を含み得る。好ましくは、本明細書で使用される「バリアント」という用語は、核酸配列または遺伝子の天然に存在するバリアント、および操作されたバリアントを含む。したがって、本明細書で定義される「バリアント」は、参照核酸配列から誘導され得る、参照核酸配列から単離され得る、参照核酸配列に関連し得る、参照核酸配列に基づき得る、または参照核酸配列と相同であり得る。「バリアント」は、好ましくはそれぞれの天然に存在する（野生型）核酸配列もしくは遺伝子、またはそのホモログ、断片もしくは誘導体の核酸配列との少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％またはさらには９７％の配列同一性を有し得る。
また、タンパク質またはペプチドの文脈において本明細書を通して使用される「バリアント」という用語は、当業者によって認識および理解され、例えば、１つまたは複数の置換、挿入および／または欠失アミノ酸などの１つまたは複数の変異において元の配列とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質またはペプチドバリアントを指すことを意図している。好ましくは、これらの断片および／またはバリアントは、完全長天然タンパク質と比較して同じ生物学的機能または特異的活性、例えばその特異的抗原性特性を有する。本明細書で定義されるタンパク質またはペプチドの「バリアント」は、その天然の、すなわち、変異していない生理的配列と比較して保存的アミノ酸置換を含み得る。これらのアミノ酸配列ならびにそのコードヌクレオチド配列は特に、本明細書に定義されるバリアントという用語に入る。同じクラスに由来するアミノ酸が互いに交換される置換は保存的置換と呼ばれる。特に、これらは、脂肪族側鎖を有するアミノ酸、正または負に帯電した側鎖を有するアミノ酸、側鎖またはアミノ酸中に芳香族基を有するアミノ酸、その側鎖が水素架橋に入ることができる、例えばヒドロキシル官能基を有する側鎖を有するアミノ酸である。これは、例えば極性側鎖を有するアミノ酸が、同様の極性側鎖を有する別のアミノ酸によって置換されるか、または例えば疎水性側鎖を特徴とするアミノ酸が、同様の疎水性側鎖を有する別のアミノ酸によって置換される（例えば、セリン（トレオニン）がトレオニン（セリン）によって、またはロイシン（イソロイシン）がイソロイシン（ロイシン）によって）ことを意味する。特に、３次元構造に修飾を引き起こさず、結合領域に影響も及ぼさない配列位置において、挿入および置換が可能である。挿入または欠失による３次元構造への修飾は、例えばＣＤスペクトル（円二色性スペクトル）を使用して容易に決定することができる。タンパク質またはペプチドの「バリアント」は、このようなタンパク質またはペプチドの少なくとも１０個、２０個、３０個、５０個、７５個または１００個のアミノ酸の伸長にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有し得る。好ましくは、タンパク質のバリアントはタンパク質の機能的バリアントを含み、これはバリアントが、それが誘導されるタンパク質と同じ効果もしくは機能性または効果もしくは機能性の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％を発揮することを意味する。
また、核酸配列または遺伝子の文脈における「断片」という用語は、完全長参照（または「親」）核酸配列または遺伝子の連続部分配列を指す。換言すれば、「断片」は、典型的には完全長核酸配列または遺伝子のより短い部分であり得る。したがって、断片は、典型的には完全長核酸配列または遺伝子内の対応する伸長と同一である配列からなる。この用語は、天然に存在する断片ならびに操作された断片を含む。本発明の文脈における配列の好ましい断片は、その断片が誘導される全（すなわち、完全長）核酸配列または遺伝子の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％を表す、その断片が誘導される核酸または遺伝子中の実体の連続伸長に対応する核酸の連続伸長からなる。このような断片に関して示される配列同一性は、好ましくは核酸配列または遺伝子全体を指す。好ましくは、「断片」は、それが誘導される参照核酸配列または遺伝子との少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％またはさらには９７％の配列同一性を有する核酸配列を含み得る。
また、この文脈において、タンパク質の断片は、典型的にはそれぞれの天然に存在する完全長タンパク質のアミノ酸配列との少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％またはさらには９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
核酸配列またはアミノ酸配列の文脈において本明細書を通して使用される「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」という用語は、当業者によって認識および理解され、例えば、２つの配列が同一であるパーセンテージを指すことを意図している。２つの配列、例えば本明細書に定義される核酸配列またはアミノ酸（ａａ）配列、好ましくは本明細書に定義される核酸配列によってコードされるａａ配列、またはａａ配列自体が同一であるパーセンテージを決定するために、配列を整列させてその後、互いに比較することができる。したがって、例えば第１の配列の位置を第２の配列の対応する位置と比較することができる。第１の配列中の位置が第２の配列中の位置の場合と同じ残基によって占められている場合、２つの配列はこの位置で同一である。そうでない場合、配列はこの位置で異なる。第１の配列と比較して第２の配列で挿入が起こっている場合、ギャップを第１の配列に挿入してさらなるアラインメントを可能にすることができる。第１の配列と比較して第２の配列で欠失が起こっている場合、ギャップを第２の配列に挿入してさらなるアラインメントを可能にすることができる。そのため、２つの配列が同一であるパーセンテージは、同一の位置の数を、１つの配列中でのみ占められる位置を含む位置の総数で割った関数である。２つの配列が同一であるパーセンテージは、アルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれたアルゴリズムを使用して決定することができる。
本発明の文脈におけるタンパク質またはペプチドの断片は、例えば少なくとも５アミノ酸長、好ましくは少なくとも６アミノ酸長、好ましくは少なくとも７アミノ酸長、より好ましくは少なくとも８アミノ酸長、さらにより好ましくは少なくとも９アミノ酸長；さらにより好ましくは少なくとも１０アミノ酸長；さらにより好ましくは少なくとも１１アミノ酸長；さらにより好ましくは少なくとも１２アミノ酸長；さらにより好ましくは少なくとも１３アミノ酸長；さらにより好ましくは少なくとも１４アミノ酸長；さらにより好ましくは少なくとも１５アミノ酸長；さらにより好ましくは少なくとも１６アミノ酸長；さらにより好ましくは少なくとも１７アミノ酸長；さらにより好ましくは少なくとも１８アミノ酸長；さらにより好ましくは少なくとも１９アミノ酸長；さらにより好ましくは少なくとも２０アミノ酸長；さらにより好ましくは少なくとも２５アミノ酸長；さらにより好ましくは少なくとも３０アミノ酸長；さらにより好ましくは少なくとも３５アミノ酸長；さらにより好ましくは少なくとも５０アミノ酸長；最も好ましくは少なくとも１００アミノ酸長を有する、本明細書に定義されるタンパク質またはペプチドの配列をさらに含み得る。例えば、このような断片は約６～約２０またはさらに多いアミノ酸長を有し得る、例えば好ましくは約８～約１０、例えば８、９もしくは１０アミノ酸（またはさらに６、７、１１、もしくは１２アミノ酸）長を有する、ＭＨＣクラスＩ分子によって処理および提示される断片、または好ましくは約１３以上のアミノ酸、例えば１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくはさらに多いアミノ酸長を有する、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって処理および提示される断片であり得、これらの断片はアミノ酸配列の任意の部分から選択され得る。これらの断片は、典型的にはペプチド断片およびＭＨＣ分子からなる複合体の形態でＴ細胞によって認識される、すなわち、断片は典型的にはその天然形態で認識されない。タンパク質またはペプチドの断片は、これらのタンパク質またはペプチドの少なくとも１つのエピトープを含み得る。さらにまた、タンパク質のドメイン、例えばタンパク質の細胞外ドメイン、細胞内ドメインまたは膜貫通ドメインおよび短縮または切断バージョンがタンパク質の断片を構成すると理解され得る。
タンパク質のバリアント：１つまたは複数の置換、挿入および／または欠失アミノ酸などの１つまたは複数の変異において元の配列とは異なるアミノ酸配列を有する、本発明の文脈において定義されるタンパク質またはペプチドの「バリアント」が作製され得る。好ましくは、これらの断片および／またはバリアントは、完全長天然タンパク質と比較して同じ生物学的機能または特異的活性、例えばその特異的抗原性特性を有する。本明細書の文脈において定義されるタンパク質またはペプチドの「バリアント」は、その天然の、すなわち、変異していない生理的配列と比較して保存的アミノ酸置換を含み得る。これらのアミノ酸配列ならびにそのコードヌクレオチド配列は特に、本明細書に定義されるバリアントという用語に入る。同じクラスに由来するアミノ酸が互いに交換される置換は保存的置換と呼ばれる。特に、これらは、脂肪族側鎖を有するアミノ酸、正または負に帯電した側鎖を有するアミノ酸、側鎖またはアミノ酸中に芳香族基を有するアミノ酸、その側鎖が水素架橋に入ることができる、例えばヒドロキシル官能基を有する側鎖を有するアミノ酸である。これは、例えば極性側鎖を有するアミノ酸が、同様の極性側鎖を有する別のアミノ酸によって置換されるか、または例えば疎水性側鎖を特徴とするアミノ酸が、同様の疎水性側鎖を有する別のアミノ酸によって置換される（例えば、セリン（トレオニン）がトレオニン（セリン）によって、またはロイシン（イソロイシン）がイソロイシン（ロイシン）によって）ことを意味する。特に、３次元構造に修飾を引き起こさず、結合領域に影響も及ぼさない配列位置において、挿入および置換が可能である。挿入または欠失による３次元構造への修飾は、例えばＣＤスペクトル（円二色性スペクトル）を使用して容易に決定することができる（アーリ（Ｕｒｒｙ）、１９８５、Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ、ポリペプチドの円二色性およびＯＲＤ（Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ａｎｄ ＯＲＤ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）、Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ニューバーガーら（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）（編）、エルゼビア社（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、アムステルダム（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）所在）。
タンパク質またはペプチドの「バリアント」は、このようなタンパク質またはペプチドの１０個、２０個、３０個、５０個、７５個または１００個のアミノ酸の伸長にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有し得る。
さらに、核酸分子によってコードされ得る、本明細書に定義されるタンパク質またはペプチドのバリアントはまた、コード核酸配列のヌクレオチドが、タンパク質またはペプチドのそれぞれのアミノ酸配列の変化をもたらすことなく、遺伝暗号の縮重により交換されている、すなわち、アミノ酸配列またはその少なくとも一部が、上記の意味内の１つまたは複数の変異において元の配列と異ならない、配列を含み得る。
配列の同一性：２つの配列、例えば本明細書に定義される核酸配列またはアミノ酸配列、好ましくは本明細書に定義されるポリマー担体の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列またはアミノ酸配列自体が同一であるパーセンテージを決定するために、配列を整列させてその後、互いに比較することができる。したがって、例えば第１の配列の位置を第２の配列の対応する位置と比較することができる。第１の配列中の位置が第２の配列中の位置の場合と同じ成分（残基）によって占められている場合、２つの配列はこの位置で同一である。そうでない場合、配列はこの位置で異なる。第１の配列と比較して第２の配列で挿入が起こっている場合、ギャップを第１の配列に挿入してさらなるアラインメントを可能にすることができる。第１の配列と比較して第２の配列で欠失が起こっている場合、ギャップを第２の配列に挿入してさらなるアラインメントを可能にすることができる。そのため、２つの配列が同一であるパーセンテージは、同一の位置の数を、１つの配列中でのみ占められる位置を含む位置の総数で割った関数である。２つの配列が同一であるパーセンテージは、数学的アルゴリズムを使用して決定することができる。使用することができる数学的アルゴリズムの好ましいが限定的ではない例は、カーリンら（Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．）（１９９３）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９０：５８７３－５８７７またはアルトシュルら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．）（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９－３４０２のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ある特定の程度で本発明の配列と同一である配列は、このプログラムによって識別することができる。
タンパク質またはペプチドの誘導体：ペプチドまたはタンパク質の誘導体は、典型的には前記ペプチドまたはタンパク質などの別の分子から誘導される分子であると理解される。ペプチドまたはタンパク質の「誘導体」は、本発明で使用されるペプチドまたはタンパク質を含む融合体も包含する。例えば、融合体は、例えば、エピトープ、例えばＦＬＡＧエピトープまたはＶ５エピトープなどの標識を含む。例えば、エピトープはＦＬＡＧエピトープである。このようなタグは、例えば、融合タンパク質を精製するのに有用である。
薬学的有効量：本発明の文脈における薬学的有効量は、典型的には免疫応答を誘導するのに十分な量であると理解される。
担体：本発明の文脈における担体は、典型的には別の化合物の輸送および／または複合体化を促進する化合物であり得る。前記担体は前記他の化合物と複合体を形成し得る。ポリマー担体は、ポリマーで形成される担体である。
ビヒクル：典型的には、医薬組成物またはワクチンの成分の個体への投与を促進するために、医薬組成物またはワクチン内で使用され得る薬剤、例えば担体。
（ＨＥＸＡ脂質の化学構造）－（Ａ）本明細書に記載される本発明のＨＥＸＡ脂質化合物、すなわち、脂質化合物Ｃ１ ＨＥＸＡ－Ｃ４ＤＥ－ＰｉｐＳＳの構造を示す図。（Ｂ）本明細書に記載される本発明のＨＥＸＡ脂質化合物、すなわち、脂質化合物Ｃ２ ＨＥＸＡ－Ｃ５ＤＥ－ＰｉｐＳＳの構造を示す図。（完全な詳細は実施例２．１で見ることができる）。 （ＨＥＸＡ脂質の化学構造）－（Ｃ）本明細書に記載される本発明のＨＥＸＡ脂質化合物、すなわち、脂質化合物Ｃ３ ＨＥＸＡ－Ｃ６ＤＥ－ＰｉｐＳＳの構造を示す図。（Ｄ）本明細書に記載される本発明のＨＥＸＡ脂質化合物、すなわち、脂質化合物Ｃ４ ＨＥＸＡ－Ｃ７ＤＥ－ＰｉｐＳＳの構造を示す図。（完全な詳細は実施例２．１で見ることができる）。 （ＨＥＸＡ脂質の化学構造）－（Ｅ）本明細書に記載される本発明のＨＥＸＡ脂質化合物、すなわち、脂質化合物Ｃ５ ＨＥＸＡ－Ｃ８ＤＥ－ＰｉｐＳＳの構造を示す図。（Ｆ）本明細書に記載される本発明のＨＥＸＡ脂質化合物、すなわち、脂質化合物Ｃ６ ＨＥＸＡＣＡ－Ｃ３ＭＥ－ＰｉｐＳＳの構造を示す図。（完全な詳細は実施例２．１で見ることができる）。 （ＨＥＸＡ脂質の化学構造）－（Ｇ）本明細書に記載される本発明のＨＥＸＡ脂質化合物、すなわち、脂質化合物Ｃ７ ＨＥＸＡＣＡ－Ｃ４ＭＥ－ＰｉｐＳＳの構造を示す図。（Ｈ）本明細書に記載される本発明のＨＥＸＡ脂質化合物、すなわち、脂質化合物Ｃ８ ＨＥＸＡＣＡ－Ｃ６ＭＥ－ＰｉｐＳＳの構造を示す図。（完全な詳細は実施例２．１で見ることができる）。 （ＨＥＸＡ脂質の化学構造）－（Ｉ）本明細書に記載される本発明のＨＥＸＡ脂質化合物、すなわち、脂質化合物Ｃ９ ＨＥＸＡＣＡ－Ｃ８ＭＥ－ＰｉｐＳＳの構造を示す図。（完全な詳細は実施例２．１で見ることができる）。 （ＨＥＸＡ脂質のプロトン化プロファイル／ｐＫａ）－本発明のＨＥＸＡ脂質化合物のプロトン化プロファイル／ｐＫａ－ＴＮＳ（色素２－ｐ－トルイジニルナフタレン－６－スルホネート）蛍光を介したプロトン化度の測定を示す図。（Ａ）組成物１（ＤＳＰＣ）中のＬＮＰ１、ＬＮＰ２、ＬＮＰ３およびＬＮＰ４のＴＮＳ蛍光。（Ｂ）組成物１（ＤＳＰＣ）中のＬＮＰ５、ＬＮＰ６、ＬＮＰ７、およびＧＮ０１のＴＮＳ蛍光。（完全な詳細は実施例２．１．２／表実施例（Ｔａｂｌｅ Ｅｘ）４で見ることができる）。 （ＨＥＸＡ脂質のプロトン化プロファイル／ｐＫａ）－本発明のＨＥＸＡ脂質化合物のプロトン化プロファイル／ｐＫａ－ＴＮＳ（色素２－ｐ－トルイジニルナフタレン－６－スルホネート）蛍光を介したプロトン化度の測定を示す図。（Ｃ）組成物２１（ＤＰｈｙＰＥまたは４ＭＥ１６：０ＰＥ）中のＬＮＰ８、ＬＮＰ９、ＬＮＰ１０およびＬＮＰ１１のＴＮＳ蛍光。（Ｄ）組成物２（ＤＰｈｙＰＥ）中のＬＮＰ１２、ＬＮＰ１３、ＬＮＰ１４、およびＧＮ０１のＴＮＳ蛍光。（完全な詳細は実施例２．１．２／表実施例４で見ることができる）。 （ＨＥＸＡ脂質のプロトン化プロファイル／ｐＫａ）－本発明のＨＥＸＡ脂質化合物のプロトン化プロファイル／ｐＫａ－ＴＮＳ（色素２－ｐ－トルイジニルナフタレン－６－スルホネート）蛍光を介したプロトン化度の測定を示す図。（Ｅ）ＬＮＰ１５（組成物１－ＤＳＰＣ中）、ＬＮＰ１６（組成物２－ＤＰｈｙＰＥ中）、ＬＮＰ１７（組成物２－ＤＳＰＣ中）、ＬＮＰ１８（組成物２－ＤＰｈｙＰＥ中）およびＧＮ０１のＴＮＳ蛍光。（完全な詳細は実施例２．１．２／表実施例４で見ることができる）。 （ＨＥＡＤ脂質の構造）－（Ａ）本明細書に記載される本発明のＨＥＡＤ脂質化合物、すなわち、脂質化合物ＣＩＳＥの構造を示す図。（完全な詳細は実施例２．１／表実施例６で見ることができる）。 （ＨＥＡＤ脂質の構造）－（Ｂ）本明細書に記載される本発明のＨＥＡＤ脂質化合物、すなわち、脂質化合物ＣＰＺＥの構造を示す図。（完全な詳細は実施例２．１／表実施例６で見ることができる）。 （ＨＥＡＤ脂質の構造）－（Ｃ）本明細書に記載される本発明のＨＥＡＤ脂質化合物、すなわち、脂質化合物ＥＳＴＥＲの構造を示す図。（完全な詳細は実施例２．１／表実施例６で見ることができる）。 （ＨＥＡＤ脂質のプロトン化プロファイル／ｐＫａ）－本発明のＨＥＡＤ脂質化合物のプロトン化プロファイル／ｐＫａ－ＴＮＳ（色素２－ｐ－トルイジニルナフタレン－６－スルホネート）蛍光を介したプロトン化度の測定を示す図。（Ａ）ＧＮ０１と比較した組成物Ａ（ＤＳＰＣ）および組成物Ｂ（ＤＰｈｙＰＥ）中のＨＥＡＤ脂質ＣＩＳＥのＴＮＳ蛍光。（Ｂ）ＧＮ０１と比較した組成物Ａ（ＤＳＰＣ）および組成物Ｂ（ＤＰｈｙＰＥ）中のＨＥＡＤ脂質ＣＰＺＥのＴＮＳ蛍光。（完全な詳細は実施例２．２．２／表実施例９で見ることができる）。 （ＨＥＡＤ脂質のプロトン化プロファイル／ｐＫａ）－本発明のＨＥＡＤ脂質化合物のプロトン化プロファイル／ｐＫａ－ＴＮＳ（色素２－ｐ－トルイジニルナフタレン－６－スルホネート）蛍光を介したプロトン化度の測定を示す図。ＧＮ０１と比較した組成物Ａ（ＤＳＰＣ）および組成物Ｂ（ＤＰｈｙＰＥ）中のＨＥＡＤ脂質ＥＳＴＥＲのＴＮＳ蛍光。（完全な詳細は実施例２．２．２／表実施例９で見ることができる）。 （ＨｅＬａおよびＨｅｐＧ２におけるＰｐＬｕｃ発現－ＨＥＸＡ脂質１～７）－ＨＥＸＡ脂質１～７を、組成物１または２を使用して、ＬＮＰとして製剤化し、ＰｐＬｕｃ ｍＲＮＡと共にＨｅＬａ細胞またはＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトした。相対発光量（ＲＬＵ）をトランスフェクション２４時間後に測定した。（Ａ）ＬＮＰ１～ＬＮＰ７（組成物１－ＤＳＰＣ）およびＧＮ０１のＨｅＬａ細胞へのトランスフェクションを示す図。（Ｂ）ＬＮＰ８～ＬＮＰ１４（組成物２－ＤＰｈｙＰＥ）およびＧＮ０１のＨｅＬａ細胞へのトランスフェクションを示す図。（完全な詳細は実施例３．１．１で見ることができる）。 （ＨｅＬａおよびＨｅｐＧ２におけるＰｐＬｕｃ発現－ＨＥＸＡ脂質１～７）－ＨＥＸＡ脂質１～７を、組成物１または２を使用して、ＬＮＰとして製剤化し、ＰｐＬｕｃ ｍＲＮＡと共にＨｅＬａ細胞またはＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトした。相対発光量（ＲＬＵ）をトランスフェクション２４時間後に測定した。（Ｃ）ＬＮＰ１～ＬＮＰ７（組成物１－ＤＳＰＣ）およびＧＮ０１のＨｅｐＧ２細胞へのトランスフェクションを示す図。（Ｄ）ＬＮＰ８～ＬＮＰ１４（組成物２－ＤＰｈｙＰＥ）およびＧＮ０１のＨｅｐＧ２細胞へのトランスフェクションを示す図。すなわち脂質および組成物を用いて製剤化したｍＲＮＡは、ＨｅＬａおよびマウスにおいて非常に優れたおよびより優れてさえいるＰｐＬｕｃ発現を示したことを示す。（完全な詳細は実施例３．１．１で見ることができる）。 （ＨＥＡＤ脂質のＨｅＬａにおけるＰｐＬｕｃ発現）－ＤＰｈｙＰＥを含む組成物がまた、実施例３．１．１および図５による、ほぼ全ての先行技術ＬＮＰ－組成物において標準的な中性脂質として当技術分野で現在まで使用されているＤＳＰＣに対して明確な利点を与えたことを示す図。ＨＥＡＤ脂質ＣＩＳＥ、ＣＰＺＥおよびＥＳＴＥＲを、組成物ＡおよびＢを使用して、ＬＮＰとして製剤化し、ＰｐＬｕｃ ｍＲＮＡと共にＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。相対発光量（ＲＬＵ）をトランスフェクション２４時間後に測定した。（完全な詳細は実施例３．２．１で見ることができる）。 （ＨｅＬａ細胞におけるＨＥＸＡ脂質１～７のｈＥＰＯ発現）－処理後のＨｅＬａ細胞におけるインビトロでの優れたｈＥｐｏ発現を示す図。ＧＮ０１、および組成物２を使用して、ＬＮＰとして調製したＨＥＸＡ脂質－ＤＰｈｙＰＥを、ｈＰＥＯをコードするｍＲＮＡと共に製剤化し、ＨａＬａ細胞にトランスフェクトした。ｈＥｐｏ ＥＬＩＳＡをトランスフェクション２４時間後に実施し、トランスフェクション効率を示す（完全な詳細は実施例４．１．１で見ることができる）。 （マウスにおけるＨＥＸＡ脂質１～７のｈＥＰＯ発現）－本発明の組成物のインビボ分析が注射６時間後および２４時間後に明確に高いｈＥＰＯ発現を与えたことを示す図。ＧＮ０１、および組成物２を使用して、ＬＮＰとして調製したＨＥＸＡ脂質－ＤＰｈｙＰＥを、ｈＥＰＯをコードするｍＲＮＡと共に製剤化し、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（５匹／群）に０．５ｍｇ／ｋｇで注射した。ＥＬＩＳＡを使用して、ＨｓＥｐｏレベルを血漿中で注射６時間後および２４時間後に測定した。（完全な詳細は実施例４．１．１で見ることができる）。 （ＨＥＸＡ脂質の忍容性－肝臓酵素）－試験した動物のいずれも、緩衝液対照と比較して、有意に上昇したＡＳＴおよびＡＬＴ肝臓酵素活性を示さなかったことを示す図。ＨＥＸＡ脂質の忍容性を分析するために、ＡＬＴおよびＡＳＴレベルを、それぞれのＬＮＰのＢａｌｂ／Ｃマウスへの静脈内トランスフェクションの２４時間後に測定した。（Ａ）緩衝液と比較した、ＨＥＸＡ脂質１～９を含有するＬＮＰおよびＧＮ０１のＡＬＴおよびＡＳＴレベル。（Ｂ）緩衝液と比較した、脂質２ ｍ／ｍ比（ｍ／ｍ２０、ｍ／ｍ３０、ｍ／ｍ４０）およびＧＮ０１のＡＬＴおよびＡＳＴレベル。（完全な詳細は実施例４．１．２で見ることができる）。 （ＨＥＸＡ脂質の忍容性－免疫賦活）－試験した脂質化合物のいずれも、有意に上昇したサイトカインレベルを誘導しなかったことを示す図。ＨＥＸＡ脂質の免疫賦活特性を分析するために、ＨＥＸＡ脂質含有ＬＮＰおよびＧＮ０１ ＬＮＰのＢａｌｂ／Ｃマウスへの注射６時間後にマウスから採取した血清試料を用いたＣＢＡアッセイを実施した。血清中のＩＦＮ－αのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。（Ａ）ＨＥＸＡ脂質１～７およびＧＮ０１のＭＣＰ－１。（Ｂ）ＨＥＸＡ脂質１～７およびＧＮ０１のＩＬ－６。（Ｃ）ＨＥＸＡ脂質１～７およびＧＮ０１のＭＰ１－β。（Ｄ）ＨＥＸＡ脂質１～７およびＧＮ０１のＩＮＦ－α。（完全な詳細は実施例４．１．２で見ることができる）。 （ＨＥＸＡ脂質の忍容性－免疫賦活）－試験した脂質化合物のいずれも、有意に上昇したサイトカインレベルを誘導しなかったことを示す図。ＨＥＸＡ脂質の免疫賦活特性を分析するために、ＨＥＸＡ脂質含有ＬＮＰおよびＧＮ０１ ＬＮＰのＢａｌｂ／Ｃマウスへの注射６時間後にマウスから採取した血清試料を用いたＣＢＡアッセイを実施した。血清中のＩＦＮ－αのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。（Ｅ）ＨＥＸＡ脂質８、９、および脂質２ ｍ／ｍ比（ｍ／ｍ２０、ｍ／ｍ３０、ｍ／ｍ４０）およびＧＮ０１のＭＣＰ－１。（Ｆ）ＨＥＸＡ脂質８、９、および脂質２ ｍ／ｍ比（ｍ／ｍ２０、ｍ／ｍ３０、ｍ／ｍ４０）およびＧＮ０１のＩＬ－６。（Ｇ）ＨＥＸＡ脂質８、９、および脂質２ ｍ／ｍ比（ｍ／ｍ２０、ｍ／ｍ３０、ｍ／ｍ４０）およびＧＮ０１のＭＰ１－β。（Ｈ）ＨＥＸＡ脂質８、９、および脂質２ ｍ／ｍ比（ｍ／ｍ２０、ｍ／ｍ３０、ｍ／ｍ４０）およびＧＮ０１のＩＮＦ－α。（完全な詳細は実施例４．１．２で見ることができる）。 （予防用および治療用ワクチンアプローチのためのＬＮＰ－腫瘍抗原Ｔｒｐ２ ｉ．ｄ．注射）－ｔｒｐ２ ｍＲＮＡを含むＧＮ０１、ＧＮ０２およびＣＩＳＥ ＬＮＰを使用したワクチン接種（完全な詳細は実施例４．２．１で見ることができる）が安定なＩｇＧ１およびＩｇＧ２価を示したこと（図１１Ａおよび図１１Ｂ）、ならびにＧＮ０１、ＧＮ０２およびＣＩＳＥ ＬＮＰが低いＴ細胞応答を示したこと（図１１Ｃおよび図１１Ｄ）を示す。すなわち、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、製剤化した腫瘍抗原Ｔｒｐ２をコードするｍＲＮＡおよびＧＮ０１、ＧＮ０２またはＣＩＳＥを背中に皮内（ｉ．ｄ．）注射した。免疫化は０日目、７日目および１４日目に行われた。血液試料を１４時間で採取し、血液および臓器試料を最初のワクチン接種の２１日後に採取した。ＥＬＩＳＡを使用してＴ細胞応答および液性免疫応答を測定した。（Ａ）ＩｇＧ１エンドポイント価を示す図。（Ｂ）ＩｇＧ２ａ［ｂ］エンドポイント価を示す図。（Ｃ）ＣＤ４＋細胞の％ＴＮＦα＋／ＩＦＮγ＋を示す図。（Ｄ）ＣＤ８＋細胞の％ＴＮＦα＋／ＩＦＮγ＋を示す図。（完全な詳細を実施例４．２．１で見ることができる）。 （ＨＥＡＤ脂質の忍容性－肝臓酵素）－試験した動物のいずれも、緩衝液対照と比較して、有意に上昇したＡＳＴおよびＡＬＴ肝臓酵素活性を示さなかったことを示す図。ＨＥＡＤ脂質の忍容性を分析するために、ＡＬＴおよびＡＳＴレベルを、Ｂａｌｂ／Ｃマウスへの静脈内トランスフェクションの２４時間後に測定した。ＨＡＥＤ脂質ＥＳＴＥＲ（ｍ／ｍ４０）およびＣＰＺＥ（ｍ／ｍ２０）のＡＬＴおよびＡＳＴレベルを測定し、ＣＩＳＥ／脂質２（ｍ／ｍ３０）、脂質２（ｍ／ｍ３０）およびＧＮ０１および緩衝液のレベルと比較した。異なるモル／質量（ｍ／ｍ）比（ｍ／ｍ２０、ｍ／ｍ３０、ｍ／ｍ４０）を使用した（完全な詳細は実施例４．２．２で見ることができる）。 （ＨＥＡＤ脂質の忍容性－免疫賦活）－試験した脂質化合物のいずれも、有意に上昇したサイトカインレベルを誘導しなかったことを示す図。ＨＥＸＡ脂質（脂質２）、ＧＮ０１および両者の混合物（ＣＩＳＥ／脂質２）と比較した、ＨＥＡＤ脂質（ＣＰＺＥ、ＥＳＴＥＲ）の免疫賦活特性を分析するために、ＨＥＸＡ脂質のＢａｌｂ／Ｃマウスへの注射の６時間後にマウスから採取した血清試料を用いたＣＢＡアッセイを実施した。血清中のＩＦＮ－αのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。（Ａ）ＭＣＰ－１を示す図。（Ｂ）ＩＬ－６を示す図。（Ｃ）ＭＰ１－βを示す図。（Ｄ）ＩＦＮ－αを示す図。（完全な詳細は実施例４．２．２で見ることができる）。 （長期貯蔵後の本発明のＬＮＰの安定性）－４℃および－８０℃で長期間貯蔵したＧＮ０１ ＬＮＰの完全性および生物物理学的特性の分析を示す図。明らかなように、粒子およびＲＮＡは安定であり、有意な変化は観察されなかった－すなわち、ＬＮＰの生物物理学的特性およびｍＲＮＡ完全性の変化は、ゲル電気泳動後にアガロースゲル上に示され得る。ＧＮ０１ ＬＮＰをｈＥＰＯ ｍＲＮＡと共に製剤化し、４℃および－８０℃で１．５か月間または６か月間貯蔵した。ゲル電気泳動で分析するために、ＬＮＰを破壊したので、組み込まれたｍＲＮＡをゲル上に示すことができた。（Ａ）１．５か月後－分解条件１（ヘパリンとトリトンの組合せを使用してＬＮＰを分解した；図のＣ１）、分解条件２（ヘパリンとＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の組合せおよび１５分間４５℃への加熱を使用してＬＮＰを分解した；図のＣ２）を示す図。（Ｂ）６か月後－分解条件１（ヘパリンとトリトンの組合せを使用してＬＮＰを分解した；図のＣ１）、分解条件２（ヘパリンとＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の組合せおよび１５分間４５℃への加熱を使用してＬＮＰを分解した；図のＣ２）を示す図。（完全な詳細は実施例５．１で見ることができる）。 （１０週間の－８０貯蔵後のＧＮ０１の生物活性）－１週間の貯蔵と比較した、１０週間の貯蔵後のＧＮ０１製剤化ｍＲＮＡの分析（注射後６時間および２４時間後にさらに高い発現効率をもたらした）を示す図。すなわち、製剤化ＧＮ０１の生物活性をＥＬＩＳＡによって評価した。ＧＮ０１ ＬＮＰをｈＥＰＯ ｍＲＮＡと共に製剤化し、１週間および１０週間それぞれ凍結した。Ｂａｌｂ／Ｃマウス（５匹／群）に静脈内注射した。注射の６時間後および２４時間後に、血漿試料を採取し、分析した（完全な詳細は実施例５．２で見ることができる）。 （異なるＦ／Ｔサイクル後のＧＮ０１ ＬＮＰの生物活性）－血漿試料を１凍結／解凍サイクル（１Ｆ／Ｔ）後に２Ｆ／Ｔサイクル（共に－８０℃で１週間貯蔵後）後の血漿試料と比較して分析した－結果は、ＨｓＥｐｏの生物活性を全ての試験アプローチについて示すことができた－、第２の評価を示す図。すなわち、製剤化ＧＮ０１の生物活性をＥＬＩＳＡによって評価した。ＧＮ０１ ＬＮＰをｈＥＰＯ ｍＲＮＡと共に製剤化し、１週間凍結し、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（５匹／群）に静脈内注射した。（Ａ）１Ｆ／Ｔサイクル後にＥｌｉｓａ血漿レベルを分析したことを示す図。（Ｂ）２Ｆ／Ｔサイクル後にＥｌｉｓａ血漿レベルを分析したことを示す図。（完全な詳細は実施例５．２で見ることができる）。 （リン脂質成分の変動および本発明の組成物に対する影響）－ＤＰｈｙＰＥの組み込みが、標準的な中性脂質ＤＳＰＣと比較して高い発現をもたらしたことを示す図－すなわち、ＬＮＰを、異なるリン脂質（ＤＰｈｙＰＥ、ＤＳＰＣ、ＤＰｈｙＰＥ＋ＤＳＰＣ（１＋１））を使用して作製した。（Ａ）脂質１（脂質化合物Ｃ１）およびＧＮ０１ ＬＮＰをＰｐＬｕｃ ｍＲＮＡに製剤化し、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。ＲＬＵ強度を測定することによって、トランスフェクション効率をトランスフェクションの２４時間後に分析した。（Ｂ）異なるリン脂質を含むＬＮＰを含む、ＧＮ０１および脂質化合物Ｃ１のＴＮＳ（色素２－ｐ－トルイジニルナフタレン－６－スルホネート）蛍光を介したプロトン化度の測定。点線＝ＧＮ０１；破線＝ＤＰｈｙＰＥ；通常線＝ＤＳＰＣ、破線から右の階段状の線＝ＤＳＰＣ／ＤＰｈｙＰＥ（完全な詳細は実施例６で見ることができる）。 （ＰＥＧ成分の変動および本発明の組成物に対する影響）－より短いアルキル鎖を有するポリマーコンジュゲート脂質（Ｃ８尾部、Ｃ８－セラミド－ＰＥＧ、Ｃｅｒ８として図に示される）を含む組成物が、より長いアルキル鎖を含むポリマーコンジュゲート脂質（Ｃ１４＝Ｃ１４ ＤＭＧ－ＰＥＧ＝１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００））よりも効率的であったことを示す図。ＨｅｐＧ２細胞におけるＰｐＬｕｃの発現－塗りつぶされたバーは１時間後の結果を示し、空のバーは４時間後の結果を示す（完全な詳細は実施例７で見ることができる）。 （単回ｉ．ｖ．後のＧＮ０１の抗狂犬病ｍＡｂ発現）－単回ｉ．ｖ．注射後のＧＮ０１ ＬＮＰに製剤化された抗狂犬病モノクローナル抗体の発現を示す図。明らかなように、ｉ．ｖ．注射後６時間後および２４時間後に非常に強力な抗狂犬病ｍＡｂ発現を検出することができた（完全な詳細は図８で見ることができる）。 （ＧＮ０１およびＧＮ０２の免疫原性 インビボＴ細胞応答－ＶＮＴ分析）－（Ａ）５μｇのＧＮ０１－およびＧＮ０２－ＬＮＰ製剤化ＲＡＢＶ－Ｇ－ｍＲＮＡによる単回ｉ．ｍ．免疫化が、プライムワクチン接種後３５日目で、全ての動物において、０．５ＩＵ／ｍｌの防御価を十分に上回る非常に堅牢なＶＮＴをすでに誘導したことを示す図。（Ｂ）本発明のＧＮ０１およびＧＮ０２－ＬＮＰ製剤化ＲＡＢＶ－Ｇ ｍＲＮＡワクチンがワクチン接種後に特異的な細胞応答－対照ＬＮＰワクチン接種動物で観察されなかった効果を誘導したことを示す図。ＲＡＢＶ－Ｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞がｍＲＮＡ製剤ＧＮ０１とＧＮ２の両方について観察された。（完全な詳細は実施例９で見ることができる）。 （ＧＮ０１およびＧＮ０２の免疫原性 インビボＴ細胞応答－ＶＮＴ分析）（Ｃ）本発明のＧＮ０１およびＧＮ０２－ＬＮＰ製剤化ＲＡＢＶ－Ｇ ｍＲＮＡワクチンがワクチン接種後に特異的な細胞応答－対照ＬＮＰワクチン接種動物で観察されなかった効果を誘導したことを示す図。ＲＡＢＶ－Ｇ特異的ＣＤ８＋ＴもｍＲＮＡ製剤ＧＮ０１とＧＮ２の両方について観察された。（完全な詳細は実施例９で見ることができる）。 （モノトープ（ｍｏｎｏｔｏｐｅ）ワクチンアプローチのためのＧＮ０１）－ＧＮ０１製剤化ＲＮＡの高い反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を観察することができたことを示す図。（Ａ）ＧＮ０１ ＬＮＰを介したＰＡＤＲＥを含有するモノトープ構築物によるワクチン接種によって、脾細胞数が増加する。（Ｂ）ＧＮ０１製剤化および皮内施用と組み合わせた、モノトープ構築物は、非常に強力なＣＤ８ Ｔ細胞応答をもたらした。（Ｃ）ＧＮ０１製剤化および皮内施用と組み合わせた、モノトープ構築物は、非常に強力なＣＤ８ Ｔ細胞応答をもたらした。（Ｄ）ＧＮ０１製剤化および皮内施用と組み合わせた、モノトープ構築物は、非常に強力なＣＤ８ Ｔ細胞応答をもたらした。（完全な詳細は実施例１０で見ることができる）。 （インフルエンザ／インフルワクチン接種のためのＧＮ０１－Ｈ３Ｎ２）－１０μｇのＧＮ０１ ＬＮＰ製剤化ＨＡ－ｍＲＮＡによる単回ｉ．ｍ．免疫化が、プライムワクチン接種後２１日目で、全ての動物において、４０の防御価を十分に上回る防御ＨＩ価を誘導し、１０μｇのＧＮ０１ ＬＮＰ製剤化ＨＡ－ｍＲＮＡによるブーストが液性免疫応答の多重増加を誘導したことを示す図（完全な詳細は実施例１１で見ることができる）。 （子ウシ動物モデルで試験した狂犬病のためのＧＮ０１）－ＧＮ０１製剤化ＲＡＢＶ－ＧコードｍＲＮＡによる子ウシの筋肉内ワクチン接種が、プライムワクチン接種後、１４日後に、わずか３０μｇのｍＲＮＡの用量で、中和抗体の非常に強力な誘導をすでにもたらしたことを示す図（０．５ＩＵ／ｍｌのＷＨＯ標準を破線で示す；空のバー＝Ｒａｂｉｓｉｎ対照、塗りつぶされたバー＝ＧＮ０１製剤化ｍＲＮＡ）（完全な詳細は実施例１２で見ることができる）。 （インビボマラリアワクチン接種のためのＧＮ０１－エンドポイント価）－ＣＳＰをコードするＧＮ０１製剤化ｍＲＮＡマラリアワクチンが、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、マウスにおいて非常に強力な液性免疫応答を誘導したことを示す図。（Ａ）コーティング：［ＮＡＮＰ］７ペプチド、プライミング後２１日目および３５日目でのＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａエンドポイント価。（Ｂ）コーティングＣ末端ペプチド、プライミング後２１日目および３５日目でのＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａエンドポイント価。１群：ＣＳＰワクチンを含むＧＮ０１－ＬＮＰ；２群；無関係のｍＲＮＡを含むＧＮ０１－ＬＮＰ。（完全な詳細は実施例１３で見ることができる）。 （インビボマラリアワクチン接種のためのＧＮ０１－ＩＣＳ）－ＣＳＰをコードするＧＮ０１製剤化ｍＲＮＡマラリアワクチンが、細胞内サイトカイン染色アッセイ（ワクチン接種後３５日目）を使用して、マウスにおいて細胞性免疫応答（ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞応答）を誘導したことを示す図。１群：ＣＳＰワクチンを含むＧＮ０１－ＬＮＰ；２群：無関係のｍＲＮＡを含むＧＮ０１－ＬＮＰ（完全な詳細は実施例１３で見ることができる）。 （ＦＧＦ２１のインビボ発現のためのＧＮ０１）－本発明のＬＮＰに製剤化されたＦＧＦ２１ ｍＲＮＡが、ｉ．ｖ．注射を介してマウスに０．２５ｍｇ／ｋｇの低用量を投与した後に、高いＦＧＦ２１濃度をもたらしたことを示す図（完全な詳細は実施例１４で見ることができる）。 （ＦＧＦ２１のインビボ発現のためのＧＮ０１）－本発明のＬＮＰに製剤化されたＦＧＦ２１ ｍＲＮＡが、ｉ．ｖ．注射を介してマウスに１ｍｇ／ｋｇの高用量を投与した後に、非常に高いＦＧＦ２１濃度をもたらしたことを示す図（完全な詳細は実施例１４で見ることができる）。 （ＨＥＸＡ脂質の化学構造）－（Ａ）本明細書に記載される本発明のＨＥＸＡ脂質化合物、すなわち、脂質化合物Ｃ２４ ＨＥＸＡ－Ｃ５ＤＥ－逆ＰｉｐＳＳの構造を示す図。（Ｂ）本明細書に記載される本発明のＨＥＸＡ脂質化合物、すなわち、脂質化合物Ｃ２５ ＨＥＸＡ－Ｃ５ＤＥ－Ｐｉｐ－Ｃ３チオエーテルの構造を示す図。（完全な詳細は実施例２０．１で見ることができる）。 （ＨＥＡＤ脂質の構造）－（Ａ）本明細書に記載される本発明のＨＥＡＤ脂質化合物（完全な詳細は実施例２０．２で見ることができる）、すなわち、脂質化合物ＴＨＩＯＥＴＨＥＲの構造を示す図。（Ｂ）本明細書に記載される本発明のＨＥＡＤ脂質化合物（完全な詳細は実施例２０．２で見ることができる）、すなわち、脂質化合物Ｃ３ＳＳの構造を示す図。 （インビボＴ細胞応答におけるＣ２を含むＬＮＰの免疫原性－ＶＮＴ分析）－５μｇのＬＮＰ（Ｃ２を含む）製剤化ＲＡＢＶ－Ｇ－ｍＲＮＡによる単回ｉ．ｍ．免疫化が、プライムワクチン接種後２１日目で、全ての動物において、０．５ＩＵ／ｍｌの防御価を十分に上回る非常に堅牢なＶＮＴをすでに誘導したことを示す図。完全な詳細は実施例２１で見ることができる。 （インビボＴ細胞応答における異なるカチオン性脂質を含むＬＮＰの免疫原性－ＶＮＴ分析）－５μｇのＬＮＰ製剤化ＲＡＢＶ－Ｇ－ｍＲＮＡによる単回ｉ．ｍ．免疫化が、プライムワクチン接種後２１日目で、全ての動物において、０．５ＩＵ／ｍｌの防御価を十分に上回る非常に堅牢なＶＮＴをすでに誘導したことを示す図。ＬＮＰを、実施例２１に示される本発明による異なるカチオン性脂質を用いて製剤化した。 （インビボＴ細胞応答における異なるカチオン性脂質を含むＬＮＰの免疫原性－ＶＮＴ分析）－本発明のＬＮＰ製剤化ＲＡＢＶ－Ｇ ｍＲＮＡワクチンが、非刺激脾細胞に対して再刺激脾細胞においてワクチン接種後に特異的細胞応答を誘導したことを示す図。ＲＡＢＶ－Ｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を（ｉ）再刺激および（ｉｉ）非刺激設定について示す。 （インビボＴ細胞応答における異なるカチオン性脂質を含むＬＮＰの免疫原性－ＶＮＴ分析）－本発明のＬＮＰ製剤化ＲＡＢＶ－Ｇ ｍＲＮＡワクチンが、非刺激脾細胞に対して再刺激脾細胞においてワクチン接種後に特異的細胞応答を誘導したことを示す図。ＲＡＢＶ－Ｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を（ｉ）再刺激および（ｉｉ）非刺激設定について示す。完全な詳細は実施例２１で見ることができる。 （インビボＴ細胞応答におけるＴＨＩＯＥＴＨＥＲを含むＬＮＰの免疫原性－ＶＮＴ分析）－１μｇのＬＮＰ（ＴＨＩＯＥＴＨＥＲを含む）製剤化ＲＡＢＶ－Ｇ－ｍＲＮＡによる単回ｉ．ｍ．免疫化が、プライムワクチン接種後２１日目で、全ての動物において、０．５ＩＵ／ｍｌの防御価を十分に上回る非常に堅牢なＶＮＴをすでに誘導したことを示す図。完全な詳細は実施例２１で見ることができる。 （インビボマラリアワクチン接種のためのＧＮ０２様ＬＮＰ－ＩＣＳ）－ＣＳＰをコードするＧＮ０２様製剤化ｍＲＮＡマラリアワクチンが、細胞内サイトカイン染色アッセイ（ワクチン接種後３５日目）を使用して、マウスにおいて細胞性免疫応答（ＣＤ４＋Ｔ細胞応答）を誘導したことを示す図。ＲＡＢＶ－Ｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を（ｉ）再刺激および（ｉｉ）非刺激設定について示す。完全な詳細は実施例２２で見ることができる。 （インビボマラリアワクチン接種のためのＧＮ０２様ＬＮＰ－ＩＣＳ）－ＣＳＰをコードするＧＮ０２様製剤化ｍＲＮＡマラリアワクチンが、細胞内サイトカイン染色アッセイ（ワクチン接種後３５日目）を使用して、マウスにおいて細胞性免疫応答（ＣＤ８＋Ｔ細胞応答）を誘導したことを示す図。ＲＡＢＶ－Ｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を（ｉ）再刺激および（ｉｉ）非刺激設定について示す。完全な詳細は実施例２２で見ることができる。 （インビボマラリアワクチン接種のためのＧＮ０２様ＬＮＰ－ＩｇＧ全価）－ＣＳＰをコードするＧＮ０２様製剤化ｍＲＮＡマラリアワクチンが、ＥＬＩＳＡアッセイ（コーティング：［ＮＡＮＰ］７ペプチド、プライミング後３５日目でのＩｇＧ全エンドポイント価）を使用して、マウスにおいて非常に強力な液性免疫応答を誘導したことを示す図（完全な詳細は実施例２２で見ることができる）。 （インビボマラリアワクチン接種のための本発明の異なるカチオン性脂質を含むＬＮＰ－ＩＣＳ）－ＣＳＰをコードするＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡマラリアワクチンが、細胞内サイトカイン染色アッセイ（ワクチン接種後３５日目）を使用して、マウスにおいて細胞性免疫応答（（ｉ）再刺激および（ｉｉ）非刺激設定について示されるＣＤ４＋Ｔ細胞応答）を誘導したことを示す図。完全な詳細は実施例２２で見ることができる。 （インビボマラリアワクチン接種のための本発明の異なるカチオン性脂質を含むＬＮＰ－ＩＣＳ）－ＣＳＰをコードするＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡマラリアワクチンが、細胞内サイトカイン染色アッセイ（ワクチン接種後３５日目）を使用して、マウスにおいて細胞性免疫応答（（ｉ）再刺激および（ｉｉ）非刺激設定について示されるＣＤ８＋Ｔ細胞応答）を誘導したことを示す図。完全な詳細は実施例２２で見ることができる。 （インビボマラリアワクチン接種のための本発明の異なるカチオン性脂質を含むＬＮＰ－ＩｇＧ全価）－ＣＳＰをコードするＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡマラリアワクチンが、ＥＬＩＳＡアッセイ（コーティング：［ＮＡＮＰ］７ペプチド、プライミング後３５日目でのＩｇＧ全エンドポイント価）を使用して、マウスにおいて非常に強力な液性免疫応答を誘導したことを示す図（完全な詳細は実施例２２で見ることができる）。 （インビボマラリアワクチン接種のための本発明のＣ２６脂質を含むＬＮＰ－ＩｇＧ１価）－ＣＳＰをコードするＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡマラリアワクチンが、ＥＬＩＳＡアッセイ（コーティング：［ＮＡＮＰ］７ペプチド、プライミング後３５日目でのＩｇＧ１エンドポイント価）を使用して、マウスにおいて非常に強力な液性免疫応答を誘導したことを示す図（完全な詳細は実施例２２で見ることができる）。
本発明は、新規なカチオン性脂質および／または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の使用がｍＲＮＡなどの核酸をヒト個体などの生きた生物に送達するのに高度に有効であるという本発明者らの驚くべき発見に基づく。特に、このような核酸の細胞内送達が増強される。これにより、本発明者らが、例えば、抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡ化合物を送達し、非常に低い投薬量で抗原特異的免疫応答を非常に効率的に誘導する改善されたワクチンを作製することが可能になった。本発明によって達成されるさらなる利点は、極めて驚くべきことに、本発明者らが、本発明の態様および実施形態に従って、増強された抗原生成および中和能力を有する機能的抗体産生を含む、有意に増強された、および多くの点で、相乗的な、免疫応答をもたらす、インビボでｍＲＮＡワクチンを送達するための製剤のクラスを発見したことである。脂質ベースの製剤の他のクラスで使用されるｍＲＮＡ用量と比較して有意に低い用量のｍＲＮＡを投与した場合でさえ、これらの結果を達成することができる。本発明の製剤は、予防剤および治療剤としての機能的ｍＲＮＡワクチンの有効性を確立するのに十分な、有意な予測できないインビボ免疫応答を実証した。通常、自己複製ＲＮＡワクチンは、免疫原性応答をもたらすために十分なＲＮＡを細胞に送達するためにウイルス複製経路に頼る－本発明の製剤は、強力な免疫応答をもたらすのに十分なタンパク質を産生するためにウイルス複製を要しない。よって、好ましくは、本発明のｍＲＮＡは自己複製ＲＮＡではなく、ウイルス複製に必要な成分を含まない。
脂質組成物
第１の態様において、本発明は、本明細書において以下に記載されるカチオン性脂質を含む組成物に向けられている。カチオン性脂質自体について開示される全ての選択肢および選好は本発明のこの態様で組成物にも適用可能である。換言すれば、カチオン性脂質、および特に好ましいカチオン性脂質の具体的に開示される実施形態は、本発明による組成物、すなわち、本明細書に記載される具体的な選択の１つによるカチオン性脂質を含むことを特徴とする組成物の具体的な好ましい実施形態も定義すると理解されるべきである。組成物は、以下にさらに記載されるさらなる活性および／または不活性の賦形剤を含み得る。１つの具体的な実施形態において、カチオン性脂質に加えて、組成物は、（ａ）ステロイド；（ｂ）中性脂質；および（ｃ）ポリマーコンジュゲート脂質、好ましくはペグ化脂質からなる群から選択される１種または複数の脂質を含む。
カチオン性脂質
カチオン性脂質は、好ましくはカチオン化可能である、すなわち、ｐＨが脂質のイオン化可能基のｐＫａより下に低下すると、プロトン化するが、より高いｐＨ値では次第により中性である。正に帯電すると、脂質は負に帯電した核酸と会合することができる。ある特定の実施形態において、カチオン性脂質は、ｐＨ低下で正の電荷を帯びる双性イオン性脂質を含む。
一態様において、本発明は、式（Ｉ）による化合物：
Ｒａ－Ａ－Ｒｂ 式（Ｉ）
（式中、
Ｒａは、
－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４
から選択され；
Ｒｂは、
－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４、または
－Ｒ１－Ｎ（ＣＨ３）２
から選択され；
Ａは－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｓ－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－であり；
Ｒ１は場合により置換されたエタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、または２～８個の炭素原子を有する直鎖もしくは非分岐アルカンジイルであり；
Ｒ２は２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｒ３は任意選択であり、存在する場合、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｒ５－ＯＣ（Ｏ）－ＮＨ－、またはＲ５－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり；
Ｒ４は１２～３６個の炭素原子を有する親油性置換基であり；
Ｒ５は１～６個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｘは炭素または窒素原子であり；
全ての選択は互いに独立しており、
場合により、Ｒ１、Ｒ２およびＲ５が全て直鎖非置換エタンジイルであり、ＡはＳ－Ｓ－であり、ＲａおよびＲｂが同一である場合、Ｒ４は、
ではない）
として定義される新規なカチオン性脂質を提供する。
別の態様において、本発明は、生細胞への核酸の送達に有用な新規なカチオン性脂質に関する。カチオン性脂質は、式（Ｉ）による化合物：
Ｒａ－Ａ－Ｒｂ 式（Ｉ）
（式中、
Ｒａは、
－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４
から選択され；
Ｒｂは、
－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４、または
－Ｒ１－Ｎ（ＣＨ３）２
から選択され；
Ａは－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｓ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｓ－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－であり；
Ｒ１は場合により置換されたエタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、または２～８個の炭素原子を有する直鎖もしくは非分岐アルカンジイルであり；
Ｒ２は２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｒ３は任意選択であり、存在する場合、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、または－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｒ５－ＯＣ（Ｏ）－ＮＨ－、またはＲ５－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり；
Ｒ４は１２～３６個の炭素原子を有する親油性置換基であり；
Ｒ５は１～６個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｘは炭素または窒素原子であり；
全ての選択は互いに独立しており、
場合により、Ｒ１、Ｒ２およびＲ５が全てエタンジイルであり、ＡはＳ－Ｓ－であり、ＲａおよびＲｂが同一である場合、Ｒ４は、
ではない）
である。
さらに別の態様、態様Ａでは、本発明は、式（Ｉ）による化合物：
Ｒａ－Ａ－Ｒｂ 式（Ｉ）
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグもしくは立体異性体
（式中、
Ｒａは、
または－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４
から選択され；
Ｒｂは、
－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４、または－Ｒ１－Ｎ（ＣＨ３）２
から選択され；
Ａは－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｓ－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－であり；
Ｒ１はエタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、または２～８個の炭素原子を有する直鎖もしくは非分岐アルカンジイルであり、各置換可能な炭素原子は非置換であるか、または１つもしくは複数のＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルケニレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキレン、もしくはＣ３～Ｃ８シクロアルケニレンで置換されており；
Ｒ２は２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｒ３は任意選択であり、存在する場合、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｒ５－ＯＣ（Ｏ）－ＮＨ－、またはＲ５－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり；
Ｒ４は１２～３６個の炭素原子を有する親油性置換基であり、１２～３６個の炭素原子を有する親油性置換基は、１２～２５個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐のアルキルもしくはアルケニルであるか、またはアルファ－トコフェロールから誘導され；
Ｒ５は１～６個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｘは水素原子と結合した炭素原子（ＣＨ）または窒素原子であり；
全ての選択は互いに独立しており；
場合により、（ｉ）Ｒ３が－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－として存在し、（ｉｉ）Ｒ１およびＲ２が直鎖非置換エタンジイルであり、（ｉｉｉ）Ｒ５が直鎖非置換エタンジイル、直鎖非置換プロパンジイルまたは直鎖非置換ブタンジイルであり、（ｉｖ）Ａが－Ｓ－Ｓ－であり、（ｖ）ＲａおよびＲｂが同一である場合、Ｒ４は、
ではなく、
さらに（ｉ）Ｒ３が非存在であり、（ｉｉ）Ｒ１およびＲ２が直鎖非置換エタンジイルであり、（ｉｉｉ）Ａが－Ｓ－Ｓ－であり、（ｉｖ）ＲａおよびＲｂが同一である場合、Ｒ４は、
でも
でもない；
あるいは上記但し書きの代替として、場合により、カチオン性脂質は、
からなる群から選択される脂質ではない）
として定義される新規なカチオン性脂質を提供する。
新規なカチオン性脂質において、分解可能／生分解可能部分Ａは、同じであっても異なっていてもよい２つの構造ＲａおよびＲｂを接続する。ＲａおよびＲｂの各々は、少なくとも１つの塩基性、すなわち、カチオン性の、第３級窒素原子を含む部分を含む。ＲａおよびＲｂの少なくとも１つは、実質的に親油性の尾部（ｔａｉｌ）構造および少なくとも１つのエステル基を有する。
分解可能／生分解可能部分Ａは、以下の官能基：－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｓ－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－から選択され得る。好ましい実施形態の１つでは、Ａが、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、または－Ｓ－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－などの、１個または複数の硫黄原子を含有する部分または基である。別の好ましい実施形態において、Ａがジスルフィド基（－Ｓ－Ｓ－）であり、カチオン性脂質がＲａ－Ｓ－Ｓ－Ｒｂ（式中、ＲａおよびＲｂは上に定義される通り選択され得る）として表され得る。特に上記の態様Ａのさらに別の好ましい実施形態において、Ａが－Ｓ－であり、カチオン性脂質がＲａ－Ｓ－Ｒｂ（式中、ＲａおよびＲｂは上に定義される通り選択され得る）として表され得る。
理論によって拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、今のところ、部分Ａの分解性が、新たな脂質の明白な生物学的有効性において重要な役割を果たし得ると考えている。例えば、Ａがジスルフィド部分である場合、および脂質を以下にさらに詳細に記載される他の賦形剤と一緒に使用して、カーゴとして核酸化合物を搭載したリポソームまたは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成する場合、このようなリポソームまたはＬＮＰがエンドサイトーシスを通して細胞によって有効に取り込まれるだろう。エンドサイトーシス小胞内では、カチオン性脂質のジスルフィド基が、２つのチオール部分に還元され（おそらく、グルタチオンの存在下で）、同時に、カチオン性脂質分子の２つのより小さなカチオン性種への切断をもたらす。潜在的に、細胞内の高濃度のチオールはまた、チオエステル化などを通して、脂質のさらなる分解をもたらし得る。
ＲａおよびＲｂは場合により互いに異なっていてもよいので、独立に選択され得る。言及されるように、Ｒａは、
（好ましくは、ＸはＣＨである）、または－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４から選択され得；Ｒｂは、
（好ましくは、ＸはＣＨである）、－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４、または－Ｒ１－Ｎ（ＣＨ３）２から選択され得る。
さらに、言及されるように、Ｒａは、
（好ましくは、ＸはＣＨである）
から選択され得、Ｒｂは、
（好ましくは、ＸはＣＨである）
から選択され得る。
好ましい実施形態の１つでは、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つが、それぞれＲ２とＡまたはＲ１との間のピペリジン－またはピペラジン誘導６員環構造を含む。これは、少なくとも１個の第３級窒素原子が、部分Ａに近接し、少なくとも１つのスペーサ（Ｒ２）任意のエステル基によって親油性尾部構造Ｒ４から離れて存在および位置することを意味する。エステル基（またはＲ３が存在する場合、複数のエステル基）の潜在的な利点は、加水分解的に不安定なエステル結合によって提供される、生理的環境、例えば、細胞内環境中における脂質のさらに増強された分解性に関する。
さらなる実施形態において、ＲａとＲｂの両方はピペリジン－またはピペラジン誘導６員環状構造を含む。ＲａとＲｂの両方が、独立に選択されるか、あるいはＲａおよびＲｂが同一であり、
（好ましくは、ＸはＣＨである）
である、カチオン性脂質も好ましい。
言及されるように、Ｒ１は場合により置換されたエタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、または２～８個の炭素原子を有する直鎖もしくは非分岐アルカンジイルである。プロパンジイルは、好ましくはｎ－プロパンジイル、すなわち、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（式中、１個または複数の水素原子は場合により置換されている）である。ブタンジイルは、好ましくはｎ－ブタンジイル、すなわち、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－（式中、１個または複数の水素原子は場合により置換されている）である。しかしながら、好ましくは、エタンジイル、プロパンジイルまたはブタンジイルの１個以下の水素原子が置換されている。一部の実施形態において、Ｒａ中のＲ１置換基およびＲｂ中のＲ１置換基は同じであるか、または異なる。一部の実施形態において、Ｒａ中のＲ１置換基およびＲｂ中のＲ１置換基は共にエタンジイルである。他の実施形態において、Ｒａ中のＲ１置換基およびＲｂ中のＲ１置換基は共にプロパンジイルである。他の実施形態において、Ｒａ中のＲ１置換基およびＲｂ中のＲ１置換基は共にブタンジイルである。一部の実施形態において、Ｒａ中のＲ１置換基はエタンジイルであり、Ｒｂ中のＲ１置換基はプロパンジイルである。他の実施形態において、Ｒａ中のＲ１置換基はプロパンジイルであり、Ｒｂ中のＲ１置換基はエタンジイルである。一部の実施形態において、Ｒａ中のＲ１置換基はブタンジイルであり、Ｒｂ中のＲ１置換基はプロパンジイルである。他の実施形態において、Ｒａ中のＲ１置換基はブタンジイルであり、Ｒｂ中のＲ１置換基はエタンジイルである。ある特定の他の実施形態において、特にＲ１に関して言えば、「場合により置換された」という用語は、各置換可能な炭素原子が独立に、１つまたは複数のＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルケニレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキレン、またはＣ３～Ｃ８シクロアルケニレンで置換されていてもよいことを示す。
同様に、一部の実施形態において、Ｒａ中のＲ２置換基およびＲｂ中のＲ２置換基は同じであるか、または異なる。一部の実施形態において、Ｒａ中のＲ２置換基およびＲｂ中のＲ２置換基は共にエタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、ペンタンジイル、ヘキサンジイル、ヘプタンジイル、またはオクタンジイルである。他の実施形態において、Ｒａ中のＲ２置換基はプロパンジイルであり、Ｒｂ中のＲ２置換基はヘプタンジイルである。他の実施形態において、Ｒａ中のＲ２置換基はヘプタンジイルであり、Ｒｂ中のＲ２置換基はプロパンジイルである。特に上記の態様Ａの一部の実施形態において、Ｒａ中のＲ２置換基およびＲｂ中のＲ２置換基は共にエタンジイルである。
さらに、Ｒ３がＲａとＲｂの両方に存在する一部の実施形態において、Ｒａ中のＲ５置換基およびＲｂ中のＲ５置換基は同じであるか、または異なる。一部の実施形態において、Ｒａ中のＲ５置換基およびＲｂ中のＲ５置換基は共にメタンジイル、エタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、ペンタンジイル、またはヘキサンジイルである。他の実施形態において、Ｒａ中のＲ５置換基はエタンジイルであり、Ｒｂ中のＲ５置換基はヘキサンジイルである。他の実施形態において、Ｒａ中のＲ５置換基はヘキサンジイルであり、Ｒｂ中のＲ５置換基はエタンジイルである。Ｒ３がＲａとＲｂの両方に存在する、特に上記の態様Ａの一部の実施形態において、Ｒａ中のＲ５置換基およびＲｂ中のＲ５置換基は共にエタンジイルである。
置換基は、場合によりエステルまたはアミド基などのさらなる官能基を含んでもよい任意の適切な置換基、すなわち、任意の直鎖または分岐アルキル、アリール、ヘテロアルキル、複素芳香族構造であり得る。
特に、－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４がＲａおよび／またはＲｂについて選択される場合、Ｒ１は、置換プロパンジイルなどの、置換エタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、または２～８個の炭素原子を有する直鎖もしくは非分岐アルカンジイルであることが好ましい。それ自体がアミノ基などのカチオン性部分を含まない－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４が使用される場合、Ｒ１の置換基がこのようなアミノ基を含むことが好ましく；場合により、このようなアミノ基は、ピペリジンまたはピペラジンから誘導される６員環構造などの環状構造の一部であり得る。場合により、カチオン性窒素原子を特徴とする環構造は、エステル基などの分解可能基を介してエタンジイルまたはプロパンジイルに連結している。
Ｒａは
（好ましくは、ＸはＣＨである）
である、および／またはＲｂは
（好ましくは、ＸはＣＨである）
である、一実施形態において、Ｒ２は、それぞれの塩基性ピペリジン－またはピペラジン誘導環構造とエステル基との間のリンカーまたはスペーサとして働く。言及されるように、Ｒ２は２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルとして定義される。Ｒ２は直鎖または分岐であり得、そうでなければ（すなわち、分岐を除く）、好ましくは非置換である。一実施形態において、Ｒ２は２、３、４、５、６、７または８個の炭素原子を有する直鎖非置換アルカンジイルである。別の実施形態において、Ｒ２は２～６個の炭素原子を有する直鎖非置換アルカンジイルである。さらなる好ましい実施形態において、Ｒ２は直鎖非置換エタンジイルまたはプロパンジイルである。例えば、ＲａとＲｂの両方は
（好ましくは、ＸはＣＨであり、Ｒ２は、エタンジイルまたはプロパンジイルなどの、２～６個の炭素原子を有する直鎖非置換アルカンジイルから選択される）
であり得る。
Ｒａは
（好ましくは、ＸはＣＨである）
である、および／またはＲｂは
（好ましくは、ＸはＣＨである）
である、さらなる実施形態において、Ｒ２は、それぞれの塩基性ピペリジン－またはピペラジン誘導環構造とエステル基との間のリンカーまたはスペーサとして働く。言及されるように、Ｒ２は２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルとして定義される。Ｒ２は直鎖または分岐であり得、そうでなければ（すなわち、分岐を除く）、好ましくは非置換である。一実施形態において、Ｒ２は２、３、４、５、６、７または８個の炭素原子を有する直鎖非置換アルカンジイルである。別の実施形態において、Ｒ２は２～６個の炭素原子を有する直鎖非置換アルカンジイルである。さらなる好ましい実施形態において、Ｒ２は直鎖非置換エタンジイルまたはプロパンジイルである。例えば、ＲａとＲｂの両方は
（好ましくは、ＸはＣＨであり、Ｒ２は、エタンジイルまたはプロパンジイルなどの、２～６個の炭素原子を有する直鎖非置換アルカンジイルから選択される）
であり得る。
任意選択の構造Ｒ３は、生理的、例えば細胞内、条件下での、カチオン性脂質のより低分子の種への分解性をさらに増強し得るエステル基を含む。上に定義されるように、Ｒ３は、存在する場合、とりわけ、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－または－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－（式中、Ｒ５は１～６個の炭素原子を有するアルカンジイルからなるスペーサであり得る）として定義される。換言すれば、エステル基はいずれかの配向を有し得る。好ましくは、Ｒ５は１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有する非置換直鎖アルカンジイルである。別の好ましい実施形態において、Ｒ３が存在し、Ｒ５が２個もしくは３個の炭素原子を有する、または３～６個の炭素原子を有する非置換直鎖アルカンジイルである。
Ｒ４は１２～３６個の炭素原子を有する親油性置換基として定義される。Ｒａおよび場合によりまたＲｂ（Ｒｂが－Ｒ１－Ｎ（ＣＨ３）２でない限り）のこの「尾部（ｔａｉｌ）」末端は、分子が生体膜を横切ることができるために典型的に必要とされる親油性度を提供すると考えられる。したがって、Ｒ４は、原則として、実質的に親油性の任意の構造であり得る。例えば、炭化水素構造は親油性である。一実施形態において、Ｒ４は、その出現の少なくとも１つにおいて、炭素および水素原子のみからなり得る。１つの好ましい実施形態において、Ｒ４は、好ましくは１２～２５個の炭素原子を有する、直鎖または分岐のアルキルまたはアルケニルを表す。分岐アルキルまたはアルケニルは、場合により２個、３個、４個またはそれ以上のメチル側鎖などの、複数の側鎖を有し得る。別の実施形態において、Ｒ４は、例えば２～１０個の炭素原子を有する単一アルキルまたはアルケニル側鎖を含むアルキルまたはアルケニルであり得る。例えば、Ｒ４は１－ｎ－ヘキシル－ｎ－ノニル（もしくは７－ｎ－ペンタデシル）、または２－ｎ－ヘキシル－ｎ－デシルであり得る。他の実施形態において、親油性置換基は、場合によりＯ、Ｓ、またはＮなどの１個または複数のヘテロ原子を含み得る。他の実施形態において、親油性置換基は、場合によりＯ、Ｓ、またはＮなどの１個または複数のヘテロ原子を含み得る、１個または複数の飽和、不飽和、または芳香族環構造を場合により含み得る。
Ｒ４はまた、主に親油性の性質は維持される限り、少数の酸素原子などのヘテロ原子を含み得る。一実施形態において、Ｒ４は１個または複数の酸素原子を含み、他のヘテロ原子を含まない。Ｒ４はまた、場合により１個または複数の酸素原子を含む芳香族または脂肪族環構造などの環状構造を含み得る。存在する場合、ヘテロ原子および／または環状構造は、「尾部」の末端に向かってではなく任意選択のＲ３構造に向かって位置することが好ましい。一実施形態において、Ｒ４はトコフェロールまたはトコトリエノールから誘導される親油性基である。一実施形態において、特にＲ１、Ｒ２およびＲ５の全てが直鎖非置換エタンジイルではなく、Ａが－Ｓ－Ｓ－であり、ＲａおよびＲｂが同一である場合、Ｒ４はアルファ－トコフェロールから誘導される親油性基、特に
である。
本明細書で言及される「トコフェロールまたはトコトリエノール（ｔｏｃｏｔｒｅｉｎｏｌ）から誘導される親油性基」は、トコフェロールおよびトコトリエノールの誘導体、特に以下のスキーム１に示される構造を有する誘導体、すなわち、アルファ－トコフェロール、ベータ－トコフェロール、ガンマ－トコフェロール、デルタ－トコフェロール、アルファ－トコトリエノール、ベータ－トコトリエノール、ガンマ－トコトリエノールおよびデルタ－トコトリエノールから誘導される誘導体を含む。
特に上記の態様Ａの好ましい実施形態において、Ｒ４は１２～２５個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐のアルキルもしくはアルケニルであるか、またはスキーム１で本明細書に示されるアルファ－トコフェロール、ベータ－トコフェロール、ガンマ－トコフェロール、デルタ－トコフェロール、アルファ－トコトリエノール、ベータ－トコトリエノール、ガンマ－トコトリエノールおよびデルタ－トコトリエノールの誘導体からなる群から選択される親油性基である。
特に上記の態様Ａのさらに別の好ましい実施形態において、Ｒ４は１２～２５個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐のアルキルもしくはアルケニルであるか、または
である。
特に上記の態様Ａのさらに別の好ましい実施形態において、Ｒ４は
からなる群から選択される。
言及されるように、Ｘは各出現（ｅａｃｈ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）で独立に選択される炭素原子または窒素原子である。一実施形態において、Ｘは炭素原子である。別の実施形態において、ＲａとＲｂの両方はＸを含む構造であり、好ましくは、Ｘは各出現で炭素原子である。あるいは、Ｘは窒素原子であり；例えば、ＲａとＲｂの両方はＸを含む構造であり、各出現で、窒素原子はＸについて選択される。本明細書においてＸが炭素原子であると言及される場合はいつでも、これは、炭素原子が水素原子に結合していること、すなわち、ＣＨを指すと理解される。本明細書における一部の例では、ＸがＣＨであるとすでに言及されている。
さらなる具体的な実施形態によると、Ｒａは
（好ましくは、ＸはＣＨである）
または－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４
から選択され；
Ｒｂは
（好ましくは、ＸはＣＨである）
－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４、または－Ｒ１－Ｎ（ＣＨ３）２
から選択され；
Ａが－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｓ－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－であり；
Ｒ１が場合により置換されたエタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、または２～８個の炭素原子を有する直鎖もしくは非分岐アルカンジイルであり；
Ｒ２が２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｒ３が任意選択であり、存在する場合、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｒ５－ＯＣ（Ｏ）－ＮＨ－、またはＲ５－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり；
Ｒ４が１２～３６個の炭素原子を有する親油性置換基であり；
Ｒ５が３～６個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｘが炭素または窒素原子であり；
全ての選択が互いに独立している、
式（Ｉ）を有するカチオン性脂質が提供される。場合により、Ｒ２および／またはＲ５によって表されるアルカンジイルは直鎖および非置換である。
さらなる具体的な実施形態によると、Ｒａは
（好ましくは、ＸはＣＨである）
または－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４
から選択され；
Ｒｂは
（好ましくは、ＸはＣＨである）
－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４、または－Ｒ１－Ｎ（ＣＨ３）２
から選択され；
Ａが－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｓ－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－であり；
Ｒ１が場合により置換されたエタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、または２～８個の炭素原子を有する直鎖もしくは非分岐アルカンジイルであり；
Ｒ２が２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｒ３が任意選択であり、存在する場合、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｒ５－ＯＣ（Ｏ）－ＮＨ－、またはＲ５－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり；
Ｒ４が１２～２５個の炭素原子を有するアルキルまたはアルケニルであり；
Ｒ５が１～６個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｘが炭素または窒素原子であり；
全ての選択が互いに独立している、
式（Ｉ）のカチオン性脂質が提供される。場合により、Ｒ２および／またはＲ５によって表されるアルカンジイルは直鎖および非置換である。
さらに、別の実施形態において、
ＲａおよびＲｂは
（好ましくは、ＸはＣＨである）
または－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４
から選択され；
Ａが－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｓ－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－であり；
Ｒ１が場合により置換されたエタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、または２～８個の炭素原子を有する直鎖もしくは非分岐アルカンジイルであり；
Ｒ２が２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｒ３が任意選択であり、存在する場合、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｒ５－ＯＣ（Ｏ）－ＮＨ－、またはＲ５－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり；
Ｒ４が１２～３６個の炭素原子を有する親油性置換基であり；
Ｒ５が１～６個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｘが炭素または窒素原子であり；
全ての選択が互いに独立しており、
場合により、Ｒ１、Ｒ２およびＲ５が全て直鎖非置換エタンジイルであり、Ａが－Ｓ－Ｓ－であり、ＲａおよびＲｂが同一である場合、Ｒ４が
ではない、
式（Ｉ）によるカチオン性脂質が提供される。
この実施形態において、Ｒ２および／またはＲ５によって表されるアルカンジイルが直鎖および非置換であり得；場合により、Ｒ５が２～６個の炭素原子を含み、ＲａおよびＲｂの各々が
（好ましくは、ＸはＣＨである）
である。
さらなる具体的な実施形態において、ＲａおよびＲｂの各々は
（好ましくは、ＸはＣＨである）
であり；
Ａが－Ｓ－Ｓ－であり；
Ｒ１が場合により置換されたエタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、または２～８個の炭素原子を有する直鎖もしくは非分岐アルカンジイルであり；
Ｒ２が２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｒ３が任意選択であり、存在する場合、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－または－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｒ４が１２～３６個の炭素原子を有する親油性置換基であり；
Ｒ５が２～６個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｘが炭素または窒素原子であり；
全ての選択が互いに独立しており、
場合により、Ｒ１、Ｒ２およびＲ５が全て直鎖非置換エタンジイルであり、Ａが－Ｓ－Ｓ－であり、ＲａおよびＲｂが同一である場合、Ｒ４が
ではない、
式（Ｉ）によるカチオン性脂質が提供される。また、Ｒ２および／またはＲ５によって表されるアルカンジイルは直鎖および非置換であり得る。
さらなる実施形態は、ＲａおよびＲｂの各々が
（好ましくは、ＸがＣＨである）
であり；
Ａが－Ｓ－Ｓ－であり；
Ｒ１が場合により置換されたエタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、または２～８個の炭素原子を有する直鎖もしくは非分岐アルカンジイルであり；
Ｒ２が２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｒ３が任意選択であり、存在する場合、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－または－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｒ４が１２～２５個の炭素原子を有するアルキルまたはアルケニルであり；
Ｒ５が２～６個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｘが炭素または窒素原子であり；
全ての選択が互いに独立しており、
Ｒ２および／またはＲ５によって表されるアルカンジイルは直鎖および非置換であり得る、
式（Ｉ）によるカチオン性脂質を提供する。
別の実施形態において、ＲａおよびＲｂの各々は
（好ましくは、ＸはＣＨである）
であり；
Ａが－Ｓ－Ｓ－であり；
Ｒ１が場合により置換されたエタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、または２～８個の炭素原子を有する直鎖もしくは非分岐アルカンジイルであり；
Ｒ２が２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｒ３が任意選択であり、存在する場合、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－または－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｒ４が
から選択されるアルキルであり；
Ｒ５が２～６個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｘが炭素または窒素原子であり；
全ての選択が互いに独立しており、Ｒ２および／またはＲ５によって表されるアルカンジイルは直鎖および非置換であり得る、
式（Ｉ）によるカチオン性脂質が提供される。
さらなる実施形態は、ＲａおよびＲｂの各々は
（好ましくは、ＸはＣＨである）
であり；
Ａが－Ｓ－Ｓ－であり；
Ｒ１が場合により置換されたエタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、または２～８個の炭素原子を有する直鎖もしくは非分岐アルカンジイルであり；
Ｒ２が２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｒ３が－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－または－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｒ４が
であり；
Ｒ５が２～６個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｘが炭素または窒素原子であり；
ＲａおよびＲｂが同一であり、全ての他の選択が互いに独立しており、Ｒ２および／またはＲ５によって表されるアルカンジイルが直鎖および非置換であり得る、
式（Ｉ）によるカチオン性脂質に関する。
さらなる実施形態において、本発明は、ＲａおよびＲｂの各々は
（好ましくは、ＸはＣＨである）
であり；
Ａが－Ｓ－Ｓ－であり；
Ｒ１が場合により置換されたエタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、または２～８個の炭素原子を有する直鎖もしくは非分岐アルカンジイルであり；
Ｒ２が２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｒ３が－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－であり；
Ｒ４が
であり；
Ｒ５が２～６個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｘが炭素または窒素原子であり；
ＲａおよびＲｂが同一であり、全ての他の選択が互いに独立しており、Ｒ２および／またはＲ５によって表されるアルカンジイルは直鎖および非置換であり得る、
式（Ｉ）によるカチオン性脂質を提供する。
さらなる実施形態によると、本発明によって提供されるカチオン性脂質は、ＲａおよびＲｂの各々は
（好ましくは、ＸはＣＨである）
であり；
Ａが－Ｓ－Ｓ－であり；
Ｒ１が場合により置換されたエタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、または２～８個の炭素原子を有する直鎖もしくは非分岐アルカンジイルであり；
Ｒ２が２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｒ３が－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－であり；
Ｒ４が
であり；
Ｒ５が２～６個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｘが炭素原子であり；
ＲａおよびＲｂが同一であり、全ての他の選択が互いに独立しており、Ｒ２および／またはＲ５によって表されるアルカンジイルは直鎖および非置換であり得る、
式（Ｉ）の化合物である。
別の具体的な実施形態において、本発明によって提供されるカチオン性脂質は、ＲａおよびＲｂの各々が
（好ましくは、ＸはＣＨである）
であり；
Ａが－Ｓ－Ｓ－であり；
Ｒ１がエタンジイルであり；
Ｒ２が２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｒ３が－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－であり；
Ｒ４が
であり；
Ｒ５が２～６個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｘが炭素原子であり；
ＲａおよびＲｂが同一であり、全ての他の選択が互いに独立しており、Ｒ２および／またはＲ５によって表されるアルカンジイルは直鎖および非置換であり得；好ましくは、Ｒ１のエタンジイルも直鎖および非置換である、
式（Ｉ）による化合物である。
好ましい実施形態の別の１つでは、カチオン性脂質は、各出現で独立に選択される、以下の特徴：
（ｉ）Ｒ１が非置換エタンジイル、プロパンジイル、またはブタンジイルである；
（ｉｉ）Ｒ２が２～８個の炭素原子を有する直鎖、非分岐アルカンジイルである；
（ｉｉｉ）Ｒ３が－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－または－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－である；
（ｉｖ）Ｒ４が１２～２５個の炭素原子を有するアルキルまたはアルケニルである；
（ｖ）Ｒ５が２～６個の炭素原子を有するアルカンジイルである；および／または
（ｖｉ）Ｘが炭素原子である、
の１つまたは複数を有する。
特に上記の態様Ａの別の好ましい実施形態において、Ｒ３は存在し、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｒ５－ＯＣ（Ｏ）－ＮＨ－、およびＲ５－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－からなる群から選択され；Ｒ４は１２～２５個の炭素原子を有する直鎖または分岐のアルキルまたはアルケニルである。この実施形態において、Ｒ３はＲ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－または－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－であることが特に好まれ得る。この実施形態において、Ｒ４は
からなる群から選択されることがさらに好まれ得る。
特に上記の態様Ａのさらに別の好ましい実施形態において、Ａが－Ｓ－である。この実施形態において、ＲａおよびＲｂが同一であり、
（Ｘは、好ましくはＣＨである）
であることが好まれ得る。この実施形態において、Ｒ３は存在し、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－または－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－から選択されることがさらに好まれ得る。この実施形態において、Ｒ４は
であることも好まれ得る。この実施形態において、ＲａのＲ４およびＲｂのＲ４は同一であることがさらに好まれ得る。最後に、この実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の１つまたは全部は１～６個の炭素原子を有する、特に２、３または３個の炭素原子を有するアルカンジイルであることも好まれる。
なおさらなる実施形態において、カチオン性脂質は、好ましくは表１に列挙されるカチオン性脂質から選択される。
したがって、本発明は、上記のカチオン性脂質を含む組成物に向けられる。例えば、組成物は、表１の化合物Ｃ１～Ｃ２７から選択されるカチオン性脂質を含み得る。
さらなるある特定の実施形態において、カチオン性またはカチオン化可能な脂質は、第３級もしくは第４級窒素／アミノ基を含むか、または生理的ｐＨなどの選択的ｐＨで正味の（ｎｅｔ）正の電荷を有するいくつかの脂質種のいずれかであり得る。したがって、一実施形態において、第３級もしくは第４級窒素／アミノ基を含むカチオン性脂質、または生理的ｐＨで正味の正の電荷を有するカチオン性脂質は、限定されるものではないが、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）；Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）；およびＮ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）からなる群から選択される。
さらなる実施形態において、第３級もしくは第４級窒素／アミノ基を含むカチオン性脂質、または生理的ｐＨで正味の正の電荷を有するカチオン性脂質は、限定されるものではないが、アミノ脂質からなる群から選択される。別の実施形態において、適切なアミノ酸には、その全体を本願明細書に援用する、国際公開第２０１２／０１６１８４号に記載されるものが含まれる。［０３２０］組成物に使用するための他の適切な追加のカチオン性脂質には、コレステロール系カチオン性脂質が含まれる。
さらなる代表的なアミノ脂質には、限定されるものではないが、
（ｉ）式：
（式中、Ｒ１およびＲ２は同じであるか、または異なり、独立に、場合により置換されたＣ１０～Ｃ２４アルキル、場合により置換されたＣ１０～Ｃ２４アルケニル、場合により置換されたＣ１０～Ｃ２４アルキニル、または場合により置換されたＣ１０～Ｃ２４アシルであり；Ｒ３およびＲ４は同じであるか、または異なり、独立に、場合により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、場合により置換されたＣ２～Ｃ６アルケニル、または場合により置換されたＣ２～Ｃ６アルキニルであるか、あるいはＲ３およびＲ４は結合して、４～６個の炭素原子ならびに窒素および酸素から選択される１個または２個のヘテロ原子の場合により置換された複素環式環を形成してもよく；Ｒ５は非存在であるか、または存在し、存在する場合、水素またはＣ１～Ｃ６アルキルであり；ｍ、ｎ、およびｐは同じであるか、または異なり、独立に、０または１であり、但し、ｍ、ｎ、およびｐは同時に０ではなく；ｑは０、１、２、３、または４であり；ＹおよびＺは同じであるか、または異なり、独立に、Ｏ、Ｓ、またはＮＨである）
を有するもの。一実施形態において、Ｒ１およびＲ２がそれぞれリノレイルであり、アミノ脂質がジリノレイルアミノ脂質である；
または、
（ｉｉ）ジリノレイルアミノ脂質；１，２－ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）；１，２－ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）；１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）；１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）；１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）；１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）；１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）；１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）；３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）；３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＯＡＰ）；１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）；２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）；およびＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（ｎが２である、上記のＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）からなる群から選択されるもの、
が含まれる。
本明細書に記載されるカチオン性脂質は、塩、例えば酸付加塩、またはある特定の場合には、カルボン酸塩、スルホン酸塩およびリン酸塩などの有機および無機塩基の塩の形態で存在することができる。全てのこのような塩が本発明の範囲内にあり、式（Ｉ）のカチオン性脂質および化合物ならびにそのサブグループへの言及は、これらの化合物の塩形態を含む。
さらなる実施形態において、カチオン性脂質の商業的調製物が本発明で使用され得る。これらには、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＤＯＴＭＡおよび１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む商業的に入手可能なカチオン性リポソーム、ギブコ／ビーアールエル社（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）［ニューヨーク州グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）所在］製）；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－（２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）およびＤＯＰＥを含む商業的に入手可能なカチオン性リポソーム、ギブコ／ビーアールエル社（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）製）；およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（エタノール中ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）を含む商業的に入手可能なカチオン性脂質、プロメガコーポレーション（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）［ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在］製）が含まれる。
さらなる実施形態において、組成物は、全体を本願明細書に援用する、国際公開第２０１９２２６９２５号の段落［０３２０］および［０３３９］～［０３４０］に開示されるイミダゾールコレステロールエステルまたは「ＩＣＥ」を含む。他の適切な（カチオン性）脂質は、全て全体を本願明細書に援用する、国際公開第２００９／０８６５５８号、国際公開第２００９／１２７０６０号、国際公開第２０１０／０４８５３６号、国際公開第２０１０／０５４４０６号、国際公開第２０１０／０８８５３７号、国際公開第２０１０／１２９７０９号、国際公開第２０１１／１５３４９３号、米国特許出願公開第２０１１／０２５６１７５号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１２８７６０号明細書、米国特許出願公開第２０１２／００２７８０３号明細書、米国特許第８１５８６０１号明細書、国際公開第２０１６１１８７２４号、国際公開第２０１６１１８７２５号、国際公開第２０１７０７０６１３号、国際公開第２０１７０７０６２０号、国際公開第２０１７０９９８２３号、および国際公開第２０１７１１２８６５号に開示される。一部の実施形態において、カチオン性脂質は、全て全体を本願明細書に援用する、国際公開第２０１７０４９０７４号、米国特許第９５１２０７３号明細書、国際公開第２０１５２００４６５号、米国特許出願公開第２０１５０３７６１４４号明細書に開示される、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、およびｃｋｋ－Ｅ１２からなる群から選択される。
カチオン性脂質は、本発明の組成物または脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％～約７０もしくは７５ｍｏｌ％、または約４５～約６５ｍｏｌ％、または約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、もしくは７０ｍｏｌ％を構成することができる。別の実施形態において、脂質ナノ粒子は、モルベースで約２５％～約７５％、例えば、モルベースで（脂質ナノ粒子中の脂質の１００％全モルに基づいて）約２０～約７０％、約３５～約６５％、約４５～約６５％、約６０％、約５７．５％、約５７．１％、約５０％、または約４０％のカチオン性脂質を含む。
一般的に、本発明による組成物は、１種または複数のさらなる脂質などの他の賦形剤を含み得る。一実施形態において、組成物は、さらなるカチオン性脂質、すなわち、第２、第３などのカチオン性脂質を含み得る。このようなさらなるカチオン性脂質は、場合により本明細書に開示されるカチオン性脂質であってもよい。あるいは、これは、医薬組成物、特にｍＲＮＡなどの核酸化合物から選択される活性成分を含む組成物に適した任意の他のカチオン性脂質であってもよい。
１つの具体的な実施形態において、さらなるカチオン性脂質は、少なくとも１個の第４級窒素原子を含む永続的にカチオン性の脂質である。この場合、第１のカチオン性脂質は、好ましくは永続的にカチオン性ではなくカチオン化可能である脂質である。
塩基性カチオン性脂質の薬学的に許容される塩は、無機または有機酸から誘導され得る。例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸から、ならびに酢酸、プロパン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２－アセトキシ安息香酸、フマル酸（ｆｕｍａｔｉｃ）、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸からの塩。薬学的に許容される塩のさらなる例としては、限定されるものではないが、アミンなどの塩基性残基の鉱酸または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩；などが挙げられる。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが含まれる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに限定されるものではないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含む非毒性アンモニウム、第４級アンモニウム、およびアミンカチオンが含まれる。本開示の薬学的に許容される塩には、例えば、非毒性無機または有機酸から形成された親化合物の慣用的な非毒性塩が含まれる。本開示の薬学的に許容される塩は、慣用的な化学法によって塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般的に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、水中もしくは有機溶媒中、またはこれらの２つの混合物中で化学量論的量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができる；一般的に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体が好ましい。適切な塩のリストは、それぞれ全体を本願明細書に援用する、レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１７版、マック出版社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）［ペンシルバニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）所在］、１９８５、１４１８頁、医薬塩：特性、選択、および使用（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ）、ピー・エイチ・スタール（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ）およびシー・ジー・ワームース（Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ）（編）、ワイリー－ブイシーエイチ社（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ）、２００８、およびベルジュら（Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６、１－１９（１９７７）に見出される。
ポリマーコンジュゲート脂質、ペグ化脂質
一部の実施形態において、ＬＮＰは、脂質コンジュゲート、好ましくはポリマーコンジュゲート脂質を含む。「ポリマーコンジュゲート脂質（ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｉｐｉｄ）」という用語は、脂質部分とポリマー部分の両方を含む分子を指す。好ましくは、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質またはＰＥＧ脂質である。「ペグ化脂質」または「ＰＥＧ脂質」という用語は、脂質部分とポリエチレングリコール部分の両方を含む分子を指す。ペグ化脂質は当技術分野で公知であり、ＰＥＧ－ＤＭＧなどを含む。
具体的な実施形態において、ポリマーコンジュゲート脂質は、式（ＩＩ）による化合物：
Ｐ－Ａ－Ｌ 式（ＩＩ）
（式中、Ｐは親水性ポリマー部分であり、Ａは任意選択のリンカーまたはスペーサであり、Ｌは脂質部分である）
として定義される。
親水性ポリマー部分Ｐ
式（ＩＩ）によるポリマーコンジュゲート脂質中の親水性ポリマー部分Ｐはポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）部分であり得る。具体的な実施形態において、ＰＥＧ部分は、１ｋＤａ～３ｋＤａの間、例えば、１．５～２．５ｋＤａの間、１．７～２．３ｋＤａの間、１．８～２．２ｋＤａの間、１．９～２．１ｋＤａの間、または２ｋＤａの平均分子質量を有する。よって、ＰＥＧは、「ＰＥＧ２０００」または「ＰＥＧ２ｋ」として一般的に知られているＰＥＧであり得るが、より短い「ＰＥＧ１０００」およびより長い「ＰＥＧ３０００」も使用することができる。ＰＥＧ部分は通常、直鎖ポリマー鎖を含むが、一部の実施形態において、ＰＥＧ部分が分岐ポリマー鎖を含み得る。あるいは、企図されるＰＥＧ修飾脂質には、限定されるものではないが、脂質に共有結合的に結合した、長さ最大２ｋＤａ、最大３ｋＤａ、最大４ｋＤａまたは最大５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖が含まれる。
別の実施形態において、ポリマーコンジュゲート脂質中の親水性ポリマー部分Ｐはまた、上記の親水性ポリマー部分とは異なる実質的に親水性のポリマーであり得る、すなわち、ポリマーコンジュゲート脂質中の親水性ポリマー部分Ｐは、ポリ（プロピレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ－Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ヘシル化（ｈｅｓｙｌａｔｉｏｎ）工程（ＰＭＩＤ２４６８１３９６による）、ＰＡＳ化（ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ）アプローチ（すなわち、プロリン－アラニン－セリン）、当技術分野で公知のＸＴＥＮアプローチ（すなわち、ペプチドベースのＰＥＧ）、ポリサルコシンまたはポリ（酢酸ビニル）に基づき得る。
任意選択のリンカーまたはスペーサＡ
式（ＩＩ）によるポリマーコンジュゲート脂質中の任意選択のリンカーまたはスペーサＡは、一般的にペグ化脂質で有用なことが分かっているもの、例えば、限定されるものではないが、スクシンイミド、アミン、エーテル、エステル、無水物、アルデヒド、ケトン、アミド、カルバメートリンカーまたはこれらの組合せから選択されるスペーサなどの、任意の有用なスペーサ構造であり得る。
脂質部分Ｌ
式（ＩＩ）によるポリマーコンジュゲート脂質中の脂質部分Ｌは、リン脂質、スフィンゴ脂質またはセラミドから誘導され得る。本明細書で使用される場合、「リン脂質またはセラミドから誘導される」という表現は、リン脂質およびセラミドの基を含む。例としては、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルグリセロール部分を含むポリマーコンジュゲート脂質がある。
具体的な実施形態において、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質である。より具体的な実施形態において、本発明の組成物に含まれるポリマーコンジュゲート脂質は、ペグ化ジアシルグリセロール脂質（ＰＥＧ－ＤＡＧ）；ペグ化セラミド脂質（ＰＥＧ－Ｃｅｒ）；ペグ化ホスファチジルエタノールアミン脂質（ＰＥＧ－ＰＥ）；ペグ化スクシネートジアシルグリセロール脂質（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）；ペグ化ジアルコキシプロピルカルバメート脂質；１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール（「ＰＥＧ－ＤＭＧ」または「ＤＭＧ－ＰＥＧ」）；１，２－ジカプリル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレングリコール（Ｃ１０ジアシルグリセロールＰＥＧ）；Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝（ＰＥＧ－セラミド８、Ｃ８－セラミド－ＰＥＧ、ＰＥＧ－Ｃｅｒ８、Ｃ８ ＰＥＧ２０００セラミドまたはセラミド８ＰＥＧとも呼ばれる、Ｎ－オクタノイル－Ｄ－エリスロ－スフィンゴシン（ｄ１８：１／８：０）を含む）；４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）；２－ｍＰＥＧ２０００－ｎ，ｎ－ジテトラデシルアセトアミド；Ｎ－［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバミル］－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）；ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル－Ｎ－（２，３－ジ（テトラデカンオキシ）プロピル）カルバメート；国際公開第２０１８１２６０８４号、国際公開第２０２００９３０６１号、または国際公開第２０２０２１９９４１号（３つ全ての参考文献を本願明細書に援用する）に開示されるＰＥＧ脂質、本明細書に開示されるＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ化コレステロール誘導体、および２，３－ジ（テトラデカンオキシ）プロピル－Ｎ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）カルバメートからなる群から選択されるポリマーコンジュゲート脂質である。
さらに好ましい実施形態において、脂質部分Ｌは、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の疎水性脂肪酸（「尾部（ｔａｉｌｓ）」、偶数の炭素原子を含む脂肪族鎖に対応する）を含む。より好ましい実施形態において、脂質部分Ｌは、同じまたは異なる数の炭素原子を有する２つの疎水性脂肪酸（「尾部」）を含む。
好ましくは、脂質部分Ｌは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５もしくは２６個の炭素原子またはこれらの組合せを含む脂肪酸（「尾部」）を含む。より好ましくは、脂質部分Ｌは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７もしくは１８個の炭素原子またはこれらの組合せを含む脂肪酸（「尾部」）を含む。より具体的な実施形態において、脂質部分Ｌは、カプリル酸またはオクタン酸（８：０）；カプリン酸（１０：０）；ラウリン酸（１２：０）；ミリスチン酸（１４：０）；パルミチン酸（１６：０）；ステアリン酸（１８：０）；アラキジン酸（２０：０）；ベヘン酸（２２：０）；リグノセリン酸（２４：０）；およびセロチン酸（２６：０）からなる群から選択される脂肪酸（「尾部」）を含む。
さらにより好ましい実施形態において、脂質部分Ｌは、８個、１０個または１２個の炭素原子、好ましくは８個または１０個の炭素原子を含む少なくとも１つの脂肪酸（「尾部」）を含む。
さらに好ましい実施形態において、組成物は、ポリマーコンジュゲート脂質
－ １，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）
を含む。
好ましくは、当技術分野で使用されるように、「ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００」は、約９７：３比の１，２－ＤＭＧ ＰＥＧ２０００と１，３－ＤＭＧ ＰＥＧ２０００の混合物であると考えられる。
さらに具体的な実施形態において、組成物は、
－ １，２－ジカプリル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレングリコール２０００（Ｃ１０－ＰＥＧ２０００）
および
－ Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝（Ｃｅｒ８－ＰＥＧ２０００）
からなる群から選択されるポリマーコンジュゲート脂質を含む。
さらなる実施形態において、組成物は、以下の化学構造：
を有する「Ｃ８－ＰＥＧ２０００」に似た以下の構造からなる群から選択されるポリマーコンジュゲート脂質を含む。
本発明の具体的な実施形態において、「Ｃ１０－ＰＥＧ２０００」を含む本明細書中の本明細書に開示される各組成物を、「Ｃ１０－ＰＥＧ２０００」の代わりに「Ｃ８－ＰＥＧ２０００」を用いて製剤化することもできる。
したがって、例として、ポリマーコンジュゲート脂質、またはそれぞれ、脂質部分Ｌは、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸またはこれらの組合せ（「尾部」）を含む２つの脂肪酸尾部を有し得る、例えば、１つの飽和脂肪酸鎖（８：０；カプリル酸またはそれぞれオクタン酸）および９個以上の炭素原子を有する、異なる長さの１つの不飽和脂肪酸を含むＣｅｒ８－ＰＥＧ２０００であり得る。
具体的には、有意に増強された免疫応答をもたらす、インビボでｍＲＮＡワクチンを送達するための、好ましくは、本明細書、例えば表１に開示される本発明の脂質および／またはＤＳＰＣの代わりに中性脂質としてのＤＰｈｙＰＥと組み合わせた、本明細書に開示されるより短いアルキル鎖を有するポリマーコンジュゲート脂質（例えば、Ｃｅｒ８）の有利な使用が本発明者らによってなされたさらに非常に驚くべき発見であり、本発明の具体的な態様および実施形態に似ている。
ステロイド
「ステロイド」は、特定の分子配置で配列された４個の環を有する有機化合物である。ステロイドは以下の炭素骨格を含む：
ステロイドおよび中性ステロイドは、共に天然に存在するステロイドおよびその類似体を含む（例えば、コレステロール誘導体としてコレステロールのベータ－ヒドロキシル基にエステル化されたコハク酸からなる両親媒性脂質コレステリルヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）である）。本明細書で提供される「中性」についての定義を使用すると、中性ステロイドは、生理的条件下でイオン化可能な原子も基も有さないステロイドであり得るか、または双性イオン性ステロイドであり得る。好ましい実施形態の１つでは、中性ステロイドは、生理的条件下でイオン化可能な原子も基も含まない。一部の好ましい実施形態において、ステロイドまたはステロイド類似体はコレステロールである。「ステロイド」および「中性ステロイド」という用語は本明細書において互換的に使用される。
さらなる実施形態において、ステロイドは、全体を本願明細書に援用する、国際公開第２０１９２２６９２５号の段落［０３２０］および［０３３９］～［０３４０］に開示されるイミダゾールコレステロールエステルまたは「ＩＣＥ」である。
中性脂質、中性リン脂質
本発明による「ヘルパー脂質」とも呼ばれる「中性脂質」は、好ましくはリン脂質または中性リン脂質である。本明細書で使用される場合、「中性リン脂質」は、典型的には２つの疎水性脂肪酸「尾部」およびリン酸基を含む親水性「頭部（ｈｅａｄ）」を有する分子からなる両親媒性化合物である。リン酸基は、コリン、エタノールアミンまたはセリンなどの単純な有機分子で修飾され得る。リン脂質は自然界に豊富に存在する。例えば、リン脂質は生体膜の添加物のかなりの割合となる。本明細書で使用される場合、「リン脂質」または「中性リン脂質」という表現は、天然リン脂質と合成リン脂質の両方を網羅する。
本明細書で互換的に使用される「中性脂質」、「中性リン脂質」または「双性イオン性化合物」という用語は、生理的ｐＨで帯電していないまたは中性双性イオン性形態で存在するいくつかの脂質種のいずれか１つを指す。代表的な中性脂質には、本明細書において以下にさらに記載されるジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドが含まれる。
好ましい実施形態の１つによると、組成物は、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンなどの、双性イオン性の中性脂質を含む。適切なホスファチジルコリンの例としては、通常、卵黄もしくは大豆から誘導される、時々「レシチン」もしくは「ホスファチジルコリン」と呼ばれる、天然もしくは精製混合物；またはミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、オレオイルなどから選択される２つの脂肪アシル部分を有するホスファチジルコリンなどの高度精製もしくは半合成化合物が挙げられる。
別の好ましい実施形態において、中性脂質または中性リン脂質は、限定されるものではないが、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ；１，２－ジ－（３，７，１１，１５－テトラメチルヘキサデカノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンとも呼ばれる）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈｙＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ；ジオレオイルホスファチジルコリンとも呼ばれる）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ、ジパルミトイルホスファチジルコリンとも呼ばれる）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥＡ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬｏＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルホスホエタノールアミン、１６－Ｏ－ジメチルホスファチジルエタノールアミン、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１８－１－トランスホスファチジルエタノールアミン、１－ステアロイル－２－オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、１，２－ジスクアレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＱＰＥ）、１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（トランスＤＯＰＥ）、１－ステアロイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＳＬＰＥ）、１－トリデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）、１－オレオイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）（ＰＯＰＳ）、１－１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）（ＤＯＰＳ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）、１－Ｏ－ヘキサデカニル－２－Ｏ－（９Ｚ－オクタデセニル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリンまたは１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－フィタニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１－パルミトイル－２－コレステリル－ヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＣｈｅｍｓＰＣ）、１，２－ジコレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＣｈｅｍｓＰＣ）、２－（（２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロピル）ジメチルアンモニオ）エチル水素ホスフェート（ＤＯＣＰ）、２－（（２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロピル）ジメチルアンモニオ）エチルエチルホスフェート（ＤＯＣＰｅ）、および１－Ｏ－オクタデシル－２－Ｏ－メチル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（エデルホシン）からなる群から選択される双性イオン性化合物である。
好ましい実施形態において、本発明による中性脂質は、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。より好ましい実施形態において、本発明による中性脂質は１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈｙＰＣ）である。さらにより好ましい、特に好ましい実施形態において、本発明による中性脂質は１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）である。ＤＰｈｙＰＥの使用に関連する本発明の利点は、嵩高い尾部による膜融合性の高い能力であり、これにより、エンドソーム脂質と高いレベルで融合することが可能である。
具体的には、有意に増強された免疫応答をもたらす、インビボでｍＲＮＡワクチンを送達するための、好ましくは、本明細書、例えば表１に開示される本発明の脂質と組み合わせた、本明細書に開示される１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）の有利な使用が本発明者らによってなされた驚くべき発見であり、本発明の具体的な態様および実施形態に似ている。換言すれば、本発明者らは驚くべきことに、ＤＰｈｙＰＥの使用が、ｍＲＮＡおよびまたｓｉＲＮＡ、具体的には、限定されるものではないが、ワクチン接種設定のためのほぼ全ての先行技術のＬＮＰ組成物における標準的な中性脂質として当技術分野で現在まで使用されているＤＳＰＣに対する明確な利点をもたらすことを見出した。換言すれば、本発明の組成物は、高度に増強された免疫応答をもたらす、インビボでの高度に有利な予測できない挙動を有する。
興味深いことに、本発明者らは、ＤＳＰＣの代わりにＤＰｈｙＰＥを含む組成物が、ＧＮ０１組成物と比較した場合でさえ、インビトロおよびインビボで優れた発現プロファイルを示すことを見出した。したがって、驚くべきことに、ＤＰｈｙＰＥの使用が、ほぼ全ての先行技術のＬＮＰ組成物における標準的な中性脂質として当技術分野で現在まで使用されているＤＳＰＣに対する明確な利点をもたらすことが分かった。
重要なことに、本発明者らは、本発明の組成物および脂質ナノ粒子、例えば、ＧＮ０１製剤の有利な特徴の１つが、それが強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することができることであることを見出した。これは、例えばマラリアについては、ＣＤ８＋Ｔ細胞がマラリア原虫によって引き起こされる細胞内感染症に対する主な防御免疫機序であるので、有効なマラリアワクチンは強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するはずであるという事実のためである。
さらに、実施例で提示されるデータは、本発明の組成物、すなわち、全ての本発明のＲＮＡワクチンを使用して有意に増強された免疫応答が本発明により有用であることを実証している。驚くべきことに、ＤＳＰＣが脂質ナノ粒子のための最も一般的で、疑う余地のない中性脂質であることを示す先行技術の知識と対照的に、ワクチンを製造するための組成物のｍＲＮＡ製剤にＤＰｈｙＰＥを使用することが好ましいことが本発明者らによって見出された。
本発明者らはさらに驚くべきことに、少なくとも１つのさらなる中性脂質、特に第２の中性脂質を上記中性脂質に添加することによっても免疫応答を増強することができることを見出した（図２８～図３１および対応する実施例参照）。上記のように、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、オレオイルなどから選択される２つの脂肪アシル部分を有する（これは特に、脂肪アシル部分が１４個の炭素原子を有する部分から始まるかなり長い部分であることを意味する）ことが本発明の（第１の）中性脂質にとって好ましい。本発明者らは、特に、追加の中性脂質がペンタノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル、ノナノイル（ｎｏｎａｏｙｌ）およびデカノイルから選択される２つの脂肪酸部分、すなわち、最大で１０個の炭素原子を有する部分を有する場合、より短い脂肪アシル部分を有する中性脂質の添加が有益な効果を提供することを見出した。特に好ましい追加の中性脂質は１，２－ジヘプタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＨＰＣ）であるが、例えば０５：０ＰＣ（１，２－ジペンタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、０６：０ＰＣ（１，２－ジヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、０８：０ＰＣ（１，２－ジオクタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、０９：０ＰＣ（１，２－ジノナノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、および１０：０ＰＣ（１，２－ジヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）などの関連する中性脂質も使用することができる。
したがって、本発明の一態様において、本発明の脂質ナノ粒子は、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３またはＣ１４の長さを有する、好ましくはＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、またはＣ１０の長さを有する、より好ましくはＣ６、Ｃ７、Ｃ８の長さを有する、最も好ましくはＣ７の長さを有する少なくとも１つのアルキル鎖を有する中性脂質またはリン脂質を含む。本発明の別の実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子は、各アルキル鎖が独立に、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３またはＣ１４の長さを有する、好ましくはＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、またはＣ１０の長さを有する、より好ましくはＣ６、Ｃ７、Ｃ８の長さを有する、最も好ましくはＣ７の長さを有する、少なくとも２つのアルキル鎖を有する中性脂質またはリン脂質を含む。好ましい実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子はさらにＤＨＰＣを含む。さらなる実施形態において、１つまたは複数のアルキル鎖は炭素二重結合を含み得る。他の実施形態において、脂質ナノ粒子は、０５：０ＰＣ（１，２－ジペンタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、０４：０ＰＣ（１，２－ジブチリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、０６：０ＰＣ（ＤＨＰＣ、１，２－ジヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、０８：０ＰＣ（１，２－ジオクタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、および０９：０ＰＣ（１，２－ジノナノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）からなる群から選択される追加のリン脂質を含む。
脂質ナノ粒子組成物
「脂質ナノ粒子組成物」および「組成物」という用語は本明細書において互換的に使用される。本発明の文脈においては、脂質ナノ粒子がいずれの特定の形態にも制限されず、カチオン性脂質および場合により１つまたは複数のさらなる脂質を、例えば水性環境中で、および／または核酸化合物の存在下で、合わせると生成される任意の形態を含むと解釈されるべきである。例えば、リポソーム、脂質複合体、リポプレックスなどは脂質ナノ粒子の範囲内にある。
本発明の文脈において、「組成物」は、指定された成分が、場合により任意のさらなる賦形剤と、通常は少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤と共に組み込まれ得る任意の種類の組成物を指す。よって、組成物は、粉末もしくは顆粒などの乾燥組成物、または凍結乾燥形態もしくは錠剤などの固体単位であり得る。あるいは、組成物は液体形態であり得、各賦形剤が独立に、溶解または分散（例えば、懸濁または乳化）形態で組み込まれ得る。好ましい実施形態の１つでは、組成物は、水性液体担体による再構成のための粉末または凍結乾燥形態などの、無菌固体組成物として製剤化される。このような製剤はまた、以下にさらに詳細に記載される核酸カーゴを含む組成物のバージョンにも好ましい。
本発明の組成物において、カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に、またはその一部として存在し得る。換言すれば、このような組成物は脂質ナノ粒子を含み、カチオン性脂質は脂質ナノ粒子中に存在する。
本明細書で使用される「ナノ粒子」は、任意の構造または形態を有するサブミクロン粒子である。サブミクロン粒子はコロイドまたはコロイド状とも呼ばれ得る。ナノ粒子がベースとする材料、および構造または形態に関して、ナノ粒子は、特定の種類のナノ粒子の可能な呼称のほんのわずかだけ言及すると、例えば、ナノカプセル、小胞、リポソーム、脂質ナノ粒子、ミセル、架橋ミセル、リポプレックス、ポリプレックス、混合またはハイブリッド複合体として分類され得る。「脂質ナノ粒子」（ＬＮＰ）は、典型的には少なくとも１つの両親媒性膜形成脂質、および場合により他の脂質を含み、さらに場合により核酸化合物などのカーゴ材料を含む脂質によって形成されるナノ粒子である。本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」という表現は、リポソームおよびリポプレックスなどの、脂質によって形成または共形成された任意のサブタイプおよび形態のナノ粒子を含む。
上に定義されるように、脂質ナノ粒子は、脂質によって形成または共形成された任意の種類のナノ粒子を含む。特に、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの両親媒性、小胞形成脂質を含む脂質の組合せによって共形成され得る。リポソームおよびリポプレックスは脂質ナノ粒子の例である。
一部の実施形態において、このような脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質（例えば、式（Ｉ）の脂質）と、中性脂質、帯電脂質、ステロイドおよびポリマーコンジュゲート脂質（例えば、式（ＩＩ）のペグ化脂質などのペグ化脂質）から選択される１種または複数の賦形剤とを含む。本明細書に定義されるカチオン性脂質、ステロイド、中性脂質、および式（ＩＩ）によるポリマーコンジュゲート脂質を含む組成物は、少なくとも水性環境中で、典型的にはこれらの賦形剤によって形成される脂質ナノ粒子を含む組成物として存在すると本発明者らによって現在考えられている。
ＬＮＰは、１つもしくは複数の核酸分子が結合しているか、または１つもしくは複数の核酸分子がカプセル化されている粒子を形成することができる任意の脂質を含み得る。一部の実施形態において、ｍＲＮＡ、またはその一部が、脂質ナノ粒子の脂質部分、または脂質ナノ粒子の脂質部分の一部もしくは全部によって包まれている水性空間にカプセル化されており、それによってこれが宿主生物または細胞の機序によって誘導される酵素分解または他の望ましくない効果、例えば有害免疫応答から保護されている。一部の実施形態において、ｍＲＮＡまたはその一部が脂質ナノ粒子と会合している（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）。
言及されるように、本明細書に記載される脂質賦形剤を含む組成物は通常、少なくとも水性環境中で、脂質ナノ粒子を形成する。本明細書に定義されるように、ナノ粒子は主にサブミクロンサイズを有する。ある特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子中に存在する場合、水溶液中で、ヌクレアーゼによる分解に耐性である。本明細書で使用される場合、平均直径は、動的光散乱によって決定されるｚ平均によって表され得る。一実施形態において、組成物は、約３０ｎｍ～約８００ｎｍの動的レーザー散乱によって決定される平均流体力学直径（または平均粒径）を有する脂質ナノ粒子を含む無菌液体組成物である。様々な実施形態において、脂質ナノ粒子は、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約６０ｎｍ～約２００ｎｍ、約７０ｎｍ～約２００ｎｍ、約８０ｎｍ～約２００ｎｍ、約９０ｎｍ～約２００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１９０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１８０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１７０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１６０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１４０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ、１７０ｎｍ、１８０ｎｍ、１９０ｎｍ、もしくは２００ｎｍの平均直径を有し、実質的に非毒性である。本発明の別の好ましい実施形態において、脂質ナノ粒子は、約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、または約６０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１５０ｎｍ、または約６０ｎｍ～約１２０ｎｍ、または約８０ｎｍ～約１６０、または約９０ｎｍ～約１４０ｎｍ、５０ｎｍ～約３００ｎｍ、または約６０ｎｍ～約２５０ｎｍ、または約６０ｎｍ～約２００ｎｍ、または約７０～２００ｎｍ、または約７５ｎｍ～約１６０、または約１００ｎｍ～約１４０ｎｍ、または約９０ｎｍ～約１４０ｎｍの範囲の流体力学直径を有する。
本発明の脂質ナノ粒子をもたらす、本明細書に記載される脂質賦形剤を含む組成物は比較的均質であり得る。多分散指数（ＰＤＩ）を使用して、ナノ粒子組成物の均質性、例えばナノ粒子組成物の粒径分布を示すことができる。小さな（例えば、０．３未満）多分散指数は、一般的に狭い粒径分布を示す。本発明のナノ粒子組成物は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３０、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４または０．３５など、約０～約０．３５の多分散指数を有し得る。一部の実施形態において、ナノ粒子組成物の多分散指数（ＰＤＩ）は約０．１～約０．２であり得る。
本発明の組成物に関する様々な任意選択の特徴、選択および選好は、一般的に本明細書に記載されている：当業者によって明確に理解されるように、これらの全てが脂質ナノ粒子にも適用される。同様に、選択肢および選好はこのような脂質ナノ粒子を含む組成物にも適用される。
例えば、好ましい実施形態の１つによる脂質ナノ粒子は、上に定義されるカチオン性脂質、場合によりＤＨＰＣであり得る第２の中性脂質と組み合わせた、ＤｐｈｙＰＥであり得る中性脂質、コレステロールであり得るステロイド、および１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）であり得るポリマーコンジュゲート脂質を含み；カチオン性脂質は、場合により表１に列挙される化合物から選択され得る。
よって、本発明の文脈において、ｍＲＮＡは、好ましくは液体または半液体組成物に含まれ、ｍＲＮＡは、好ましい実施形態の１つによる脂質ナノ粒子と複合体化または会合している。すなわち、好ましい実施形態において、前記液体または半液体組成物は、ｍＲＮＡを含む複合体を含み、複合体が、好ましくは本明細書に定義される脂質ナノ粒子として存在する。
それぞれの賦形剤の量に関しては、カチオン性脂質が、ポリマーコンジュゲート脂質が存在するモル量と比較して比較的高いモル量で、本発明による脂質ナノ粒子または組成物に組み込まれることが好ましい。さらに、カチオン性脂質のモル量はまた、好ましくはそれぞれ組成物またはナノ粒子中の中性脂質のモル量よりも高い。さらに、ステロイドのモル量は、場合によりポリマーコンジュゲート脂質のモル量よりも高い。
ある特定の実施形態において、ポリマーコンジュゲート脂質は、ナノ粒子の総脂質含有量に対して、約１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％の量でＬＮＰ中に存在する。一実施形態において、ポリマーコンジュゲート脂質は、約１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％の量でＬＮＰ中に存在する。一実施形態において、ポリマーコンジュゲート脂質は、約１ｍｏｌ％または約１．５ｍｏｌ％でＬＮＰ中に存在する。
様々な実施形態において、カチオン性脂質（例えば、式（Ｉ）の脂質）のポリマーコンジュゲート脂質に対するモル比は、約１００：１～約２５：１、約５０：１～約２５：１、または約４０：１～約２５：１の範囲である。
ある特定の実施形態において、ＬＮＰは、粒子の形成中にその形成を安定化する１種または複数の追加の脂質を含む。適切な安定化脂質には、中性脂質およびアニオン性脂質が含まれる。様々な実施形態において、カチオン性脂質（例えば、式（Ｉ）の脂質）の中性脂質に対するモル比は、約２：１～約８：１、約３：１～約７：１、または約４：１～約６：１の範囲である。
本明細書で使用される場合、脂質ナノ粒子は、典型的にはそれぞれの賦形剤によって形成され、ナノ粒子を含有する組成物全体と同じ定量的比の賦形剤を反映するので、本発明の組成物中の脂質賦形剤のモル量への言及は、組成物に含まれる脂質ナノ粒子中のそれぞれの賦形剤のモル量を記載するものとしても理解されるべきである。
一般的に、組成物中（よって、脂質ナノ粒子中）のカチオン性脂質の量は、典型的には組成物（またはナノ粒子）中の全ての脂質賦形剤の総モル量に対して、少なくとも約２０ｍｏｌ％である。別の実施形態において、カチオン性脂質の量は、それぞれ少なくとも約２５ｍｏｌ％、または少なくとも３０ｍｏｌ％である。他の好ましい実施形態において、組成物中のカチオン性脂質の量は、それぞれ約３０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、または約４０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、または約４５ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％；例えばそれぞれ約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、もしくは７０ｍｏｌ％、または約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％；例えばそれぞれ約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％である。
組成物中のステロイドの量は、場合により少なくとも約１０ｍｏｌ％であり得るか、またはそれぞれ約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、もしくは約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、もしくは約２５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％の範囲；例えばそれぞれ約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、もしくは６０ｍｏｌ％であり得る。また、疑義を回避するために、モルパーセンテージは、組成物中の全ての脂質賦形剤の総モル量に対するものとする。
中性脂質は、場合により少なくとも約５ｍｏｌ％の量で存在し得る。一部の実施形態において、組成物中の中性脂質の量は、モルパーセンテージの同じ基礎を使用して、それぞれ約５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％、または約５ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％、または約８ｍｏｌ％～約１２ｍｏｌ％の範囲；例えばそれぞれ約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１１ｍｏｌ％、１２ｍｏｌ％、１３ｍｏｌ％、１４ｍｏｌ％、１５ｍｏｌ％、１６ｍｏｌ％、１７ｍｏｌ％、１８ｍｏｌ％、１９ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％、２１ｍｏｌ％、２２ｍｏｌ％、２３ｍｏｌ％、２４ｍｏｌ％または２５ｍｏｌ％である。この量は全中性脂質の量である、すなわち、この量は、例えばＤＰｈｙＰＥおよびＤＨＰＣなどの２つの中性脂質の量から得られる総量であり得る。
組成物または脂質ナノ粒子中のポリマーコンジュゲート脂質の量は、例えば、約０．１ｍｏｌ％以上となるよう選択され得る。ある特定の実施形態において、ポリマーコンジュゲート脂質の量は、同様にモルパーセンテージの基礎として全ての脂質賦形剤の総モル量を使用して、約０．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、または約１ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％の範囲、例えばそれぞれ約０．１、０．３、０．５、１、２、３、４または５ｍｏｌ％である。他のある特定の実施形態において、組成物または脂質ナノ粒子は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７ｍｏｌ％または７ｍｏｌ％超のポリマーコンジュゲート脂質を含み得る。好ましい実施形態において、ポリマーコンジュゲート脂質またはペグ化脂質の含有量は、製剤の全体の脂質含有量の約１～５ｍｏｌ％である。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は１．５％のポリマーコンジュゲート脂質を含む。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は１．７％のポリマーコンジュゲート脂質を含む。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は３％のポリマーコンジュゲート脂質を含む。さらに別の例として、脂質ナノ粒子は５％のポリマーコンジュゲート脂質を含む。
一実施形態において、組成物は、
（ａ）３０～７０ｍｏｌ％の量の式（Ｉ）による、または本明細書に記載されるカチオン性脂質；
（ｂ）２０～５０ｍｏｌ％の量のステロイド；
（ｃ）５～２５ｍｏｌ％の量の中性脂質；および
（ｄ）０．５～５ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質
を含む脂質ナノ粒子を含み；
各量が脂質ナノ粒子の全ての脂質賦形剤の総モル量に対するものである。
別の実施形態において、組成物は、
（ａ）４０～７０ｍｏｌ％の量の式（Ｉ）による、または本明細書に記載されるカチオン性脂質；
（ｂ）２０～５０ｍｏｌ％の量のステロイド；
（ｃ）５～１５ｍｏｌ％の量の中性脂質；および
（ｄ）０．５～５ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質
を含む脂質ナノ粒子を含み；
各量が脂質ナノ粒子の全ての脂質賦形剤の総モル量に対するものである。
一実施形態において、組成物は、
（ａ）２０～６０ｍｏｌ％の量の式（Ｉ）による、または本明細書に記載されるカチオン性脂質；
（ｂ）２５～５５ｍｏｌ％の量のステロイド；
（ｃ）５～２５ｍｏｌ％の量の中性脂質；および
（ｄ）０．５～１５ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質
を含む脂質ナノ粒子を含み；
各量が脂質ナノ粒子の全ての脂質賦形剤の総モル量に対するものである。
さらなる実施形態において、組成物は、
（ａ）４５～６５ｍｏｌ％の量の式（Ｉ）による、または本明細書に記載されるカチオン性脂質；
（ｂ）２５～４５ｍｏｌ％の量のステロイド；
（ｃ）８～１２ｍｏｌ％の量の中性脂質；および
（ｄ）１～３ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質
を含む脂質ナノ粒子を含み；
各量が脂質ナノ粒子の全ての脂質賦形剤の総モル量に対するものである。
さらに好ましい実施形態において、組成物は、
（ａ）４５～６５ｍｏｌ％の量の式（Ｉ）による、または本明細書に記載されるカチオン性脂質；
（ｂ）２５～４５ｍｏｌ％の量のコレステロール；
（ｃ）８～１２ｍｏｌ％の量の中性脂質；および
（ｄ）１～３ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質
を含む脂質ナノ粒子を含み；
各量が脂質ナノ粒子の全ての脂質賦形剤の総モル量に対するものである。
さらに好ましい実施形態において、組成物は、
（ａ）４５～６５ｍｏｌ％の量の式（Ｉ）による、または本明細書に記載されるカチオン性脂質；
（ｂ）２５～４５ｍｏｌ％の量のコレステロール；
（ｃ）８～１２ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥおよび場合により１～１０ｍｏｌ％の量のＤＨＰＣ；ならびに
（ｄ）１～３ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質
を含有する脂質ナノ粒子を含み；
各量が脂質ナノ粒子の全ての脂質賦形剤の総モル量に対するものである。
さらに好ましい実施形態において、組成物は、
（ａ）４５～６５ｍｏｌ％の量の式（Ｉ）による、または本明細書に記載されるカチオン性脂質；
（ｂ）２５～４５ｍｏｌ％の量のコレステロール；
（ｃ）８～１２ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥおよび場合により１～１０ｍｏｌ％の量のＤＨＰＣ；ならびに
（ｄ）１～３ｍｏｌ％の量のＰＥＧ－ＤＭＧ２０００
を含有する脂質ナノ粒子を含み；
各量が脂質ナノ粒子の全ての脂質賦形剤の総モル量に対するものである。
これらの実施形態において、カチオン性脂質は、好ましくは本明細書に開示される選好のいずれか１つにより選択される化合物である。例えば、カチオン性脂質は表１に列挙される化合物から選択され得る。さらに、これらの実施形態はまた、本明細書に開示される選好のいずれか１つにより選択されるステロイド、中性脂質、および／またはポリマーコンジュゲート脂質を含み得る。本明細書に記載される組成物または脂質ナノ粒子を列挙し、ｍｏｌ％値が各賦形剤について与えられる全ての実施形態において、各量が脂質ナノ粒子の全ての脂質賦形剤の総モル量に対するものであるとみなされるべきである。
さらに好ましい実施形態において、本明細書に記載される組成物または脂質ナノ粒子は、５９ｍｏｌ％の本発明の式（Ｉ）によるカチオン性脂質、１０ｍｏｌ％の中性脂質、２９．３ｍｏｌ％のステロイドおよび１．７ｍｏｌ％のポリマーコンジュゲート脂質を含む。
一実施形態において、本明細書に記載される組成物または脂質ナノ粒子は、５９ｍｏｌ％の本発明の式（Ｉ）によるカチオン性脂質、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥ、２９．３ｍｏｌ％のコレステロールおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含む。
一実施形態において、本明細書に記載される組成物または脂質ナノ粒子は、５９ｍｏｌ％の本発明の式（Ｉ）によるカチオン性脂質、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥ、２９．３ｍｏｌ％のコレステロールおよび１．７ｍｏｌ％のＣ１０－ＰＥＧ２０００を含む。一実施形態において、本明細書に記載される組成物または脂質ナノ粒子は、５９ｍｏｌ％の本発明の式（Ｉ）によるカチオン性脂質、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥ、２９．３ｍｏｌ％のコレステロールおよび１．７ｍｏｌ％のＣｅｒ８－ＰＥＧ２０００を含む。
別の実施形態において、本明細書に記載される組成物または脂質ナノ粒子は、４７．４ｍｏｌ％の本発明の式（Ｉ）によるカチオン性脂質、１０ｍｏｌ％の中性脂質、４０．９ｍｏｌ％のステロイドおよび１．７ｍｏｌ％のポリマーコンジュゲート脂質を含む。
さらなる実施形態において、本明細書に記載される組成物または脂質ナノ粒子は、４７．４ｍｏｌ％の本発明の式（Ｉ）によるカチオン性脂質、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥ、４０．９ｍｏｌ％のコレステロールおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含む。一実施形態において、本明細書に記載される組成物または脂質ナノ粒子は、４７．４ｍｏｌ％の本発明の式（Ｉ）によるカチオン性脂質、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥ、４０．９ｍｏｌ％のコレステロールおよび１．７ｍｏｌ％のＣ１０－ＰＥＧ２０００を含む。一実施形態において、本明細書に記載される組成物または脂質ナノ粒子は、４７．４ｍｏｌ％の本発明の式（Ｉ）によるカチオン性脂質、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥ、４０．９ｍｏｌ％のコレステロールおよび１．７ｍｏｌ％のＣｅｒ８－ＰＥＧ２０００を含む。
別の実施形態において、本明細書に記載される組成物または脂質ナノ粒子は、５９ｍｏｌ％の本発明の式（Ｉ）によるカチオン性脂質、１１ｍｏｌ％の中性脂質、２８．３ｍｏｌ％のステロイドおよび１．７ｍｏｌ％のポリマーコンジュゲート脂質を含む。
一実施形態において、本明細書に記載される組成物または脂質ナノ粒子は、５９ｍｏｌ％の本発明の式（Ｉ）によるカチオン性脂質、１０ｍｏｌ％のＤｐｈｙＰＥおよび１ｍｏｌ％のＤＨＰＣ、２８．３ｍｏｌ％のコレステロールならびに１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含む。一実施形態において、本明細書に記載される組成物または脂質ナノ粒子は、５９ｍｏｌ％の本発明の式（Ｉ）によるカチオン性脂質、１０ｍｏｌ％のＤｐｈｙＰＥおよび１ｍｏｌ％のＤＨＰＣ、２８．３ｍｏｌ％のコレステロールならびに１．７ｍｏｌ％のＣ１０－ＰＥＧ２０００を含む。一実施形態において、本明細書に記載される組成物または脂質ナノ粒子は、５９ｍｏｌ％の本発明の式（Ｉ）によるカチオン性脂質、１０ｍｏｌ％のＤｐｈｙＰＥおよび１ｍｏｌ％のＤＨＰＣ、２９．３ｍｏｌ％のコレステロールならびに１．７ｍｏｌ％のＣｅｒ８－ＰＥＧ２０００を含む。
別の実施形態において、本明細書に記載される組成物または脂質ナノ粒子は、４９ｍｏｌ％の本発明の式（Ｉ）によるカチオン性脂質、２０ｍｏｌ％の中性脂質、２９．３ｍｏｌ％のステロイドおよび１．７ｍｏｌ％のポリマーコンジュゲート脂質を含む。
一実施形態において、本明細書に記載される組成物または脂質ナノ粒子は、４９ｍｏｌ％の本発明の式（Ｉ）によるカチオン性脂質、１０ｍｏｌ％のＤｐｈｙＰＥおよび１０ｍｏｌ％のＤＨＰＣ、２９．３ｍｏｌ％のコレステロールならびに１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含む。一実施形態において、本明細書に記載される組成物または脂質ナノ粒子は、４９ｍｏｌ％の本発明の式（Ｉ）によるカチオン性脂質、１０ｍｏｌ％のＤｐｈｙＰＥおよび１０ｍｏｌ％のＤＨＰＣ、２９．３ｍｏｌ％のコレステロールならびに１．７ｍｏｌ％のＣ１０－ＰＥＧ２０００を含む。一実施形態において、本明細書に記載される組成物または脂質ナノ粒子は、４９ｍｏｌ％の本発明の式（Ｉ）によるカチオン性脂質、１０ｍｏｌ％のＤｐｈｙＰＥおよび１０ｍｏｌ％のＤＨＰＣ、２９．３ｍｏｌ％のコレステロールならびに１．７ｍｏｌ％のＣｅｒ８－ＰＥＧ２０００を含む。
賦形剤について別個の％値を有する具体的な組成物または脂質ナノ粒子を開示するこの節における上記実施形態のいずれにおいても、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）が中性脂質として言及される場合、さらなる実施形態において、ＤＰｈｙＰＥが別の中性脂質、好ましくは１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈｙＰＣ）と交換され得る。さらに、賦形剤について別個の％値を有する具体的な組成物または脂質ナノ粒子を開示するこの節における上記実施形態のいずれにおいても、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）が中性脂質として言及される場合、なおさらなる実施形態において、ＤＰｈｙＰＥが別の中性脂質、好ましくは１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ；ジオレオイルホスファチジルコリンとも呼ばれる）または代わりに１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）と交換され得る。
本発明のさらなる具体的な実施形態によるさらに好ましい脂質組成物は、表Ｅにおいて本明細書に開示される少なくとも４種の脂質賦形剤を含む。例えば、好ましい脂質組成物は、カチオン性脂質としての「Ｃ１」（表１において本明細書に開示される）、中性脂質としてのＤＰｈｙＰＥ、ステロールとしてのコレステロールおよびポリマーコンジュゲート脂質賦形剤としてのＤＭＧ－ＰＥＧ２０００である「Ｅ１」行に開示される賦形剤を含む。別の例として、好ましい脂質組成物は、カチオン性脂質としての「Ｃ１２」（表１において本明細書に開示される）、中性脂質としてのＤＰｈｙＰＥ、ステロールとしてのコレステロールおよびポリマーコンジュゲート脂質賦形剤としてのＣ１０－ＰＥＧ２０００である「Ｅ３５」行に開示される賦形剤を含む。
さらに、本発明の組成物の少なくとも４種の脂質賦形剤の別個のｍｏｌパーセンテージを示す本発明の好ましい脂質製剤を表Ｆに示す。例えば、好ましい脂質組成物は、「Ｆ１」行に開示される脂質のｍｏｌパーセンテージ、すなわち、５９ｍｏｌ％のカチオン性脂質、２９．３ｍｏｌ％のステロール、１０ｍｏｌ％の中性脂質、および１．７ｍｏｌ％のポリマーコンジュゲート脂質を含む。別の例として、好ましい脂質組成物は、「Ｆ３１」行に開示される脂質のｍｏｌパーセンテージ、すなわち、４５ｍｏｌ％のカチオン性脂質、４３．５ｍｏｌ％のステロール、１０ｍｏｌ％の中性脂質および１．５ｍｏｌ％のポリマーコンジュゲート脂質を含む。
したがって、本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明の組成物は、製剤呼称
Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１２、Ｆ１３、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ１６、Ｆ１７、Ｆ１８、Ｆ１９、Ｆ２０、Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３、Ｆ２４、Ｆ２５、Ｆ２６、Ｆ２７、Ｆ２８、Ｆ２９、Ｆ３０、Ｆ３１、Ｆ３２、Ｆ３３、Ｆ３４、Ｆ３５、Ｆ３６、Ｆ３７、Ｆ３８、Ｆ３９、Ｆ４０、Ｆ４１、Ｆ４２、Ｆ４３、Ｆ４４、Ｆ４５、Ｆ４６、Ｆ４７、Ｆ４８、Ｆ４９、Ｆ５０、Ｆ５１、Ｆ５２、Ｆ５３、Ｆ５４、Ｆ５５、Ｆ５６、Ｆ５７、Ｆ５８、Ｆ５９、Ｆ６０、Ｆ６１およびＦ６２
からなる群から選択される、表Ｆに開示される別個のｍｏｌパーセンテージの、賦形剤組合せ呼称
Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｅ１７、Ｅ１８、Ｅ１９、Ｅ２０、Ｅ２１、Ｅ２２、Ｅ２３、Ｅ２４、Ｅ２５、Ｅ２６、Ｅ２７、Ｅ２８、Ｅ２９、Ｅ３０、Ｅ３１、Ｅ３２、Ｅ３３、Ｅ３４、Ｅ３５、Ｅ３６、Ｅ３７、Ｅ３８、Ｅ３９、Ｅ４０、Ｅ４１、Ｅ４２、Ｅ４３、Ｅ４４、Ｅ４５、Ｅ４６、Ｅ４７、Ｅ４８、Ｅ４９、Ｅ５０、Ｅ５１、Ｅ５２、Ｅ５３、Ｅ５４、Ｅ５５、Ｅ５６、Ｅ５７、Ｅ５８、Ｅ５９、Ｅ６０、Ｅ６１、Ｅ６２、Ｅ６３、Ｅ６４、Ｅ６５、Ｅ６６、Ｅ６７、Ｅ６８、Ｅ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｅ７２、Ｅ７３、Ｅ７４、Ｅ７５、Ｅ７６、Ｅ７７、Ｅ７８、Ｅ７９、Ｅ８０、Ｅ８１、Ｅ８２、Ｅ８３、Ｅ８４、Ｅ８５、Ｅ８６、Ｅ８７、Ｅ８８、Ｅ８９、Ｅ９０、Ｅ９１、Ｅ９２、Ｅ９３、Ｅ９４、Ｅ９５、Ｅ９６、Ｅ９７、Ｅ９８、Ｅ９９、Ｅ１００、Ｅ１０１、Ｅ１０２、Ｅ１０３、Ｅ１０４、Ｅ１０５、Ｅ１０６、Ｅ１０７およびＥ１０８
からなる群から選択される、表Ｅに開示される賦形剤を含む。
表Ｅおよび表Ｆによる組合せＦ１×Ｅ２３、すなわち、５９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ２３、すなわち、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ（以前の名称：実施例節（ｅｘａｍｐｌｅｓ ｓｅｃｔｉｏｎ）から明らかなように、ＳＳ－３３／４ＰＥ－１５；エヌオーエフコーポレーション（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、日本東京所在）、２９．３ｍｏｌ％のステロイドとしてのコレステロール、１０ｍｏｌ％の中性脂質／リン脂質としてのＤＰｈｙＰＥおよび１．７ｍｏｌ％のポリマーコンジュゲート脂質としてのＤＭＧ－ＰＥＧ２０００が脂質ナノ粒子を製剤化するために使用される場合に、本発明の脂質ナノ粒子についての特に好ましい実施形態が与えられる。前記ＬＮＰ組成物は本明細書および実施例において「ＧＮ０１」と呼ばれる。ＳＳ－ＥＣはｐＨ４で正の電荷およびｐＨ７で中性電荷を有し、これは本発明のＬＮＰおよび製剤／組成物にとって有利である。「ＧＮ０１」について、Ｎ／Ｐ（脂質対ｍＲＮＡのｍｏｌ比）は、好ましくは１４であり、全脂質／ｍＲＮＡ質量比は、好ましくは約２０～約６０の間、より好ましくは約３０～約５０の間、最も好ましくは４０（ｍ／ｍ）である。
表Ｅおよび表Ｆによる組合せＦ１×Ｅ２、すなわち、５９ｍｏｌ％のカチオン性脂質としての表１に開示されるＣ２脂質（すなわち、実施例節、図１Ｂから明らかなようにＨＥＸＡ－Ｃ５ＤＥ－ＰｉｐＳＳ）、２９．３ｍｏｌ％のステロイドとしてのコレステロール、１０ｍｏｌ％の中性脂質／リン脂質としてのＤＰｈｙＰＥおよび１．７ｍｏｌ％のポリマーコンジュゲート脂質としてのＤＭＧ－ＰＥＧ２０００が脂質ナノ粒子を製剤化するために使用される場合に、本発明の脂質ナノ粒子についてのさらに特に好ましい実施形態が与えられる。前記ＬＮＰ組成物は本明細書および実施例において「ＧＮ０２」と呼ばれる。「ＧＮ０２」について、Ｎ／Ｐ（脂質対ｍＲＮＡのｍｏｌ比）は、好ましくは１７．５であり、全脂質／ｍＲＮＡ質量比は、好ましくは約２０～約６０の間、より好ましくは約３０～約５０の間、最も好ましくは４０（ｍ／ｍ）である。
表Ｅおよび表Ｆによる組合せＦ１×Ｅ２３、すなわち、５９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ２３、すなわち、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ（以前の名称：実施例節から明らかなように、ＳＳ－３３／４ＰＥ－１５；エヌオーエフコーポレーション（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、日本東京所在）、２６ｍｏｌ％のステロイドとしてのコレステロール、１０ｍｏｌ％の中性脂質／リン脂質としてのＤＰｈｙＰＥおよび５ｍｏｌ％のより短いアルキル鎖を含むポリマーコンジュゲート脂質としてのＣｅｒ８が脂質ナノ粒子を製剤化するために使用される場合に、本発明の脂質ナノ粒子についての別の特に好ましい実施形態が与えられる。前記ＬＮＰ組成物は本明細書および実施例において「ＧＮ０１－Ｃ８」と呼ばれる。「ＧＮ０１－Ｃ８」について、Ｎ／Ｐ（脂質対ｍＲＮＡのｍｏｌ比）は、好ましくは１４であり、全脂質／ｍＲＮＡ質量比は、好ましくは約２０～約６０の間、より好ましくは約３０～約５０の間、最も好ましくは４０（ｍ／ｍ）である。
表Ｅおよび表Ｆによる組合せＦ１×Ｅ７２、すなわち、５９ｍｏｌ％のカチオン性脂質としての表１に開示されるＣ２６脂質（すなわち、実施例節、図２５Ａから明らかなようにＴＨＩＯＥＴＨＥＲ）、２９．３ｍｏｌ％のステロイドとしてのコレステロール、１０ｍｏｌ％の中性脂質／リン脂質としてのＤＰｈｙＰＥおよび１．７ｍｏｌ％のポリマーコンジュゲート脂質としてのＤＭＧ－ＰＥＧ２０００が脂質ナノ粒子を製剤化するために使用される場合に、本発明の脂質ナノ粒子についてのさらに特に好ましい実施形態が与えられる。前記ＬＮＰ組成物は本明細書および実施例において「ＬＮＰ２８」と呼ばれる。「ＬＮＰ２８」について、Ｎ／Ｐ（脂質対ｍＲＮＡのｍｏｌ比）は、好ましくは１４であり、全脂質／ｍＲＮＡ質量比は、好ましくは約２０～約６０の間、より好ましくは約３０～約５０の間、最も好ましくは４０（ｍ／ｍ）である。
さらに、好ましい組成物については、
（ｉ）カチオン性脂質が表１の化合物から選択され得る；および／または
（ｉｉ）中性脂質または中性リン脂質が、場合により１，２－ジヘプタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＨＰＣ）と組み合わせた、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ；１，２－ジ－（３，７，１１，１５－テトラメチルヘキサデカノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンとも呼ばれる）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈｙＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ；ジオレオイルホスファチジルコリンとも呼ばれる）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ、ジパルミトイルホスファチジルコリンとも呼ばれる）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥＡ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬｏＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルホスホエタノールアミン、１６－Ｏ－ジメチルホスファチジルエタノールアミン、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１８－１－トランスホスファチジルエタノールアミン、１－ステアロイル－２－オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、１，２－ジスクアレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＱＰＥ）、１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（トランスＤＯＰＥ）、１－ステアロイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＳＬＰＥ）、１－トリデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）、１－オレオイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）（ＰＯＰＳ）、１－１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）（ＤＯＰＳ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）、１－Ｏ－ヘキサデカニル－２－Ｏ－（９Ｚ－オクタデセニル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリンまたは１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－フィタニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１－パルミトイル－２－コレステリル－ヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＣｈｅｍｓＰＣ）、１，２－ジコレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＣｈｅｍｓＰＣ）、２－（（２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロピル）ジメチルアンモニオ）エチル水素ホスフェート（ＤＯＣＰ）、２－（（２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロピル）ジメチルアンモニオ）エチルエチルホスフェート（ＤＯＣＰｅ）、および１－Ｏ－オクタデシル－２－Ｏ－メチル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（エデルホシン）からなる群から選択される双性イオン性化合物である；および／または
（ｉｉｉ）ポリマーコンジュゲート脂質が、ペグ化ジアシルグリセロール脂質（ＰＥＧ－ＤＡＧ）；ペグ化セラミド脂質（ＰＥＧ－Ｃｅｒ）；ペグ化ホスファチジルエタノールアミン脂質（ＰＥＧ－ＰＥ）；ペグ化スクシネートジアシルグリセロール脂質（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）；ペグ化ジアルコキシプロピルカルバメート脂質；１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール（「ＰＥＧ－ＤＭＧ」または「ＤＭＧ－ＰＥＧ」）；１，２－ジカプリル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレングリコール（Ｃ１０ジアシルグリセロールＰＥＧ）；Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－セラミド８またはＰＥＧ－Ｃｅｒ８）；４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）；２－ｍＰＥＧ２０００－ｎ，ｎ－ジテトラデシルアセトアミド；Ｎ－［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバミル］－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）；ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル－Ｎ－（２，３－ジ（テトラデカンオキシ）プロピル）カルバメート；および２，３－ジ（テトラデカンオキシ）プロピル－Ｎ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）カルバメートからなる群から選択され得る。
あるいは、組成物は固体形態で提供され得る。特に、組成物は、無菌液体担体で再構成するための無菌固体組成物として提供され得る；この場合、固体組成物は、ｐＨ修正剤、増量剤、安定剤、非イオン性界面活性剤および抗酸化剤から選択される１種または複数の不活性成分をさらに含み得る。この実施形態において、無菌液体担体は、好ましくは水性担体である。
ナノ粒子組成物のゼータ電位を使用して、組成物の界面動電位を示すことができる。例えば、ゼータ電位は、ナノ粒子組成物の表面電荷を記載し得る。本発明による脂質ナノ粒子は、負に帯電した化合物と正に帯電した化合物の両方の存在により、比較的中性のゼータ電位を示し得る。ゼータ電位（時々、「電荷」と略される）は、例えばＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（マルバーンインスツルメンツ社（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．）；英国マルバーン（Ｍａｌｖｅｒｎ）所在）を使用して、動的光散乱およびレーザードップラ微小電気泳動法によって、粒子の粒径と共に決定され得る。脂質ナノ粒子中の帯電した化合物の量および性質に応じて、ナノ粒子はゼータ電位によって特徴付けられ得る。好ましい実施形態において、ゼータ電位は約－５０ｍＶ～約＋５０ｍＶの範囲にある。他の好ましい実施形態において、ゼータ電位は約－２５ｍＶ～約＋２５ｍＶの範囲にある。一部の実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約－１０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約－５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－５ｍＶ～約０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、または約＋５ｍＶ～約＋１０ｍＶであり得る。
ある特定の実施形態において、ＬＮＰは、ＬＮＰを細胞または細胞集団に標的化することはできる１つまたは複数の標的化部分を含む。例えば、一実施形態において、標的化部分は、ＬＮＰを細胞表面上に見られる受容体に向けるリガンドである。
ある特定の実施形態において、ＬＮＰは１つまたは複数の内在化ドメインを含む。例えば、一実施形態において、ＬＮＰは、細胞に結合してＬＮＰの内在化を誘導する１つまたは複数のドメインを含む。例えば、一実施形態において、１つまたは複数の内在化ドメインは、細胞表面上に見られる受容体に結合して、ＬＮＰの受容体媒介取り込みを誘導する。ある特定の実施形態において、ＬＮＰはインビボで生体分子に結合することができ、それによって、ＬＮＰ結合生体分子は細胞表面受容体によって認識されて内在化を誘導し得る。例えば、一実施形態において、ＬＮＰは全身性ＡｐｏＥに結合し、これがＬＮＰおよび会合したカーゴの取り込みにつながる。本発明のある特定の実施形態において、ＡｐｏＥを使用される媒体または医薬組成物に補充することができる。
好ましくは、一実施形態において、本発明の組成物は、生物活性成分をさらに含む。
生物活性成分
本明細書で使用される場合、生物活性成分は、生物活性を有する任意の化合物または材料を意味し、そのために、この化合物または材料は、動物などの対象、特にヒト対象における疾患または状態の防止、管理、改善、処置または治療に潜在的に有用である。
好ましい実施形態の１つでは、活性化合物は核酸化合物である。本発明を行うために潜在的に有用な核酸化合物の例としては、化学修飾もしくは非修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、化学修飾もしくは非修飾ＲＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡ、コードもしくは非コードＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、レプリコンＲＮＡ、および自己複製ＲＮＡ、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される核酸化合物が挙げられ；好ましくは、生物活性成分がｍＲＮＡである。
好ましい実施形態において、核酸化合物は１つまたは複数の脂質（例えば、カチオン性脂質および／または中性脂質）と複合体化または会合して、それによって、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポプレックス、および／またはナノリポソームを形成する。この文脈において、「複合体化（ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ）」または「会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」という用語は、共有結合を用いない、第１の態様の核酸化合物と１つまたは複数の脂質のより大きな複合体または集合体への本質的に安定な組合せを指す。
具体的な実施形態において、活性成分は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼと合わせた、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）＋トレーサＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）もしくはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）および／またはドナーＤＮＡを含み得る。適切には、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが、タンパク質もしくはポリペプチドとして、または前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡとして提供され得る。この組合せを含む組成物または製剤は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集活性を標的細胞に送達するのに適している。一実施形態において、本発明による組成物は、別々の、順次の、または同時の投与のための、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを提供し得る。すなわち、ｇＲＮＡおよびｍＲＮＡは、本発明による同じ製剤もしくは脂質ナノ粒子内で提供され得るか、または別々の、同時のもしくは順次の投与のための別々の脂質ナノ粒子で提供され得る。適切には、投与するためのｇＲＮＡのｍＲＮＡに対する比が、例えば、１：１、１：３、１：９、１：１９（すなわち、５０％、２５％、１０％および５％のガイドＲＮＡ）である。一実施形態において、ｇＲＮＡおよびｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは本発明による製剤に共充填される。有利には、共充填により、より優れたカプセル化効率（ＥＥ）を得ることが可能になる。適切には、ｇＲＮＡおよびｍＲＮＡが共充填された本発明による製剤または医薬組成物が、８０～１６０ｎｍの間の平均直径を有するＬＮＰを含む。一実施形態において、ｇＲＮＡが修飾ｇＲＮＡ配列であり得る。適切な修飾は、例えば国際公開第２０１６／０８９４３３号およびＰＣＴ／ＧＢ２０１６／０５３３１２号に記載されている。他の適切な修飾は当業者によく知られている。
「ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ」とは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集組成物に使用することができるエンドヌクレアーゼを意味する。適切な「ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ」には、ｃａｓ９ならびにその変異体および修飾形態が含まれる。したがって、ｇＲＮＡと組み合わせて使用するためのｍＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、好ましくはｃａｓ９をコードするものである。他の「ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ」には、例えば、ｃｐｆ１が含まれる。当業者であれば、ｇＲＮＡが特定の「ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ」と対形成することに気づくだろう。したがって、本発明は、適切なｇＲＮＡ／エンドヌクレアーゼ対形成を使用した組成物を企図する。適切には、ｇＲＮＡが標的遺伝子に特異的であり、好ましくは、標的遺伝子が肝臓疾患に関連する遺伝子である。
別の実施形態において、核酸化合物によって発現されるペプチドまたはタンパク質が治療用タンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり、治療用タンパク質が遺伝病もしくは後天性疾患の処置もしくは予防に有用であるか、または個体の状態を改善する。特に、治療用タンパク質は、数ある機能の中でも、遺伝子欠損を修飾および修復する、がん細胞もしくは病原体感染細胞を破壊する、免疫系障害を処置もしくは防止する、または代謝もしくは内分泌障害を処置もしくは防止することができる新たな治療剤の設計において重要な役割を果たす。
別の実施形態において、核酸化合物によって発現されるペプチドまたはタンパク質が抗原である。本明細書において上でより詳細に定義されるように、抗原は、免疫系によって、好ましくは適応免疫系によって認識されて、例えば抗原特異的免疫応答を誘引し得る化合物または材料である。
一部の実施形態において、活性成分はｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、例えば国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０８６６６号に記載される、低分子干渉ＲＮＡである。これらの分子は、典型的にはワトソン－クリック塩基対形成によって媒介される、互いに塩基対形成することができる、すなわち、互いに本質的に相補的な１５～２５個、好ましくは１８～２３個の間のヌクレオチド対を含む二本鎖ＲＮＡ構造からなる。この二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖は、標的核酸、好ましくはｍＲＮＡと本質的に相補的であり、前記二本鎖ＲＮＡ分子の第２の鎖は、前記標的核酸の伸長と本質的に同一である。ｓｉＲＮＡ分子には、それぞれ各側および各伸長において、必ずしも互いに塩基対形成しなければならないわけではない、いくつかの追加のヌクレオチドが隣接し得る。
一部の実施形態において、活性成分はＲＮＡｉである。ＲＮＡｉはｓｉＲＮＡと本質的に同じ設計を有するが、分子はｓｉＲＮＡと比較して有意に長い。ＲＮＡｉ分子は、典型的にはそれぞれ５０個以上のヌクレオチドおよび塩基対を含む。
一部の実施形態において、活性成分はアンチセンス核酸である。好ましくは本明細書で使用されるアンチセンス核酸は、塩基相補性に基づいて、標的ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡとハイブリダイズし、それによって、ＲＮアーゼＨを活性化するオリゴヌクレオチドである。ＲＮアーゼＨは、ホスホジエステル結合ＤＮＡとホスホチオエート結合ＤＮＡの両方によって活性化される。しかしながら、ホスホジエステル結合ＤＮＡは細胞ヌクレアーゼによって迅速に分解されるが、ホスホチオエート結合ＤＮＡは分解されない。よって、アンチセンスポリヌクレオチドは、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド複合体としてのみ有効である。アンチセンス核酸の好ましい長さは、１６～２３個のヌクレオチドの範囲である。この種のアンチセンスオリゴヌクレオチドについての例は、とりわけ、米国特許第５８４９９０２号および米国特許第５９８９９１２号に記載されている。
一部の実施形態において、活性成分はリボザイムである。リボザイムは、好ましくは、基本的に２つの部分を含むＲＮＡからなる触媒活性核酸である。第１の部分は触媒活性を示し、第２の部分は標的核酸との特異的相互作用を担う。典型的には２つのハイブリダイジング鎖上の塩基の本質的に相補的な伸長のハイブリダイゼーションおよびワトソン－クリック塩基対形成によって、標的核酸とリボザイムの前記部分との間で相互作用すると、触媒活性部分が活性となり得、これはこの部分が、リボザイムの触媒活性がホスホジエステラーゼ活性である場合、標的核酸を分子内または分子間切断することを意味する。リボザイム、その使用および設計原理は当業者に公知であり、例えば、ドハーティ（Ｄｏｈｅｒｔｙ）およびダウドナ（Ｄｏｕｄｎａ）（Ａｎｎｕ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌｓｔｒｕｃ．２０００：３０：４５７－７５）に記載されている。
一部の実施形態において、活性成分はアプタマーである。アプタマーは、一本鎖または二本鎖であり、標的分子と特異的に相互作用するＤ－核酸である。アプタマーの製造または選択は、例えば欧州特許第０５３３８３８号に記載されている。ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチドおよびリボザイムと対照的に、アプタマーは、いずれの標的ｍＲＮＡも分解しないが、タンパク質などの標的化合物の２次構造および３次構造と特異的に相互作用する。標的と相互作用すると、標的は、典型的にはその生物活性の変化を示す。アプタマーの長さは、典型的には最小１５～最大８０ヌクレオチドほどの範囲であり、好ましくは約２０～約５０ヌクレオチドの範囲である。
一部の実施形態において、活性成分はスピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）である。スピーゲルマーは、例えば、国際公開第９８／０８８５６号に記載されている。スピーゲルマーは、アプタマーに類似の分子である。しかしながら、スピーゲルマーは、アプタマーと対照的に、完全にまたはほとんどＤ－ヌクレオチドではなくＬ－ヌクレオチドからなる。その他の点で、特にスピーゲルマーの可能な長さに関しては、アプタマーに関して概説されるのと同じことがスピーゲルマーに当てはまる。
ｍＲＮＡ
好ましい実施形態の１つでは、核酸化合物はｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ化合物である。本発明者らによって見出されたように、本発明による脂質および組成物は、抗原を発現するｍＲＮＡ化合物のインビボ送達に特に適しており、よって、手頃なコストで迅速に開発することができる、高度に有効で、強力で、汎用性が高く、安全なワクチンを可能にする。本発明を行うための目的の具体的な抗原を以下でさらに詳細に記載する。本発明によるｍＲＮＡ化合物は脂質ナノ粒子中にカプセル化されるか、または脂質ナノ粒子と会合している。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に含まれる少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡの利点は：
－ 強力な液性免疫応答の誘導；
－ Ｂ細胞記憶の誘導；
－ 免疫防御のより速い開始；
－ 誘導された免疫応答の長寿命；
－ 広範な細胞性Ｔ細胞応答の誘導；
－ （局所的かつ一過的）炎症促進環境の誘導；
－ 全身性サイトカインまたはケモカイン応答の誘導がない；
－ 優れた忍容性、副作用がない、非毒性；
－ 有利な安定性特徴；
－ 多くの異なる抗原と適合性の製剤：同じ（製造）技術に基づいて実行可能なより大きな抗原カクテル；
－ ベクター免疫がない、すなわち、複数の（異なる）抗原に対して複数回、同じ対象にワクチン接種するために技術を使用することができる；
－ 製造の速度、適合性、簡潔性およびスケーラビリティ；
である。
ある特定の実施形態において、脂質ナノ粒子は、少なくとも
（ｉ）本明細書に定義されるカチオン性脂質および／またはポリマーコンジュゲート脂質；ならびに
（ｉｉ）抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物
を含む。
他の特定の実施形態において、脂質ナノ粒子組成物は、
（ａ）本明細書に記載される式（Ｉ）によるカチオン性脂質；
（ｂ）ステロイド；
（ｃ）中性脂質；
（ｄ）本明細書に記載される式（ＩＩ）による化合物であるポリマーコンジュゲート脂質；および
（ｅ）ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡ化合物
を含む。
カチオン性脂質、ステロイド、中性脂質、ポリマーコンジュゲート脂質、およびペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡ化合物に関して、上記のこれらの特徴に関して記載されているのと同じ選択肢、選好および代替を適用する。例えば、好ましい実施形態の１つでは、ｍＲＮＡ化合物によって発現されるペプチドまたはタンパク質は抗原である。
脂質ナノ粒子中のｍＲＮＡ化合物の量に対するカチオン性脂質の量も重量比（例えば、「ｍ／ｍ」と略される）として表され得る。例えば、脂質ナノ粒子は、約２０～約６０、または約１０～約５０の範囲の脂質対ｍＲＮＡ重量比を達成するような量でｍＲＮＡ化合物を含む。他の実施形態において、質量比は約３０～約５０の範囲にある。他の実施形態において、カチオン性脂質の核酸またはｍＲＮＡに対する比は、約５～約１３、約４～約８または約７～約１１など、約３～約１５である。本発明の非常に好ましい実施形態において、全脂質／ｍＲＮＡ質量比は約４０または４０、すなわち、ｍＲＮＡカプセル化を確保するために約４０または４０倍質量過剰である。別の好ましいＲＮＡ／脂質比は約１～約１０、約２～約５、約２～約４の間、または好ましくは約３である。
さらに、カチオン性脂質の量は、ｍＲＮＡ化合物などの核酸カーゴの量を考慮して選択され得る。一実施形態において、Ｎ／Ｐ比は約１～約５０の範囲にあり得る。別の実施形態において、範囲は約１～約２０、約１～約１０、約１～約５である。１つの好ましい実施形態において、これらの量は、約１０～約２０の範囲の脂質ナノ粒子または組成物のＮ／Ｐ比をもたらすように選択される。さらなる非常に好ましい実施形態において、Ｎ／Ｐは１４（すなわち、ｍＲＮＡカプセル化を確保するために１４倍ｍｏｌ過剰の正の電荷）である。別の非常に好ましい実施形態において、Ｎ／Ｐは１７．５（すなわち、ｍＲＮＡカプセル化を確保するために１７．５倍ｍｏｌ過剰の正の電荷）である。
この文脈において、Ｎ／Ｐ比は、カチオン性脂質の塩基性窒素含有基の窒素原子（「Ｎ」）の、生物活性カーゴとして脂質ナノ粒子内に組み込まれているか、またはこれと会合している核酸のリン酸基（「Ｐ」）に対するモル比として定義される。Ｎ／Ｐ比は、例えば、ＲＮＡが塩基の統計分布を示すという条件で、１μｇのＲＮＡが典型的には約３ｎｍｏｌのリン酸残基を含有するということに基づいて計算され得る。カチオン性脂質またはリピドイドの「Ｎ」値は、その分子量およびカチオン性基の相対含有量に基づいて計算され得る。２つ以上のカチオン性脂質が存在する場合、脂質ナノ粒子に含まれる全てのカチオン性脂質に基づいてＮ値を計算すべきである。
脂質ナノ粒子中のｍＲＮＡの総量は変動し、ｍＲＮＡ対全脂質ｗ／ｗ比に応じて定義され得る。本発明の一実施形態において、ｍＲＮＡ対全脂質比は０．０６ｗ／ｗ未満、好ましくは０．０３～０．０４ｗ／ｗの間である。
好ましくは、ｍＲＮＡ化合物またはそのコード配列は、約５０～約２００００、または１００～約２００００ヌクレオチド、好ましくは約２５０～約２００００ヌクレオチド、より好ましくは約５００～約１００００、さらにより好ましくは約５００～約５０００の長さを有する。
言及されるように、ｍＲＮＡ化合物によって発現されるペプチドまたはタンパク質は抗原であり得る。換言すれば、組成物は、抗原性ペプチドもしくはタンパク質、またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードするｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ化合物を含む。このような抗原、または抗原性ペプチドもしくはタンパク質は、好ましくは本明細書に定義される、病原性抗原、腫瘍抗原、アレルゲン抗原もしくは自己免疫自己抗原、またはその断片もしくはバリアントから誘導され得る。
病原性抗原
病原性抗原は、病原性生物、特に細菌、ウイルス、原生動物学的（多細胞）病原性生物から誘導され、対象、特に哺乳動物対象、さらに特にヒトによる免疫学的反応を引き起こす。より具体的には、病原性抗原は、好ましくはウイルスまたは細菌または原生動物学的生物の表面に位置する表面抗原、例えばタンパク質（またはタンパク質の断片、例えば表面抗原の外部部分）である。
したがって、一部の好ましい実施形態において、人工核酸（ＲＮＡ）分子は、その少なくとも１つのコード領域において、細菌、ウイルス、真菌または原生動物抗原から選択される少なくとも１つの病原性抗原をコードし得る。コードされる（ポリ）ペプチドまたはタンパク質は、病原性抗原またはその断片、バリアントもしくは誘導体からなり得るか、またはこれを含み得る。
病原性抗原は、好ましくは、限定されるものではないが、国際公開第２０１８／０７８０５３号の２１～３５頁に開示される病原体から誘導される抗原の群から選択される感染性疾患に関連する病原体から誘導されるペプチドまたはタンパク質抗原である；国際公開第２０１８／０７８０５３号全体を本願明細書に援用する。さらに、病原性抗原は、好ましくは、限定されるものではないが、国際公開第２０１９／０７７００１号の５７頁３段落～６３頁２段落に開示される病原体から誘導される抗原の群から選択される感染性疾患に関連する病原体から誘導されるペプチドまたはタンパク質抗原である；国際公開第２０１９／０７７００１号全体を本願明細書に援用する。
なおさらなる病原性抗原は、好ましくは、限定されるものではないが、国際公開第２０１３１２０６２８号の３２頁２６行～３４頁２７行に開示される病原体から誘導される抗原の群から選択される病原体から誘導される抗原から選択される感染性疾患に関連する病原体から誘導されるペプチドまたはタンパク質である。さらに、この点で、病原性抗原（感染性疾患に関連する病原体から誘導される抗原）は、好ましくは、限定されるものではないが、国際公開第２０１３１２０６２８号の３４頁２９行～５９頁５行に開示される抗原の群から選択される抗原から誘導される抗原から選択され得る（括弧中は、特定の病原体または抗原が誘導される病原体のファミリーおよび病原体が関連する感染性疾患である）；国際公開第２０１３１２０６２８号全体を本願明細書に援用する。
本発明の組成物に組み込まれるｍＲＮＡ化合物によって発現される好ましい抗原の中には、限定されるものではないが、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏＶ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（Ｌａｓｓａ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、およびマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））からなる群から選択される病原体である。好ましい実施形態の別の１つでは、病原性抗原が、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏＶ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、マラリア原虫、インフルエンザウイルスまたは狂犬病ウイルスから誘導される。
さらに、病原性抗原はさらに好ましくは、限定されるものではないが、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、アナプラズマ属（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、ブラジル鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｅ）、ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、アルカノバクテリウム・ヘモリティクム（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ヒト回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アストロウイルス科（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、バベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バルトネラ・ヘンセレ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ＢＫウイルス、ブラストシスチス・ホミニス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ボレリア属種（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐｐ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）および他のバークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミドフィラ・ニューモニアエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ＣＪＤプリオン、肝吸虫（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コクシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）種、コロナウイルス、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コクシエラ・バーネッティイ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、二核アメーバ（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、エボラウイルス（ＥＢＯＶ－例えば、エンベロープ糖タンパク質）、エキノコックス属（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、エーリキア・エウィンギイ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ）、エーリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロウイルス属（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、エンテロウイルス、主に、コクサッキーＡウイルスおよびエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、エピデルモフィトン属（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）種、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）０１ ５７：Ｈ７、０１ １ １およびＯ１ ０４：Ｈ４、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）および巨大肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ）、ＦＦＩプリオン、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、フィラリア上科（Ｆｉｌａｒｉｏｉｄｅａ）、フラビウイルス、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、顎口虫属（Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ）種、ＧＳＳプリオン、グアナリト（Ｇｕａｎａｒｉｔｏ）ウイルス、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、へニパウイルス（Ｈｅｎｉｐａｖｉｒｕｓ）（ヘンドラウイルス（Ｈｅｎｃｌｒａ ｖｉｒｕｓ）ニパウイルス（Ｎｉｐａｈ ｖｉｒｕｓ））、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒストプラズマ・カプスラツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ホルテア・ウェルネッキ（Ｈｏｒｔａｅａ ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ）、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、フニンウイルス（Ｊｕｎｉｎ ｖｉｒｕｓ）、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、クレブシエラ・グラニュロマティス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、クーループリオン、ラッサウイルス、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、マチュポウイルス（Ｍａｃｈｕｐｏ ｖｉｒｕｓ）、マラセチア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）種、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、横川吸虫（Ｍｅｔａｇｏｎｉｍｕｓ ｙｏｋａｇａｗａｉ）、微胞子虫（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ ｐｈｙｌｕｍ）、伝染性軟属腫ウイルス（Ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ ｖｉｒｕｓ）（ＭＣＶ）、ムンプスウイルス、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）およびマイコバクテリウム・レプロマトーシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、フォーラーネグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ）、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）種、回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、オリエンティア・ツツガムシ（Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（インフルエンザ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、肺吸虫属（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）種、ウェステルマン肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ）、パルボウイルスＢ１９、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、ニューモシスチス・イロベチイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、ポリオウイルス、ライノウイルス、ライノウイルス、リケッチア・アカリ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、ロッキー山紅斑熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ）、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルス（好ましくは、例えばＶＰ８抗原）、風疹ウイルス、サビアウイルス（Ｓａｂｉａ ｖｉｒｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ヒゼンダニ（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ）、ＳＡＲＳコロナウイルス、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、シンノンブル（Ｓｉｎ Ｎｏｍｂｒｅ）ウイルス、ハンタウイルス、スポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、テニア属（Ｔａｅｎｉａ）、有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓｏｌｉｕｍ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、犬回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｎｉｓ）または猫回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｔｉ）、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、トリチネラ・スピラリス（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ）、膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、トリコフィトン属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）種、鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、ブルーストリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、ワクシニアウイルス（好ましくは、例えば免疫回避タンパク質Ｅ３、Ｋ３、もしくはＢ１８）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、バリオラ・メジャー（Ｖａｒｉｏｌａ ｍａｊｏｒ）もしくはバリオラ・マイナー（Ｖａｒｉｏｌａ ｍｉｎｏｒ）、ｖＣＪＤプリオン、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ウエストナイルウイルス、西部馬脳炎ウイルス、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、および仮性結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ジカウイルス、ジカＳＰＨ２０１５－ブラジル、Ｚ１１０６０３３－スリナム、ＭＲ７６６－ウガンダもしくはＮａｔａｌ ＲＧＮ、からなる群から選択される病原体から誘導される抗原またはこれらのタンパク質のいずれかのアイソフォーム、ホモログ、断片、バリアントもしくは誘導体から選択され得る。特に好ましい病原性抗原は、病原体ＳＡＲＳコロナウイルスから誘導される抗原、特にＳＡＲＳコロナウイルスのスパイクタンパク質（Ｓ）である。
さらなる実施形態において、感染症を処置するのに有用な病原性抗原は、以下の抗原から選択され得る（関連する感染症および関連する病原体はそれぞれの抗原の後の括弧内に示される－当然、括弧内の以下の病原体から誘導され得る他の抗原も本発明により誘導および使用され得る）：
・スパイクタンパク質（Ｓ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、膜タンパク質（Ｍ）もしくはヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、またはこれらのいずれかの免疫原性断片もしくはバリアント（感染性疾患は「ＣＯＶＩＤ－１９疾患」である；病原体：ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏＶ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ））；
・スパイクタンパク質（Ｓ）、スパイクＳ１断片（Ｓ１）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、膜タンパク質（Ｍ）またはヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）（感染性疾患はＭＥＲＳ感染症である；病原体：中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳコロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ））；
・複製タンパク質Ｅ１、調節タンパク質Ｅ２、タンパク質Ｅ３、タンパク質Ｅ４、タンパク質Ｅ５、タンパク質Ｅ６、タンパク質Ｅ７、タンパク質Ｅ８、メジャーカプシドタンパク質Ｌ１、マイナーカプシドタンパク質Ｌ２（感染性疾患はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症である；病原体：ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）またはＨＰＶ１６）；
・融合タンパク質Ｆ、ヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｄａｓｅ）ＨＮ、糖タンパク質Ｇ、マトリックスタンパク質Ｍ、リンタンパク質Ｐ、核タンパク質Ｎ、ポリメラーゼＬ、ヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ、融合（Ｆ）糖タンパク質Ｆ０、Ｆ１またはＦ２、組換えＰＩＶ３／ＰＩＶ１融合糖タンパク質（Ｆ）およびヘマグルチニン（ＨＮ）、Ｃタンパク質、リンタンパク質、Ｄタンパク質、マトリックスタンパク質（Ｍ）、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、ウイルスレプリカーゼ（Ｌ）、非構造Ｖタンパク質（感染性疾患はヒトパラインフルエンザウイルス感染症である；病原体：ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ／ＰＩＶ）ｈＰＩＶ－１、ｈＰＩＶ－２、ｈＰＩＶ－３、またはｈＰＩＶ－４血清型、好ましくはｈＰＩＶ－３血清型、好ましくはＰＩＶ－３）；
・融合（Ｆ）糖タンパク質、糖タンパク質Ｇ、リンタンパク質Ｐ、核タンパク質Ｎ、ヌクレオカプシド（Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｎ）タンパク質（感染性疾患：ｈＭＰＶ感染症；病原体：ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ））；
・ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、ＮＳ２タンパク質（ＮＥＰタンパク質：核外輸送タンパク質）、ＰＡタンパク質、ＰＢ１タンパク質（ポリメラーゼ塩基性１タンパク質）、ＰＢ１－Ｆ２タンパク質およびＰＢ２タンパク質、Ｈ１０Ｎ８、Ｈ７Ｎ９、Ｈ１０、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２（Ｘ３１）、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８、ＨＡの抗原性サブドメイン、ＨＡ１、ＨＡ２、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）、非構造タンパク質２（ＮＳ２）、ＨＡ７抗原、Ｈ７またはＨ１０およびＢ、病原体：オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、インフルエンザウイルス（インフル））；
・核タンパク質Ｎ、大型構造タンパク質Ｌ、リンタンパク質Ｐ、マトリックスタンパク質Ｍ、糖タンパク質Ｇ、Ｇタンパク質（感染性疾患は狂犬病である；病原体：狂犬病ウイルス）；
・ＨＩＶｐ２４抗原、ＨＩＶエンベロープタンパク質（Ｇｐ１２０、Ｇｐ４１、Ｇｐ１６０）、ポリタンパク質ＧＡＧ、ネガティブ因子タンパク質Ｎｅｆ、転写のトランス活性化因子Ｔａｔ、Ｂｒｅｃ１（感染性疾患ＨＩＶ；病原体：ヒト免疫不全ウイルス）；
・主要外膜タンパク質ＭＯＭＰ、可能性が高い外膜タンパク質ＰＭＰＣ、外膜複合タンパク質Ｂ ＯｍｃＢ、ヒートショックタンパク質Ｈｓｐ６０ ＨＳＰ１０、タンパク質ＩｎｃＡ、ＩＩＩ型分泌系のタンパク質、リボヌクレオチドレダクターゼ小型鎖タンパク質ＮｒｄＢ、プラスミドタンパク質Ｐｇｐ３、クラミジア外側タンパク質Ｎ ＣｏｐＮ、抗原ＣＴ５２１、抗原ＣＴ４２５、抗原ＣＴ０４３、抗原ＴＣ００５２、抗原ＴＣ０１８９、抗原ＴＣ０５８２、抗原ＴＣ０６６０、抗原ＴＣ０７２６、抗原ＴＣ０８１６、抗原ＴＣ０８２８（感染性疾患：トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）による感染症；病原体：トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）；
・ｐｐ６５抗原、膜タンパク質ｐｐ１５、カプシド近位外被タンパク質ｐｐ１５０、タンパク質Ｍ４５、ＤＮＡポリメラーゼＵＬ５４、ヘリカーゼＵＬ１０５、糖タンパク質ｇＭ、糖タンパク質ｇＮ、糖タンパク質Ｈ、糖タンパク質Ｂ ｇＢ、タンパク質ＵＬ８３、タンパク質ＵＬ９４、タンパク質ＵＬ９９、ｇＨ ｇＬ、ｇＢ、ｇＯ、ｇＮ、およびｇＭから選択されるＨＣＭＶ糖タンパク質、ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａから選択されるＨＣＭＶタンパク質、外被タンパク質ｐｐ１５０（ｐｐ１５０）、外被タンパク質ｐｐ６５／下部マトリックスリンタンパク質（ｐｐ６５）、エンベロープ糖タンパク質Ｍ（ＵＬ１００）、調節タンパク質ＩＥ１（ＵＬ１２３）、エンベロープタンパク質（ＵＬ１２８）、エンベロープ糖タンパク質（１３０）、エンベロープタンパク質（ＵＬ１３１Ａ）、エンベロープ糖タンパク質Ｂ（ＵＬ５５）、構造糖タンパク質Ｎ ｇｐＵＬ７３（ＵＬ７３）、構造糖タンパク質Ｏ ｇｐＵＬ７４（ＵＬ７４）（感染性疾患はサイトメガロウイルス感染症である；病原体：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ／ＨＣＭＶ））；
・カプシドタンパク質Ｃ、膜前駆体タンパク質ｐｒＭ、膜タンパク質Ｍ、エンベロープタンパク質Ｅ（ドメインＩ、ドメインＩＩ、ドメインＩＩ）、タンパク質ＮＳ１、タンパク質ＮＳ２Ａ、タンパク質ＮＳ２Ｂ、タンパク質ＮＳ３、タンパク質ＮＳ４Ａ、タンパク質２Ｋ、タンパク質ＮＳ４Ｂ、タンパク質ＮＳ５（感染性疾患デング熱；病原体：デング熱ウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４））；
・ＥＢＯＶ糖タンパク質（ＧＰ）、表面ＥＢＯＶ ＧＰ、野生型ＥＢＯＶ プロＧＰ、成熟ＥＢＯＶ ＧＰ、分泌野生型ＥＢＯＶ プロＧＰ、分泌成熟ＥＢＯＶ ＧＰ、ＥＢＯＶ核タンパク質（ＮＰ）、ＲＮＡポリメラーゼＬ、ならびにＶＰ３５、ＶＰ４０、ＶＰ２４、およびＶＰ３０から選択されるＥＢＯＶマトリックスタンパク質（感染性疾患：エボラ；病原体：エボラウイルス）；
・Ｂ型肝炎表面抗原ＨＢｓＡｇ、Ｂ型肝炎コア抗原ＨｂｃＡｇ、ポリメラーゼ、タンパク質Ｈｂｘ、プレＳ２、中央表面タンパク質、表面タンパク質Ｌ、大型Ｓタンパク質、ウイルスタンパク質ＶＰ１、ウイルスタンパク質ＶＰ２、ウイルスタンパク質ＶＰ３、ウイルスタンパク質ＶＰ４（感染性疾患はＢ型肝炎である；病原体：Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））；
・融合タンパク質Ｆ、Ｆタンパク質、核タンパク質Ｎ、マトリックスタンパク質Ｍ、マトリックスタンパク質Ｍ２－１、マトリックスタンパク質Ｍ２－２、リンタンパク質Ｐ、小型疎水性タンパク質ＳＨ、主要表面糖タンパク質Ｇ、ポリメラーゼＬ、非構造タンパク質１ ＮＳ１、非構造タンパク質２ ＮＳ２、ＲＳＶ付着タンパク質（Ｇ）（糖タンパク質Ｇ）、融合（Ｆ）糖タンパク質（糖タンパク質Ｆ）、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、大型ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）、マトリックスタンパク質（Ｍ、Ｍ２）、小型疎水性タンパク質（ＳＨ）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）、非構造タンパク質２（ＮＳ２）、膜結合ＲＳＶ Ｆタンパク質、膜結合ＤＳ－Ｃａｖｌ（安定化前融合ＲＳＶ Ｆタンパク質）（感染性疾患は呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）による感染症である：病原体：呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ））；
・分泌抗原ＳｓｓＡ（スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌食中毒）；分泌抗原ＳｓｓＡ（スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、例えば黄色ブドウ球菌、ブドウ球菌感染症）；分子シャペロンＤｎａＫ、細胞表面リポタンパク質Ｍｐｔ８３、リポタンパク質Ｐ２３、リン酸輸送系パーミアーゼタンパク質ｐｓｔＡ、１４ｋＤａ抗原、フィブロネクチン結合タンパク質Ｃ ＦｂｐＣ１、アラニンデヒドロゲナーゼＴＢ４３、グルタミン合成酵素１、ＥＳＸ－１タンパク質、タンパク質ＣＦＰ１０、ＴＢ１０．４タンパク質、タンパク質ＭＰＴ８３、タンパク質ＭＴＢ１２、タンパク質ＭＴＢ８、Ｒｐｆ様タンパク質、タンパク質ＭＴＢ３２、タンパク質ＭＴＢ３９、クリスタリン、ヒートショックタンパク質ＨＳＰ６５、タンパク質ＰＳＴ－Ｓ（感染性疾患は結核である；病原体：結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））：
・ゲノムポリタンパク質、タンパク質Ｅ、タンパク質Ｍ、カプシドタンパク質Ｃ、プロテアーゼＮＳ３、タンパク質ＮＳ１、タンパク質ＮＳ２Ａ、タンパク質ＡＳ２Ｂ、タンパク質ＮＳ４Ａ、タンパク質ＮＳ４Ｂ、タンパク質ＮＳ５（感染性疾患は黄熱病である；病原体：黄熱病ウイルス））；
・スポロゾイト表面タンパク質（ＣＳＰ）（感染性疾患はマラリアである；病原体：熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）および三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ））；および
・国際公開第２０１７／１４０９０５号によるジカウイルスタンパク質、すなわち、ジカウイルスカプシドタンパク質（Ｃ）、ジカウイルス膜前駆体タンパク質（ｐｒＭ）、ジカウイルスｐｒタンパク質（ｐｒ）、ジカウイルス膜タンパク質（Ｍ）、ジカウイルスエンベロープタンパク質（Ｅ）、ジカウイルス非構造タンパク質、ＺＩＫＶ ｐｒＭＥ抗原、ＺＩＫＶカプシドタンパク質、膜前駆体／膜タンパク質、ＺＩＫＶエンベロープタンパク質、ＺＩＫＶ非構造タンパク質１、ＺＩＫＶ非構造タンパク質２Ａ、ＺＩＫＶ非構造タンパク質２Ｂ、ＺＩＫＶ非構造タンパク質３、ＺＩＫＶ非構造タンパク質４Ａ、ＺＩＫＶ非構造タンパク質４Ｂ、ＺＩＫＶ非構造タンパク質５、またはジカウイルスエンベロープタンパク質（Ｅ）（ドメインＩＩの融合ループが国際公開第２０１７／１４０９０５号により変異している）；国際公開第２０１７／１４０９０５号全体を本願明細書に援用する（感染性疾患はジカウイルス感染症である；病原体：ジカウイルス）。
本発明の一部の実施形態において、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量の本明細書で提供されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンのいずれかを対象に投与する工程を含む、対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法についての開示が提供される。
一部の実施形態において、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏＶ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、およびマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））である。好ましい実施形態の別の１つでは、病原性抗原は、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏＶ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、マラリア原虫、インフルエンザウイルスまたは狂犬病ウイルスワクチンから誘導される。他の実施形態において、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンはＣＯＶＩＤ－１９、狂犬病、インフルエンザまたはマラリアワクチンである。
一部の実施形態において、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、インフルエンザワクチンの組合せを含む混合ワクチン（広範囲インフルエンザワクチン）である。一部の実施形態において、抗原特異的免疫応答はＴ細胞応答またはＢ細胞応答を含む。
一部の実施形態において、抗原特異的免疫応答をもたらす方法は、単回投与（すなわち、ブースタ投与なし）のＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏＶ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、およびマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））を対象に投与する工程を含む。好ましい実施形態の別の１つでは、病原性抗原は、本開示のＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏＶ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、マラリア原虫、インフルエンザウイルスまたは狂犬病ウイルス（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンから誘導される。
一部の実施形態において、方法は、第２の（ブースタ）投与のＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏＶ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、およびマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））を対象に投与する工程をさらに含む。好ましい実施形態の別の１つでは、病原性抗原は、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏＶ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、マラリア原虫、インフルエンザウイルスまたは狂犬病ウイルスＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンから誘導される。
一部の実施形態において、対象は、ワクチンの第１の投与または第２の（ブースタ）投与後に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％）の抗体陽転率を示す。抗体陽転は、特異的抗体が発達し、血液中で検出可能になる期間である。抗体陽転が起こった後、ウイルスを抗体についての血液検査で検出することができる。感染または免疫化中、抗原は血液に侵入し、免疫系が応答して抗体を産生し始める。抗体陽転前は、抗原自体は検出可能な場合と検出可能でない場合があるが、抗体は存在しないと考えられる。抗体陽転中は、抗体は存在するが、まだ検出可能ではない。抗体陽転後はいつでも、抗体を血液中で検出することができ、以前または現在の感染を示す。一部の実施形態において、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、皮内注射、筋肉内注射、または鼻腔内投与によって対象に投与される。一部の実施形態において、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは筋肉内注射によって対象に投与される。
本開示の一部の実施形態は、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏＶ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、およびマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））を対象に投与する工程を含む、対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法を提供する。好ましい実施形態の別の１つでは、病原性抗原が、対象において抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量のＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏＶ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、マラリア原虫、インフルエンザウイルスまたは狂犬病ウイルスＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンから誘導される。
対象における抗原特異的免疫応答は、一部の実施形態において、本開示のＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏＶ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、またはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンのいずれかの対象への投与後に、抗体価（ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏＶ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、またはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））抗原性ポリペプチドに結合する抗体の力価）をアッセイすることによって決定され得る。一部の実施形態において、対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体価は、対照に対して少なくとも１ｌｏｇ増加する。一部の実施形態において、対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体価は、対照に対して１～３ｌｏｇ増加する。
腫瘍抗原
さらに好ましい実施形態において、ｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ化合物は、好ましくは本明細書に定義される腫瘍抗原、またはその断片もしくはバリアントをコードし、腫瘍抗原は、好ましくは、限定されるものではないが、国際公開第２０１８／０７８０５３号の４５～５１頁に開示される腫瘍抗原からなる群から選択される；国際公開第２０１８／０７８０５３号全体を本願明細書に援用する。
さらに、本発明に、例えばがん処置に有用な、腫瘍またはがん発達に関連するタンパク質に対して向けられた、サイトカイン、ケモカイン、自殺酵素および遺伝子産物、アポトーシス誘導因子、内因性血管新生阻害剤、ヒートショックタンパク質、腫瘍抗原、自然免疫活性化因子、抗体は、限定されるものではないが、国際公開第２０１６／１７０１７６号の表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表８、表１０、表１１および表１２に開示される、腫瘍またはがん発達に関連するタンパク質に対して向けられたサイトカイン、ケモカイン、自殺酵素および遺伝子産物、アポトーシス誘導因子、内因性血管新生阻害剤、ヒートショックタンパク質、腫瘍抗原、自然免疫活性化因子、抗体の群から選択される；国際公開第２０１６／１７０１７６号および特に表１～１２全体を本願明細書に援用する。
遺伝病または後天性疾患を処置または予防するための治療用タンパク質および使用
さらなる実施形態において、活性成分は少なくとも１つのコード配列を含む核酸化合物であり、少なくとも１つのコード配列がペプチドまたはタンパク質をコードし、タンパク質が治療用タンパク質、または治療用タンパク質の断片もしくはバリアントである。この文脈において、治療用ペプチド、タンパク質またはその断片は、動物などの対象、特にヒト対象における疾患または状態の防止、管理、改善、処置または治療に有用な任意のペプチド性化合物であり得る。
実際、一実施形態において、少なくとも１つのコード配列を含むｍＲＮＡは、
（ａ）ペプチドまたはタンパク質が抗原であり、抗原が、好ましくは、病原性抗原、腫瘍抗原、アレルゲン抗原もしくは自己免疫自己抗原、またはその断片もしくはバリアントから誘導される、ペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくはバリアント；あるいは
（ｂ）治療用タンパク質、またはその断片もしくはバリアント
をコードし得る。治療用タンパク質は、例えば、
（ｉ）代謝、内分泌もしくはアミノ酸障害を処置するための酵素補充療法に使用するため、または非存在、欠損もしくは変異タンパク質の置換に使用するための治療用タンパク質；
（ｉｉ）血液障害、循環系の疾患、呼吸器系の疾患、感染性疾患または免疫不全の処置に使用するための治療用タンパク質；
（ｉｉｉ）がんまたは腫瘍疾患の処置に使用するための治療用タンパク質；
（ｉｖ）ホルモン補充療法に使用するための治療用タンパク質；
（ｖ）体細胞を多能性または全能性幹細胞に再プログラミングするのに使用するための治療用タンパク質；
（ｖｉ）アジュバントまたは免疫賦活として使用するための治療用タンパク質；
（ｖｉｉ）治療用抗体である治療用タンパク質；
（ｖｉｉｉ）遺伝子編集剤である治療用タンパク質；および
（ｉｘ）肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患の処置または防止に使用するための治療用タンパク質
からなる群から選択され得る。
具体的な実施形態において、治療用タンパク質、またはその断片もしくはバリアントは、
酸性スフィンゴミエリナーゼ、アディポチド（Ａｄｉｐｏｔｉｄｅ）、アガルシダーゼ－ベータ、アルグルコシダーゼ、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、アルファ－グルコシダーゼ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、アンフィレギュリン、アンジオポエチン（Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３、Ａｎｇ４、ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ５、ＡＮＧＰＴＬ６、ＡＮＧＰＴＬ７）、ＡＴＰアーゼ、Ｃｕ（２＋）輸送ベータポリペプチド（ＡＴＰ７Ｂ）、アルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）、ベータセルリン、ベータ－グルクロニダーゼ、骨形成タンパク質ＢＭＰ（ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５）、ＣＬＮ６タンパク質、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エピジェン、エピレギュリン、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、ＦＧＦ－１、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－３、ＦＧＦ－４、ＦＧＦ－５、ＦＧＦ－６、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－８、ＦＧＦ－９、ＦＧＦ－１０、ＦＧＦ－１１、ＦＧＦ－１２、ＦＧＦ－１３、ＦＧＦ－１４、ＦＧＦ－１６、ＦＧＦ－１７、ＦＧＦ－１７、ＦＧＦ－１８、ＦＧＦ－１９、ＦＧＦ－２０、ＦＧＦ－２１、ＦＧＦ－２２、ＦＧＦ－２３）、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（ＦＡＨ）、ガルスルファーゼ、グレリン、グルコセレブロシダーゼ、ＧＭ－ＣＳＦ、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ－ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子ＨＧＦ、ヘプシジン（Ｈｅｐｃｉｄｉｎ）、ヒトアルブミン、アルブミンの喪失増加、イデュルスルファーゼ（イズロン酸－２－スルファターゼ）、インテグリンαＶβ３、αＶβ５およびα５β１、イズロン酸スルファターゼ、ラロニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ（ｒｈＡＳＢ；ガルスルファーゼ、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ））、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ、神経成長因子（ＮＧＦ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、およびニューロトロフィン４／５（ＮＴ－４／５）、ニューレグリン（ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧ４）、ニューロピリン（ＮＲＰ－１、ＮＲＰ－２）、オベスタチン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ（ＰＤＦＦ－Ａ、ＰＤＧＦ－Ｂ、ＰＤＧＦ－Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｄ）、ＴＧＦベータ受容体（エンドグリン、ＴＧＦ－ベータ１受容体、ＴＧＦ－ベータ２受容体、ＴＧＦ－ベータ３受容体）、トロンボポエチン（ＴＨＰＯ）（巨核球増殖分化因子（ＭＧＤＦ））、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ（ＴＧＦ－ａ、ＴＧＦ－ベータ（ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、およびＴＧＦベータ３）））、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＶＥＧＦ－ＦおよびＰＩＧＦ）、ネシリチド、トリプシン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、コレシストキニン、ガストリン、レプチン、オキシトシン、ソマトスタチン、バソプレシン（抗利尿ホルモン）、カルシトニン、エキセナチド、成長ホルモン（ＧＨ）、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様成長因子１ ＩＧＦ－１、メカセルミンリンファベート（Ｍｅｃａｓｅｒｍｉｎ ｒｉｎｆａｂａｔｅ）、ＩＧＦ－１類似体、メカセルミン、ＩＧＦ－１類似体、ペグビソマント、プラムリンチド、テリパラチド（ヒト副甲状腺ホルモン残基１～３４）、ベカプレルミン、ジボテルミン－アルファ（骨形成タンパク質２）、ヒストレリン酢酸塩（性腺刺激ホルモン放出ホルモン；ＧｎＲＨ）、オクトレオチド、肝細胞核因子４アルファ（ＨＮＦ４Ａ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ（ＣＥＢＰＡ）、線維芽細胞増殖因子２１（ＥＧＦ２１）、細胞外マトリックスプロテアーゼまたはヒトコラゲナーゼＭＭＰ１、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、オピオイド成長因子受容体様１（ＯＧＦＲＬ１）、クロストリジウムＩＩ型コラゲナーゼ、リラキシン１（ＲＬＮ１）、リラキシン２（ＲＬＮ２）、リラキシン３（ＲＬＮ３）およびパリフェルミン（ケラチノサイト増殖因子、ＫＧＦ）を含む、代謝、内分泌もしくはアミノ酸障害を処置するための酵素補充療法に使用するため、または非存在、欠損もしくは変異タンパク質の置換に使用するための治療用タンパク質；
アルテプラーゼ（組織プラスミノーゲン活性化因子；ｔＰＡ）、アニストレプラーゼ、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ－ＩＩＩ）、ビバリルジン、ダルベポエチン－アルファ、ドロトレコギン－アルファ（活性化タンパク質Ｃ、エリスロポエチン、エポエチン－アルファ、エリスロポエチン、エリスロポエチン、第ＩＸ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、レピルジン、プロテインＣ濃縮物、レテプラーゼ（ｔＰＡの欠失変異タンパク質）、ストレプトキナーゼ、テネクテプラーゼ、ウロキナーゼ、アンジオスタチン、抗ＣＤ２２免疫毒素、デニロイキンジフチトクス、イムノシアニン、ＭＰＳ（メタロパンスチムリン（Ｍｅｔａｌｌｏｐａｎｓｔｉｍｕｌｉｎ））、アフリベルセプト、エンドスタチン、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ドルナーゼ、ヒアルロニダーゼ、パパイン、Ｌ－アスパラギナーゼ、ペグ－アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）、ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ルトロピン－アルファ、プロラクチン、アルファ－１－プロテイナーゼ阻害剤、ラクターゼ、膵酵素（リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ）、アデノシンデアミナーゼ（ペガデマーゼ・ウシ薬（Ｐｅｇａｄｅｍａｓｅ ｂｏｖｉｎｅ）、ＰＥＧ－ＡＤＡ）、アバタセプト、アレファセプト、アナキンラ、エタネルセプト、インターロイキン－１（ＩＬ－１）受容体アンタゴニスト、アナキンラ、チムリン、ＴＮＦ－アルファアンタゴニスト、エンフビルチド、およびチモシンα１を含む、血液障害、循環系の疾患、呼吸器系の疾患、がんもしくは腫瘍疾患、感染性疾患または免疫不全の処置に使用するための治療用タンパク質；
サイトカイン、ケモカイン、自殺遺伝子産物、免疫原性タンパク質またはペプチド、アポトーシス誘導因子、血管新生阻害剤、ヒートショックタンパク質、腫瘍抗原、ベータ－カテニン阻害剤、ＳＴＩＮＧ経路の活性化因子、チェックポイントモジュレータ、自然免疫活性化因子、抗体、ドミナントネガティブ受容体およびデコイ受容体、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の阻害剤、ＩＤＯ経路阻害剤、およびアポトーシスの阻害剤に結合するタンパク質またはペプチドを含む、がんまたは腫瘍疾患の処置に使用するための治療用タンパク質；
ヒトアジュバントタンパク質、特にパターン認識受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１；ＮＯＤ１、ＮＯＤ２、ＮＯＤ３、ＮＯＤ４、ＮＯＤ５、ＮＡＬＰ１、ＮＡＬＰ２、ＮＡＬＰ３、ＮＡＬＰ４、ＮＡＬＰ５、ＮＡＬＰ６、ＮＡＬＰ６、ＮＡＬＰ７、ＮＡＬＰ７、ＮＡＬＰ８、ＮＡＬＰ９、ＮＡＬＰ１０、ＮＡＬＰ１１、ＮＡＬＰ１２、ＮＡＬＰ１３、ＮＡＬＰ１４、ｌ ＩＰＡＦ、ＮＡＩＰ、ＣＩＩＴＡ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５およびＬＧＰ２、例えばＴｒｉｆおよびＣａｒｄｉｆを含むアダプタータンパク質を含むＴＬＲシグナル伝達のシグナル伝達因子；低分子量ＧＴＰアーゼシグナル伝達の成分（ＲｈｏＡ、Ｒａｓ、Ｒａｃ１、Ｃｄｃ４２、Ｒａｂ等）、ＰＩＰシグナル伝達の成分（ＰＩ３Ｋ、Ｓｒｃキナーゼ等）、ＭｙＤ８８依存性シグナル伝達の成分（ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４、ＴＩＲＡＰ、ＴＲＡＦ６等）、ＭｙＤ８８非依存性シグナル伝達の成分（ＴＩＣＡＭ１、ＴＩＣＡＭ２、ＴＲＡＦ６、ＴＢＫ１、ＩＲＦ３、ＴＡＫ１、ＩＲＡＫ１等）；例えばＡｋｔ、ＭＥＫＫ１、ＭＫＫ１、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＧＳＫ３、ＰＫＣキナーゼ、ＰＫＤキナーゼ、ＧＳＫ３キナーゼ、ＪＮＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＴＡＫ１、ＩＫＫ、およびＴＡＫ１を含む活性化キナーゼ；例えばＮＦ－ｋＢ、ｃ－Ｆｏｓ、ｃ－Ｊｕｎ、ｃ－Ｍｙｃ、ＣＲＥＢ、ＡＰ－１、Ｅｌｋ－１、ＡＴＦ２、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７を含む活性化転写因子、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７５およびＨＳＰ９０などのヒートショックタンパク質、ｇｐ９６、フィブリノーゲン、フィブリノーゲンのＴｙｐＩＩＩ反復エクストラドメインＡ；またはＣ１ｑ、ＭＢＬ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２ｂ、Ｂｂ、Ｄ、ＭＡＳＰ－１、ＭＡＳＰ－２、Ｃ４ｂ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３、ＣＲ４、Ｃ１ｑＲ、Ｃ１ＩＮＨ、Ｃ４ｂｐ、ＭＣＰ、ＤＡＦ、Ｈ、Ｉ、ＰおよびＣＤ５９を含む補体系の成分、または例えばベータ－ディフェンシン、細胞表面タンパク質を含む誘導標的遺伝子；またはｔｒｉｆ、ｆｌｔ－３リガンド、Ｇｐ９６もしくはフィブロネクチンを含むヒトアジュバントタンパク質、ＩＬ－１アルファ、ＩＬ１ベータ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＮＦアルファ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦを含む、自然免疫応答を誘導もしくは増強するサイトカイン；ＩＬ－８、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１アルファ、ＲＡＮＴＥＳ、エオタキシン、ＣＣＬ２１を含むケモカイン；ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２およびＴＮＦ－アルファ；ならびにＩＬ－１Ｒ１およびＩＬ－１アルファを含む、マクロファージから放出されるサイトカインを含む、アジュバントまたは免疫賦活タンパク質から選択される治療用タンパク質；
Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１００を含むヒートショックタンパク質またはシャペロン；グラム陰性菌由来のＯｍｐＡ（外膜タンパク質）；ＯｓｐＡ；ＯｍｐＦを含む細菌ポリン；百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）由来の百日咳毒素（ＰＴ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）由来の百日咳アデニル酸シクラーゼ毒素ＣｙａＡおよびＣｙａＣ、百日咳毒素のＰＴ－９Ｋ／１２９Ｇ変異体、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）由来の百日咳アデニル酸シクラーゼ毒素ＣｙａＡおよびＣｙａＣ、破傷風毒素、コレラ毒素（ＣＴ）、コレラ毒素Ｂサブユニット、コレラ毒素のＣＴＫ６３変異体、ＣＴのＣＴＥ１１２Ｋ変異体、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）、易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＬＴＢ） ＬＴＫ６３、ＬＴＲ７２を含む毒性が減少した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシン変異体；フェノール可溶性モジュリン；ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）由来の好中球活性化タンパク質（ＨＰ－ＮＡＰ）を含む細菌毒素；サーファクタントタンパク質Ｄ；ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）由来の外表面タンパク質Ａリポタンパク質、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＡｇ３８（３８ｋＤａ抗原）；細菌線毛由来のタンパク質；コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）のエンテロトキシンＣＴ、グラム陰性菌の線毛由来のピリン、およびサーファクタントタンパク質Ａおよび細菌フラジェリンを含む細菌（アジュバント）タンパク質；
クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）由来のＴｃ５２、トリパノソーマ・ゴンディ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｇｏｎｄｉｉ）由来のＰＦＴＧ、原生動物ヒートショックタンパク質、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種由来のＬｅＩＦ、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）由来のプロファイリング様タンパク質を含む、原生動物（アジュバント）タンパク質；
呼吸器合胞体ウイルス融合糖タンパク質（Ｆタンパク質）、ＭＭＴウイルス由来のエンベロープタンパク質、マウス白血病ウイルスタンパク質、野生型麻疹ウイルスのヘマグルチニンタンパク質を含む、ウイルス（アジュバント）タンパク質；
真菌免疫調節タンパク質（ＦＩＰ；ＬＺ－８）を含む、真菌（アジュバント）タンパク質；
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を含む、動物由来タンパク質；
ホルモンがエストロゲン、プロゲステロンまたはプロゲスチン、およびテストステロンを含む、ホルモン補充療法に使用するための治療用タンパク質；ならびに
Ｏｃｔ－３／４、Ｓｏｘ遺伝子ファミリー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、およびＳｏｘ１５）、Ｋｌｆファミリー（Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃ、およびＮ－ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、およびＬＩＮ２８を含む、体細胞を多能性または全能性幹細胞に再プログラミングするために使用される治療用タンパク質
から選択される。
本発明は、本明細書に記載される組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、対象における疾患または状態を防止、改善または処置する方法を含む。本発明の組成物は、ヒトまたは動物の体の処置に使用され得る。
この文脈において、とりわけ代謝または内分泌障害の処置に使用することができる特に好ましい治療用タンパク質は、国際公開第２０１７／１９１２７４号の表Ａ（表Ｃと組み合わせた）に開示されるものから選択される。さらに、好ましくは感染性疾患、新生物（例えば、がんまたは腫瘍疾患）、血液および造血器官の疾患、内分泌、栄養および代謝疾患、神経系の疾患、循環系の疾患、呼吸器系の疾患、消化器系の疾患、皮膚および皮下組織の疾患、筋骨格系および結合組織の疾患、ならびに泌尿生殖器系の疾患から選択される、好ましくは本発明の組成物で処置することができる疾患は、国際公開第２０１７／１９１２７４号の９５頁４行～１０３頁２４行に開示されている。とりわけ代謝または内分泌障害の処置に使用することができるさらに特に好ましい治療用タンパク質は、本願明細書に援用する、具体的な標的／疾患組合せ、および配列についても言及している、国際公開第２０１７／１９１２７４号の表１に開示されている。表Ａ／Ｃおよび表１を含む国際公開第２０１７／１９１２７４号全体を本願明細書に援用する。
好ましい実施形態において、人工核酸（ＲＮＡ）分子、（医薬）組成物またはワクチンまたはキットが感染性疾患の処置または予防に使用される。「感染症」または「感染性疾患」という用語は、通常は体内に存在しない細菌、ウイルス、および寄生生物などの微生物の侵入および増殖に関する。感染症は症状を引き起こさず、亜臨床的であり得るか、または症状を引き起こし、臨床的に明らかであり得る。感染症は局所にとどまったままであり得るか、または血液もしくはリンパ系を通して広がって全身性となり得る。この文脈における感染性疾患は、好ましくはウイルス、細菌、真菌または原生動物学的感染性疾患を含む。特に、感染性疾患は、国際公開第２０１９／０７７００１号の１５７頁で始まる「感染性疾患」の節（１６０頁で終わる）に開示される群から選択される；国際公開第２０１９／０７７００１号全体を本願明細書に援用する。
この文脈において、本発明の組成物またはそれぞれ本発明の翻訳可能な分子を処置に使用することができる疾患および／または状態についてのさらに特に好ましい例は、米国特許出願公開第２０１９／０００２９０６号の表２に開示されている；表２を含む米国特許出願公開第２０１９／０００２９０６号全体を本願明細書に援用する。
動物、さらに特にヒトにおける肝臓疾患または肝臓関連疾患には、限定されるものではないが、先天性疾患または後天性疾患、例えばウイルスおよび寄生生物感染性疾患、原発腫瘍および転移などの腫瘍学的病態、代謝、アミノ酸および／または内分泌障害ならびに炎症性および免疫および自己免疫状態が含まれ得る。好ましくは本発明の組成物で処置され得る肝臓疾患は、限定されるものではないが、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、肝炎、Ａ型肝炎、硬変、肝臓がん、肝細胞癌、肝性脳症、自己免疫肝炎、ウィルソン病、アルファ－１アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴ欠損症）、Ｄ型肝炎、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、ウィルソン病（肝レンズ核変性症）、チロシン血症Ｉ型（ＦＡＨ欠損症）、アラジール症候群、門脈圧亢進、脂肪性肝炎、慢性肝炎およびＥ型肝炎からなる群から選択される。
さらに好ましい実施形態において、本発明の組成物は、好ましくは肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される、肝臓疾患である障害を処置または防止する方法に使用され得る。したがって、少なくとも１つのコード配列を含むｍＲＮＡは、肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患の処置または防止に使用するための治療用タンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードし得る。さらに、好ましくは、肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患を処置または防止するためのｍＲＮＡは、核因子４アルファ（ＨＮＦ４Ａ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ（ＣＥＢＰＡ）、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）、細胞外マトリックスプロテアーゼまたはヒトコラゲナーゼＭＭＰ１、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、オピオイド成長因子受容体様１（ＯＧＦＲＬ１）、クロストリジウムＩＩ型コラゲナーゼ、リラキシン１（ＲＬＮ１）、リラキシン２（ＲＬＮ２）およびリラキシン３（ＲＬＮ３）からなる群から選択されるペプチドまたはタンパク質をコードする。この点で、国際公開第２０１８／１０４５３８号の肝臓疾患の具体的な開示ならびに国際公開第２０１８／１０４５３８号に開示される配列を本願明細書に援用する。
他の抗原
本発明に有用なさらなる抗原は、国際公開第２０１８／０７８０５３号の４８～５１頁に列挙される；国際公開第２０１８／０７８０５３号全体を本願明細書に援用する。
アレルゲン抗原および自己免疫自己抗原
言及されるように、本発明の組成物に含まれるｍＲＮＡ化合物は、一部の実施形態によると、アレルゲン、またはアレルゲン抗原、または自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）もしくは自己免疫抗原とも呼ばれる自己抗原を表す抗原をコードし得る。
アレルギーまたはアレルギー性疾患に関連するこのような抗原および自己抗原（アレルゲンまたはアレルゲン抗原）は、限定されるものではないが、国際公開第２０１８／０７８０５３号の５９～７３頁に開示される抗原の群から誘導されるか、または好ましくは選択される；国際公開第２０１８／０７８０５３号全体を本願明細書に援用する。
チェックポイントモジュレータ／チェックポイント阻害剤
本発明の文脈において、免疫チェックポイントタンパク質、チェックポイントモジュレータまたはチェックポイント阻害剤は、典型的には免疫チェックポイントタンパク質の機能を調節する、タンパク質（例えば、抗体）、ドミナントネガティブ受容体、デコイ受容体、またはそのリガンドもしくは断片もしくはバリアントなどの分子である、例えば、チェックポイント阻害剤（もしくは抑制性チェックポイント分子）の活性を阻害するか、もしくは低下させるか、またはチェックポイント刺激剤（もしくは刺激性チェックポイント分子）の活性を刺激するか、もしくは増強する。したがって、本明細書に定義されるチェックポイントモジュレータは、チェックポイント分子の活性に影響を及ぼす。この文脈において、抑制性チェックポイント分子はチェックポイント阻害剤として定義され、同義的に使用され得る。さらに、刺激性チェックポイント分子はチェックポイント刺激剤として定義され、同義的に使用され得る。
さらに好ましい実施形態において、ｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ化合物は、好ましくは本明細書に定義される、免疫チェックポイントタンパク質、チェックポイントモジュレータもしくはチェックポイント阻害剤、またはその断片もしくはバリアントをコードし、免疫チェックポイントタンパク質、チェックポイントモジュレータまたはチェックポイント阻害剤は、好ましくは、限定されるものではないが、国際公開第２０１８／０７８０５３号の５１～５６頁に開示される免疫チェックポイントタンパク質、チェックポイントモジュレータまたはチェックポイント阻害剤からなる群から選択される；国際公開第２０１８／０７８０５３号全体を本願明細書に援用する。
ＲＮＡエレメント、ｍＲＮＡエレメント
本発明のある特定の実施形態によると、ｍＲＮＡ配列は、好ましくは本明細書に定義されるように、モノ、バイ、またはマルチシストロン性である。バイまたはマルチシストロン性ｍＲＮＡのコード配列は、好ましくは本明細書に定義される別個のペプチドもしくはタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする。好ましくは、２つ以上のペプチドまたはタンパク質をコードするコード配列は、以下に定義される、少なくとも１つのＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）配列によって、バイまたはマルチシストロン性ｍＲＮＡに分離され得る。よって、「２つ以上のペプチドまたはタンパク質をコードする」という用語は、これに限定されないが、バイまたはさらにはマルチシストロン性ｍＲＮＡが、例えば、本明細書で提供される定義内の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくはそれ以上の（好ましくは異なる）ペプチドもしくはタンパク質またはこれらの断片もしくはバリアントをコードし得ることを意味し得る。より好ましくは、これに限定されないが、バイまたはさらにはマルチシストロン性ｍＲＮＡが、例えば、本明細書に定義される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくはそれ以上の（好ましくは異なる）ペプチドもしくはタンパク質、または本明細書に定義されるこれらの断片もしくはバリアントをコードし得る。この文脈において、上に定義されるいわゆるＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）配列は、唯一のリボソーム結合部位として機能することができるが、これはまた、互いに独立に、リボソームによって翻訳される数個のペプチドまたはタンパク質をコードする、上に定義されるバイまたはさらにはマルチシストロン性ｍＲＮＡを提供するよう働くこともできる。本発明により使用することができる、ＩＲＥＳ配列の例としては、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、ペスチウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、豚熱ウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものである。
さらなる実施形態によると、本発明によるｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域は、アミノ酸リンカー配列を用いてまたは用いないで連結された本明細書に定義される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つおよびそれ以上のペプチドもしくはタンパク質（またはその断片および誘導体）をコードし得、前記リンカー配列はリジッドリンカー、フレキシブルリンカー、切断可能なリンカー（例えば、自己切断ペプチド）またはこれらの組合せを含むことができる。その中で、ペプチドまたはタンパク質は同一であっても、異なっていても、その組合せであってもよい。特定のペプチドまたはタンパク質組合せは、本明細書で説明される少なくとも２つのペプチドまたはタンパク質をコードする前記ｍＲＮＡによってコードされ得る（本明細書においては「マルチ抗原構築物／ｍＲＮＡ」とも呼ばれる）。
別の好ましい実施形態において、組成物に含まれるｍＲＮＡ化合物は、そのアミノ酸配列がそれぞれの野生型アミノ酸配列に関して修飾されていない病原性抗原をコードする。この場合、ｍＲＮＡ化合物は、それぞれの野生型ｍＲＮＡ配列に関して修飾されていない核酸配列と共にコード領域も含み得る。例えば、ｍＲＮＡ化合物は天然および非修飾ｍＲＮＡであり得る。本明細書で使用される場合、天然および非修飾ｍＲＮＡは、化学修飾も配列の変化も有さない、インビトロで生成されたｍＲＮＡを包含する。
ｍＲＮＡ修飾および配列
本発明の別の実施形態において、ｍＲＮＡ化合物は人工ｍＲＮＡを含む。この文脈において、人工ｍＲＮＡは、化学修飾、配列修飾または非天然配列を有するｍＲＮＡを包含する。
化学修飾
本発明の別の実施形態によると、組成物に含まれるｍＲＮＡ化合物は少なくとも１つの化学修飾を含む。一実施形態において、化学修飾は、塩基修飾、糖修飾、骨格修飾および脂質修飾からなる群から選択され得る。本発明に関する骨格修飾は、本明細書に定義されるｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物に含有されるヌクレオチドの骨格のリン酸が化学修飾される修飾である。本発明に関する糖修飾は、本明細書に定義されるｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物のヌクレオチドの糖の化学修飾である。さらに、本発明に関する塩基修飾は、ｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ化合物のヌクレオチドの塩基部分の化学修飾である。この文脈において、ヌクレオチド類似体または修飾は、好ましくは転写および／または翻訳に適用可能な、ヌクレオチド類似体から選択される。
糖修飾
本明細書に記載されるｍＲＮＡ配列を含む修飾ｍＲＮＡ化合物に組み込まれ得る、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、糖部分が修飾され得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または置換され得る。「オキシ」－２’ヒドロキシル基修飾の例としては、限定されるものではないが、アルコキシまたはアリールオキシ（－ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；２’ヒドロキシルが、例えばメチレン架橋によって、同じリボース糖の４’炭素に結合している「ロック」核酸（ＬＮＡ）；およびアミノ基（－Ｏ－アミノ、アミノ基、例えばＮＲＲはアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノであり得る）またはアミノアルコキシが挙げられる。
「デオキシ」修飾は、水素、アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）を含む；またはアミノ基がリンカーを通して糖に結合していてもよく、リンカーが原子Ｃ、Ｎ、およびＯの１つまたは複数を含む。
糖基はまた、リボースの対応する炭素と反対の立体化学配置を有する１個または複数の炭素を含有することができる。よって、修飾ｍＲＮＡは、例えば、糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドを含むことができる。
骨格修飾
骨格のリン酸基は、酸素原子の１個または複数を異なる置換基で置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、非修飾リン酸部分の本明細書に記載される修飾リン酸による完全な置換を含むことができる。修飾リン酸基の例としては、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは共に硫黄によって置換された非連結酸素を有する。リン酸リンカーはまた、連結酸素の窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）および炭素（架橋メチレン－ホスホネート）による置換によっても修飾され得る。
脂質修飾
脂質修飾ｍＲＮＡは、典型的には本明細書に定義されるｍＲＮＡを含む。本明細書に定義されるこのような脂質修飾ｍＲＮＡは、典型的にはｍＲＮＡと共有結合的に連結した少なくとも１つのリンカー、およびそれぞれのリンカーと共有結合的に連結した少なくとも１つの脂質をさらに含む。あるいは、脂質修飾ｍＲＮＡは、少なくとも１つの本明細書に定義されるｍＲＮＡ、およびそのｍＲＮＡと共有結合的に連結した（リンカーを用いないで）少なくとも１つの（二官能性）脂質を含む。第３の代替によると、脂質修飾ｍＲＮＡは、本明細書に定義されるｍＲＮＡ分子、そのｍＲＮＡと共有結合的に連結した少なくとも１つのリンカー、およびそれぞれのリンカーと共有結合的に連結した少なくとも１つの脂質、およびまたそのｍＲＮＡと共有結合的に連結した（リンカーを用いないで）少なくとも１つの（二官能性）脂質を含む。この文脈において、脂質修飾が直鎖ｍＲＮＡ分子の末端に存在することが特に好ましい。
別の好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ化合物は、ヌクレオシド修飾を含まない、特に塩基修飾を含まない。さらなる実施形態において、ｍＲＮＡ化合物は、１－メチルシュードウリジン修飾も、シュードウリジン修飾も、５－メチルウリジン修飾も含まない。１つの好ましい実施形態において、ｍＲＮＡは天然に存在するヌクレオシドのみを含む。さらに好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ化合物はいずれの化学修飾も含まず、場合により配列修飾を含む。本発明のさらに好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ化合物は、天然に存在するヌクレオシドアデニン、ウラシル、グアニンおよびシトシンのみを含む。
塩基修飾
代替実施形態において、ｍＲＮＡ化合物は少なくとも１つの塩基修飾を含む。
本明細書に記載されるｍＲＮＡ配列を含む修飾ｍＲＮＡ化合物に組み込まれ得る、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、核酸塩基部分がさらに修飾され得る。ｍＲＮＡに見られる核酸塩基の例としては、限定されるものではないが、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルが挙げられる。例えば、本明細書に記載されるヌクレオシドおよびヌクレオチドは、主溝面上で化学修飾され得る。一部の実施形態において、主溝化学修飾は、アミノ基、チオール基、アルキル基、またはハロ基を含むことができる。
本発明の特に好ましい実施形態において、ヌクレオチド類似体／修飾は、好ましくは２－アミノ－６－クロロプリンリボシド－５’－トリホスフェート、２－アミノプリン－リボシド－５’－トリホスフェート、２－アミノアデノシン－５’－トリホスフェート、２’－アミノ－２’－デオキシシチジン－トリホスフェート、２－チオシチジン－５’－トリホスフェート、２－チオウリジン－５’－トリホスフェート、２’－フルオロチミジン－５’－トリホスフェート、２’－Ｏ－メチル－イノシン－５’－トリホスフェート、４－チオウリジン－５’－トリホスフェート、５－アミノアリルシチジン－５’－トリホスフェート、５－アミノアリルウリジン－５’－トリホスフェート、５－ブロモシチジン－５’－トリホスフェート、５－ブロモウリジン－５’－トリホスフェート、５－ブロモ－２’－デオキシシチジン－５’－トリホスフェート、５－ブロモ－２’－デオキシウリジン－５’－トリホスフェート、５－ヨードシチジン－５’－トリホスフェート、５－ヨード－２’－デオキシシチジン－５’－トリホスフェート、５－ヨードウリジン－５’－トリホスフェート、５－ヨード－２’－デオキシウリジン－５’－トリホスフェート、５－メチルシチジン－５’－トリホスフェート、５－メチルウリジン－５’－トリホスフェート、５－プロピニル－２’－デオキシシチジン－５’－トリホスフェート、５－プロピニル－２’－デオキシウリジン－５’－トリホスフェート、６－アザシチジン－５’－トリホスフェート、６－アザウリジン－５’－トリホスフェート、６－クロロプリンリボシド－５’－トリホスフェート、７－デアザアデノシン－５’－トリホスフェート、７－デアザグアノシン－５’－トリホスフェート、８－アザアデノシン－５’－トリホスフェート、８－アジドアデノシン－５’－トリホスフェート、ベンズイミダゾール－リボシド－５’－トリホスフェート、Ｎ１－メチルアデノシン－５’－トリホスフェート、Ｎ１－メチルグアノシン－５’－トリホスフェート、Ｎ６－メチルアデノシン－５’－トリホスフェート、Ｏ６－メチルグアノシン－５’－トリホスフェート、シュードウリジン－５’－トリホスフェート、またはピューロマイシン－５’－トリホスフェート、キサントシン－５’－トリホスフェートから選択される、塩基修飾から選択される。５－メチルシチジン－５’－トリホスフェート、７－デアザグアノシン－５’－トリホスフェート、５－ブロモシチジン－５’－トリホスフェート、およびシュードウリジン－５’－トリホスフェートからなる塩基修飾ヌクレオチドの群から選択される塩基修飾についてのヌクレオチドが特に好ましい。一部の実施形態において、修飾ヌクレオシドは、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、および４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジンを含む。一部の実施形態において、修飾ヌクレオシドは、５－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、および４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジンを含む。他の実施形態において、修飾ヌクレオシドは、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチル－チオ－アデニン、および２－メトキシ－アデニンを含む。他の実施形態において、修飾ヌクレオシドは、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、およびＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンを含む。一部の実施形態において、ヌクレオチドは、主溝面上で修飾され得、ウラシルのＣ－５上の水素のメチル基またはハロ基による置換を含むことができる。具体的な実施形態において、修飾ヌクレオシドは、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－アデノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－シチジン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－グアノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－ウリジンまたは５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－シュードウリジンである。
さらに具体的な実施形態において、修飾ｍＲＮＡは、６－アザ－シチジン、２－チオ－シチジン、α－チオ－シチジン、シュード－イソ－シチジン、５－アミノアリル－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、α－チオ－ウリジン、４－チオ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン、デオキシ－チミジン、５－メチル－ウリジン、ピロロ－シチジン、イノシン、α－チオ－グアノシン、６－メチル－グアノシン、５－メチル－シチジン、８－オキソ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、Ｎ１－メチル－アデノシン、２－アミノ－６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－２－アミノ－プリン、シュード－イソ－シチジン、６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－アデノシン、α－チオ－アデノシン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデノシンから選択されるヌクレオシド修飾を含み得る。
さらなる実施形態において、化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－エチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、５－メチルウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メトキシウリジンおよび２’－０－メチルウリジンから選択される。
具体的な実施形態において、化学修飾は、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウラシル（Ｎ１Ｍψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
配列修飾
さらなる実施形態によると、ｍＲＮＡ化合物は修飾ｍＲＮＡ配列を含む。例えば、ｍＲＮＡ配列の修飾は、ｍＲＮＡ配列の安定化をもたらし得る。一実施形態において、ｍＲＮＡ化合物は、少なくとも１つの本明細書に定義されるコード領域を含む安定化ｍＲＮＡ配列を含む。特に、本明細書に記載される本発明の組成物は、本明細書に記載される実施形態のいずれかに定義されるような、ペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域を含むｍＲＮＡ化合物を含み得、前記コード領域は配列修飾を示す。
一実施形態によると、ｍＲＮＡ化合物は、「安定化ｍＲＮＡ配列」、すなわち、インビボ分解（例えば、エキソ－またはエンド－ヌクレアーゼによる）に対して本質的に耐性のｍＲＮＡを含む。このような安定化は、例えば、本発明のｍＲＮＡの修飾リン酸骨格によってもたらされ得る。本発明に関する骨格修飾は、ｍＲＮＡに含有されるヌクレオチドの骨格のリン酸が化学修飾される修飾である。好ましくはこれに関して使用され得るヌクレオチドは、例えばホスホロチオエート修飾リン酸骨格を含有し、好ましくはリン酸骨格に含有されるリン酸酸素の少なくとも１個が硫黄原子によって置換されている。安定化ｍＲＮＡは、例えば：帯電したリン酸酸素がアルキルもしくはアリール基によって置換されているアルキルおよびアリールホスホネート、または帯電した酸素残基がアルキル化形態で存在する、ホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステルなどの非イオン性リン酸類似体をさらに含み得る。このような骨格修飾は、典型的には、いかなる限定も意味しないが、メチルホスホネート、ホスホロアミダートおよびホスホロチオエート（例えば、シチジン－５’－Ｏ－（１－チオホスフェート））からなる群の修飾を含む。
以下では、好ましくは本明細書に定義されるｍＲＮＡを「安定化する」ことができる具体的な修飾を記載する。
Ｇ／Ｃ含量修飾
一実施形態によると、ｍＲＮＡ化合物は、そのグアノシン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量の修飾によって、修飾、よって安定化されているｍＲＮＡ配列を含む。このような修飾、またはこれらの修飾の少なくとも１つは、ｍＲＮＡ化合物のコード領域に位置する。
１つの好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ化合物のコード領域のＧ／Ｃ含量は、それぞれの野生型ｍＲＮＡ、すなわち、非修飾ｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量と比較して増加している。同時に、ｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列は、好ましくは、それぞれの野生型ｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列と比較して修飾されていない。例えば、上記の組成物は、そのアミノ酸配列がそれぞれの野生型核酸のコードアミノ酸配列に関して修飾されていない病原性抗原をコードするｍＲＮＡ化合物を含み得る。
本発明のｍＲＮＡ配列のこの修飾は、翻訳されるいずれのｍＲＮＡ領域の配列もそのｍＲＮＡの効率的な翻訳にとって重要であるという事実に基づく。よって、ｍＲＮＡの組成および様々なヌクレオチドの配列が重要である。特に、増加したＧ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含量を有する配列は、増加したＡ（アデノシン）／Ｕ（ウラシル）含量を有する配列よりも安定である。したがって、本発明によると、ｍＲＮＡのコドンは、増加した量のＧ／Ｃヌクレオチドを含むように、翻訳されたアミノ酸配列を保持しながら、それぞれの野生型ｍＲＮＡと比較して変動する。いくつかのコドンは１つの、同じアミノ酸をコードするという事実（いわゆる、遺伝暗号の縮重）に関して、安定性にとって最も有利なコドンを決定することができる（いわゆる、代替コドン使用頻度）。ｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸に応じて、その野生型配列と比較して、ｍＲＮＡ配列の修飾についての様々な可能性が存在する。もっぱらＧまたはＣヌクレオチドを含有するコドンによってコードされるアミノ酸の場合、コドンの修飾は必要ではない。よって、Ｐｒｏ（ＣＣＣまたはＣＣＧ）、Ａｒｇ（ＣＧＣまたはＣＧＧ）、Ａｌａ（ＧＣＣまたはＧＣＧ）およびＧｌｙ（ＧＧＣまたはＧＧＧ）のコドンは、ＡもＵも存在しないので、修飾を要さない。対照的に、Ａおよび／またはＵヌクレオチドを含有するコドンは、同じアミノ酸をコードするが、Ａおよび／またはＵを含有しない他のコドンの置換によって修飾され得る。これらの例としては以下がある：ＰｒｏのコドンはＣＣＵまたはＣＣＡからＣＣＣまたはＣＣＧに修飾され得る；ＡｒｇのコドンはＣＧＵまたはＣＧＡまたはＡＧＡまたはＡＧＧからＣＧＣまたはＣＧＧに修飾され得る；ＡｌａのコドンはＧＣＵまたはＧＣＡからＧＣＣまたはＧＣＧに修飾され得る；ＧｌｙのコドンはＧＧＵまたはＧＧＡからＧＧＣまたはＧＧＧに修飾され得る。他の場合、ＡヌクレオチドもＵヌクレオチドもコドンから排除することができないが、より低い含量のＡおよび／またはＵヌクレオチドを含有するコドンを使用することによって、ＡおよびＵ含量を減少させることが可能である。これらの例としては以下がある：ＰｈｅのコドンはＵＵＵからＵＵＣに修飾され得る；ＬｅｕのコドンはＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵまたはＣＵＡからＣＵＣまたはＣＵＧに修飾され得る；ＳｅｒのコドンはＵＣＵまたはＵＣＡまたはＡＧＵからＵＣＣ、ＵＣＧまたはＡＧＣに修飾され得る；ＴｙｒのコドンはＵＡＵからＵＡＣに修飾され得る；ＣｙｓのコドンはＵＧＵからＵＧＣに修飾され得る；ＨｉｓのコドンはＣＡＵからＣＡＣに修飾され得る；ＧｌｎのコドンはＣＡＡからＣＡＧに修飾され得る；ＩｌｅのコドンはＡＵＵまたはＡＵＡからＡＵＣに修飾され得る；ＴｈｒのコドンはＡＣＵまたはＡＣＡからＡＣＣまたはＡＣＧに修飾され得る；ＡｓｎのコドンはＡＡＵからＡＡＣに修飾され得る；ＬｙｓのコドンはＡＡＡからＡＡＧに修飾され得る；ＶａｌのコドンはＧＵＵまたはＧＵＡからＧＵＣまたはＧＵＧに修飾され得る；ＡｓｐのコドンはＧＡＵからＧＡＣに修飾され得る；ＧｌｕのコドンはＧＡＡからＧＡＧに修飾され得る；終止コドンＵＡＡはＵＡＧまたはＵＧＡに修飾され得る。他方、Ｍｅｔ（ＡＵＧ）およびＴｒｐ（ＵＧＧ）のコドンの場合、配列修飾の可能性がない。上に列挙される置換を個別にまたは全ての可能な組合せで使用して、本発明のｍＲＮＡ配列のＧ／Ｃ含量をその特定の野生型ｍＲＮＡ（すなわち、元の配列）と比較して増加させることができる。よって、例えば、野生型配列で存在するＴｈｒの全てのコドンがＡＣＣ（またはＡＣＧ）に修飾され得る。しかしながら、好ましくは、例えば、上記置換の可能性の組合せが使用される：
－ 元の配列（野生型ｍＲＮＡ）のＴｈｒをコードする全てのコドンのＡＣＣ（またはＡＣＧ）への置換、および
－ Ｓｅｒを元々コードする全てのコドンのＵＣＣ（またはＵＣＧまたはＡＧＣ）への置換；
－ 元の配列でＩｌｅをコードする全てのコドンのＡＵＣへの置換、および
－ Ｌｙｓを元々コードする全てのコドンのＡＡＧへの置換、および
－ Ｔｙｒを元々コードする全てのコドンのＵＡＣへの置換；
－ 元の配列でＶａｌをコードする全てのコドンのＧＵＣ（またはＧＵＧ）への置換、および
－ Ｇｌｕを元々コードする全てのコドンのＧＡＧへの置換、および
－ Ａｌａを元々コードする全てのコドンのＧＣＣ（またはＧＣＧ）への置換、および
－ Ａｒｇを元々コードする全てのコドンのＣＧＣ（またはＣＧＧ）への置換；
－ 元の配列でＶａｌをコードする全てのコドンのＧＵＣ（またはＧＵＧ）への置換、および
－ Ｇｌｕを元々コードする全てのコドンのＧＡＧへの置換、および
－ Ａｌａを元々コードする全てのコドンのＧＣＣ（またはＧＣＧ）への置換、および
－ Ｇｌｙを元々コードする全てのコドンのＧＧＣ（またはＧＧＧ）への置換、および
－ Ａｓｎを元々コードする全てのコドンのＡＡＣへの置換；
－ 元の配列でＶａｌをコードする全てのコドンのＧＵＣ（またはＧＵＧ）への置換、および
－ Ｐｈｅを元々コードする全てのコドンのＵＵＣへの置換、および
－ Ｃｙｓを元々コードする全てのコドンのＵＧＣへの置換、および
－ Ｌｅｕを元々コードする全てのコドンのＣＵＧ（またはＣＵＣ）への置換、および
－ Ｇｌｎを元々コードする全てのコドンのＣＡＧへの置換、および
－ Ｐｒｏを元々コードする全てのコドンのＣＣＣ（またはＣＣＧ）への置換；等。
好ましくは、本発明のｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物のコード領域のＧ／Ｃ含量が、本明細書に定義される抗原またはその断片もしくはバリアントをコードする野生型ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量と比較して、少なくとも７％、より好ましくは少なくとも１５％、特に好ましくは少なくとも２０％増加する。具体的な実施形態によると、本明細書に定義されるペプチドもしくはタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする領域あるいは野生型ｍＲＮＡ配列の全配列の置換可能なコドンの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９５％またはさらには１００％が置換され、それによって、前記配列のＧ／Ｃ含量が増加する。この文脈において、本発明のｍＲＮＡ配列、好ましくは本発明によるｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域のＧ／Ｃ含量を、野生型配列と比較して最大限に（すなわち、置換可能なコドンの１００％）増加させることが特に好ましい。本発明によると、本発明のｍＲＮＡ配列のさらに好ましい修飾は、翻訳効率が細胞中のｔＲＮＡの出現の異なる頻度によっても決定されるという所見に基づく。よって、いわゆる「希少コドン」が本発明のｍＲＮＡ配列中に増加した程度に存在する場合、対応する修飾ｍＲＮＡ配列が、比較的「頻度が高い」ｔＲＮＡをコードするコドンが存在する場合よりも有意に低い程度に翻訳される。本発明によると、本発明の修飾ｍＲＮＡ配列において、本明細書に定義されるペプチドもしくはタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする領域は、細胞中で比較的希少なｔＲＮＡをコードする野生型配列の少なくとも１つのコドンが、細胞中で比較的頻度が高く、比較的希少なｔＲＮＡと同じアミノ酸を運ぶｔＲＮＡをコードするコドンと交換されるように、野生型ｍＲＮＡ配列の対応する領域と比較して修飾される。この修飾によって、本発明のｍＲＮＡの配列が、頻繁に存在するｔＲＮＡが利用可能なコドンが挿入されるように修飾される。換言すれば、本発明によると、この修飾によって、細胞中で比較的希少なｔＲＮＡをコードする野生型配列の全てのコドンが、各場合で、細胞中で比較的頻度が高く、各場合で、比較的希少なｔＲＮＡと同じアミノ酸を運ぶｔＲＮＡをコードするコドンに交換され得る。どのｔＲＮＡが細胞中で比較的高い頻度で存在し、対照的に、どれが比較的希少で存在するのかは当業者に公知である；例えば、アカシ（Ａｋａｓｈｉ）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．２００１、１１（６）：６６０－６６６を参照されたい。特定のアミノ酸について、最も頻繁に存在するｔＲＮＡを使用するコドン、例えば、（ヒト）細胞中で最も頻繁に存在する、ｔＲＮＡを使用する、Ｇｌｙコドンが特に好ましい。本発明によると、本発明の修飾ｍＲＮＡ配列において、増加、特に最大化される連続的Ｇ／Ｃ含量を、ｍＲＮＡ配列のコード領域によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を修飾することなく、「頻度が高い」コドンと連結させることが特に好ましい。この好ましい実施形態により、本発明の特に効率的に翻訳される、安定化（修飾）ｍＲＮＡ配列の提供が可能になる。上記の本発明の修飾ｍＲＮＡ配列（増加したＧ／Ｃ含量；ｔＲＮＡの交換）の決定は、その開示の内容が本発明の全範囲に含まれる、国際公開第０２／０９８４４３号に説明されるコンピュータプログラムを使用して行うことができる。このコンピュータプログラムを使用して、最大のＧ／Ｃ含量が、細胞中で可能な限り高い頻度で存在するｔＲＮＡをコードするコドンの使用と組み合わせて、好ましくは非修飾配列と比較して修飾されていない修飾ｍＲＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列をもたらすように、所望のｍＲＮＡ配列のヌクレオチド配列を遺伝暗号またはその縮重性質を用いて修飾することができる。あるいは、元の配列と比較して、Ｇ／Ｃ含量のみ、またはコドン使用頻度のみを修飾することも可能である。Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ ６．０のソースコード（使用した開発環境：サービスパック３を用いたマイクロソフト・ビジュアル・スタジオ・エンタープライズ６．０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｔｕｄｉｏ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ ６．０ ｗｉｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｃｋ ３））も国際公開第０２／０２９８４４３号に記載される。本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明のｍＲＮＡ配列のリボソーム結合部位の環境中のＡ／Ｕ含量が、そのそれぞれの野生型ｍＲＮＡのリボソーム結合部位の環境中のＡ／Ｕ含量と比較して増加している。この修飾（リボソーム結合部位の周りの増加したＡ／Ｕ含量）によって、リボソームのｍＲＮＡへの結合効率が増加する。リボソームのリボソーム結合部位への有効な結合（コザック配列：配列番号１もしくは配列番号２、または最小コザック配列ＡＣＣ（ＡＵＧは開始コドンを形成する））が、今度は、ｍＲＮＡの効率的な翻訳の効果を有する。本発明のさらなる実施形態によると、本発明のｍＲＮＡ配列は、潜在的不安定化配列エレメントに関して修飾され得る。特に、このｍＲＮＡ配列のコード領域ならびに／あるいは５’および／または３’非翻訳領域は、修飾ｍＲＮＡ配列のコードアミノ酸配列が好ましくはそのそれぞれの野生型ｍＲＮＡと比較して修飾されないで、不安定化配列エレメントを含有しないように、それぞれの野生型ｍＲＮＡと比較して修飾され得る。例えば、真核生物ｍＲＮＡの配列において、シグナルタンパク質が結合し、インビボでｍＲＮＡの酵素分解を調節する、不安定化配列エレメント（ＤＳＥ）が存在することが知られている。したがって、場合により少なくとも１つの本明細書に定義されるペプチドもしくはタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする領域における、修飾ｍＲＮＡ配列のさらなる安定化のために、不安定化配列エレメントが全くまたは実質的にそこに含有されないように、野生型ｍＲＮＡの対応する領域と比較した１つまたは複数のこのような修飾を行うことができる。本発明によると、非翻訳領域（３’－および／または５’－ＵＴＲ）に存在するＤＳＥも、このような修飾によって、本発明のｍＲＮＡ配列から排除することができる。このような不安定化配列は、例えば、多数の不安定なｍＲＮＡの３’－ＵＴＲセクションに存在する、ＡＵリッチ配列（ＡＵＲＥＳ）である（カプトら（Ｃａｐｕｔ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８６、８３：１６７０－１６７４）。したがって、本発明のｍＲＮＡ配列は、好ましくは本発明のｍＲＮＡ配列がこのような不安定化配列を含有しないように、それぞれの野生型ｍＲＮＡと比較して修飾される。これはまた、可能なエンドヌクレアーゼによって認識される配列モチーフ、例えば、トランスフェリン受容体をコードする遺伝子の３’－ＵＴＲセグメントに含有される、配列ＧＡＡＣＡＡＧにも当てはまる（バインダーら（Ｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．）、ＥＭＢＯ Ｊ．１９９４、１３：１９６９－１９８０）。これらの配列モチーフも、好ましくは本発明のｍＲＮＡ配列において除去される。
さらなる実施形態によると、ｍＲＮＡ化合物は、国際公開第２０１８／０７８０５３号の表１～表５、図２０～図２４または配列表に開示されるＲＮＡ配列のいずれか１つを含むか、またはからなるコード領域を含むｍＲＮＡ配列を含む；国際公開第２０１８／０７８０５３号の表１～表５または図２０～図２４；国際公開第２０１８／０７８０５３号全体を本願明細書に援用する。
ヒトコドン使用頻度に適合した配列
ｍＲＮＡ化合物のさらに好ましい修飾は、同じアミノ酸をコードするコドンが、典型的には異なる頻度で存在するという所見に基づく。この実施形態によると、ｍＲＮＡ化合物のコード領域中の同じアミノ酸をコードするコドンの頻度は、例えば表２（ヒトコドン使用頻度表）に示されるヒトコドン使用頻度に従ってそのコドンの天然に存在する頻度とは異なる。例えば、アミノ酸アラニン（Ａｌａ）の場合、野生型コード領域は、好ましくは、コドン「ＧＣＣ」が０．４０の頻度で使用され、コドン「ＧＣＴ」が０．２８の頻度で使用され、コドン「ＧＣＡ」が０．２２の頻度で使用され、コドン「ＧＣＧ」が０．１０の頻度で使用される等のように、適合される（表２参照）。
コドン最適化配列
一実施形態において、細胞中で比較的希少な、ｔＲＮＡをコードする野生型配列の全てのコドンが、細胞中で比較的頻度が高く、各場合で、比較的希少なｔＲＮＡと同じアミノ酸を運ぶ、ｔＲＮＡをコードするコドンに交換される。したがって、最も頻度が高いコドンが各コードアミノ酸に使用されることが特に好ましい（表２参照）。このような最適化手順は、コドン適応指標（ＣＡＩ）を増加させ、最終的にはＣＡＩを最大化する。本発明の文脈において、増加または最大化したＣＡＩを有する配列は、典型的には「コドン最適化」配列ならびに／あるいはＣＡＩ増加および／または最大化配列と呼ばれる。好ましい実施形態によると、本発明のｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物は少なくとも１つのコード領域を含み、コード領域／配列は本明細書に記載されるようにコドン最適化されている。より好ましくは、少なくとも１つのコード配列のコドン適応指標（ＣＡＩ）が少なくとも０．５、少なくとも０．８、少なくとも０．９または少なくとも０．９５である。最も好ましくは、少なくとも１つのコード配列のコドン適応指標（ＣＡＩ）が１である。
例えば、本発明によるＲＮＡの少なくとも１つのコード配列によってコードされるアミノ酸配列中に存在するアミノ酸アラニン（Ａｌａ）の場合、野生型コード配列が、最も頻度が高いヒトコドン「ＧＣＣ」が常に前記アミノ酸に使用されるように適合されるか、またはアミノ酸システイン（Ｃｙｓ）について、野生型配列が、最も頻度が高いヒトコドン「ＴＧＣ」が常に前記アミノ酸に使用されるように適合される、等々である。
Ｃ最適化配列
別の実施形態によると、それぞれの野生型ｍＲＮＡ、すなわち、非修飾ｍＲＮＡのコード領域のＣ含量と比較して、好ましくはｍＲＮＡ配列のコード領域の、修飾された－特に増加した－シトシン（Ｃ）含量を有するｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物。同時に、本発明のｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域によってコードされるアミノ酸配列は、好ましくはそれぞれの野生型ｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列と比較して修飾されていない。
本発明の好ましい実施形態において、修飾ｍＲＮＡ配列は、理論上可能な最大のシトシン含量の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％もしくは８０％、もしくは少なくとも９０％またはさらには最大シトシン含量が達成されるように修飾される。
さらに好ましい実施形態において、「シトシン含量最適化可能」な標的ｍＲＮＡ野生型配列のコドンの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはさらには１００％が、野生型配列中に存在するシトシン含量より高いシトシン含量を有するコドンによって置換される。
さらに好ましい実施形態において、野生型コード配列のコドンの一部は、比較的頻度が高いｔＲＮＡの置換コドンが元の野生型コドンの比較的希少なｔＲＮＡと同じアミノ酸を運ぶという条件で、細胞中の比較的希少なｔＲＮＡのコドンが細胞中の比較的頻度が高いｔＲＮＡのコドンによって交換されるようにさらに修飾され得る。好ましくは、シトシンを含有しないコドンによってもっぱらコードされるアミノ酸をコードするコドンを除いて、またはそれぞれ同じ数のシトシンを含有する２つのコドンによってコードされるグルタミン（Ｇｌｎ）を除いて、比較的希少なｔＲＮＡのコドンの全てが、細胞中の比較的頻度が高いｔＲＮＡのコドンによって置換される。
本発明のさらに好ましい実施形態において、修飾標的ｍＲＮＡは、理論上可能な最大のシトシン含量の少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％、またはさらには最大のシトシン含量は、細胞中の比較的頻度が高いｔＲＮＡをコードするコドンによって達成され、アミノ酸配列は変化しないままであるように修飾される。
遺伝暗号の天然に存在する縮重のために、２つ以上のコドンが特定のアミノ酸をコードし得る。したがって、２０種のうちの１８種の天然に存在するアミノ酸が、２つ以上のコドンによって（ＴｒｐおよびＭｅｔは例外である）、例えば、２つのコドンによって（例えば、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、３つのコドンによって（例えば、Ｉｌｅ）、４つのコドンによって（例えば、Ａｌ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ）、または６つのコドンによって（例えば、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ）コードされる。しかしながら、同じアミノ酸をコードする全てのコドンが、インビボ条件下で、同じ頻度で利用されるわけではない。各単一生物に応じて、典型的なコドン使用頻度プロファイルが確立されている。
本発明の文脈内で使用される「シトシン含量最適化可能コドン」という用語は、同じアミノ酸をコードする他のコドンよりも低い含量のシトシンを示すコドンを指す。したがって、同じアミノ酸をコードし、そのコドン内でより多数のシトシンを示す別のコドンによって置換され得る、いずれの野生型コドンもシトシン最適化可能（Ｃ最適化可能）であると考えられる。野生型コード領域内のＣ最適化可能野生型コドンの具体的なＣ最適化コドンによるいずれのこのような置換も、その全体的なＣ含量を増加させ、Ｃ濃縮修飾ｍＲＮＡ配列を反映する。好ましい実施形態によると、本発明のｍＲＮＡ配列、好ましくは本発明のｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域は、全ての潜在的なＣ最適化可能コドンについてのＣ最適化コドンを含有するＣ最大化ｍＲＮＡ配列を含むか、またはからなる。したがって、理論上置換可能なＣ最適化可能コドンの１００％または全てが、好ましくはコード領域の全長にわたってＣ最適化コドンによって置換されている。この文脈において、シトシン含量最適化可能コドンは、同じアミノ酸をコードする他のコドンよりも少数のシトシンを含有するコドンである。
コドンＧＣＧ、ＧＣＡ、ＧＣＵのいずれもアミノ酸Ａｌａをコードし、同じアミノ酸をコードするコドンＧＣＣによって交換され得る、および／または
ＣｙｓをコードするコドンＵＧＵは同じアミノ酸をコードするコドンＵＧＣによって交換され得る、および／または
ＡｓｐをコードするコドンＧＡＵは同じアミノ酸をコードするコドンＧＡＣによって交換され得る、および／または
ＰｈｅをコードするコドンＵＵＵは同じアミノ酸をコードするコドンＵＵＣに交換され得る、および／または
ＧｌｙをコードするコドンＧＧＧ、ＧＧＡ、ＧＧＵのいずれも同じアミノ酸をコードするコドンＧＧＣによって交換され得る、および／または
ＨｉｓをコードするコドンＣＡＵは同じアミノ酸をコードするコドンＣＡＣによって交換され得る、および／または
ＩｌｅをコードするコドンＡＵＡ、ＡＵＵのいずれもコドンＡＵＣによって交換され得る、および／または
ＬｅｕをコードするコドンＵＵＧ、ＵＵＡ、ＣＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＵのいずれも同じアミノ酸をコードするコドンＣＵＣによって交換され得る、および／または
ＡｓｎをコードするコドンＡＡＵは同じアミノ酸をコードするコドンＡＡＣによって交換され得る、および／または
ＰｒｏをコードするコドンＣＣＧ、ＣＣＡ、ＣＣＵのいずれも同じアミノ酸をコードするコドンＣＣＣによって交換され得る、および／または
ＡｒｇをコードするコドンＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＵのいずれも同じアミノ酸をコードするコドンＣＧＣによって交換され得る、および／または
ＳｅｒをコードするコドンＡＧＵ、ＡＧＣ、ＵＣＧ、ＵＣＡ、ＵＣＵのいずれも同じアミノ酸をコードするコドンＵＣＣによって交換され得る、および／または
ＴｈｒをコードするコドンＡＣＧ、ＡＣＡ、ＡＣＵのいずれも同じアミノ酸をコードするコドンＡＣＣによって交換され得る、および／または
ＶａｌをコードするコドンＧＵＧ、ＧＵＡ、ＧＵＵのいずれも同じアミノ酸をコードするコドンＧＵＣによって交換され得る、および／または
ＴｙｒをコードするコドンＵＡＵは同じアミノ酸をコードするコドンＵＡＣによって交換され得る。
上記例のいずれにおいても、シトシンの数が交換されたコドン１つ当たり１だけ増加する。コード領域の全ての非Ｃ最適化コドンの交換（Ｃ最適化可能コドンに対応する）が、Ｃ最大化コード配列をもたらす。本発明の文脈において、本発明によるｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域内の非Ｃ最適化コドンの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％がＣ最適化コドンによって置換される。
一部のアミノ酸について、Ｃ最適化コドンによって置換されるＣ最適化可能コドンのパーセンテージが７０％未満であり、他のアミノ酸について、置換コドンのパーセンテージが７０％より高く、コード領域の全てのＣ最適化可能野生型コドンの少なくとも７０％のＣ最適化の全体的パーセンテージを満たすことが好ましいだろう。
好ましくは、Ｃ最適化ｍＲＮＡ配列において、いずれかの所与のアミノ酸についてのＣ最適化可能野生型コドンの少なくとも５０％がＣ最適化コドンによって置換される、例えば、いずれかの修飾Ｃ濃縮ｍＲＮＡ配列が、好ましくは上に言及されるアミノ酸Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＶａｌおよびＴｙｒのいずれか１つをコードするＣ最適化可能野生型コドン位置で少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％のＣ最適化コドンを含有する。
この文脈において、シトシン含量最適化可能ではないが、少なくとも２つのコドンによってコードされるアミノ酸をコードするコドンが、いずれのさらなる選択工程も用いることなく使用され得る。しかしながら、細胞、例えばヒト細胞中で比較的希少なｔＲＮＡをコードする野生型配列のコドンは、細胞中で比較的頻度が高いｔＲＮＡをコードするコドンに交換され得る（共に同じアミノ酸をコードする）。したがって、Ｇｌｕをコードする比較的希少なコドンＧＡＡは同じアミノ酸をコードする比較的頻度が高いコドンＧＡＧによって交換され得る、および／または
Ｌｙｓをコードする比較的希少なコドンＡＡＡは同じアミノ酸をコードする比較的頻度が高いコドンＡＡＧによって交換され得る、および／または
Ｇｌｎをコードする比較的希少なコドンＣＡＡは同じアミノ酸をコードする比較的頻度が高いコドンＣＡＧに交換され得る。
この文脈において、それぞれただ１つのコドンによってコードされるアミノ酸Ｍｅｔ（ＡＵＧ）およびＴｒｐ（ＵＧＧ）は変化しないままである。終止コドンはシトシン含量最適化されないが、比較的希少な終止コドンであるａｍｂｅｒ、ｏｃｈｒｅ（ＵＡＡ、ＵＡＧ）は、比較的頻度が高い終止コドンｏｐａｌ（ＵＧＡ）によって交換され得る。
上に列挙される単一置換は、野生型ｍＲＮＡ配列と比較して修飾ｍＲＮＡ配列のシトシン含量を最適化するために、個別に、ならびに全ての可能な組合せで使用され得る。
したがって、少なくとも１つの本明細書に定義されるコード配列は、アミノ酸が、その１つが１個の追加のシトシンを含む少なくとも２つ以上のコドンによってコードされ、このようなコドンが１個の追加のシトシンを含むＣ最適化コドンによって交換され得、アミノ酸が好ましくは野生型配列と比較して変化していないように、それぞれの野生型ｍＲＮＡのコード領域と比較して変化し得る。
さらに好ましい実施形態によると、本発明の組成物は、そのコード領域が対応する野生型ｍＲＮＡの対応するコード領域のＧ／Ｃ含量と比較して増加したＧ／Ｃ含量、および／または対応する野生型ｍＲＮＡの対応するコード領域のＣ含量と比較して増加したＣ含量を有する、ならびに／あるいはコード領域中のコドンがヒトコドン使用頻度に適合されており、コドン適応指標（ＣＡＩ）が好ましくは増加または最大化されている、ならびにｍＲＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列が好ましくは対応する野生型ｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列と比較して修飾されていない、ｍＲＮＡ化合物を含む。
本発明の１つの好ましい実施形態において、組成物はペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域を含むｍＲＮＡ化合物を含み、コード領域は、配列のＧ／Ｃ含量修飾、コドン修飾、コドン最適化またはＣ最適化から選択される配列修飾を示す。
別の好ましい実施形態において、本明細書に定義される組成物または脂質ナノ粒子は、
対応する野生型ｍＲＮＡのコード領域と比較して、
－ コード領域のＧ／Ｃ含量が増加している；
－ コード領域のＣ含量が増加している；
－ コード領域のコドン使用頻度がヒトコドン使用頻度に適合されている；および／またはコドン適応指標（ＣＡＩ）がコード領域で増加もしくは最大化している、
本明細書に定義されるペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域を含むｍＲＮＡを含む。
５’キャップ構造
本発明の別の好ましい実施形態によると、ｍＲＮＡ化合物は、好ましくは本明細書に記載されるｍＲＮＡを安定化する、いわゆる「５’キャップ（ＣＡＰ）構造」の付加によって修飾された配列を有し得る。５’キャップは、一般的には成熟ｍＲＮＡの５’末端を「キャップする」実体、典型的には修飾ヌクレオチド実体である。５’キャップは、典型的には修飾ヌクレオチドによって、特にグアニンヌクレオチドの誘導体によって形成され得る。好ましくは、５’キャップは、５’－５’－三リン酸結合を介して５’末端に連結される。５’キャップはメチル化されてもよく、例えばｍ７ＧｐｐｐＮ（式中、Ｎは５’キャップ、典型的にはｍＲＮＡの５’末端を有する核酸の末端５’ヌクレオチドである）であり得る。ｍ７ＧｐｐｐＮは、ポリメラーゼＩＩによって転写されるｍＲＮＡ中に自然に存在し、したはって、好ましくはこの文脈において修飾ｍＲＮＡに含まれる修飾とみなされない５’キャップ構造である。したはって、本発明の修飾ｍＲＮＡ配列は５’キャップとしてｍ７ＧｐｐｐＮを含んでもよいは、さらに、修飾ｍＲＮＡは、典型的には少なくとも１つのさらなる本明細書に定義される修飾を含む。１つの好ましい実施形態において、本発明のｍＲＮＡ化合物は、ｍ７ＧｐｐｐＮである５’キャップ構造を含む。最も好ましい実施形態において、５’キャップ構造は、ｍ７Ｇ（５’）、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）およびｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）またはそれぞれｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧおよびｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧからなる群から選択される。
本発明の文脈において、５’キャップ構造はまた、キャップアナログを使用した化学ＲＮＡ合成もしくはＲＮＡインビトロ転写（共転写キャッピング）で形成され得るか、またはキャップ構造はキャッピング酵素を使用してインビトロで形成され得る。キャッピング酵素を含むキットは商業的に入手可能である（例えば、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ（商標）Ｃａｐｐｉｎｇ ＥｎｚｙｍｅおよびＳｃｒｉｐｔＣａｐ（商標）２’－０－メチルトランスフェラーゼ（共にセルスクリプト社（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ）製）。したがって、ＲＮＡ転写産物は、好ましくは製造業者の説明書に従って処理される。
実際、キャップアナログは、翻訳もしくは局在化を促進する、および／またはＲＮＡ分子の５’末端で組み込まれると、ＲＮＡ分子の分解を防止するという点でキャップ機能性を有する非重合性ジヌクレオチドを指す。非重合性とは、キャップアナログが、５’三リン酸を有さず、したがって、鋳型依存的ＲＮＡポリメラーゼによって３’方向に伸長され得ないために、５’末端でのみ組み込まれることを意味する。
キャップアナログには、限定されるものではないが、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ；非メチル化キャップアナログ（例えば、ＧｐｐｐＧ）；ジメチル化キャップアナログ（例えば、ｍ２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップアナログ（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称キャップアナログ（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、またはアンチリバースキャップアナログ（例えば、ＡＲＣＡ；ｍ７，２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ｄＧｐｐｐＧおよびこれらの四リン酸誘導体）からなる群から選択される化学構造が含まれる（ステピンスキら（Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．）、２００１．ＲＮＡ ７（１０）：１４８６－９５）。
５’キャップ構造のさらなる例としては、グリセリル、逆位デオキシ脱塩基残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｏｘｙ ａｂａｓｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅ）（部分）、４’，５’メチレンヌクレオチド、１－（ベータ－Ｄ－エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’－チオヌクレオチド、炭素環状ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ－ヌクレオチド、アルファ－ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ－ペントフラノシルヌクレオチド、非環状３’，４’－セコヌクレオチド、非環状３，４－ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環状３，５ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’－３’逆位ヌクレオチド部分、３’－３’－逆位脱塩基部分、３’－２’－逆位ヌクレオチド部分、３’－２’－逆位脱塩基部分、１，４－ブタンジオールホスフェート、３’－ホスホロアミダート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’－ホスフェート、３’ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または架橋もしくは非架橋メチルホスホネート部分が挙げられる。これらの修飾５’キャップ構造は、この文脈において、少なくとも１つの修飾とみなされ、本発明の文脈において、本発明の組成物のｍＲＮＡ配列を修飾するために使用され得る。
特に好ましい修飾５’キャップ構造は、キャップ１（ｍ７Ｇの隣接ヌクレオチドのリボースのメチル化）、キャップ２（ｍ７Ｇの下流の第２のヌクレオチドのリボースの追加のメチル化）、キャップ３（ｍ７Ｇの下流の第３のヌクレオチドのリボースの追加のメチル化）、キャップ４（ｍ７Ｇの下流の第４のヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ）、修飾ＡＲＣＡ（例えば、ホスホチオエート修飾ＡＲＣＡ）、ＣｌｅａｎＣａｐまたはそれぞれｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧもしくはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ（トリリンク社（ＴｒｉＬｉｎｋ））および／または国際公開第２０１７０５３２９７号（本願明細書に援用する）に開示されるキャップ構造、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、および２－アジド－グアノシンである。特に、国際公開第２０１７／０５３２９７号の請求項１～５に開示される構造から誘導可能ないずれのキャップ構造も、修飾キャップ１構造を共転写的に生成するために適切に使用され得る。さらに、国際公開第２０１８／０７５８２７号の請求項１または請求項２１に定義される構造から誘導可能ないずれのキャップ構造も、修飾キャップ１構造を共転写的に生成するために適切に使用され得る。
さらに、キャップアナログは以前記載されている（米国特許第７０７４５９６号、国際公開第２００８／０１６４７３号、国際公開第２００８／１５７６８８号、国際公開第２００９／１４９２５３号、国際公開第２０１１／０１５３４７号、および国際公開第２０１３／０５９４７５号）。Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチドキャップアナログの合成が最近記載されている（コレら（Ｋｏｒｅ ｅｔ ａｌ．）（２０１３）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２１（１５）：４５７０－４）。その文脈におけるさらに適切なキャップアナログは、国際公開第２０１７／０６６７９３号、国際公開第２０１７／０６６７８１号、国際公開第２０１７／０６６７９１号、国際公開第２０１７／０６６７８９号、国際公開第２０１７／０６６７８２号、国際公開第２０１８０７５８２７号および国際公開第２０１７／０６６７９７号に記載されており、キャップアナログに言及する具体的な開示を本願明細書に援用する。
ポリ（Ａ）配列／ポリＡ尾部
「３’ポリ（Ａ）尾部」、「ポリＡ配列」または「ポリ（Ａ）配列」とも呼ばれるポリＡ尾部は、典型的にはＲＮＡの３’末端に付加された、最大約４００個のアデノシンヌクレオチド、例えば１０～２００個、１０～１００個、４０～８０個、５０～７０個、約２５～約４００個、好ましくは約５０個～約４００個、より好ましくは約５０個～約３００個、さらにより好ましくは約５０個～約２５０個、最も好ましくは約６０個～約２５０個のアデノシンヌクレオチド、または約４０個～約１５０個のアデノシンヌクレオチド、または約７０個～９０個のアデノシンヌクレオチドの長いアデノシンヌクレオチド配列である。特に好ましい実施形態において、ポリ（Ａ）配列は約６４個のアデノシンヌクレオチドを含む。別の特に好ましい実施形態において、ポリ（Ａ）配列は約１００個のアデノシンヌクレオチドを含む。さらに、ポリ（Ａ）配列、またはポリ（Ａ）尾部は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または酵母から誘導されるポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用した、ＲＮＡの酵素的ポリアデニル化によってインビトロで生成され得る。適切には、コードＲＮＡのポリ（Ａ）配列は、ポリＡ結合タンパク質の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のモノマーに結合するのに十分長くなり得る。
ポリアデニル化は、典型的にはポリ（Ａ）配列のＲＮＡ分子などの核酸分子、例えばｍＲＮＡ前駆体への付加であると理解される。ポリアデニル化は、いわゆるポリアデニル化シグナルによって誘導され得る。このシグナルは、好ましくはポリアデニル化される、ＲＮＡ分子などの核酸分子の３’末端のヌクレオチドの伸長内に位置する。ポリアデニル化シグナルは、典型的にはアデニンおよびウラシル／チミンヌクレオチドからなるヘキサマー、好ましくはヘキサマー配列ＡＡＵＡＡＡを含む。他の配列、好ましくはヘキサマー配列も考えられる。ポリアデニル化は、典型的にはプレｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体とも呼ばれる）のプロセシング中に起こる。典型的には、ＲＮＡ成熟（プレｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへ）は、ポリアデニル化の工程を含む。
実際、さらに好ましい実施形態によると、組成物は、典型的には約１０個～２００個のアデノシンヌクレオチド、好ましくは約１０個～１００個のアデノシンヌクレオチド、より好ましくは約４０個～８０個のアデノシンヌクレオチド、同様に好ましくは約７０個～約９０個のアデノシンヌクレオチド、またはさらにより好ましくは約５０個～７０個のアデノシンヌクレオチドの３’末端のポリＡ尾部を含有するｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物を含む。好ましくは、ポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡインビトロ転写によってＤＮＡ鋳型から誘導される。あるいは、ポリ（Ａ）配列はまた、必ずしもＤＮＡ前駆体から転写されることなく、一般的な化学合成法によってインビトロで得ることもできる。さらに、ポリ（Ａ）配列、またはポリ（Ａ）尾部は、商業的に入手可能なポリアデニル化キットおよび当技術分野で公知の対応するプロトコルを使用して、本発明によるＲＮＡの酵素的ポリアデニル化によって生成され得る。
あるいは、本明細書に記載されるｍＲＮＡは、場合により特異的タンパク質因子（例えば、切断・ポリアデニル化特異的因子（ＣＰＳＦ）、切断刺激因子（ＣｓｔＦ）、切断因子ＩおよびＩＩ（ＣＦＩおよびＣＦＩＩ）、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ））によって（転写された）ＲＮＡにポリアデニル化を伝達するシグナルとして本明細書に定義されるポリアデニル化シグナルを含む。この文脈において、ＮＮ（Ｕ／Ｔ）ＡＮＡコンセンサス配列を含むコンセンサスポリアデニル化シグナルが好ましい。特に好ましい態様において、ポリアデニル化シグナルは以下の配列の１つを含む：ＡＡ（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡまたはＡ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡ（式中、ウリジンは通常、ＲＮＡ中に存在し、チミジンは通常、ＤＮＡ中に存在する）。
ポリ（Ｃ）配列
ポリ（Ｃ）配列は、典型的には約１０個～約２００個のシトシンヌクレオチド、好ましくは約１０個～約１００個のシトシンヌクレオチド、より好ましくは約１０個～約７０個のシトシンヌクレオチドまたはさらにより好ましくは約２０個～約５０個またはさらには約２０個～約３０個のシトシンヌクレオチドの、典型的には長いシトシンヌクレオチド配列である。ポリ（Ｃ）配列は、好ましくは核酸に含まれるコード領域の３’に位置し得る。
実際、さらに好ましい実施形態によると、本発明の組成物は、典型的には約１０個～２００個のシトシンヌクレオチド、好ましくは約１０個～１００個のシトシンヌクレオチド、より好ましくは約２０個～７０個のシトシンヌクレオチドまたはさらにより好ましくは約２０個～６０個またはさらには１０個～４０個のシトシンヌクレオチドの３’末端のポリ（Ｃ）尾部を含むｍＲＮＡ化合物を含む。
１つの好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ化合物は、好ましくは５’→３’方向に：
ａ）５’キャップ構造、好ましくはキャップ１またはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ；
ｂ）場合により、５’－ＵＴＲエレメント；
ｃ）少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域；
ｄ）場合により、３’－ＵＴＲエレメント；
ｅ）場合により、好ましくは６４個のアデノシンを含む、ポリ（Ａ）配列；
ｆ）場合により、好ましくは３０個のシトシンを含む、ポリ（Ｃ）配列
を含む。
ＵＴＲ
好ましい実施形態において、組成物は、少なくとも１つの５’－または３’－ＵＴＲエレメントを含むｍＲＮＡ化合物を含む。この文脈において、ＵＴＲエレメントは、いずれかの天然に存在する遺伝子の５’－もしくは３’－ＵＴＲから誘導される、または遺伝子の５’－もしくは３’－ＵＴＲの断片、ホモログもしくはバリアントから誘導される、核酸配列を含むか、またはからなる。好ましくは、本発明により使用される５’－または３’－ＵＴＲエレメントは、本発明のｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域に対して異種である。天然に存在する遺伝子から誘導される５’－または３’－ＵＴＲエレメントが好ましいとしても、合成的に設計されたＵＴＲエレメントが本発明の文脈で使用され得る。
「３’－ＵＴＲエレメント」という用語は、典型的には３’－ＵＴＲまたは３’－ＵＴＲのバリアントから誘導される核酸配列を含むか、またはからなる核酸配列を指す。本発明の意味における３’－ＵＴＲエレメントは、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡの３’－ＵＴＲを表し得る。よって、本発明の意味において、好ましくは、３’－ＵＴＲエレメントは、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡの３’－ＵＴＲであり得るか、またはＲＮＡの３’－ＵＴＲの転写鋳型であり得る。よって、３’－ＵＴＲエレメントは、好ましくはＲＮＡの３’－ＵＴＲ、好ましくは遺伝子操作されたベクター構築物の転写によって得られるｍＲＮＡなどのｍＲＮＡの３’－ＵＴＲに対応する核酸配列である。好ましくは、３’－ＵＴＲエレメントは、３’－ＵＴＲの機能を果たすか、または３’－ＵＴＲの機能を果たす配列をコードする。
好ましくは、少なくとも１つの３’－ＵＴＲエレメントは、脊索動物遺伝子、好ましくは脊椎動物遺伝子、より好ましくは哺乳動物遺伝子、最も好ましくはヒト遺伝子の３’－ＵＴＲ、または脊索動物遺伝子、好ましくは脊椎動物遺伝子、より好ましくは哺乳動物遺伝子、最も好ましくはヒト遺伝子の３’－ＵＴＲのバリアントから誘導される核酸配列を含むか、またはからなる。
好ましくは、組成物は、増強された半減期を有するｍＲＮＡに関する（安定なｍＲＮＡを提供する）遺伝子から誘導可能であり得る、３’－ＵＴＲエレメント、例えば以下に定義および記載される３’－ＵＴＲエレメントを含むｍＲＮＡ化合物を含む。好ましくは、３’－ＵＴＲエレメントが、好ましくは安定なｍＲＮＡをコードする、遺伝子の３’－ＵＴＲ、または前記遺伝子のホモログ、断片もしくはバリアントから誘導される核酸配列を含むか、またはからなる。
１つの好ましい実施形態において、国際公開第２０１９／０７７００１号の表１、請求項１および請求項４、請求項６～８および請求項９に開示されるＵＴＲ組合せは、本発明のｍＲＮＡ化合物にとって好ましいＵＴＲ組合せである。さらに、好ましくは、国際公開第２０１９／０７７００１号の２４頁、表１の後の第２段落全体および２４頁、最後の段落～２９頁、第２段落に開示されるＵＴＲ組合せは、本発明のｍＲＮＡ化合物にとって好ましいＵＴＲ組合せである。国際公開第２０１９／０７７００１号全体を本願明細書に援用する。
さらに好ましい実施形態において、その３’－ＵＴＲエレメントは、ＰＳＭＢ３、ＡＬＢもしくはＡＬＢ７、アルファ－グロビン（「ｍｕａｇ」、すなわち、変異アルファ－グロビン３’－ＵＴＲと呼ばれる）、ＣＡＳＰ１、ＣＯＸ６Ｂ１、ＧＮＡＳ、ＮＤＵＦＡ１およびＲＰＳ９から選択される遺伝子の３’－ＵＴＲからなる群から選択される遺伝子の３’－ＵＴＲ、またはこれらの遺伝子のいずれか１つのホモログ、断片もしくはバリアントから誘導される核酸配列を含むか、またはからなる（例えば、本願明細書に援用する、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３６９に開示されるヒトアルブミン７／ａｌｂ７ ３’－ＵＴＲ）。さらに好ましい実施形態において、３’－ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３７６によるヒトアルブミン遺伝子の断片から誘導される核酸配列を含む（アルブミン７／ａｌｂ７ ３’－ＵＴＲ）。さらに好ましい実施形態において、３’－ＵＴＲエレメントは、アルブミン遺伝子、好ましくは脊椎動物アルブミン遺伝子、より好ましくは哺乳動物アルブミン遺伝子、最も好ましくはヒトアルブミン遺伝子の３’－ＵＴＲ、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００４７７．５によるヒトアルブミン遺伝子の３’－ＵＴＲ（配列番号１３～１８）、またはその断片もしくはバリアントから誘導される核酸配列を含むか、またはからなる。別の好ましい実施形態において、３’－ＵＴＲエレメントは、α－グロビン遺伝子、例えば好ましくは配列番号５もしくは配列番号６～８によるヒトα－グロビン遺伝子、またはα－グロビン遺伝子のホモログ、断片もしくはバリアントの３’－ＵＴＲの中心、α－複合体結合部分、あるいはα－グロビン遺伝子の３’－ＵＴＲのα複合体結合部分（本明細書で「ｍｕａｇ」とも呼ばれる）ＧＣＣＣＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＣＡＡＣＧＧＧＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＡＣＣＧ（配列番号１１または配列番号１２、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３９３に対応する）を含むか、またはからなる。
別の好ましい実施形態において、３’－ＵＴＲエレメントは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９または対応するＲＮＡ配列 配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、すなわち（配列番号５；ＤＮＡ；ＨＢＡ１ ３’－ＵＴＲ）；（配列番号：７；ＤＮＡ；ＨＢＡ２ ３’－ＵＴＲ）；（配列番号９；ＤＮＡ；ＨＢＢ ３’－ＵＴＲ）；（配列番号１１；ＤＮＡ；ｍｕａｇ ３’－ＵＴＲ）；（配列番号１３；ＤＮＡ；アルブミン３’－ＵＴＲ）；（配列番号１５；ＤＮＡ；アルブミン７ ３’－ＵＴＲ）；（配列番号１７；ＤＮＡ；ＡＬＢ７ ３’－ＵＴＲ）；（配列番号１９；ＤＮＡ；ＰＳＭＢ３ ３’－ＵＴＲ）；（配列番号６；ＲＮＡ；ＨＢＡ１ ３’－ＵＴＲ）；（配列番号８；ＲＮＡ；ＨＢＡ２ ３’－ＵＴＲ）；（配列番号１０；ＲＮＡ；ＨＢＢ ３’－ＵＴＲ）；（配列番号１２；ＲＮＡ；ｍｕａｇ ３’－ＵＴＲ）；（配列番号１４；ＲＮＡ；アルブミン３’－ＵＴＲ）；（配列番号１６；ＲＮＡ；アルブミン７ ３’－ＵＴＲ）；（配列番号１８；ＲＮＡ；ＡＬＢ７ ３’－ＵＴＲ）；（配列番号２０；ＲＮＡ；ＰＳＭＢ３ ３’－ＵＴＲ）による、α－またはβ－グロビン遺伝子、好ましくは脊椎動物α－またはβ－グロビン遺伝子、好ましくは哺乳動物α－またはβ－グロビン遺伝子、好ましくはヒトα－またはβ－グロビン遺伝子の３’－ＵＴＲから誘導される核酸配列を含むか、またはからなる。
この文脈において、本発明によるｍＲＮＡ配列の３’－ＵＴＲエレメントが、配列番号１２に示される、配列番号１１による核酸配列、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントの対応するＲＮＡ配列を含むか、またはからなることも好ましい。
「［．．．］遺伝子の３’－ＵＴＲから誘導される核酸配列」という用語は、好ましくはアルブミン遺伝子、α－グロビン遺伝子、β－グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、またはコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子などのコラーゲンアルファ遺伝子、好ましくはアルブミン遺伝子の３’－ＵＴＲ、またはその一部などの、［．．．］遺伝子の３’－ＵＴＲ配列またはその一部に基づく核酸配列を指す。この用語は、アルブミン遺伝子、α－グロビン遺伝子、β－グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、またはコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子などのコラーゲンアルファ遺伝子などの遺伝子、好ましくはアルブミン遺伝子の３’－ＵＴＲ配列全体、すなわち、遺伝子の完全長３’－ＵＴＲに対応する配列、および遺伝子の３’－ＵＴＲ配列の断片に対応する配列を含む。
「［．．．］遺伝子の３’－ＵＴＲのバリアントから誘導される核酸配列」という用語は、好ましくは上記のアルブミン遺伝子、α－グロビン遺伝子、β－グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、もしくはコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子などのコラーゲンアルファ遺伝子の３’－ＵＴＲのバリアント、またはその一部などの、遺伝子の３’－ＵＴＲ配列のバリアントに基づく核酸配列を指す。この用語は、遺伝子の３’－ＵＴＲのバリアントの配列全体、すなわち、遺伝子の完全長バリアント３’－ＵＴＲ配列に対応する配列、および遺伝子のバリアント３’－ＵＴＲ配列の断片に対応する配列を含む。この文脈における断片は、好ましくは完全長バリアント３’－ＵＴＲの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す、完全長バリアント３’－ＵＴＲ中のヌクレオチドの連続伸長に対応するヌクレオチドの連続伸長からなる。本発明の意味における、このようなバリアントの断片は、好ましくは本明細書に記載されるバリアントの機能的断片である。
好ましい実施形態によると、本発明によるｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物は、好ましくは本明細書に定義される、５’キャップ構造および／または少なくとも１つの３’非翻訳領域エレメント（３’－ＵＴＲエレメント）を含む。より好ましくは、ＲＮＡは、本明細書に定義される５’－ＵＴＲエレメントをさらに含む。
１つの好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ化合物は、好ましくは５’→３’方向に：
ａ）５’キャップ構造、好ましくはキャップ１またはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ；
ｂ）場合により、５’－ＵＴＲエレメント；
ｃ）少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域；
ｄ）場合により、好ましくは配列番号１２に示される、配列番号１１による核酸配列の対応するＲＮＡ配列を含む、アルファグロビン遺伝子、そのホモログ、断片またはバリアントから誘導される核酸配列を含むか、またはからなる３’－ＵＴＲエレメント；
ｅ）場合により、好ましくは６４個のアデノシンまたは１００個のアデノシンを含む、ポリ（Ａ）配列；
ｆ）場合により、好ましくは３０個のシトシンを含む、ポリ（Ｃ）配列
を含む。
さらに好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ化合物は、好ましくは５’→３’方向に：
ａ）５’キャップ構造、好ましくはキャップ１またはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ；
ｂ）好ましくはＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、またはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））のタンパク質から誘導される、少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード領域；
ｃ）場合により、好ましくは配列番号１２に示される、配列番号１１による核酸配列の対応するＲＮＡ配列を含む、アルファグロビン遺伝子、そのホモログ、断片またはバリアントから誘導される核酸配列を含むか、またはからなる３’－ＵＴＲエレメント；
ｄ）場合により、好ましくは６４個のアデノシンを含む、ポリ（Ａ）配列；
ｅ）場合により、好ましくは３０個のシトシンを含む、ポリ（Ｃ）配列
を含む。
さらに好ましい実施形態において、組成物は、少なくとも１つの５’非翻訳領域エレメント（５’－ＵＴＲエレメント）を含むｍＲＮＡ化合物を含む。好ましくは、少なくとも１つの５’－ＵＴＲエレメントは、ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲから誘導される、またはＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲの断片、ホモログもしくはバリアントから誘導される、核酸配列を含むか、またはからなる。５’－ＵＴＲエレメントは、上に定義されるＴＯＰモチーフも５’－ＴＯＰも含まないことが好ましい。
一部の実施形態において、ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲから誘導される、５’－ＵＴＲエレメントの核酸配列は、それが誘導される遺伝子またはｍＲＮＡの開始コドン（例えば、Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ）の上流１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０位に位置するヌクレオチドによりその３’末端で終結する。よって、５’－ＵＴＲエレメントはタンパク質コード領域のいずれの部分も含まない。よって、好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡ配列のタンパク質コード部分のみがコード領域によって提供される。
ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲから誘導される核酸配列は、好ましくは真核生物ＴＯＰ遺伝子、好ましくは植物または動物ＴＯＰ遺伝子、より好ましくは脊索動物ＴＯＰ遺伝子、さらにより好ましくは脊椎動物ＴＯＰ遺伝子、最も好ましくは哺乳動物ＴＯＰ遺伝子、例えばヒトＴＯＰ遺伝子から誘導される。
例えば、５’－ＵＴＲエレメントは、その開示全体を本願明細書に援用する、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１～１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１および配列番号１４２２からなる群から選択される核酸配列、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１～１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１および配列番号１４２２のホモログ、そのバリアント、または好ましくは対応するＲＮＡ配列から誘導される、核酸配列を含むか、またはからなる５’－ＵＴＲエレメントから選択され得る。「国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１～１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１および配列番号１４２２のホモログ」という用語は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）以外の種の配列を指し、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１～１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１および配列番号１４２２による配列と相同である。
好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ化合物の５’－ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１～１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１および配列番号１４２２から選択される核酸配列、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１～１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１および配列番号１４２２のホモログ、そのバリアント、または対応するＲＮＡ配列の、５位のヌクレオチド（すなわち、配列中５位に位置するヌクレオチド）から開始コドン（配列の３’末端に位置する）に対して直ぐ５’位のヌクレオチド、例えばＡＴＧ配列に対して直ぐ５’位のヌクレオチドまで伸長する核酸配列から誘導される、核酸配列を含むか、またはからなる。５’－ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１～１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１および配列番号１４２２から選択される核酸配列、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１～１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１および配列番号１４２２のホモログ、そのバリアント、または対応するＲＮＡ配列の、５’－ＴＯＰに対して直ぐ３’位のヌクレオチドから開始コドン（配列の３’末端に位置する）に対して直ぐ５’位のヌクレオチド、例えばＡＴＧ配列に対して直ぐ５’位のヌクレオチドまで伸長する核酸配列から誘導されることが特に好ましい。
さらに好ましい実施形態において、５’－ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質をコードするＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲ、またはリボソームタンパク質をコードするＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲのバリアントから誘導される、核酸配列を含むか、またはからなる。例えば、５’－ＵＴＲエレメントは、好ましくは５’－ＴＯＰモチーフを欠く、本明細書に記載される国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号６７、１７０、１９３、２４４、２５９、５５４、６５０、６７５、７００、７２１、９１３、１０１６、１０６３、１１２０、１１３８、および１２８４～１３６０のいずれかによる核酸配列の５’－ＵＴＲ、対応するＲＮＡ配列、そのホモログ、またはそのバリアントから誘導される、核酸配列を含むか、またはからなる。上記のように、５位からＡＴＧ（配列の３’末端に位置する）に対して直ぐ５’のヌクレオチドまで伸長する配列は、前記配列の５’－ＵＴＲに対応する。
好ましくは、５’－ＵＴＲエレメントは、リボソーム大タンパク質（ＲＰＬ）をコードするＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲ、またはリボソーム大タンパク質（ＲＰＬ）をコードするＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲのホモログもしくはバリアントから誘導される、核酸配列を含むか、またはからなる。例えば、５’－ＵＴＲエレメントは、好ましくは５’－ＴＯＰモチーフを欠く、本明細書に記載される国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号６７、２５９、１２８４～１３１８、１３４４、１３４６、１３４８～１３５４、１３５７、１３５８、１４２１および１４２２のいずれかによる核酸配列の５’－ＵＴＲ、対応するＲＮＡ配列、そのホモログ、またはそのバリアントから誘導される、核酸配列を含むか、またはからなる。
特に好ましい実施形態において、５’－ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３２遺伝子、好ましくは脊椎動物リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３２（Ｌ３２）遺伝子、より好ましくは哺乳動物リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３２（Ｌ３２）遺伝子、最も好ましくはヒトリボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３２（Ｌ３２）遺伝子の５’－ＵＴＲ、またはリボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３２遺伝子、好ましくは脊椎動物リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３２（Ｌ３２）遺伝子、より好ましくは哺乳動物リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３２（Ｌ３２）遺伝子、最も好ましくはヒトリボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３２（Ｌ３２）遺伝子の５’－ＵＴＲのバリアントから誘導される核酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは５’－ＵＴＲエレメントが前記遺伝子の５’－ＴＯＰを含まない。
したがって、好ましい実施形態において、５’－ＵＴＲエレメントは、配列番号２３もしくは配列番号２４による核酸配列（５’末端オリゴピリミジントラクト：ＧＧＣＧＣＴＧＣＣＴＡＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＧＧＣＡＴＣを欠くヒトリボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３２の５’－ＵＴＲ；国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３６８に対応する）、または好ましくは対応するＲＮＡ配列との少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、さらにより好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはからなる、あるいは少なくとも１つの５’－ＵＴＲエレメントは、配列番号２３による核酸配列またはより好ましくは対応するＲＮＡ配列（配列番号２４）との少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、さらにより好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか、またはからなり、好ましくは、断片が上記の通りである、すなわち、完全長５’－ＵＴＲの少なくとも２０％等を表すヌクレオチドの連続伸長である。好ましくは、断片が、少なくとも約２０ヌクレオチド長以上、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド長以上、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド長以上を示す。好ましくは、断片が本明細書に記載される機能的断片である。
非常に好ましい実施形態において、本発明によるｍＲＮＡ配列の５’－ＵＴＲエレメントは、配列番号２１または配列番号２２による核酸配列の対応するＲＮＡ配列、すなわち、ＨＳＤ１７Ｂ４を含むか、またはからなる。また、非常に好ましい実施形態において、本発明によるｍＲＮＡ配列の３’－ＵＴＲエレメントは、配列番号１９または配列番号２０による核酸配列の対応するＲＮＡ配列、すなわち、ＰＳＭＢ３を含むか、またはからなる。同様に非常に好ましい実施形態において、本発明によるｍＲＮＡ配列の５’－ＵＴＲエレメントおよび３’－ＵＴＲエレメントは、上記ＨＳＤ１７Ｂ４－ＵＴＲとＰＳＭＢ３－ＵＴＲの組合せを含むか、またはからなる。
一部の実施形態において、ｍＲＮＡ化合物は、ＲＰＳＡ、ＲＰＳ２、ＲＰＳ３、ＲＰＳ３Ａ、ＲＰＳ４、ＲＰＳ５、ＲＰＳ６、ＲＰＳ７、ＲＰＳ８、ＲＰＳ９、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１２、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１５、ＲＰＳ１５Ａ、ＲＰＳ１６、ＲＰＳ１７、ＲＰＳ１８、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＲＰＳ２３、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２９、ＲＰＳ３０、ＲＰＬ３、ＲＰＬ４、ＲＰＬ５、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７、ＲＰＬ７Ａ、ＲＰＬ８、ＲＰＬ９、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ１２、ＲＰＬ１３、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＬ１４、ＲＰＬ１５、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ１８、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ２３、ＲＰＬ２３Ａ、ＲＰＬ２４、ＲＰＬ２６、ＲＰＬ２７、ＲＰＬ２７Ａ、ＲＰＬ２８、ＲＰＬ２９、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３１、ＲＰＬ３２、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３５、ＲＰＬ３５Ａ、ＲＰＬ３６、ＲＰＬ３６Ａ、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ３９、ＲＰＬ４０、ＲＰＬ４１、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＲＰＬＰ３、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＥＥＦ１Ａ１、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＥＦ１Ｄ、ＥＥＦ１Ｇ、ＥＥＦ２、ＥＩＦ３Ｅ、ＥＩＦ３Ｆ、ＥＩＦ３Ｈ、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＩＦ３Ｃ、ＥＩＦ３Ｋ、ＥＩＦ３ＥＩＰ、ＥＩＦ４Ａ２、ＰＡＢＰＣ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＴＰＴ１、ＴＵＢＢ１、ＵＢＡ５２、ＮＰＭ１、ＡＴＰ５Ｇ２、ＧＮＢ２Ｌ１、ＮＭＥ２、ＵＱＣＲＢから選択される、哺乳動物、例えばヒトＴＯＰ遺伝子などの脊椎動物ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲ、またはそのホモログもしくはバリアントから誘導される核酸配列を含むか、またはからなる５’－ＵＴＲエレメントを含み、好ましくは、５’－ＵＴＲエレメントが前記遺伝子のＴＯＰモチーフも５’－ＴＯＰも含まず、場合により、５’－ＵＴＲエレメントが、５’末端オリゴピリミジントラクト（ＴＯＰ）の下流１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０位に位置するヌクレオチドによりその５’末端で始まり、さらに場合により、ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲから誘導される５’－ＵＴＲエレメントが、それが誘導される遺伝子の開始コドン（Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ）の上流１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０位に位置するヌクレオチドによりその３’末端で終結する。
さらに好ましい実施形態において、５’－ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体、アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、ヒドロキシステロイド（１７－ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、アンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、チトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、もしくはＮ－アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）の５’－ＵＴＲまたはそのバリアント、好ましくは脊椎動物リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、脊椎動物リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、脊椎動物リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、脊椎動物ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体、アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、脊椎動物ヒドロキシステロイド（１７－ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、脊椎動物アンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、脊椎動物チトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、もしくは脊椎動物Ｎ－アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）またはそのバリアント、より好ましくは哺乳動物リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、哺乳動物ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体、アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、哺乳動物ヒドロキシステロイド（１７－ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、哺乳動物アンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、哺乳動物チトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、もしくは哺乳動物Ｎ－アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）またはそのバリアント、最も好ましくはヒトリボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、ヒトリボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、ヒトリボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、ヒトＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体、アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、ヒトヒドロキシステロイド（１７－ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、ヒトアンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、ヒトチトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、もしくはヒトＮ－アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）またはそのバリアントから誘導される、核酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、５’－ＵＴＲエレメントは前記遺伝子の５’－ＴＯＰを含まない。
したがって、好ましい実施形態において、５’－ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３６８もしくは配列番号１４１２～１４２０による核酸配列、または対応するＲＮＡ配列との少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、さらにより好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはからなる、あるいは少なくとも１つの５’－ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３６８または配列番号１４１２～１４２０による核酸配列との少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、さらにより好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか、またはからなり、好ましくは、断片が上記の通りである、すなわち、完全長５’－ＵＴＲの少なくとも２０％等を表すヌクレオチドの連続伸長である。好ましくは、断片が少なくとも約２０ヌクレオチド長以上、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド長以上、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド長以上を示す。好ましくは、断片が本明細書に記載される機能的断片である。
したがって、好ましい実施形態において、５’－ＵＴＲエレメントは、配列番号２５による核酸配列（５’末端オリゴピリミジントラクト：ＧＣＧＧＣＴＣＧＧＣＣＡＴＴＴＴＧＴＣＣＣＡＧＴＣＡＧＴＣＣＧＧＡＧＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＣＧＧＡＧＴＡＡＣＴＧＣＡＡＡＧを欠くＡＴＰ５Ａ１の５’－ＵＴＲ；国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号２２４２８９に対応する）または好ましくは対応するＲＮＡ配列（配列番号２６）との少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、さらにより好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはからなる、あるいは少なくとも１つの５’－ＵＴＲエレメントは、配列番号２５による核酸配列またはより好ましくは対応するＲＮＡ配列（配列番号２６）との少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、さらにより好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか、またはからなり、好ましくは、断片が上記の通りである、すなわち、完全長５’－ＵＴＲの少なくとも２０％等を表すヌクレオチドの連続伸長である。好ましくは、断片が少なくとも約２０ヌクレオチド長以上、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド長以上、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド長以上を示す。好ましくは、断片が本明細書に記載される機能的断片である。
別の好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ化合物は、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３１（ＲＰＬ３１）遺伝子から誘導される核酸配列を含むか、またはからなる５’－ＵＴＲエレメントを含み、前記５’－ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１９０７７００１号に開示される配列番号１３によるＤＮＡ配列またはそれぞれ国際公開第２０１９０７７００１号に開示される配列番号１４によるＲＮＡ配列を含むか、またはからなる。別の好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ化合物は、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）遺伝子から誘導される核酸配列を含むか、またはからなる３’－ＵＴＲエレメントを含み、前記３’－ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１９０７７００１号に開示される配列番号３３によるＤＮＡ配列またはそれぞれ国際公開第２０１９０７７００１号に開示される配列番号３４によるＲＮＡ配列を含むか、またはからなる。さらに好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ化合物は、国際公開第２０１９０７７００１号に開示されるＵＴＲ組合せ、すなわち、ＲＰＬ３１遺伝子から誘導される核酸配列を含むか、またはからなる５’－ＵＴＲエレメントと、ＲＰＳ９遺伝子から誘導される核酸配列を含むか、またはからなる３’－ＵＴＲエレメントの両方を含む。
別の好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ化合物は、カチオン性アミノ酸輸送体３（溶質担体ファミリー７メンバー３、ＳＬＣ７Ａ３）遺伝子から誘導される核酸配列を含むか、またはからなる５’－ＵＴＲエレメントを含み、前記５’－ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１９０７７００１号に開示される配列番号１５によるＤＮＡ配列またはそれぞれ国際公開第２０１９９７７００１号に開示される配列番号１６によるＲＮＡ配列を含むか、またはからなる。別の好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ化合物は、プロテアソームサブユニットベータ３型（ＰＳＭＢ３）遺伝子から誘導される核酸配列を含むか、またはからなる３’－ＵＴＲエレメントを含み、前記３’－ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１９０７７００１号に開示される配列番号２３によるＤＮＡ配列またはそれぞれ国際公開第２０１９９７７００１号に開示される配列番号２４によるＲＮＡ配列を含むか、またはからなる。さらに好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ化合物は、国際公開第２０１９０７７００１号に開示されるＵＴＲ組合せ、すなわち、ＳＬｃ７ａ３遺伝子から誘導される核酸配列を含むか、またはからなる５’－ＵＴＲエレメントと、ＰＳＭＢ３遺伝子から誘導される核酸配列を含むか、またはからなる３’－ＵＴＲエレメントの両方を含む。
好ましくは、少なくとも１つの５’－ＵＴＲエレメントと少なくとも１つの３’－ＵＴＲエレメントは相乗的に作用して、少なくとも１つの上記のｍＲＮＡ配列からのタンパク質産生を増加させる。
好ましい実施形態によると、本発明の組成物は、好ましくは５’→３’方向に：
ａ）５’キャップ構造、好ましくはキャップ１またはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ；
ｂ）場合により、より好ましくは配列番号２１、２３、２５またはそれぞれ配列番号２２、２４もしくは２６による核酸配列の対応するＲＮＡ配列を含むか、またはからなる、好ましくはＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲから誘導される核酸配列、そのホモログ、断片またはバリアントを含むか、またはからなる、５’－ＵＴＲエレメント；
ｃ）好ましくは全体を本願明細書に援用する、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７５８４３号または国際公開第２０１８／０７８０５３号の「誘導および／修飾ＣＤＳ配列（ｗｔ）」もしくは「誘導および／または修飾ＣＤＳ配列（ｏｐｔ１）」、「誘導および／または修飾ＣＤＳ配列（ｏｐｔ２）」、「誘導および／または修飾ＣＤＳ配列（ｏｐｔ３）」、「誘導および／または修飾ＣＤＳ配列（ｏｐｔ４）」、もしくは「誘導および／または修飾ＣＤＳ配列（ｏｐｔ５）」により始まる識別番号＜２２３＞を有する配列表、またはそれぞれ表１～表５もしくは図２０～図２４の「Ｂ列」もしくは「Ｃ列」、またはそれぞれの配列表に開示される核酸配列；または配列番号２７～４０、もしくは７１に含まれるＯＲＦ、またはこれらの配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントのいずれか１つを含むか、またはからなる、好ましくはＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）、ｎＣｏＶ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、インフルエンザウイルスもしくは狂犬病ウイルスのタンパク質から誘導される少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード領域；あるいは好ましくはＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、またはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））のタンパク質から誘導される少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域；
ｄ）場合により、好ましくは配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７もしくは１９による、より好ましくは配列番号１１もしくは配列番号１７による核酸配列の対応するＲＮＡ配列を含むか、またはからなる、好ましくは安定なｍＲＮＡを提供する遺伝子またはそのホモログ、断片もしくはバリアントから誘導される核酸配列を含むか、またはからなる３’－ＵＴＲエレメント；
ｅ）場合により、好ましくは６４個のアデノシンを含む、ポリ（Ａ）配列；および
ｆ）場合により、好ましくは３０個のシトシンを含む、ポリ（Ｃ）配列
を含むｍＲＮＡ化合物を含む。
一実施形態によると、ｍＲＮＡ化合物はｍｉＲＮＡ配列を含む。ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）は、典型的には遺伝子制御において、例えば、限定されるものではないが、ｍＲＮＡ分解または翻訳阻害もしくは抑制によって、機能し得る、約２０～２５ヌクレオチド長の小さな非コード一本鎖ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、典型的にはヘアピンＲＮＡ前駆体（プレｍｉＲＮＡ）から生成され、タンパク質と機能的複合体を形成し得る。さらに、ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’－ＵＴＲ領域に結合し得る。好ましくは、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、ｍｉＲ－２６ａ、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択されるマイクロＲＮＡのためのものである。
一実施形態において、ｍｉＲＮＡ配列は天然に存在するｍｉＲＮＡ配列である。別の実施形態において、ｍｉＲＮＡ配列は天然に存在するｍｉＲＮＡ配列の模倣物、または修飾であり得る。
１つの好ましい実施形態によると、本発明によるｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物は、本明細書に定義されるように：
ａ）５’キャップ構造；
ｂ）好ましくは、マイクロＲＮＡ結合部位はｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、ｍｉＲ－２６ａ、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択されるマイクロＲＮＡのためのものである、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列；
ｃ）少なくとも１つの５’－ＵＴＲエレメント；
ｄ）少なくとも１つの３’－ＵＴＲエレメント；
ｅ）少なくとも１つのポリ（Ａ）配列；
ｆ）少なくとも１つのポリ（Ｃ）配列；
またはこれらの任意の組合せ、
をさらに含み得る。
ヒストンステムループ（ＨＳＬ）／ヒストン３’ＵＴＲステムループ
さらに好ましい実施形態において、組成物は、ヒストンステムループ配列／構造（ＨＳＬ）を含むｍＲＮＡ化合物を含む。前記実施形態において、ｍＲＮＡ配列は、少なくとも１つ（または複数）のヒストンステムループ配列または構造を含み得る。このようなヒストンステムループ配列は、好ましくはその開示を本願明細書に援用する、国際公開第２０１２／０１９７８０号に開示されるヒストンステムループ配列から選択される。本発明内で使用され得るヒストンステムループ配列は、好ましくは国際公開第２０１２／０１９７８０号の式（Ｉ）または（ＩＩ）から誘導され得る。さらに好ましい実施形態によると、コードＲＮＡは、国際公開第２０１２／０１９７８０号の具体的な式（Ｉａ）または（ＩＩａ）の少なくとも１つから誘導される少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含み得る。さらに好ましい実施形態によると、コードＲＮＡは、国際公開第２０１８／１０４５３８号の式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（Ｉａ）または４９～５２頁の「ヒストンステムループ」の節に開示されるヒストンステムループから誘導される少なくとも１つのヒストンステムループ配列および国際公開第２０１８／１０４５３８号に開示される国際公開第２０１８／１０４５３８号－配列番号１４５１～１４５２を含み得る；国際公開第２０１８／１０４５３８号全体、特に配列番号１４５１～１４５２を本願明細書に援用する。
特に好ましい実施形態において、本発明のＲＮＡは少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含み、前記ヒストンステムループ配列は、配列番号３もしくは４と同一または少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である核酸配列、またはその断片もしくはバリアントを含む。
シグナルペプチド
別の実施形態によると、本発明の組成物は、さらにまたは代わりに、分泌シグナルペプチドをコードし得るｍＲＮＡ化合物を含む。このようなシグナルペプチドは、これに限定されないが、典型的には約１５～３０アミノ酸長を示し、好ましくはコードされるペプチドのＮ末端に位置する配列である。本明細書に定義されるシグナルペプチドは、好ましくは少なくとも１つのｍＲＮＡ配列によってコードされる抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの、定義される細胞区画、好ましくは細胞表面、小胞体（ＥＲ）またはエンドソーム－リソソーム区画への輸送を可能にする。本明細書に定義される分泌シグナルペプチド配列の例としては、これに限定されないが、古典的または非古典的ＭＨＣ分子のシグナル配列（例えば、ＭＨＣ ＩおよびＩＩ分子、例えばＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ－Ａ＊０２０１のシグナル配列）、本明細書に定義されるサイトカインまたは免疫グロブリンのシグナル配列、本明細書に定義される免疫グロブリンまたは抗体のインバリアント鎖のシグナル配列、Ｌａｍｐ１、タパシン（Ｔａｐａｓｉｎ）、Ｅｒｐ５７、カルレティキュリン（Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）、カルネキシン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）、およびさらなる膜結合タンパク質、または小胞体（ＥＲ）もしくはエンドソーム－リソソーム区画に関連するタンパク質のシグナル配列が挙げられる。最も好ましくは、ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ－Ａ＊０２０１のシグナル配列が本発明により使用され得る。例えば、本明細書に定義されるコードされる抗原またはその断片もしくはバリアントの分泌を促進するために、好ましくは、ＨＬＡ－Ａから誘導されるシグナルペプチドが使用される。より好ましくは、ＨＬＡ－Ａシグナルペプチドが、本明細書に定義されるコードされる抗原またはその断片もしくはバリアントに融合される。
本発明による組成物に組み込まれるｍＲＮＡ化合物は、例えば固相ＲＮＡ合成などの合成法、ならびに特に実施例に記載される、ＲＮＡインビトロ転写反応などのインビトロ法を含む、当技術分野で公知の任意の方法を使用して調製され得る。
脂質ナノ粒子組成物を調製する方法
本発明はさらに、
（ｉ）
ａ）本明細書に定義される式（Ｉ）のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体；
ｂ）本明細書に定義されるポリマーコンジュゲート脂質；
ｃ）少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を含む少なくとも１つのｍＲＮＡ化合物；
ｄ）場合により、ステロイド；および
ｅ）場合により、中性脂質
を用意する工程と；
（ｉｉ）カチオン性脂質および／またはポリマーコンジュゲート脂質ならびに場合により中性脂質および／またはステロイドもしくはステロイド誘導体をエタノールなどのアルコールに可溶化する工程と；
（ｉｉｉ）アルコール性脂質溶液を、ｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む水溶液と混合する工程と；
（ｉｖ）アルコールを除去して、ｍＲＮＡポリヌクレオチドをカプセル化しているか、またはこれと会合している脂質ナノ粒子を形成する工程と；
場合により
（ｖ）脂質ナノ粒子を分離または精製する工程と
を含む、前記脂質ナノ粒子を調製する方法に関する。
アルコールは、脂質または形成する脂質ナノ粒子に悪影響を及ぼさない任意の適切な方法によって除去され得る。本発明の一実施形態において、アルコールは透析によって除去される。代替実施形態において、アルコールが透析濾過によって除去される。
脂質ナノ粒子の分離および任意選択の精製も任意の適切な方法によって実施され得る。好ましくは、脂質ナノ粒子が濾過され、より好ましくは脂質ナノ粒子が滅菌フィルタを通して濾過によって分離または精製される。
一部の実施形態において、組成物を得るために溶液がマイクロ流体ミキサー中で混合される。適切には、マイクロ流体混合条件が、８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９４％超のカプセル化効率（ＥＥ）で薬学的に活性な化合物のカプセル化を与えるように選択される。
医薬組成物およびキット
本発明はさらに、少なくとも１つの本発明による脂質ナノ粒子を含む医薬組成物に関する。脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの本明細書に定義される抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含むｍＲＮＡ化合物を含み得る。
本発明の一実施形態において、ｍＲＮＡ配列は１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする。本発明の代替実施形態において、ｍＲＮＡ配列は２つ以上の抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする。
本発明の一実施形態において、医薬組成物は本発明による脂質ナノ粒子を含み、脂質ナノ粒子が、それぞれ抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする異なるｍＲＮＡを含む２つ以上のｍＲＮＡ化合物を含む。
本発明の代替実施形態において、医薬組成物は第２の脂質ナノ粒子を含み、第２の脂質ナノ粒子によって含まれるｍＲＮＡ化合物は第１の脂質ナノ粒子によって含まれるｍＲＮＡ化合物と異なる。
さらなる態様において、本発明は、ｍＲＮＡが少なくとも１つの本明細書に定義されるコード領域を含むｍＲＮＡ配列を含む、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。本発明による組成物は、好ましくは医薬組成物またはワクチンとして提供される。
本発明による組成物はまた、適切な薬学的に許容されるアジュバントを含み得る。好ましい実施形態において、組成物の免疫賦活特性を増強するために、好ましくは、アジュバントが添加される。この文脈において、アジュバントは、本発明による組成物の投与および送達を支持するのに適した、任意の化合物として理解され得る。さらに、このようなアジュバントは、これに拘束されないが、自然免疫系の免疫応答、すなわち、非特異的免疫応答を開始し得るか、または増加させ得る。換言すれば、本発明による組成物は、投与されると、典型的には本発明の組成物に含有される本発明のｍＲＮＡの少なくとも１つのコード配列によってコードされる、本明細書に定義される抗原またはその断片もしくはバリアントによる適応免疫応答を開始する。さらに、本発明による組成物は、本明細書に定義されるアジュバントの本発明による組成物への添加による（支持）自然免疫応答をもたらし得る。
一部の実施形態において、本発明は、対象において抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量の本発明のワクチンを対象に投与する工程を含む、対象において免疫応答を誘導する方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、ウイルス抗原をコードする有効用量のｍＲＮＡを含む、対象のワクチン接種に使用するための、本明細書に記載される組成物またはキットもしくはパーツキットを含む医薬組成物を提供する。
このようなアジュバントは、当業者に公知で、本ケースに適した、すなわち、哺乳動物における免疫応答の誘導を支持する任意のアジュバントから選択され得る。好ましくは、アジュバントが、これに限定されないが、国際公開第２０１８／０７８０５３号の１６０頁３行～１６１頁８行に開示されるアジュバントからなる群から選択され得る；国際公開第２０１８／０７８０５３号全体を本願明細書に援用する。
特に好ましくは、アジュバントが、Ｔｈ１免疫応答の誘導またはナイーブＴ細胞の成熟を支持するアジュバント、例えばＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＩＦＮγ、上に定義される任意の免疫賦活性核酸、好ましくは免疫賦活性ＲＮＡ、ＣｐＧ ＤＮＡ等から選択され得る。
さらに好ましい実施形態において、本発明の組成物は、抗原を提供するｍＲＮＡに加えて、さらなる抗原（例えば、ペプチドもしくはタンパク質の形態）もしくはさらなる抗原コード核酸；さらなる免疫療法剤；１種もしくは複数の補助物質；またはヒトＴｏｌｌ様受容体に対する結合親和性（リガンドとして）により免疫賦活性であることが知られている任意のさらなる化合物；および／またはアジュバント核酸、好ましくは免疫賦活性ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）を含む群から選択されるさらなる成分を含有することも可能である。
本発明の組成物は、所望であれば、その免疫原性または免疫賦活性能力を増加させるために、１種または複数の補助物質をさらに含有することができる。本明細書に定義されるｍＲＮＡと本発明の組成物に場合により含有され得る補助物質の相乗作用が好ましくはそれによって達成される。補助物質の様々な種類に応じて、様々な機序をこの点で考慮に入れることができる。例えば、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を可能にする化合物、例えばリポ多糖、ＴＮＦ－アルファまたはＣＤ４０リガンドは、適切な補助物質の第１のクラスを形成する。一般的に、免疫応答を増強させる、および／または標的化された方法でこれに影響を及ぼすことを可能にする、ＧＭ－ＣＦＳなどの、「デンジャーシグナル」（ＬＰＳ、ＧＰ９６等）またはサイトカインの方法で免疫系に影響を及ぼす任意の薬剤を補助物質として使用することが可能である。特に好ましい補助物質は、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ベータ、ＩＦＮ－ガンマ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＬＴ－ベータまたはＴＮＦ－アルファ、ｈＧＨなどの成長因子などの、自然免疫応答をさらに促進する、モノカイン、リンホカイン、インターロイキンまたはケモカインなどのサイトカインである。
適切なアジュバントはさらに、式ＧｌＸｍＧｎ（式中、グアノシン、ウラシルまたはグアノシンもしくはウラシルの類似体であり；Ｘはグアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジン、シトシンまたは上記ヌクレオチドの類似体であり；ｌは１～４０の整数であり、ｌ＝１の場合、Ｇはグアノシンまたはその類似体であり、ｌ＞１の場合、ヌクレオチドの少なくとも５０％はグアノシンまたはその類似体であり；ｍは整数であり、少なくとも３であり；ｍ＝３の場合、Ｘはウラシルまたはその類似体であり、ｍ＞３の場合、少なくとも３つの連続するウラシルまたはウラシルの類似体が存在し；ｎは１～４０の整数であり、ｎ＝１の場合、Ｇはグアノシンまたはその類似体であり、ｎ＞１の場合、ヌクレオチドの少なくとも５０％はグアノシンまたはその類似体である）、または式：（ＮｕＧｌＸｍＧｎＮｖ）ａ（式中、Ｇはグアノシン（グアニン）、ウリジン（ウラシル）またはグアノシン（グアニン）もしくはウリジン（ウラシル）の類似体、好ましくはグアノシン（グアニン）またはその類似体であり；Ｘはグアノシン（グアニン）、ウリジン（ウラシル）、アデノシン（アデニン）、チミジン（チミン）、シチジン（シトシン）、またはこれらのヌクレオチド（ヌクレオシド）の類似体、好ましくはウリジン（ウラシル）またはその類似体であり；Ｎは約４～５０、好ましくは約４～４０、より好ましくは約４～３０または４～２０個の核酸長を有する核酸配列であり、各Ｎは独立に、グアノシン（グアニン）、ウリジン（ウラシル）、アデノシン（アデニン）、チミジン（チミン）、シチジン（シトシン）またはこれらのヌクレオチド（ヌクレオシド）の類似体から選択され；ａは１～２０、好ましくは１～１５、最も好ましくは１～１０の整数であり；ｌは１～４０の整数であり、ｌ＝１の場合、Ｇはグアノシン（グアニン）またはその類似体であり、ｌ＞１の場合、これらのヌクレオチド（ヌクレオシド）の少なくとも５０％はグアノシン（グアニン）またはその類似体であり；ｍは整数であり、少なくとも３であり；ｍ＝３の場合、Ｘはウリジン（ウラシル）またはその類似体であり、ｍ＞３の場合、少なくとも３つの連続するウリジン（ウラシル）またはウリジン（ウラシル）の類似体が存在し；ｎは１～４０の整数であり、ｎ＝１の場合、Ｇはグアノシン（グアニン）またはその類似体であり、ｎ＞１の場合、これらのヌクレオチド（ヌクレオシド）の少なくとも５０％はグアノシン（グアニン）またはその類似体であり；ｕ、ｖは互いに独立に、０～５０の整数であり得、好ましくは、ｕ＝０、ｖ≧１の場合、またはｖ＝０、ｕ≧１の場合；式（ＮｕＧｌＸｍＧｎＮｖ）ａの核酸分子は少なくとも５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１５０ヌクレオチド長、さらにより好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも２５０ヌクレオチド長を有する）を有する核酸から選択され得る。他の適切なアジュバントはさらに、式：ＣｌＸｍＣｎ（式中、Ｃはシトシン、ウラシルまたはシトシンもしくはウラシルの類似体であり；Ｘはグアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジン、シトシンまたは上記ヌクレオチドの類似体であり；ｌは１～４０の整数であり、ｌ＝１の場合、Ｃはシトシンまたはその類似体であり、ｌ＞１の場合、ヌクレオチドの少なくとも５０％はシトシンまたはその類似体であり；ｍは整数であり、少なくとも３であり；ｍ＝３の場合、Ｘはウラシルまたはその類似体であり、ｍ＞３の場合、少なくとも３つの連続したウラシルまたはウラシルの類似体が存在し；ｎは１～４０の整数であり、ｎ＝１の場合、Ｃはシトシンまたはその類似体であり、ｎ＞１の場合、ヌクレオチドの少なくとも５０％はシトシンまたはその類似体である）を有する核酸から選択され得る。
この文脈において、国際公開第２００８／０１４９７９号（その開示、特に請求項１、請求項２、請求項３、請求項４および請求項５の主題）および国際公開第２００９／０９５２２６号の開示も全体を本願明細書に援用する。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義されるコード領域を含むｍＲＮＡ配列を含む少なくとも１つのｍＲＮＡ化合物を含む、本発明によるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子に基づくワクチンを提供する。本発明によるワクチンは、好ましくは本明細書に定義される（医薬）組成物である。
したがって、本発明によるワクチンは、本明細書に記載される（医薬）組成物と同じ成分に基づく。その限りにおいて、本明細書で提供される（医薬）組成物の記載が参照され得る。好ましくは、本発明によるワクチンは、少なくとも１つの本明細書に定義されるｍＲＮＡ配列を含む少なくとも１つのｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される担体とを含む。ワクチンが、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子中にカプセル化された２つ以上のｍＲＮＡ配列（それぞれが好ましくは別個の抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする、複数の本発明によるＲＮＡ配列など）を含む実施形態において、ワクチンが物理的に別々の形態で提供され得、別々の投与工程によって投与され得る。本発明によるワクチンは、特にｍＲＮＡ配列がただ１つの組成物によって提供される場合、本明細書に記載される（医薬）組成物に対応し得る。しかしながら、本発明のワクチンはまた、物理的に分かれて提供されてもよい。例えば、ワクチンが、本明細書に定義されるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子中にカプセル化された２つ以上のｍＲＮＡ配列／種を含む実施形態において、これらのＲＮＡ種が、例えば、それぞれが別個の抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする、それぞれ少なくとも１つのｍＲＮＡ種／配列（例えば、３つの別個のｍＲＮＡ種／配列）を含有し得る、例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの別々の組成物が提供されるように提供され得る（これらは組み合わされても、されなくてもよい）。また、本発明のワクチンは、各組成物が本明細書に定義される抗原性ペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含む、少なくとも２つの別個の組成物の組合せであり得る。あるいは、ワクチンが、それぞれ本明細書に定義される抗原性ペプチドまたはタンパク質の１つをコードする、少なくとも１つのｍＲＮＡ、好ましくは少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上のｍＲＮＡの組合せとして提供され得る。ワクチンをその使用前に組み合わせてただ１つの組成物を提供してもよいし、または本明細書に定義されるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子中にカプセル化された抗原性ペプチドもしくはタンパク質のいずれかをコードする別個のｍＲＮＡ配列／種を投与するために２回以上の投与が要求されるように使用してもよい。ワクチンが、典型的には本明細書に定義される抗原組合せをコードする少なくとも２つのｍＲＮＡ配列を含む、少なくとも１つのｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を含有する場合、ワクチンは、例えばただ１回の投与（全てのｍＲＮＡ種／配列を組み合わせた）によって、少なくとも２回の別々の投与によって投与され得る。したがって、別々の実体（１つのｍＲＮＡ種を含有する）または組み合わせた実体（２つ以上のｍＲＮＡ種を含有する）として提供される、本明細書に定義される少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質または抗原（および場合によりさらなる抗原）の任意の組合せをコードするモノ、バイまたはマルチシストロン性ｍＲＮＡの任意の組合せが、本発明によるワクチンとして理解される。本発明のワクチンの特に好ましい実施形態によると、全体として本発明の組成物によってコードされる少なくとも１つの抗原、好ましくは少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の抗原の本明細書に定義される組合せが、別々に投与される、個別の（モノシストロン性）ｍＲＮＡとして提供される。
本発明による（医薬）組成物と同様に、ワクチンの実体は液体および乾燥（例えば、凍結乾燥）形態で提供され得る。これらは、さらなる成分、特にその医薬用途を可能にするさらなる成分を含有し得る。ワクチンまたは（医薬）組成物は、例えば薬学的に許容される担体ならびに／あるいはさらなる補助物質および添加剤および／またはアジュバントをさらに含有し得る。
ワクチンまたは（医薬）組成物は、典型的には脂質ナノ粒子内にカプセル化された、および／またはこれと会合した、本明細書に定義される抗原性ペプチドもしくはタンパク質またはその断片もしくはバリアントまたは抗原の組合せをコードする、安全かつ有効量の本明細書に定義される本発明によるｍＲＮＡ化合物を含む。本明細書で使用される場合、「安全かつ有効量」は、がんまたはがんに関連する疾患もしくは障害の正の修飾を有意に誘導するのに十分なｍＲＮＡの量を意味する。しかしながら、同時に、「安全かつ有効量」は、深刻な副作用を回避する、すなわち、利点とリスクとの間の賢明な関係を可能にするのに十分少ない。これらの限界の決定は、典型的には賢明な医学的判断の範囲内にある。本発明のワクチンまたは（医薬）組成物に関して、「安全かつ有効量」という表現は、好ましくは過度の免疫反応も有害な免疫反応も達成されないが、好ましくは、測定可能なレベル未満のこのような免疫反応も達成されないように、適応免疫系を刺激するのに適したｍＲＮＡ（よって、コードされる抗原）の量を意味する。バイまたはさらにはマルチシストロン性ｍＲＮＡは、等量のモノシストロン性ｍＲＮＡの使用よりも有意に高いコードされる抗原の発現をもたらし得るので、本明細書に定義される（医薬）組成物またはワクチンのｍＲＮＡのこのような「安全かつ有効量」はさらに、ｍＲＮＡの種類、例えばモノシストロン性、バイまたはさらにはマルチシストロン性ｍＲＮＡに応じて選択され得る。上に定義される（医薬）組成物またはワクチンのｍＲＮＡの「安全かつ有効量」はさらに、付き添いの医師の知識および経験の範囲内で、処置される特定の状態ならびにまた処置される患者の年齢および健康状態、状態の重症度、処置の持続時間、不随する治療、使用される特定の薬学的に許容される担体の性質、ならびに同様の因子に関連して変動するだろう。本発明によるワクチンまたは組成物は、医薬組成物またはワクチンとして、ヒトおよびまた獣医学的医療目的のために本発明により使用することができる。
好ましい実施形態において、本発明による（医薬）組成物、ワクチンまたはパーツキットのｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子は凍結乾燥形態で提供される。好ましくは、凍結乾燥されたｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子は、投与前に、有利には水性担体に基づく適切な緩衝液、例えば乳酸リンゲル液、リンゲル液、リン酸緩衝液に再構成される。好ましい実施形態において、本発明による（医薬）組成物、ワクチンまたはパーツキットは、場合により凍結乾燥形態で（場合により少なくとも１種のさらなる添加剤と一緒に）、脂質ナノ粒子の単一種として、または各ＬＮＰ種について別々に提供され得、好ましくは（モノシストロン性）ｍＲＮＡの各々の個別の投与を可能にするために、使用前に適切な緩衝液（乳酸リンゲル液など）に別々に再構成される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上のｍＲＮＡ化合物を含有する。
本発明によるワクチンまたは（医薬）組成物は、典型的には薬学的に許容される担体または賦形剤を含有し得る。適切な担体および賦形剤の例は、当業者に公知であり、限定されるものではないが、投与様式および剤形の性質に応じて、保存剤、充填剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、抗菌剤、抗真菌剤、潤滑剤および分散剤が挙げられる。本発明の文脈における「医薬組成物」という用語は、活性剤を含み、１種または複数の薬学的に許容される担体をさらに含む組成物を意味する。組成物は、例えば、投与様式および剤形の性質に応じて、希釈剤、賦形剤、ビヒクル、保存剤、充填剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、抗菌剤、抗真菌剤、潤滑剤および分散剤から選択される成分をさらに含有し得る。
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という表現は、好ましくは本発明のワクチンの液体または非液体基剤を含む。本発明のワクチンが液体形態で提供される場合、担体は、水、典型的にはパイロジェンフリー水；等張生理食塩水または緩衝（水性）溶液、例えばリン酸、クエン酸等緩衝液となる。特に、本発明のワクチンの注射については、ナトリウム塩、好ましくは少なくとも５０ｍＭのナトリウム塩、カルシウム塩、好ましくは少なくとも０．０１ｍＭのカルシウム塩、および場合によりカリウム塩、好ましくは少なくとも３ｍＭのカリウム塩を含有する、水、または好ましくは緩衝液、より好ましくは水性緩衝液が使用され得る。好ましい実施形態によると、ナトリウム、カルシウムおよび場合により、カリウム塩は、そのハロゲン化物、例えば塩化物、ヨウ化物または臭化物の形態、その水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩または硫酸塩等の形態で存在し得る。これに限定されないが、ナトリウム塩の例としては、例えばＮａＣｌ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＳＯ４が挙げられ、任意選択のカリウム塩の例としては、例えばＫＣｌ、ＫＩ、ＫＢｒ、Ｋ２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＳＯ４が挙げられ、カルシウム塩の例としては、例えばＣａＣｌ２、ＣａＩ２、ＣａＢｒ２、ＣａＣＯ３、ＣａＳＯ４、Ｃａ（ＯＨ）２が挙げられる。さらに、上記カチオンの有機アニオンが緩衝液に含有され得る。より好ましい実施形態によると、上に定義される注射目的に適した緩衝液は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）および場合により塩化カリウム（ＫＣｌ）から選択される塩を含有し得、さらなるアニオンが塩化物に加えて存在し得る。ＣａＣｌ２をＫＣｌなどの別の塩によって置換することもできる。典型的には、注射緩衝液中の塩が、少なくとも５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、少なくとも３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）および少なくとも０．０１ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の濃度で存在する。注射緩衝液は、具体的な参照媒体に関して高張性、等張性または低張性であり得る、すなわち、緩衝液は、具体的な参照媒体に関して高い、同一のまたは低い塩含有量を有し得、好ましくは、浸透または他の濃度効果による細胞の損傷をもたらさない、上記塩のこのような濃度が使用され得る。参照媒体は、例えば、血液、リンパ液、サイトゾル液、もしくは他の体液などの「インビボ」法で生じる液体、または例えば一般的な緩衝液もしくは液体などの、「インビトロ」法で参照媒体として使用され得る液体である。このような一般的な緩衝液または液体は当業者に公知である。
しかしながら、人への投与に適した、１種または複数の適合性の固体または液体の充填剤または希釈剤またはカプセル化化合物も使用され得る。本明細書で使用される「適合性」という用語は、本発明のワクチンの賦形剤を、典型的な使用条件下で本発明のワクチンの医薬有効性を実質的に低下させるような相互作用が起こらないように、本明細書に定義される本発明によるｍＲＮＡと混合することができることを意味する。薬学的に許容される担体、充填剤および希釈剤は、当然、それらが処置される人への投与に適したものとなるよう十分に高い純度および十分に低い毒性を有さなければならない。その薬学的に許容される担体、充填剤または賦形剤として使用することができる化合物の一部の例としては、例えば、ラクトース、グルコース、トレハロースおよびスクロースなどの糖；例えば、コーンスターチまたはジャガイモデンプンなどのデンプン；デキストロース；例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；粉末状トラガント；麦芽；ゼラチン；獣脂；例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなどの固体滑剤；硫酸カルシウム；例えば、落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびカカオ属の油などの植物油；例えば、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；アルギン酸がある。
薬学的に許容される担体の選択は、原則として、本発明による医薬組成物またはワクチンが投与される方法によって決定される。組成物またはワクチンは、例えば、全身または局所投与することができる。
全身投与のための経路には、一般的に、例えば、経皮、経口、非経口経路（皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内および腹腔内注射ならびに／あるいは鼻腔内投与経路を含む）が含まれる。ワクチンを投与するための本発明による好ましい投与経路は筋肉内注射および皮内注射である。
局所投与のための経路には、一般的に、例えば、局所投与経路が含まれるが、皮内、経皮、皮下もしくは筋肉内注射、または病巣内、頭蓋内、肺内、心臓内および舌下注射も含まれる。より好ましくは、本発明による組成物またはワクチンは、皮内、皮下、または筋肉内経路によって、好ましくは無針および／または針注射であり得る注射によって投与され得る。
好ましい実施形態によると、人工核酸（ＲＮＡ）分子、（医薬）組成物またはワクチンまたはキットは、非経口経路によって、好ましくは皮内、皮下、または筋肉内経路を介して投与される。好ましくは、前記人工核酸（ＲＮＡ）分子、（医薬）組成物またはワクチンまたはキットが、例えば無針および／または針注射であり得る、注射、例えば皮下、筋肉内または皮内注射によって投与され得る。したがって、好ましい実施形態において、本発明による医学的使用および／または処置方法が、皮下、筋肉内または皮内注射による、好ましくは筋肉内または皮内注射による、より好ましくは皮内注射による、前記人工核酸（ＲＮＡ）分子、（医薬）組成物またはワクチンまたはキットの投与を伴う。このような注射は、慣用的な針注射または（無針）ジェット注射を使用することによって、好ましくは（無針）ジェット注射を使用することによって行われ得る。
本明細書で使用される「ジェット注射」という用語は、少なくとも１つの本発明のｍＲＮＡ配列および場合により、さらなる適切な賦形剤を含有する流体がオリフィスを通して押し出されて、よって、哺乳動物の皮膚、および注射設定に応じて、皮下組織または筋組織を貫通することができる高圧の超微細液体流を生成する、無針注射法を指す。原則として、液体流が皮膚に孔を形成し、この孔を通して液体流が標的組織に押し入れられる。好ましくは、ジェット注射が、本発明によるｍＲＮＡ配列の皮内、皮下または筋肉内注射に使用される。好ましい実施形態において、ジェット注射が、本発明によるｍＲＮＡ配列の筋肉内注射に使用される。さらに好ましい実施形態において、ジェット注射が、本発明によるｍＲＮＡ配列の皮内注射に使用される。
したがって、組成物／ワクチンは、好ましくは液体または固体形態に製剤化される。投与される本発明によるワクチンまたは組成物の適切な量は、日常的な実験によって、例えば動物モデルを使用することによって決定することができる。このようなモデルには、いかなる限定も意味しないが、ウサギ、ヒツジ、マウス、ラット、イヌおよび非ヒト霊長類モデルが含まれる。注射用の好ましい単位用量形態は、水、生理的食塩水またはこれらの混合物の無菌溶液を含む。このような溶液のｐＨは、約７．４など、生理的に許容されるｐＨに調整されるべきである。注射用の適切な担体には、ヒドロゲル、制御または遅延放出用のデバイス、ポリ乳酸およびコラーゲンマトリックスが含まれる。局所施用のための適切な薬学的に許容される担体には、ローション、クリーム、ゲルなどに使用するのに適したものが含まれる。本発明の組成物またはワクチンを経口的に投与する場合、錠剤、カプセル剤などが好ましい単位用量形態である。経口投与に使用することができる単位用量形態を調製するための薬学的に許容される担体は先行技術において周知である。その選択は、本発明の目的にとって重要ではない、味、費用および貯蔵性などの２次的考慮事項に依存し、当業者によってたやすく行われ得る。
本発明のワクチンまたは組成物は、免疫原性をさらに増加させるために、１種または複数の補助物質をさらに含有することができる。本発明の組成物に含有されるｍＲＮＡと、場合により上記の本発明のワクチンまたは組成物と共製剤化（または別々に製剤化）され得る補助物質の相乗作用が好ましくはそれによって達成される。補助物質の様々な種類に応じて、様々な機序がこれに関して役割を果たし得る。例えば、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を可能にする化合物、例えばリポ多糖、ＴＮＦ－アルファまたはＣＤ４０リガンドは、適切な補助物質の第１のクラスを形成する。一般的に、本発明による免疫賦活アジュバントによってもたらされる免疫応答を増強させる、および／または標的化された方法でこれに影響を及ぼすことを可能にする、ＧＭ－ＣＦＳなどの、「デンジャーシグナル」（ＬＰＳ、ＧＰ９６等）またはサイトカインの方法で免疫系に影響を及ぼす任意の薬剤を補助物質として使用することが可能である。特に好ましい補助物質は、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ベータ、ＩＦＮ－ガンマ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＬＴ－ベータまたはＴＮＦ－アルファ、ｈＧＨなどの成長因子などの、－コードされる少なくとも１つの抗原による適応免疫応答の誘導に加えて－自然免疫応答を促進するモノカイン、リンホカイン、インターロイキンまたはケモカインなどのサイトカインである。好ましくは、このような免疫原性増加剤または化合物が別々に（本発明のワクチンまたは組成物と共製剤化されないで）提供され、個別に投与される。
本発明のワクチンまたは組成物に含まれ得るさらなる添加剤は、例えば、Ｔｗｅｅｎなどの乳化剤；例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤；着色剤；味付与剤、医薬担体；錠剤形成剤；安定剤；抗酸化剤；保存剤である。
本発明のワクチンまたは組成物はまた、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０に対する結合親和性（リガンドとして）により、またはマウスＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２もしくはＴＬＲ１３に対する結合親和性（リガンドとして）により、免疫賦活性であることが知られている任意のさらなる化合物をさらに含有することができる。
この文脈において、本発明のワクチンまたは組成物に添加され得る、別のクラスの化合物は、ＣｐＧ核酸、特にＣｐＧ－ＲＮＡまたはＣｐＧ－ＤＮＡであり得る。ＣｐＧ－ＲＮＡまたはＣｐＧ－ＤＮＡは、一本鎖ＣｐＧ－ＤＮＡ（ｓｓＣｐＧ－ＤＮＡ）、二本鎖ＣｐＧ－ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＣｐＧ－ＲＮＡ（ｓｓＣｐＧ－ＲＮＡ）または二本鎖ＣｐＧ－ＲＮＡ（ｄｓＣｐＧ－ＲＮＡ）であり得る。ＣｐＧ核酸は、好ましくはＣｐＧ－ＲＮＡの形態、より好ましくは一本鎖ＣｐＧ－ＲＮＡ（ｓｓＣｐＧ－ＲＮＡ）の形態である。ＣｐＧ核酸は、好ましくは少なくとも１つまたは複数の（マイトジェン）シトシン／グアニンジヌクレオチド配列（ＣｐＧモチーフ）を含有する。第１の好ましい代替によると、これらの配列に含有される少なくとも１つのＣｐＧモチーフ、すなわち、ＣｐＧモチーフのＣ（シトシン）およびＧ（グアニン）がメチル化されていない。場合によりこれらの配列に含有される全てのさらなるシトシンまたはグアニンはメチル化されていても、メチル化されていなくてもよい。しかしながら、さらに好ましい代替によると、ＣｐＧモチーフＣ（シトシン）およびＧ（グアニン）はメチル化形態で存在することもできる。
本発明の別の態様によると、本発明はまた、本明細書に定義されるｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物と、少なくとも１つの本明細書に定義される式（Ｉ）または式（ＩＩ）による脂質とを含む、キット、特にパーツキットを提供する。本発明の別の態様によると、本発明はまた、本明細書に定義されるｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物と、中性脂質／リン脂質としての少なくともＤＰｈｙＰＥとを含む、キット、特にパーツキットを提供する。さらなる実施形態において、キットは、上に定義される脂質ナノ粒子または上に定義される脂質ナノ粒子を含む（医薬）組成物、および／または本発明によるワクチン、場合により可溶化のための液体ビヒクル、および場合によりｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、組成物および／またはワクチンの用法および用量についての情報を含む技術的説明書を含む。技術的説明書は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、組成物および／またはワクチンの用法および用量についての情報を含有し得る。このようなキット、好ましくは、パーツキットは、例えば上記の用途または使用のいずれかのために、好ましくはＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、もしくはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、もしくは卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））感染症、またはこれに関連する疾患もしくは障害を処置または予防するための、（本発明の医薬、好ましくはワクチンを調製するための）本発明による脂質ナノ粒子の使用のために適用され得る。
キットはまた、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、もしくはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、もしくは卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））感染症、またはこれに関連する疾患もしくは障害を処置または予防するための、（本発明のワクチンを調製するための）本明細書に定義される脂質ナノ粒子、組成物またはワクチンの使用にも適用され得、脂質ナノ粒子、組成物および／またはワクチンは、上に定義される哺乳動物において免疫応答を誘導または増強することができる。
このようなキットはさらに、例えば上に定義される哺乳動物において免疫応答を調節、好ましくは誘発、例えば誘導または増強するための、および好ましくはＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、もしくはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、もしくは卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））感染症、またはこれに関連する疾患もしくは障害の処置または予防を支持するための、（本発明のワクチンを調製するための）本明細書に定義される脂質ナノ粒子、組成物またはワクチンの使用に適用され得る。
キットの特別な形態としての、パーツキット（Ｋｉｔｓ ｏｆ ｐａｒｔｓ）は、異なるパーツキット中に、本明細書に記載される１種もしくは複数の同一のもしくは異なる組成物および／または１種もしくは複数の同一のもしくは異なるワクチンを含有し得る。パーツキットはまた、例えば各パーツキットが、好ましくは別個の抗原をコードする、本明細書に定義されるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を含有する、異なるパーツキット中に本発明による（例えば１つの）組成物、（例えば１つの）ワクチンおよび／またはｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を含有し得る。好ましくは、キットまたはパーツキットが、パーツとして、場合により乳酸リンゲル液である、本発明によるｍＲＮＡを可溶化するためのビヒクルを含有する。上記キットのいずれも上に定義される処置または予防に使用され得る。
この態様の別の実施形態において、本発明によるキットは、少なくとも１種のアジュバントをさらに含有し得る。さらなる実施形態において、本発明によるキットは、少なくとも１種のさらなる薬学的に活性な成分、好ましくはがんまたは関連する障害の処置および／または予防に適した治療用化合物をさらに含有し得る。さらに、別の実施形態において、キットは、針、アプリケータ、パッチ、注射デバイスを含む、本発明による組成物またはワクチンの投与に必要なまたは適したパーツおよび／またはデバイスをさらに含有し得る。
投与経路
薬学的に許容される担体の選択は、原則として、本発明による医薬組成物またはワクチンが投与される方法によって決定される。本発明の組成物またはワクチンは、例えば、全身または局所投与することができる。全身投与のための経路には、一般的に、例えば、経皮、経口、非経口経路（皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内および腹腔内注射ならびに／あるいは鼻腔内投与経路を含む）が含まれる。局所投与のための経路には、一般的に、例えば、局所投与経路が含まれるが、皮内、経皮、皮下もしくは筋肉内注射、または病巣内、頭蓋内、肺内、心臓内および舌下注射も含まれる。呼吸器系への投与は噴霧投与によって実施され得る、または吸入は、特に肺、気管支、細気管支、肺胞、もしくは副鼻腔へのエアゾール投与によって実施され得る。
さらに好ましい実施形態において、投与経路は、血管外注射、注入もしくは埋込；皮膚もしくは粘膜への局所投与；組成物を呼吸器系に送達するためなどの吸入；または経皮もしくは経皮的投与などによる対象への血管外投与からなる群から選択される。なおさらに好ましい実施形態において、本発明の組成物またはワクチンは、局所または局所領域注射、注入または埋込、特に皮内、皮下、筋肉内、前房内、結膜下、上脈絡膜注射、網膜下、テノン嚢下、眼球後、局所、後強膜近傍（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｊｕｘｔａｓｃｌｅｒａｌ）投与、または肺内吸入、間質内、局所領域、硝子体内、腫瘍内、リンパ内、節内、関節内、関節滑液嚢内、関節周囲、腹腔内、腹部内、心臓内、病巣内、心膜内、脳室内、胸膜内、神経周囲、胸腔内、硬膜外、硬膜内、硬膜上、髄腔内、髄内、脳内、空洞内、海綿体内、前立腺内、精巣内、軟骨内、骨内、円板内、脊髄内、仙骨内、嚢内、歯肉内、卵巣内、子宮内、眼周囲、歯周、眼球後、くも膜下、結膜下、または脈絡膜上注射、注入または埋込を介して投与され得る。
さらに、皮膚または粘膜への局所投与は、真皮または皮膚、鼻、頬側、舌下、耳または耳介、眼、結膜、膣、直腸、子宮頸部内、副鼻腔内、喉頭、中咽頭、尿管、尿道投与によって実施され得る。ワクチンのためのさらにより好ましい投与経路は、筋肉内、皮内、鼻腔内および経口投与（例えば、本明細書に開示される、ポリヌクレオチド、ＲＮＡまたはｍＲＮＡを含む錠剤を介した）である。
好ましくは、本発明による組成物またはワクチンは、皮内、皮下、または筋肉内経路によって、好ましくは無針および／または針注射であり得る注射によって投与され得る。したがって、本発明による組成物またはワクチンは、好ましくは液体または固体形態に製剤化される。投与される本発明によるワクチンまたは組成物の適切な量は、日常的な実験によって、例えば動物モデルを使用することによって決定することができる。このようなモデルには、いかなる限定も意味しないが、ウサギ、ヒツジ、マウス、ラット、イヌおよび非ヒト霊長類モデルが含まれる。
注射用の好ましい単位用量形態は、水、生理的食塩水またはこれらの混合物の無菌溶液を含む。このような溶液のｐＨは、約７．４など、生理的に許容されるｐＨに調整されるべきである。注射用の適切な担体には、ヒドロゲル、制御または遅延放出用のデバイス、ポリ乳酸およびコラーゲンマトリックスが含まれる。局所施用のための適切な薬学的に許容される担体には、ローション、クリーム、ゲルなどに使用するのに適したものが含まれる。本発明の組成物またはワクチンを経口的に投与する場合、錠剤、カプセル剤などが好ましい単位用量形態である。経口投与に使用することができる単位用量形態を調製するための薬学的に許容される担体は先行技術において周知である。その選択は、本発明の目的にとって重要ではない、味、費用および貯蔵性などの２次的考慮事項に依存し、当業者によってたやすく行われ得る。
組成物の使用
本発明による組成物は、組成物内に組み込まれ、組成物および／またはその中に含有される脂質ナノ粒子によって、ヒト対象などの対象に送達され得る活性成分の説明から明らかなように、医薬として特に有用である。よって、本発明のさらなる態様は、医薬としての上記の組成物の使用である。このような使用は、医薬を製造するための組成物の使用としても表され得る。関連する態様によると、本発明は、組成物を、それを必要とするヒト対象などの対象に投与する工程を含む、処置方法を提供する。
好ましい実施形態において、本発明の組成物が医薬として使用され、医薬がワクチンである。
別の好ましい実施形態において、本発明の組成物が医薬として使用され、医薬が、ウイルス、細菌または原生動物感染性疾患を含む感染性疾患、がんまたは腫瘍疾患、肝臓疾患、自己免疫疾患、アレルギー、遺伝病を含む単一遺伝子疾患、遺伝子疾患全般、遺伝的背景を有し、典型的には定義される遺伝子欠陥によって引き起こされ、メンデルの法則に従って遺伝する疾患；心血管疾患、神経疾患、呼吸器系の疾患、消化器系の疾患、皮膚の疾患、筋骨格障害、結合組織の障害、新生物、免疫不全、内分泌、栄養および代謝疾患、眼疾患、耳疾患、およびペプチドまたはタンパク質欠損に関連する疾患から選択される疾患を防止、予防、処置および／または改善するためのものであるか、またはこれに適している。
別の好ましい実施形態において、本発明の組成物は医薬として使用され、医薬はウイルス、細菌または原生動物感染性疾患を含む感染性疾患を防止、予防、処置および／または改善するためのものであるか、またはこれに適しており、医薬はワクチンである。
別の実施形態において、本発明のワクチンは、ウイルス、細菌または原生動物感染性疾患を含む感染性疾患、がんまたは腫瘍疾患から選択される疾患を防止、予防、処置および／または改善するための、本明細書に記載される組成物またはキットもしくはパーツキットを含む。
本発明のさらに別の態様において、感染性疾患；がんもしくは腫瘍疾患、障害もしくは状態；肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患；アレルギー；または自己免疫疾患、障害もしくは状態を処置または予防する方法であって、
ａ）本明細書に記載されるｍＲＮＡ、組成物、ワクチン、キットまたはパーツキットを用意する工程と；
ｂ）ｍＲＮＡ、組成物、ワクチン、またはキットもしくはパーツキットを組織または生物に適用または投与する工程と
を含む方法が提供される。
別の実施形態において、ｍＲＮＡ、組成物、ワクチン、またはキットもしくはパーツキットが静脈内、筋肉内、皮下または皮内注射によって組織または生物に投与される、方法が提供される。
なおさらなる実施形態において、対象において抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量の本発明のワクチンを対象に投与する工程を含む、対象において免疫応答を誘導する方法が提供される。
さらなる実施形態において、有効用量のウイルス抗原をコードするｍＲＮＡを含む、対象のワクチン接種に使用するための、または使用に適した、本明細書に記載される組成物またはキットもしくはパーツキットを含む医薬組成物が提供される。
別の好ましい実施形態において、（ｉ）免疫応答を誘導するため、または（ｉｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するための、本明細書に記載される組成物またはキットもしくはパーツキットを含む医薬組成物の使用が提供される。
具体的な実施形態において、本明細書に記載される組成物またはキットもしくはパーツキットを、それを必要とする対象に投与する工程を含む、対象における疾患または状態を防止、改善または処置する方法が提供される。
さらに、具体的な実施形態において、組成物の投与が、対象のリンパ球においてｍＲＮＡによってコードされる抗原の発現をもたらす、方法が提供される。さらに、組成物の投与が抗原特異的抗体応答をもたらし、好ましくは、抗原特異的抗体応答が血清中の抗原特異的抗体の存在によって測定される、方法が提供される。
具体的な実施形態において、医薬は、がんまたは腫瘍疾患、ウイルス、細菌または原生動物感染性疾患を含む感染性疾患、自己免疫疾患、アレルギー、遺伝病を含む単一遺伝子疾患、遺伝子疾患全般、遺伝的背景を有し、典型的には定義される遺伝子欠陥によって引き起こされ、メンデルの法則に従って遺伝する疾患；心血管疾患、神経疾患、呼吸器系の疾患、消化器系の疾患、皮膚の疾患、筋骨格障害、結合組織の障害、新生物、免疫不全、アミノ酸障害、内分泌、栄養および代謝疾患、眼疾患、耳疾患、およびペプチドまたはタンパク質欠損に関連する疾患から選択される疾患を防止、予防、処置および／または改善するためのものである。好ましい実施形態の１つでは、医薬は、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、またはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））ワクチンである。
代替実施形態において、本発明は、医薬の製造における医薬組成物またはｍＲＮＡを含む脂質の使用に関する。特に、前記医薬は、それを必要とする対象の免疫応答を治療的または予防的に高めるためのものである。
好ましい実施形態において、医薬は、がんもしくは腫瘍疾患、感染性疾患、アレルギー、またはこれに関連する自己免疫疾患もしく障害を予防または処置するためのものである。
特に、医薬は、対象、好ましくは脊椎動物を処置するためのものである。好ましい実施形態において、対象は、好ましくはヤギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ロバ、サル、類人猿、齧歯類、例えばマウス、ハムスター、ウサギ、および特にヒトを含む群から選択される哺乳動物である。
したがって、１つの好ましい実施形態において、本明細書に記載される組成物は医薬として使用するのに適している。さらに好ましい実施形態において、前記医薬は、ウイルス、細菌または原生動物感染性疾患を含む感染性疾患、がんまたは腫瘍疾患、肝臓疾患、自己免疫疾患、アレルギー、遺伝病を含む単一遺伝子疾患、遺伝子疾患全般、遺伝的背景を有し、典型的には定義される遺伝子欠陥によって引き起こされ、メンデルの法則に従って遺伝する疾患；心血管疾患、神経疾患、呼吸器系の疾患、消化器系の疾患、皮膚の疾患、筋骨格障害、結合組織の障害、新生物、免疫不全、内分泌、栄養および代謝疾患、眼疾患、耳疾患、およびペプチドまたはタンパク質欠損に関連する疾患から選択される疾患を防止、予防、処置および／または改善するためのものである。さらに好ましい実施形態において、医薬として使用するための組成物は、好ましくはワクチンである。
対象、特にヒト対象への組成物の投与に関して、任意の適切な経路が使用され得る。一実施形態において、組成物は、注射または注入による投与に適合される。本明細書で使用される場合、「に適合される」という表現は、組成物が、それぞれの投与経路に適するように製剤化および処理されることを意味する。
さらに好ましい実施形態において、組成物は、血管外注射、注入もしくは埋込；皮膚もしくは粘膜への局所投与；組成物を呼吸器系に送達するためなどの吸入；または経皮もしくは経皮的投与などによる対象への血管外投与に適合される。この文脈において、血管外注射、注入または埋込は、局所または局所領域注射、注入または埋込、特に皮内、皮下、筋肉内、間質内、局所領域、硝子体内、腫瘍内、リンパ内、節内、関節内、関節滑液嚢内、関節周囲、腹腔内、腹部内、心臓内、病巣内、心膜内、脳室内、胸膜内、神経周囲、胸腔内、硬膜外、硬膜内、硬膜上、髄腔内、髄内、脳内、空洞内、海綿体内、前立腺内、精巣内、軟骨内、骨内、円板内、脊髄内、仙骨内、嚢内、歯肉内、卵巣内、子宮内、眼周囲、歯周、眼球後、くも膜下、結膜下、または脈絡膜上注射、注入または埋込によって実施され得る。さらに、皮膚または粘膜への局所投与は、真皮または皮膚、鼻、頬側、舌下、耳または耳介、眼、結膜、膣、直腸、子宮頸部内、副鼻腔内、喉頭、中咽頭、尿管、または尿道投与によって実施され得る。吸入による呼吸器系への投与は、特に、肺、気管支、細気管支、肺胞、または副鼻腔へのエアゾール投与によって実施され得る。
本発明の一態様によると、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、（医薬）組成物またはワクチンは、
（ｉ）感染性疾患；がんもしくは腫瘍疾患、障害もしくは状態；肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患；アレルギー；または自己免疫疾患、障害もしくは状態の処置または予防；および／または
（ｉｉ）代謝、アミノ酸もしくは内分泌障害を処置するための酵素補充療法、または非存在、欠損もしくは変異タンパク質の置換に使用するため
に使用するために（医薬を調製するために）本発明により使用され得る。
この文脈において、特に好ましいのは、マラリア、インフルエンザウイルスもしくは狂犬病ウイルス感染症、またはこのような感染症に関連する障害の処置または予防である。
さらに特に好ましいのは、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、もしくはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、もしくは卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））感染症、またはこのような感染症に関連する障害の処置または予防である。
さらに、薬学的有効量の本発明によるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、（医薬）組成物またはワクチンを、それを必要とする対象に投与することによって、好ましくは本明細書に定義される、がんもしくは腫瘍疾患、感染性疾患、アレルギー、または自己免疫疾患もしくはこれに関連する障害を処置または予防する方法も本発明に含まれる。このような方法は、典型的には本発明のｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、組成物またはワクチンを調製する任意選択の第１の工程と、（薬学的有効量の）前記組成物またはワクチンを、それを必要とする患者／対象に投与することを含む第２の工程とを含む。それを必要とする対象は、典型的には哺乳動物である。本発明の文脈において、哺乳動物は、好ましくはこれに限定されないが、例えばヤギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ロバ、サル、類人猿、齧歯類、例えばマウス、ハムスター、ウサギ、および特にヒトを含む群から選択される。本発明の一部の実施形態において、対象が鳥類、好ましくはニワトリである。
一実施形態において、本発明による組成物、製剤または医薬組成物は、優先的に肝臓の細胞を標的化するが、他の器官（例えば、肺、腎臓、心臓）の細胞は標的化しない。肝臓細胞には、例えば、肝細胞および肝細胞前駆細胞、星細胞／周皮細胞、内皮細胞、クッパー細胞、マクロファージおよび好中球が含まれる。組成物、製剤または医薬組成物が、ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと組み合わせてｇＲＮＡを含む一実施形態において、組成物が優先的に肝細胞、周心肝細胞（健康な肝臓において幹細胞として作用する）、または適切には肝細胞の幹細胞を標的化する。肝臓の細胞の優先的な標的化は、脂質ナノ粒子のサイズおよび中性電荷による。ある特定の例では、肝臓細胞の標的化が、体の他の器官に対する２次効果を有し得るか、またはこれに対して影響を及ぼし得る。したがって、本発明の組成物、製剤または医薬組成物はまた、肝臓に関連する疾患以外の疾患の処置における有用性も有することが認識されよう。
適切には、前記医薬組成物は、限定されるものではないが、肝臓におけるタンパク質発現が脊椎動物病態に影響を及ぼす肝臓疾患の処置に使用するためのものである。上記のように、本明細書に記載される医薬組成物はまた、肝臓に関連しない疾患の処置における用途も見出し得る。
適切には、限定されるものではないが、肝臓疾患または肝臓関連障害に関与する遺伝子のエクソンおよびイントロンならびに調節エレメントを含む、任意の転写産物、転写産物ファミリーまたは一連の異なる転写産物またはゲノム染色体もしくはミトコンドリア配列が、本発明による組成物または製剤を使用して標的化され得る。このような任意の転写産物、転写産物ファミリーまたは一連の異なる転写産物は、本明細書に記載される任意の生物活性化合物によって標的化され得る。一実施形態において、生物活性化合物は、病態関連転写産物を認識する核酸分子、例えば本明細書に記載されるｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ等である。
適切には、任意の肝臓疾患に関与する任意の遺伝子が、本発明による組成物または製剤を使用して標的化され得る。このような遺伝子は、本明細書に記載される任意の生物活性化合物によって標的化され得る。一実施形態において、生物活性化合物は、肝臓疾患遺伝子を認識する核酸分子、例えば本明細書に記載されるｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等である。
本発明はさらに、本明細書に定義される哺乳動物において免疫応答を調節、好ましくは誘導または増強するため、より好ましくはＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、もしくはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、もしくは卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））感染症、またはこれに関連する疾患もしくは障害を防止および／または処置するための、本明細書に定義される本発明によるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、（医薬）組成物またはワクチンの使用を含む。
この文脈において、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、またはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））感染症の処置または予防の支持は、慣用的なＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、またはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））治療法、例えばノイラミニダーゼ阻害剤（例えば、オセルタミビルおよびザナミビル）およびＭ２タンパク質阻害剤（例えば、アダマンタン誘導体）などの抗ウイルス薬による治療と本明細書に定義されるＲＮＡまたは医薬組成物を使用した治療の任意の組合せであり得る。
ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、またはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））感染症の処置または予防の支持はまた、本明細書に定義される他の実施形態のいずれかでも想起され得る。したがって、任意の他のアプローチ、好ましくは上記治療アプローチの１つまたは複数との共治療における、特に抗ウイルス薬と組み合わせた、本発明によるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、（医薬）組成物またはワクチンのいずれの使用も本発明の範囲内にある。
投与について、好ましくは投与経路のいずれも本明細書に定義されるように使用され得る。特に、本発明によるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子によってコードされる抗原に基づいて適応免疫応答を誘導または増強することによって、本明細書に定義されるＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、もしくはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、もしくは卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））感染症、またはこれに関連する疾患もしくは障害を処置または防止するのに適した投与経路が使用される。
そのため、本発明による組成物および／またはワクチンの投与は、さらに、異なる抗原または抗原の組合せをコードする別のｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子またはｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子の組合せを含有し得る、本明細書に定義される別の組成物および／またはワクチンを投与する前、これと同時および／またはこの後に行われ得、本発明によるｍＲＮＡ配列によってコードされる各抗原は、好ましくはＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、またはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））感染症およびこれに関連する疾患または障害を処置または予防するのに適している。
この文脈において、本明細書に定義される処置はまた、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、またはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））感染症に関連する疾患およびこれに関連する疾患または障害の調節を含み得る。
本発明のこの態様の好ましい実施形態によると、本発明による（医薬）組成物またはワクチンは注射によって投与される。当技術分野で公知の任意の適切な注射技術が採用され得る。好ましくは、本発明の組成物が、注射によって、好ましくは無針注射によって、例えばジェット注射によって投与される。
一実施形態において、本発明の組成物は、その各々が好ましくは別々に、好ましくは無針注射によって注射される、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の本明細書に定義されるｍＲＮＡを含む。あるいは、本発明の組成物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のｍＲＮＡを含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のｍＲＮＡは、混合物として、好ましくは本明細書に定義される注射によって、投与される。
さらなる態様において、本発明は、対象を抗原または抗原の組合せに対して免疫化する方法に関する。
本明細書に定義される抗原または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２もしくはそれ以上の抗原の組合せに対して対象を免疫化するための免疫化プロトコルは、典型的には本発明による（医薬）組成物またはワクチンの一連の単回投与または投薬を含む。本明細書で使用される単回投薬は、初回／第１の投与、第２の投与またはそれぞれ好ましくは免疫反応を「ブーストする」ために投与される任意のさらなる投与を指す。この文脈において、各単回投薬は、好ましくは本明細書に定義されるのと同じ抗原または同じ抗原の組合せの投与を含み、２回の単回投薬の投与間の間隔は、少なくとも１日間、好ましくは２、３、４、５、６または７日間から少なくとも１週間、好ましくは２、３、４、５、６、７または８週間まで異なり得る。単回投薬間の間隔は一定であってもよいし、または免疫化プロトコルの過程にわたって変動してもよい、例えば、間隔はプロトコルの開始においてより短く、終わりに向けてより長くなり得る。単回投薬の総数および単回投薬間の間隔に応じて、免疫化プロトコルは、好ましくは少なくとも１週間、より好ましくは数週間（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２週間）、さらにより好ましくは数か月間（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８または２４か月間）続く期間にわたって広がり得る。各単回投薬は、好ましくは本明細書に定義される抗原、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の抗原の組合せの投与を包含するので、少なくとも１回、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２回の注射を伴い得る。一部の場合、本発明による組成物またはワクチンは、典型的には１回の注射で、単回投薬として投与される。本発明によるワクチンが、本明細書に定義される別個の抗原をコードする別々のｍＲＮＡ製剤を含む場合、単回投薬の投与中に行われる注射の最小回数がワクチンの別々の成分の数に対応する。ある特定の実施形態において、単回投薬の投与が、ワクチンの各成分（例えば、１つの本明細書に定義される抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む具体的なｍＲＮＡ製剤）のための２回以上の注射を包含し得る。例えば、ワクチンの個別の成分の総量の一部が異なる体の部分に注射され得るので、２回以上の注射を伴い得る。より具体的な例では、各々が２つの異なる体の部分に投与される４つの別々のｍＲＮＡ製剤を含むワクチンの単回投薬が、８回の注射を含む。典型的には、単回投薬がワクチンの全ての成分を投与するのに必要な全ての注射を含み、単一成分が上に概説される２回以上の注射を伴い得る。本発明によるワクチンの単回投薬の投与が２回以上の注射を包含する場合、注射は本質的に同時にまたは同時発生的に、すなわち、典型的には開業医が次々に単回注射工程を行うのに必要な時間枠内で時間をずらして（ｉｎ ａ ｔｉｍｅ－ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｆａｓｉｏｎ）行われる。したがって、単回投薬の投与は、好ましくは数分間、例えば２、３、４、５、１０、１５、３０または６０分間の期間にわたって広がる。
本明細書に定義されるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、本発明による（医薬）組成物またはワクチンの投与は、時間をずらした処置で行われ得る。時間をずらした処置は、例えばＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、もしくはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、もしくは卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））感染症、またはこれに関連する疾患もしくは障害を処置または予防するのに適した治療または治療薬の投与の前、これと同時および／またはこの後のｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、組成物またはワクチンの投与による、例えばＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、もしくはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、もしくは卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））感染症、またはこれに関連する疾患もしくは障害の慣用的な治療の前、これと同時および／またはこの後のｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、組成物またはワクチンの投与であり得る。このような時間をずらした処置は、例えば本明細書に定義されるキット、好ましくはパーツキットを使用して行われ得る。
時間をずらした処置は、さらにまたは代わりに、好ましくは組成物またはワクチンの一部を形成する、本明細書に定義される抗原性ペプチドもしくはタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードするｍＲＮＡが、好ましくは同じ本発明の組成物またはワクチンの一部を形成する、上に定義される別のｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子と並行して、これの前にまたはこの後に投与される形態での、本明細書に定義されるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、本発明による（医薬）組成物またはワクチンの投与も含む。好ましくは、（全てのｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子の）投与が、１時間以内、より好ましくは３０分以内、さらにより好ましくは１５、１０、５、４、３、または２分以内、さらには１分以内に行われる。このような時間をずらした処置は、例えば本明細書に定義されるキット、好ましくはパーツキットを使用して行われ得る。
好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物またはワクチンが繰り返し投与され、各投与が好ましくは本発明の組成物またはワクチンの少なくとも１つのｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子の個別の投与を含む。投与の各時点で、少なくとも１つのｍＲＮＡが２回以上（例えば、２回または３回）投与され得る。本発明の特に好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ配列が同じまたは異なる脂質ナノ粒子のｍＲＮＡ化合物の一部である、上に定義されるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子にカプセル化されたまたはこれと会合した少なくとも２、３、４、５、６またはそれ以上のｍＲＮＡ配列（それぞれ本明細書に定義される抗原の別個のものをコードする）が各時点で投与され、各ｍＲＮＡが、四肢にわたって分配される、注射によって２回投与される。
別の好ましい実施形態において、（ｉ）免疫応答を誘導するため、（ｉｉ）抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するため、または好ましくは（ｉｉｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するための本発明の組成物または本発明のキットもしくはパーツキットを含む医薬組成物の使用が提供される。（ｉ）免疫応答を誘導するため、（ｉｉ）抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するため、または好ましくは（ｉｉｉ）対象においてＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するための前記方法が、少なくとも１つの同様に本明細書に記載される免疫原性ペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む、有効量の本明細書に記載される組成物を、それを必要とする対象に少なくとも１回投与する工程を含む。別の実施形態において、参照（脂質ナノ粒子）製剤または組成物と比較して、（ｉ）免疫応答を誘導するため、（ｉｉ）抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するため、または好ましくは（ｉｉｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するための本発明の組成物または本発明のキットもしくはパーツキットを含む医薬組成物の使用が提供される。好ましい実施形態において、前記参照（脂質ナノ粒子）製剤または組成物が、ＤＰｈｙＰＥおよび／または式（Ｉ）によるカチオン性脂質を含まない。
第１および第２の／さらなる医学的使用：
さらなる態様は、本発明の脂質賦形剤を含む、本発明の組成物が前記核酸を送達するために使用される、提供される核酸、組成物、ポリペプチド、ワクチン、またはキットの第１の医学的使用に関する。特に、核酸、組成物、ポリペプチド、ワクチン、またはキットもしくはパーツキットに関する実施形態も同様に、本発明の医学的使用の適切な実施形態で読まれ、本発明の医学的使用の適切な実施形態として理解され得る。
したがって、本発明は、医薬として使用するための、少なくとも１つの第１の態様に定義される核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、好ましくはＲＮＡ、医薬として使用するための組成物、医薬として使用するための定義されるポリペプチド、医薬として使用するための定義されるワクチン、および医薬として使用するためのキットまたはパーツキットを提供し、本発明の脂質賦形剤を含む、本発明の組成物は前記核酸を送達するために使用される。
本発明はさらに、核酸、組成物、ポリペプチド、ワクチン、またはキットのいくつかの用途および使用を提供する、すなわち、特に、核酸（好ましくは、ＲＮＡ）、組成物、ポリペプチド、ワクチン、またはキットは、ヒト医学的目的およびまた獣医学的医学的目的、好ましくはヒト医学的目的に使用され得、本発明の脂質賦形剤を含む、本発明の組成物は前記核酸を送達するために使用される。
特に、核酸（好ましくは、ＲＮＡ）、組成物、ポリペプチド、ワクチン、またはキットもしくはパーツキットはヒト医学的目的のための医薬として使用するためのものであり、前記核酸（好ましくは、ＲＮＡ）、組成物、ポリペプチド、ワクチン、またはキットもしくはパーツキットは、若齢乳児、新生児、免疫不全レシピエント、ならびに妊婦および授乳中の女性、および高齢者に適し得る。特に、核酸（好ましくは、ＲＮＡ、最も好ましくはｍＲＮＡ）、組成物、ポリペプチド、ワクチン、またはキットもしくはパーツキットはヒト医学的目的のための医薬として使用するためのものであり、前記核酸（（好ましくは、ＲＮＡ、最も好ましくはｍＲＮＡ）、組成物、ポリペプチド、ワクチン、またはキットもしくはパーツキットは高齢ヒト対象に特に適している。
前記核酸（好ましくは、ＲＮＡ）、組成物、ポリペプチド、ワクチン、またはキットはヒト医学的目的のための医薬として使用するためのものであり、前記ＲＮＡ、組成物、ワクチン、またはキットもしくはパーツキットは筋肉内注射または皮内注射に特に適し得る。
さらに別の態様において、本発明は、提供される核酸、組成物、ポリペプチド、ワクチン、またはキットの第２の医学的使用に関する。
したがって、本発明は、コロナウイルス、好ましくはベータコロナウイルス、より好ましくは重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による感染症、または２０１９年新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）などの、このような感染症に関連する障害もしくは疾患を処置または予防するための、核酸、好ましくはＲＮＡ、最も好ましくはｍＲＮＡを送達するために使用される本発明の脂質賦形剤を含む、本発明の組成物に含まれる少なくとも１つの核酸；コロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスによる感染症、またはＣＯＶＩＤ－１９などの、このような感染症に関連する障害もしくは疾患を処置または予防するための組成物；コロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスによる感染症、またはＣＯＶＩＤ－１９などの、このような感染症に関連する障害もしくは疾患を処置または予防するためのポリペプチド；コロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスによる感染症、またはＣＯＶＩＤ－１９などの、このような感染症に関連する障害もしくは疾患を処置または予防するためのワクチン；コロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスによる感染症、またはＣＯＶＩＤ－１９などの、このような感染症に関連する障害もしくは疾患を処置または予防するためのキットまたはパーツキットを提供する。
他の実施形態において、核酸、好ましくはＲＮＡ、最も好ましくはｍＲＮＡ、組成物、ポリペプチド、ワクチン、またはキットもしくはパーツキットは、コロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスによる感染症の処置または予防に使用するためのものであり、本発明の脂質賦形剤を含む、本発明の組成物は、前記核酸を送達するために使用される。
特に、核酸、好ましくはＲＮＡ、最も好ましくはｍＲＮＡ、組成物、ポリペプチド、ワクチン、またはキットもしくはパーツキットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス感染によって引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９疾患の予防的（曝露前予防もしくは曝露後予防）および／または治療的処置の方法に使用され得、本発明の脂質賦形剤を含む、本発明の組成物は、前記核酸を送達するために使用される。
核酸、組成物、ポリペプチド、またはワクチンは、好ましくは局所投与され得る。特に、組成物またはワクチンは皮内、皮下、鼻腔内、または筋肉内経路によって投与され得、本発明の脂質賦形剤を含む、本発明の組成物は、前記核酸を送達するために使用される。他の実施形態において、前記核酸、組成物、ポリペプチド、ワクチンは、慣用的な針注射または無針ジェット注射によって投与され得る。筋肉内注射がその文脈で好ましい。
他の実施形態において、本明細書に定義される核酸を送達するために使用される、本発明の脂質賦形剤を含む、本発明の組成物に含まれる核酸は、約１００ｎｇ～約５００μｇの量、約１μｇ～約２００μｇの量、約１μｇ～約１００μｇの量、約５μｇ～約１００μｇの量、好ましくは約１０μｇ～約５０μｇの量、具体的には、約１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、９０μｇ、９５μｇまたは１００μｇの量で提供される。
一実施形態において、コロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに対して対象を処置または予防するための免疫化プロトコルは組成物またはワクチンの単回投与を含み、本発明の脂質賦形剤を含む、本発明の組成物は、前記核酸を送達するために使用される。
一部の実施形態において、有効量は、１回のワクチン接種で対象に投与される１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１１μｇ、１２μｇ、１３μｇ、１４μｇ、１５μｇ、１６μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、７５μｇ、１００μｇまたは２００μｇの用量であり、本発明の脂質賦形剤を含む、本発明の組成物は、前記核酸を送達するために使用される。好ましい実施形態において、コロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス感染症を処置または予防するための免疫化プロトコルは、組成物またはワクチンの一連の単回投与または投薬、好ましくは合計２回の投与を含み、本発明の脂質賦形剤を含む、本発明の組成物は、前記核酸を送達するために使用される。本明細書で使用される単回投薬は、初回／第１の投与、第２の投与またはそれぞれ好ましくは免疫反応を「ブーストする」ために投与される任意のさらなる投与を指し、本発明の脂質賦形剤を含む、本発明の組成物は、前記核酸を送達するために使用される。
好ましい実施形態において、ワクチン／組成物は、（本明細書に定義されるように投与すると）コロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス感染症に対して対象を少なくとも１年間、好ましくは少なくとも２年間免疫化し、免疫化のために、本発明の脂質賦形剤を含む、本発明の組成物は、前記核酸を送達するために使用される。
標準治療
より好ましくは、本発明のＲＮＡ、その組合せを含む医薬組成物もしくはワクチン、または前記ＲＮＡを含む医薬組成物もしくはワクチンを受ける対象が、本明細書に記載される腫瘍またはがん疾患を患っており、化学療法（例えば、第１選択もしくは第２選択化学療法）、放射線療法、化学放射線療法／化学放射線（化学療法と放射線療法の組合せ）、キナーゼ阻害剤、抗体療法および／またはチェックポイントモジュレータ（例えば、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＰＤ１経路阻害剤）を受けたか、または受けている患者、あるいは上に指定される処置の１つまたは複数を受けた後に部分奏功または安定な疾患を達成した患者である。より好ましくは、対象が、本明細書に記載される腫瘍またはがん疾患を患っており、本明細書に記載されるこれらの疾患のいずれかで慣用的に使用される化合物を受けたか、または受けている患者、より好ましくはチェックポイントモジュレータを受けているか、または受けた患者である。
好ましくは標準治療で使用され、本発明のＲＮＡを含む医薬組成物またはワクチンと組み合わせて適用され得る化合物には、限定されるものではないが、国際公開第２０１８／０７８０５３号の５６～５８頁に開示されるものが含まれる；国際公開第２０１８／０７８０５３号全体を本願明細書に援用する。
腫瘍適応症（Ｔｕｍｏｕｒ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）
本明細書で使用される場合、「腫瘍」、「がん」または「がん疾患」という用語は、好ましくは、限定されるものではないが、国際公開第２０１８／０７８０５３号の５８～５９頁に開示される悪性疾患の群から選択される悪性疾患を指す；国際公開第２０１８／０７８０５３号全体を本願明細書に援用する。
例示的な実施形態
以下では、本発明の様々な実施形態のいくつかのセットを開示する。本明細書においては、実施形態のセットから生じる各実施形態および全ての実施形態を互いに組み合わせることができる、すなわち、実施形態の第１のセットからの実施形態１を、例えば実施形態の第２のセットからの実施形態３と組み合わせることができることが意図される。
実施形態の第１のセット
１．式（Ｉ）によるカチオン性脂質：
Ｒａ－Ａ－Ｒｂ 式（Ｉ）
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは立体異性体
（式中、
Ｒａは、
－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４
から選択され；
Ｒｂは、
－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４、または
－Ｒ１－Ｎ（ＣＨ３）２
から選択され；
Ａは－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｓ－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－であり；
Ｒ１は場合により置換されたエタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、または２～８個の炭素原子を有する直鎖もしくは非分岐アルカンジイルであり；
Ｒ２は２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｒ３は任意選択であり、存在する場合、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｒ５－ＯＣ（Ｏ）－ＮＨ－、またはＲ５－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり；
Ｒ４は１２～３６個の炭素原子を有する親油性置換基であり；
Ｒ５は１～６個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｘは炭素または窒素原子であり；
全ての選択は互いに独立している）。
２．Ｒ５が、各出現で独立に選択される、３～６個の炭素原子を有するアルカンジイルである、実施形態１に記載のカチオン性脂質。
３．Ｒ４が、各出現で独立に選択される、１２～２５個の炭素原子を有するアルキルまたはアルケニルである、実施形態１乃至実施形態２に記載のカチオン性脂質。
４．ＲａおよびＲｂが
－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４
から独立に選択される、
実施形態１乃至実施形態３に記載のカチオン性脂質。
５．ＲａおよびＲｂの各々が、各出現で独立に選択される、
であり；
Ｒ５が、各出現で独立に選択される、２～６個の炭素原子を有するアルカンジイルである、
実施形態１乃至実施形態４に記載のカチオン性脂質。
６．Ａが－Ｓ－Ｓ－である、実施形態５に記載のカチオン性脂質。
７．Ｒ４が、各出現で独立に選択される、１２～２５個の炭素原子を有するアルキルまたはアルケニルである、実施形態６に記載のカチオン性脂質。
８．各Ｒ４が、
から各出現で独立に選択されるアルキルである、
実施形態７に記載のカチオン性脂質。
９．Ｒ３が－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－または－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｒ４が
であり；
ＲａおよびＲｂが同一である、
実施形態８に記載のカチオン性脂質。
１０．Ｒ３が－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－である、実施形態９に記載のカチオン性脂質。
１１．Ｘが炭素原子である、実施形態１０に記載のカチオン性脂質。
１２．Ｒ１がエタンジイルである、実施形態１１に記載のカチオン性脂質。
１３．各出現で独立に選択される、以下の特徴：
（ｉ）Ｒ１が非置換エタンジイル、プロパンジイル、またはブタンジイルである；
（ｉｉ）Ｒ２が２～８個の炭素原子を有する直鎖、非分岐アルカンジイルである；
（ｉｉｉ）Ｒ３が－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－または－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－である；
（ｉｖ）Ｒ４が１２～２５個の炭素原子を有するアルキルまたはアルケニルである；
（ｖ）Ｒ５が２～６個の炭素原子を有するアルカンジイルである；および／または
（ｖｉ）Ｘが炭素原子である、
の１つまたは複数をさらに示す、実施形態１乃至１２のいずれか１つに記載のカチオン性脂質。
１４．表１に列挙される化合物の１つから選択される、実施形態１に記載のカチオン性脂質。
１５．
（ｉ）実施形態１乃至１４のいずれか１つに記載のカチオン性脂質；または
（ｉｉ）表１に列挙されるカチオン性脂質Ｃ１５
を含む組成物。
１６．以下の賦形剤：
（ｉ）ステロイド、好ましくはコレステロール；
（ｉｉ）中性脂質
（前記中性脂質は、好ましくは場合により中性脂質１，２－ジヘプタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＨＰＣ）と組み合わせた１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）である；または前記中性脂質は双性イオン性化合物、場合によりペンタノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル、ノナノイル（ｎｏｎａｏｙｌ）およびデカノイルから選択される２つの脂肪酸部分を有する双性イオン性化合物と組み合わせた、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイルおよびオレオイル（ｏｌｅｙｏｌ）から選択される２つの脂肪酸部分を有する双性イオン性化合物である）；
および／または
（ｉｉｉ）ポリマーコンジュゲート脂質
（前記ポリマーコンジュゲート脂質は式（ＩＩ）による化合物：
Ｐ－Ａ－Ｌ 式（ＩＩ）
（式中、Ｐは親水性ポリマー部分であり、Ａは任意選択のリンカーであり、Ｌは脂質部分である）
であり、
好ましくは、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質である）
の１つまたは複数をさらに含む、実施形態１５に記載の組成物。
１７．以下の賦形剤：
（ｉ）実施形態１乃至１４のいずれか１つに記載のカチオン性脂質または第３級もしくは第４級窒素／アミノ基を含むカチオン性脂質または生理的ｐＨで正味の正の電荷を有するカチオン性脂質；
（ｉｉ）ステロイド、好ましくはコレステロール；
（ｉｉｉ）実施形態１６の部分項目（ｉｉ）に記載される中性脂質；ならびに／あるいは
（ｉｖ）ポリマーコンジュゲート脂質（前記ポリマーコンジュゲート脂質は式（ＩＩ）による化合物：
Ｐ－Ａ－Ｌ 式（ＩＩ）
（式中、Ｐは親水性ポリマー部分であり、Ａは任意選択のリンカーであり、Ｌは脂質部分である）
であり、
好ましくは、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質であり；
より好ましくは、脂質部分Ｌは８、１０、または１２個の炭素原子、好ましくは８または１０個の炭素原子を含む少なくとも１つの脂肪酸（「尾部」）を含み；
さらにより好ましくは、ペグ化脂質は１，２－ジカプリル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレングリコール２０００（Ｃ１０－ＰＥＧ２０００）；およびＮ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝（Ｃｅｒ８－ＰＥＧ２０００）からなる群から選択される）
の１つまたは複数を含む組成物。
１８．
以下の賦形剤：
（ｉ）実施形態１７の部分項目（ｉ）に記載されるカチオン性脂質；
（ｉｉ）ステロイド、好ましくはコレステロール；
（ｉｉｉ）実施形態１６の部分項目（ｉｉ）に記載される中性脂質；および／または
（ｉｖ）ポリマーコンジュゲート脂質（前記ポリマーコンジュゲート脂質は式（ＩＩ）による化合物：
Ｐ－Ａ－Ｌ 式（ＩＩ）
（式中、Ｐは親水性ポリマー部分であり、Ａは任意選択のリンカーであり、Ｌは脂質部分である）
であり、好ましくは、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質であり；
より好ましくは、ペグ化脂質は１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）からなる群から選択される）
の１つまたは複数を含む組成物。
１９．好ましくは、
（ａ－ｉ）３０～７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２０～５０ｍｏｌ％の量のステロイド；５～２５ｍｏｌ％の量の中性脂質；および０．５～５ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ａ－ｉｉ）４０～７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２０～５０ｍｏｌ％の量のステロイド；５～１５ｍｏｌ％の量の中性脂質；および０．５～５ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ａ－ｉｉｉ）２０～６０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２５～５５ｍｏｌ％の量のステロイド；５～２５ｍｏｌ％の量のリン脂質；および０．５～１５ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ａ－ｉｖ）４５～６５ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２５～４５ｍｏｌ％の量のステロイド；８～１２ｍｏｌ％の量のリン脂質；および１～３ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ａ－ｖ）４５～６５ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２５～４５ｍｏｌ％の量のコレステロール；８～１２ｍｏｌ％の量の中性脂質；および１～３ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ａ－ｖｉ）４５～６５ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２５～４５ｍｏｌ％の量のコレステロール；８～１２ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥおよび場合により１～１０ｍｏｌ％の量のＤＨＰＣ；ならびに１～３ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；ならびに
（ａ－ｖｉｉ）４５～６５ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２５～４５ｍｏｌ％の量のコレステロール；８～１２ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥおよび場合により１～１０ｍｏｌ％の量のＤＨＰＣ；ならびに１～３ｍｏｌ％の量のＰＥＧ－ＤＭＧ２０００；
からなる群から選択される比の賦形剤を含むか、
または
より好ましくは、
（ｂ－ｉ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のステロイド；１０ｍｏｌ％の量の中性脂質；および１．７ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ｂ－ｉｉ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；１０ｍｏｌ％の量の中性脂質；および１．７ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ｂ－ｉｉｉ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；１０ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥ；および１．７ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ｂ－ｉｖ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；１０ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥ；および１．７％の量のＣ１０－ＰＥＧ２０００；ならびに
（ｂ－ｖ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；１０ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥ；および１．７％の量のＣｅｒ８－ＰＥＧ２０００
からなる群から選択される比の賦形剤を含み；
（各量は脂質ナノ粒子の脂質賦形剤の総モル量に対するものである）
より好ましくは、
（ｃ－ｉ）表Ｆに開示されるＦ１～Ｆ６０からなる群から選択されるｍｏｌパーセンテージの表Ｅに開示されるＥ１～Ｅ６９からなる群から選択される脂質賦形剤組合せ
からなる群から選択される比の賦形剤を含む、
実施形態１５乃至１８のいずれか１つに記載の組成物。
２０．好ましくは、
（ｉ）５９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ２３、２９．３ｍｏｌ％のコレステロール、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；
（ｉｉ）５９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ２、２９．３ｍｏｌ％のコレステロール、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；または
（ｉｉｉ）５９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ１５、２９．３ｍｏｌ％のコレステロール、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００
の比の賦形剤を含む、実施形態１５乃至１９のいずれか１つに記載の組成物。
２１．生物活性成分をさらに含む、実施形態１５乃至２０のいずれか１つに記載の組成物。
２２．生物活性成分が、人工ｍＲＮＡ、少なくとも１つのコード配列を含む化学修飾もしくは非修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、自己複製ＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、およびレプリコンＲＮＡ；またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される核酸化合物であり、好ましくは生物活性成分がｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ化合物である、実施形態２１に記載の組成物。
２３．脂質ナノ粒子が
（ｉ）１０～２０の範囲のＮ／Ｐ比を達成するような量；または
（ｉｉ）２０～６０、好ましくは約３～約１５、５～約１３、約４～約８または約７～約１１の範囲の脂質：ｍＲＮＡ重量比を達成するような量
のｍＲＮＡを含む、実施形態１５乃至２２のいずれか１つに記載の組成物。
２４．無菌液体担体で再構成するための無菌固体組成物であり、ｐＨ修正剤、増量剤、安定剤、非イオン性界面活性剤および抗酸化剤から選択される１種または複数の不活性成分をさらに含み、無菌液体担体が水性担体である、実施形態１５乃至２３のいずれか１つに記載の組成物。
２５．無菌液体組成物であり、脂質ナノ粒子が、約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、または約６０ｎｍ～約２５０ｎｍ、または約６０ｎｍ～約２００ｎｍ、または約７０～２００ｎｍ、または約７５ｎｍ～約１６０、または約９０ｎｍ～約１４０ｎｍ、または約１００ｎｍ～約１４０ｎｍの動的光散乱によって決定される平均流体力学的径を有する、実施形態１５乃至２４のいずれか１つに記載の組成物。
２６．脂質ナノ粒子が－５０ｍＶ～＋５０ｍＶの範囲のゼータ電位を示す、実施形態１５乃至２５のいずれか１つに記載の組成物。
２７．ｍＲＮＡ化合物がモノ、バイ、またはマルチシストロン性ｍＲＮＡである、実施形態２２乃至２６のいずれか１つに記載の組成物。
２８．ｍＲＮＡ化合物が少なくとも１つの化学修飾を含む、実施形態２２乃至２６のいずれか１つに記載の組成物。
２９．化学修飾が塩基修飾、糖修飾、骨格修飾および脂質修飾からなる群から選択され、好ましくは、化学修飾が塩基修飾であり、より好ましくは、塩基修飾が、好ましくは、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウラシル（Ｎ１Ｍψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、実施形態２８に記載の組成物。
３０．ｍＲＮＡ化合物がペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域を含み、コード領域が配列修飾を示す、実施形態２２乃至２９のいずれか１つに記載の組成物。
３１．配列修飾が配列のＧ／Ｃ含量修飾、コドン修飾、コドン最適化またはＣ最適化から選択され；好ましくは、
対応する野生型ｍＲＮＡのコード領域と比較して、
－ コード領域のＧ／Ｃ含量が増加している；
－ コード領域のＣ含量が増加している；
－ コード領域のコドン使用頻度がヒトコドン使用頻度に適合されている；および／またはコドン適応指標（ＣＡＩ）がコード領域で増加もしくは最大化している、実施形態３０に記載の組成物。
３２．ｍＲＮＡ化合物が、
ａ）５’キャップ構造；
ｂ）好ましくは、マイクロＲＮＡ結合部位がｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、ｍｉＲ－２６ａ、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択されるマイクロＲＮＡのためのものである、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列；
ｃ）少なくとも１つの５’－ＵＴＲエレメント；
ｄ）少なくとも１つのポリ（Ａ）配列；
ｅ）少なくとも１つのポリ（Ｃ）配列；
ｆ）少なくとも１つの３’－ＵＴＲエレメント；
またはこれらの任意の組合せ
をさらに含む、実施形態２２乃至３１のいずれか１つに記載の組成物。
３３．少なくとも１つのコードＲＮＡが、５’キャップ構造、好ましくはｍ７Ｇ、キャップ０、キャップ１、キャップ２、修飾キャップ０または修飾キャップ１構造を含む、実施形態２２乃至３２のいずれか１つに記載の組成物。
３４．少なくとも１つのコードＲＮＡが少なくとも１つの異種５’－ＵＴＲおよび／または少なくとも１つの異種３’－ＵＴＲを含み、好ましくは、少なくとも１つの異種５’－ＵＴＲが、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＲＰＬ３２、ＡＳＡＨ１、ＡＴＰ５Ａ１、ＭＰ６８、ＮＤＵＦＡ４、ＮＯＳＩＰ、ＲＰＬ３１、ＳＬＣ７Ａ３、ＴＵＢＢ４ＢおよびＵＢＱＬＮ２から選択される遺伝子の５’－ＵＴＲ、またはこれらの遺伝子のいずれか１つのホモログ、断片もしくはバリアントから誘導される核酸配列を含む；および／または
好ましくは、少なくとも１つの異種３’－ＵＴＲが、ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ７、アルファ－グロビン、ＣＡＳＰ１、ＣＯＸ６Ｂ１、ＧＮＡＳ、ＮＤＵＦＡ１およびＲＰＳ９から選択される遺伝子の３’－ＵＴＲ、またはこれらの遺伝子のいずれか１つのホモログ、断片もしくはバリアントから誘導される核酸配列を含む、実施形態２２乃至３３のいずれか１つに記載の組成物。
３５．少なくとも１つのコードＲＮＡが、（ｉ）ＨＳＤ１７Ｂ４ ５’－ＵＴＲおよびＰＳＭＢ ３’－ＵＴＲ、または（ｉｉ）ＲＰＬ３２ ５’－ＵＴＲおよびＡＬＢ７ ３’－ＵＴＲを含む、実施形態２２乃至３４のいずれか１つに記載の組成物。
３６．５’→３’方向に、以下のエレメント：
ａ）好ましくはｍ７Ｇ（５’）、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）およびｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）からなる群から選択される、５’キャップ構造；
ｂ）ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲから誘導される核酸配列を含む５’－ＵＴＲエレメント（前記核酸配列は、好ましくは、配列番号２２、２４、２６による核酸配列、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントに対応するＲＮＡ配列を含む）；
ｃ）少なくとも１つのコード配列；
ｄ）α－グロビン遺伝子から誘導される核酸配列を含む３’－ＵＴＲエレメント（前記核酸配 列は、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０による核酸配列、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントに対応するＲＮＡ配列を含む）；および／またはアルブミン遺伝子から誘導される核酸配列を含む３’－ＵＴＲエレメント（前記核酸配列は、好ましくは、配列番号１８による核酸配列、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントに対応するＲＮＡ配列を含む）；
ｅ）場合により、好ましくは１０～２００、１０～１００、４０～８０、５０～７０、または７０～９０個のアデノシンヌクレオチドからなる、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列；
ｆ）場合により、好ましくは１０～２００、１０～１００、２０～７０、２０～６０または１０～４０個のシトシンヌクレオチドからなる、少なくとも１つのポリ（Ｃ）配列；ならびに
ｇ）場合により、好ましくは配列番号４によるＲＮＡ配列を含む、少なくとも１つのヒストンステムループ
を含む、実施形態２２乃至３５のいずれか１つに記載の組成物。
３７．生物活性成分が、
（ａ）ペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列を含むｍＲＮＡであって、ペプチドまたはタンパク質が抗原であり、抗原が、好ましくは、病原性抗原、腫瘍抗原、アレルゲン抗原もしくは自己免疫自己抗原、またはその断片もしくはバリアントから誘導される、ｍＲＮＡ；または
（ｂ）治療用タンパク質、またはその断片もしくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列を含むｍＲＮＡであって、治療用タンパク質が、
（ｉ）代謝、内分泌もしくはアミノ酸障害を処置するための酵素補充療法に使用するため、または非存在、欠損もしくは変異タンパク質の置換に使用するための治療用タンパク質；
（ｉｉ）血液障害、循環系の疾患、呼吸器系の疾患、感染性疾患または免疫不全の処置に使用するための治療用タンパク質；
（ｉｉｉ）がんまたは腫瘍疾患の処置に使用するための治療用タンパク質；
（ｉｖ）ホルモン補充療法に使用するための治療用タンパク質；
（ｖ）体細胞を多能性または全能性幹細胞に再プログラミングするのに使用するための治療用タンパク質；
（ｖｉ）アジュバントまたは免疫賦活として使用するための治療用タンパク質；
（ｖｉｉ）治療用抗体である治療用タンパク質；
（ｖｉｉｉ）遺伝子編集剤である治療用タンパク質；および
（ｉｘ）肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患の処置または防止に使用するための治療用タンパク質
からなる群から選択される、ｍＲＮＡ
である、実施形態２１乃至３６のいずれか１つに記載の組成物。
３８．抗原が、細菌、ウイルス、真菌および原生動物抗原からなる群から選択される病原性抗原をコードする、実施形態３７部分項目（ａ）に記載の組成物。
３９．病原性抗原が、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、またはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））から誘導される、実施形態３８に記載の組成物。
４０．（ｉ）感染性疾患；がんもしくは腫瘍疾患、障害もしくは状態；肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患；アレルギー；または自己免疫疾患、障害もしくは状態の処置または予防において；および／または
（ｉｉ）代謝もしくは内分泌障害を処置するための酵素補充療法に使用するための、または非存在、欠損もしくは変異タンパク質の置換に使用するための、
使用するための、実施形態１５乃至３９のいずれか１つに記載の組成物。
４１．感染性疾患の処置または予防に使用するための、実施形態１５乃至３９のいずれか１つに記載の組成物。
４２．疾患、障害または状態の処置または防止に使用するための少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む、少なくとも１つのコードＲＮＡを含み、それを必要とする対象に筋肉内または皮内注射を介して投与される、実施形態４０または４１に記載の組成物。
４３．場合により、可溶化のための液体ビヒクル、および場合により、成分の用法および用量についての情報を提供する技術的説明書を含む、実施形態２１乃至４２に記載の組成物のいずれか１つを含む、キットまたはパーツキット。
４４．医薬として使用するための、実施形態２１乃至４２のいずれか１つに記載の組成物または実施形態４３に記載のキットもしくはパーツキット。
４５．医薬が、ウイルス、細菌または原生動物学的感染性疾患を含む感染性疾患、がんまたは腫瘍疾患、肝臓疾患、自己免疫疾患、アレルギー、遺伝病を含む単一遺伝子疾患、遺伝子疾患全般、遺伝的背景を有し、典型的には定義される遺伝子欠陥によって引き起こされ、メンデルの法則に従って遺伝する疾患；心血管疾患、神経疾患、呼吸器系の疾患、消化器系の疾患、皮膚の疾患、筋骨格障害、結合組織の障害、新生物、免疫不全、内分泌、栄養および代謝疾患、眼疾患、耳疾患、およびペプチドまたはタンパク質欠損に関連する疾患から選択される疾患を防止、予防、処置および／または改善するためのものである、実施形態４４に記載の医薬として使用するための組成物。
４６．医薬がワクチンである、実施形態４４または４５に記載の医薬として使用するための組成物。
４７．ウイルス、細菌または原生動物学的感染性疾患を含む感染性疾患、がんまたは腫瘍疾患から選択される疾患を防止、予防、処置および／または改善するための、実施形態１５乃至４２のいずれか１つに記載の組成物または実施形態４３に記載のキットもしくはパーツキットを含むワクチン。
４８．感染性疾患；がんもしくは腫瘍疾患、障害もしくは状態；肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患；アレルギー；または自己免疫疾患、障害もしくは状態を処置または予防する方法であって、
ａ）上記実施形態のいずれか１つに記載されるｍＲＮＡ、上記実施形態のいずれか１つに記載される組成物、実施形態４７に記載のワクチン、実施形態４３に記載のキットまたはパーツキットを用意する工程と；
ｂ）ｍＲＮＡ、組成物、ワクチン、またはキットもしくはパーツキットを組織または生物に適用または投与する工程と
を含む方法。
４９．実施形態１５乃至４２のいずれか１つに記載のｍＲＮＡ、組成物、実施形態４７に記載のワクチン、または実施形態４３に記載のキットもしくはパーツキットが、静脈内、筋肉内、皮下または皮内注射によって組織または生物に投与される、実施形態４８に記載の方法。
５０．対象において抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量の実施形態４７に記載のワクチンを対象に投与する工程を含む、対象において免疫応答を誘導する方法。
５１．有効用量のウイルス抗原をコードするｍＲＮＡを含む、対象のワクチン接種に使用するための、実施形態１５乃至４２のいずれか１つに記載の組成物または実施形態４３に記載のキットもしくはパーツキットを含む医薬組成物。
５２．（ｉ）免疫応答を誘導するため、（ｉｉ）抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するため、または好ましくは（ｉｉｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するための、実施形態１５乃至４２のいずれか１つに記載の組成物または実施形態４３に記載のキットもしくはパーツキットを含む医薬組成物の使用。
５３．感染性疾患を予防するための、または感染性疾患を予防するための医薬の製造における、実施形態５２に記載の医薬組成物の使用であって、前記医薬が、好ましくはワクチンである、使用。
５４．実施形態１５乃至４２のいずれか１つに記載の組成物または実施形態４３に記載のキットもしくはパーツキットを、それを必要とする対象に投与する工程を含む、対象における疾患または状態を防止、改善または処置する方法。
５５．組成物の投与が、対象のリンパ球においてｍＲＮＡによってコードされる抗原の発現をもたらす、前記方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５６．組成物の投与が抗原特異的抗体応答をもたらし、好ましくは、抗原特異的抗体応答が血清中の抗原特異的抗体の存在によって測定される、前記方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態の第２のセット
１．式（Ｉ）によるカチオン性脂質：
Ｒａ－Ａ－Ｒｂ 式（Ｉ）
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは立体異性体
（式中、
Ｒａは、
－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４
から選択され；
Ｒｂは、
－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４、または
－Ｒ１－Ｎ（ＣＨ３）２
から選択され；
Ａは－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｓ－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－であり；
Ｒ１は場合により置換されたエタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、または２～８個の炭素原子を有する直鎖もしくは非分岐アルカンジイルであり；
Ｒ２は２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｒ３は任意選択であり、存在する場合、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｒ５－ＯＣ（Ｏ）－ＮＨ－、またはＲ５－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり；
Ｒ４は１２～３６個の炭素原子を有する親油性置換基であり；
Ｒ５は１～６個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｘは炭素または窒素原子であり；
全ての選択は互いに独立している）
を含み、
以下の賦形剤：
（ｉ）コレステロール；
（ｉｉ）１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）；
および／または
（ｉｉｉ）１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）、１，２－ジカプリル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレングリコール２０００（Ｃ１０－ＰＥＧ２０００）；およびＮ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝（Ｃｅｒ８－ＰＥＧ２０００）からなる群から選択されるペグ化脂質
の１つまたは複数をさらに含む、
組成物。
２．好ましくは、
（ａ－ｉ）３０～７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２０～５０ｍｏｌ％の量のステロイド；５～２５ｍｏｌ％の量の中性脂質；および０．５～５ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ａ－ｉｉ）４０～７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２０～５０ｍｏｌ％の量のステロイド；５～１５ｍｏｌ％の量の中性脂質；および０．５～５ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ａ－ｉｉｉ）２０～６０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２５～５５ｍｏｌ％の量のステロイド；５～２５ｍｏｌ％の量のリン脂質；および０．５～１５ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ａ－ｉｖ）４５～６５ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２５～４５ｍｏｌ％の量のステロイド；８～１２ｍｏｌ％の量のリン脂質；および１～３ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ａ－ｖ）４５～６５ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２５～４５ｍｏｌ％の量のコレステロール；８～１２ｍｏｌ％の量の中性脂質；および１～３ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ａ－ｖｉ）４５～６５ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２５～４５ｍｏｌ％の量のコレステロール；８～１２ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥおよび場合により１～１０ｍｏｌ％の量のＤＨＰＣ；ならびに１～３ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；ならびに
（ａ－ｖｉｉ）４５～６５ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２５～４５ｍｏｌ％の量のコレステロール；８～１２ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥおよび場合により１～１０ｍｏｌ％の量のＤＨＰＣ；ならびに１～３ｍｏｌ％の量のＰＥＧ－ＤＭＧ２０００；
からなる群から選択される比の賦形剤を含むか、
または
より好ましくは、
（ｂ－ｉ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のステロイド；１０ｍｏｌ％の量の中性脂質；および１．７ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ｂ－ｉｉ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；１０ｍｏｌ％の量の中性脂質；および１．７ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ｂ－ｉｉｉ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；１０ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥ；および１．７ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ｂ－ｉｖ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；１０ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥ；および１．７％の量のＣ１０－ＰＥＧ２０００；ならびに
（ｂ－ｖ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；１０ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥ；および１．７％の量のＣｅｒ８－ＰＥＧ２０００
からなる群から選択される比の賦形剤を含み；
（各量は脂質ナノ粒子の脂質賦形剤の総モル量に対するものである）
より好ましくは、
（ｃ－ｉ）表Ｆに開示されるＦ１～Ｆ６０からなる群から選択されるｍｏｌパーセンテージの表Ｅに開示されるＥ１～Ｅ６９からなる群から選択される脂質賦形剤組合せ
からなる群から選択される比の賦形剤を含む、
実施形態１に記載の組成物。
３．好ましくは、
（ｉ）５９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ２３、２９．３ｍｏｌ％のコレステロール、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；
（ｉｉ）５９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ２、２９．３ｍｏｌ％のコレステロール、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；または
（ｉｉｉ）５９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ１５、２９．３ｍｏｌ％のコレステロール、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００
の比の賦形剤を含む、実施形態１乃至２のいずれか１つに記載の組成物。
４．生物活性成分をさらに含む、実施形態１乃至３のいずれか１つに記載の組成物。
５．生物活性成分が、人工ｍＲＮＡ、少なくとも１つのコード配列を含む化学修飾もしくは非修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、自己複製ＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、およびレプリコンＲＮＡ；またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される核酸化合物であり、好ましくは生物活性成分がｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ化合物である、実施形態４に記載の組成物。
６．脂質ナノ粒子が
（ｉ）１０～２０の範囲のＮ／Ｐ比を達成するような量；または
（ｉｉ）２０～６０、好ましくは約３～約１５、５～約１３、約４～約８または約７～約１１の範囲の脂質：ｍＲＮＡ重量比を達成するような量
のｍＲＮＡを含む、実施形態１乃至５のいずれか１つに記載の組成物。
７．無菌液体担体で再構成するための無菌固体組成物であり、ｐＨ修正剤、増量剤、安定剤、非イオン性界面活性剤および抗酸化剤から選択される１種または複数の不活性成分をさらに含み、無菌液体担体が水性担体である、実施形態１乃至６のいずれか１つに記載の組成物。
８．無菌液体組成物であり、脂質ナノ粒子が、約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、または約６０ｎｍ～約２５０ｎｍ、または約６０ｎｍ～約２００ｎｍ、または約７０～２００ｎｍ、または約７５ｎｍ～約１６０、または約９０ｎｍ～約１４０ｎｍ、または約１００ｎｍ～約１４０ｎｍの動的光散乱によって決定される平均流体力学的径を有する、実施形態１乃至７のいずれか１つに記載の組成物。
９．脂質ナノ粒子が－５０ｍＶ～＋５０ｍＶの範囲のゼータ電位を示す、実施形態１乃至８のいずれか１つに記載の組成物。
１０．ｍＲＮＡ化合物がモノ、バイ、またはマルチシストロン性ｍＲＮＡである、実施形態５乃至９のいずれか１つに記載の組成物。
１１．ｍＲＮＡ化合物が少なくとも１つの化学修飾を含む、実施形態５乃至１０のいずれか１つに記載の組成物。
１２．化学修飾が塩基修飾、糖修飾、骨格修飾および脂質修飾からなる群から選択され、好ましくは、化学修飾が塩基修飾であり、より好ましくは、塩基修飾が、好ましくは、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウラシル（Ｎ１Ｍψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、実施形態１１に記載の組成物。
１３．ｍＲＮＡ化合物がペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域を含み、コード領域が配列修飾を示す、実施形態５乃至１２のいずれか１つに記載の組成物。
１４．配列修飾が配列のＧ／Ｃ含量修飾、コドン修飾、コドン最適化またはＣ最適化から選択され；好ましくは、
対応する野生型ｍＲＮＡのコード領域と比較して、
－ コード領域のＧ／Ｃ含量が増加している；
－ コード領域のＣ含量が増加している；
－ コード領域のコドン使用頻度がヒトコドン使用頻度に適合されている；および／またはコドン適応指標（ＣＡＩ）がコード領域で増加もしくは最大化している、実施形態１３に記載の組成物。
１５．ｍＲＮＡ化合物が、
ａ）５’キャップ構造；
ｂ）好ましくは、マイクロＲＮＡ結合部位がｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、ｍｉＲ－２６ａ、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択されるマイクロＲＮＡのためのものである、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列；
ｃ）少なくとも１つの５’－ＵＴＲエレメント；
ｄ）少なくとも１つのポリ（Ａ）配列；
ｅ）少なくとも１つのポリ（Ｃ）配列；
ｆ）少なくとも１つの３’－ＵＴＲエレメント；
またはこれらの任意の組合せ
をさらに含む、実施形態５乃至１４のいずれか１つに記載の組成物。
１６．少なくとも１つのコードＲＮＡが、５’キャップ構造、好ましくはｍ７Ｇ、キャップ０、キャップ１、キャップ２、修飾キャップ０または修飾キャップ１構造を含む、実施形態５乃至１５のいずれか１つに記載の組成物。
１７．少なくとも１つのコードＲＮＡが少なくとも１つの異種５’－ＵＴＲおよび／または少なくとも１つの異種３’－ＵＴＲを含み、好ましくは、少なくとも１つの異種５’－ＵＴＲが、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＲＰＬ３２、ＡＳＡＨ１、ＡＴＰ５Ａ１、ＭＰ６８、ＮＤＵＦＡ４、ＮＯＳＩＰ、ＲＰＬ３１、ＳＬＣ７Ａ３、ＴＵＢＢ４ＢおよびＵＢＱＬＮ２から選択される遺伝子の５’－ＵＴＲ、またはこれらの遺伝子のいずれか１つのホモログ、断片もしくはバリアントから誘導される核酸配列を含む；および／または
好ましくは、少なくとも１つの異種３’－ＵＴＲが、ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ７、アルファ－グロビン、ＣＡＳＰ１、ＣＯＸ６Ｂ１、ＧＮＡＳ、ＮＤＵＦＡ１およびＲＰＳ９から選択される遺伝子の３’－ＵＴＲ、またはこれらの遺伝子のいずれか１つのホモログ、断片もしくはバリアントから誘導される核酸配列を含む、実施形態５乃至１６のいずれか１つに記載の組成物。
１８．少なくとも１つのコードＲＮＡが、（ｉ）ＨＳＤ１７Ｂ４ ５’－ＵＴＲおよびＰＳＭＢ ３’－ＵＴＲ、または（ｉｉ）ＲＰＬ３２ ５’－ＵＴＲおよびＡＬＢ７ ３’－ＵＴＲを含む、実施形態５乃至１７のいずれか１つに記載の組成物。
１９．５’→３’方向に、以下のエレメント：
ａ）好ましくはｍ７Ｇ（５’）、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）およびｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）からなる群から選択される、５’キャップ構造；
ｂ）ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲから誘導される核酸配列を含む５’－ＵＴＲエレメント（前記核酸配列は、好ましくは、配列番号２２、２４、２６による核酸配列、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントに対応するＲＮＡ配列を含む）；
ｃ）少なくとも１つのコード配列；
ｄ）α－グロビン遺伝子から誘導される核酸配列を含む３’－ＵＴＲエレメント（前記核酸配列は、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０による核酸配列、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントに対応するＲＮＡ配列を含む）；および／またはアルブミン遺伝子から誘導される核酸配列を含む３’－ＵＴＲエレメント（前記核酸配列は、好ましくは、配列番号１８による核酸配列、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントに対応するＲＮＡ配列を含む）；
ｅ）場合により、好ましくは１０～２００、１０～１００、４０～８０、または５０～７０個のアデノシンヌクレオチドからなる、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列；
ｆ）場合により、好ましくは１０～２００、１０～１００、２０～７０、２０～６０または１０～４０個のシトシンヌクレオチドからなる、少なくとも１つのポリ（Ｃ）配列；ならびに
ｇ）場合により、好ましくは配列番号４によるＲＮＡ配列を含む、少なくとも１つのヒストンステムループ
を含む、実施形態５乃至１８のいずれか１つに記載の組成物。
２０．生物活性成分が、
（ａ）ペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列を含むｍＲＮＡであって、ペプチドまたはタンパク質が抗原であり、抗原が、好ましくは、病原性抗原、腫瘍抗原、アレルゲン抗原もしくは自己免疫自己抗原、またはその断片もしくはバリアントから誘導される、ｍＲＮＡ；または
（ｂ）治療用タンパク質、またはその断片もしくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列を含むｍＲＮＡであって、治療用タンパク質が、
（ｉ）代謝、内分泌もしくはアミノ酸障害を処置するための酵素補充療法に使用するため、または非存在、欠損もしくは変異タンパク質の置換に使用するための治療用タンパク質；
（ｉｉ）血液障害、循環系の疾患、呼吸器系の疾患、感染性疾患または免疫不全の処置に使用するための治療用タンパク質；
（ｉｉｉ）がんまたは腫瘍疾患の処置に使用するための治療用タンパク質；
（ｉｖ）ホルモン補充療法に使用するための治療用タンパク質；
（ｖ）体細胞を多能性または全能性幹細胞に再プログラミングするのに使用するための治療用タンパク質；
（ｖｉ）アジュバントまたは免疫賦活として使用するための治療用タンパク質；
（ｖｉｉ）治療用抗体である治療用タンパク質；
（ｖｉｉｉ）遺伝子編集剤である治療用タンパク質；および
（ｉｘ）肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患の処置または防止に使用するための治療用タンパク質
からなる群から選択される、ｍＲＮＡ
である、実施形態４乃至１９のいずれか１つに記載の組成物。
２１．抗原が、細菌、ウイルス、真菌および原生動物抗原からなる群から選択される病原性抗原をコードする、実施形態２０部分項目（ａ）に記載の組成物。
２２．病原性抗原が、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、またはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））から誘導される、実施形態２１に記載の組成物。
２３．（ｉ）感染性疾患；がんもしくは腫瘍疾患、障害もしくは状態；肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患；アレルギー；または自己免疫疾患、障害もしくは状態の処置または予防において；および／または
（ｉｉ）代謝もしくは内分泌障害を処置するための酵素補充療法に使用するための、または非存在、欠損もしくは変異タンパク質の置換に使用するための、
使用するための、実施形態５乃至２２のいずれか１つに記載の組成物。
２４．感染性疾患の処置または予防に使用するための、実施形態５乃至２３のいずれか１つに記載の組成物。
２５．疾患、障害または状態の処置または防止に使用するための少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む、少なくとも１つのコードＲＮＡを含み、それを必要とする対象に筋肉内または皮内注射を介して投与される、実施形態５乃至２４のいずれか１つに記載の組成物。
２６．場合により、可溶化のための液体ビヒクル、および場合により、成分の用法および用量についての情報を提供する技術的説明書を含む、実施形態４乃至２６に記載の組成物のいずれか１つを含む、キットまたはパーツキット。
２７．医薬として使用するための、実施形態４乃至２５のいずれか１つに記載の組成物または実施形態２６に記載のキットもしくはパーツキット。
２８．医薬が、ウイルス、細菌または原生動物学的感染性疾患を含む感染性疾患、がんまたは腫瘍疾患、肝臓疾患、自己免疫疾患、アレルギー、遺伝病を含む単一遺伝子疾患、遺伝子疾患全般、遺伝的背景を有し、典型的には定義される遺伝子欠陥によって引き起こされ、メンデルの法則に従って遺伝する疾患；心血管疾患、神経疾患、呼吸器系の疾患、消化器系の疾患、皮膚の疾患、筋骨格障害、結合組織の障害、新生物、免疫不全、内分泌、栄養および代謝疾患、眼疾患、耳疾患、およびペプチドまたはタンパク質欠損に関連する疾患から選択される疾患を防止、予防、処置および／または改善するためのものである、実施形態２７に記載の医薬として使用するための組成物。
２９．医薬がワクチンである、実施形態２７または２８に記載の医薬として使用するための前記実施形態のいずれかに記載の組成物。
３０．ウイルス、細菌または原生動物学的感染性疾患を含む感染性疾患、がんまたは腫瘍疾患から選択される疾患を防止、予防、処置および／または改善するための、実施形態５乃至２５のいずれか１つに記載の組成物または実施形態２６に記載のキットもしくはパーツキットを含むワクチン。
３１．感染性疾患；がんもしくは腫瘍疾患、障害もしくは状態；肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患；アレルギー；または自己免疫疾患、障害もしくは状態を処置または予防する方法であって、
ａ）上記実施形態のいずれか１つに記載されるｍＲＮＡ、上記実施形態のいずれか１つに記載される組成物、実施形態３０に記載のワクチン、実施形態２６に記載のキットまたはパーツキットを用意する工程と；
ｂ）ｍＲＮＡ、組成物、ワクチン、またはキットもしくはパーツキットを組織または生物に適用または投与する工程と
を含む方法。
３２．実施形態５乃至２９のいずれか１つに記載のｍＲＮＡ、組成物、実施形態３０に記載のワクチン、または実施形態２６に記載のキットもしくはパーツキットが、静脈内、筋肉内、皮下または皮内注射によって組織または生物に投与される、実施形態３１に記載の方法。
３３．対象において抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量の実施形態３０に記載のワクチンを対象に投与する工程を含む、対象において免疫応答を誘導する方法。
３４．有効用量のウイルス抗原をコードするｍＲＮＡを含む、対象のワクチン接種に使用するための、実施形態４乃至２９のいずれか１つに記載の組成物または実施形態２６に記載のキットもしくはパーツキットを含む医薬組成物。
３５．（ｉ）免疫応答を誘導するため、（ｉｉ）抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するため、または好ましくは（ｉｉｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するための、実施形態４乃至２９のいずれか１つに記載の組成物または実施形態２６に記載のキットもしくはパーツキットを含む医薬組成物の使用。
３６．感染性疾患を予防するための、または感染性疾患を予防するための医薬の製造における、実施形態３４に記載の医薬組成物の使用であって、前記医薬が、好ましくはワクチンである、使用。
３７．実施形態４乃至２９のいずれか１つに記載の組成物または実施形態２６に記載のキットもしくはパーツキットを、それを必要とする対象に投与する工程を含む、対象における疾患または状態を防止、改善または処置する方法。
３８．組成物の投与が、対象のリンパ球においてｍＲＮＡによってコードされる抗原の発現をもたらす、前記方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３９．組成物の投与が抗原特異的抗体応答をもたらし、好ましくは、抗原特異的抗体応答が血清中の抗原特異的抗体の存在によって測定される、前記方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態の第３のセット
１．式（Ｉ）によるカチオン性脂質および場合により１，２－ジヘプタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＨＰＣ）と組み合わせた、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）を含み、生物活性成分をさらに含む組成物であって、好ましくは生物活性成分がｍＲＮＡであり、
（ａ）ｍＲＮＡがペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列を含み、ペプチドまたはタンパク質が抗原であり、抗原が、好ましくは病原性抗原、腫瘍抗原、アレルゲン抗原もしくは自己免疫自己抗原、またはその断片もしくはバリアントから誘導される；あるいは
（ｂ）ｍＲＮＡが治療用タンパク質、またはその断片もしくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列を含み、治療用タンパク質が、
（ｉ）代謝、内分泌もしくはアミノ酸障害を処置するための酵素補充療法に使用するため、または非存在、欠損もしくは変異タンパク質の置換に使用するための治療用タンパク質；
（ｉｉ）血液障害、循環系の疾患、呼吸器系の疾患、感染性疾患または免疫不全の処置に使用するための治療用タンパク質；
（ｉｉｉ）がんまたは腫瘍疾患の処置に使用するための治療用タンパク質；
（ｉｖ）ホルモン補充療法に使用するための治療用タンパク質；
（ｖ）体細胞を多能性または全能性幹細胞に再プログラミングするのに使用するための治療用タンパク質；
（ｖｉ）アジュバントまたは免疫賦活として使用するための治療用タンパク質；
（ｖｉｉ）治療用抗体である治療用タンパク質；
（ｖｉｉｉ）遺伝子編集剤である治療用タンパク質；および
（ｉｘ）肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患の処置または防止に使用するための治療用タンパク質
からなる群から選択される、組成物。
２．抗原が、細菌、ウイルス、真菌および原生動物抗原からなる群から選択される病原性抗原をコードする、実施形態１部分項目（ａ）に記載の組成物。
３．病原性抗原が、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、またはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））から誘導される、実施形態２に記載の組成物。
４．（ｉ）感染性疾患；がんもしくは腫瘍疾患、障害もしくは状態；肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患；アレルギー；または自己免疫疾患、障害もしくは状態の処置または予防において；および／または
（ｉｉ）代謝もしくは内分泌障害を処置するための酵素補充療法に使用するための、または非存在、欠損もしくは変異タンパク質の置換に使用するための、
使用するための実施形態１乃至３のいずれか１つに記載の組成物。
５．感染性疾患の処置または予防に使用するための実施形態１乃至４のいずれか１つに記載の組成物。
６．疾患、障害または状態の処置または防止に使用するための少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む、少なくとも１つのコードＲＮＡを含み、それを必要とする対象に筋肉内または皮内注射を介して投与される、実施形態１乃至５のいずれか１つに記載の組成物。
７．場合により、可溶化のための液体ビヒクル、および場合により、成分の用法および用量についての情報を提供する技術的説明書を含む、実施形態１乃至６のいずれか１つに記載の組成物のいずれか１つを含む、キットまたはパーツキット。
８．医薬として使用するための、実施形態１乃至７のいずれか１つに記載の組成物または実施形態７に記載のキットもしくはパーツキット。
９．医薬が、ウイルス、細菌または原生動物学的感染性疾患を含む感染性疾患、がんまたは腫瘍疾患、肝臓疾患、自己免疫疾患、アレルギー、遺伝病を含む単一遺伝子疾患、遺伝子疾患全般、遺伝的背景を有し、典型的には定義される遺伝子欠陥によって引き起こされ、メンデルの法則に従って遺伝する疾患；心血管疾患、神経疾患、呼吸器系の疾患、消化器系の疾患、皮膚の疾患、筋骨格障害、結合組織の障害、新生物、免疫不全、内分泌、栄養および代謝疾患、眼疾患、耳疾患、およびペプチドまたはタンパク質欠損に関連する疾患から選択される疾患の防止、予防、処置および／または改善のためのものである、実施形態１乃至８のいずれか１つに記載の医薬として使用するための組成物。
１０．医薬がワクチンである、実施形態１乃至９のいずれか１つに記載の医薬として使用するための組成物。
１１．ウイルス、細菌または原生動物学的感染性疾患を含む感染性疾患、がんまたは腫瘍疾患から選択される疾患を防止、予防、処置および／または改善するための、実施形態１乃至１０のいずれか１つに記載の組成物または実施形態７に記載のキットもしくはパーツキットを含むワクチン。
１２．感染性疾患；がんもしくは腫瘍疾患、障害もしくは状態；肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患；アレルギー；または自己免疫疾患、障害もしくは状態を処置または予防する方法であって、
ａ）上記実施形態のいずれか１つに記載されるｍＲＮＡ、上記実施形態のいずれか１つに記載される組成物、実施形態１１に記載のワクチン、実施形態７に記載のキットまたはパーツキットを用意する工程と；
ｂ）ｍＲＮＡ、組成物、ワクチン、またはキットもしくはパーツキットを組織または生物に適用または投与する工程と
を含む方法。
１３．実施形態１乃至１２のいずれか１つに記載のｍＲＮＡ、組成物、実施形態１１に記載のワクチン、または実施形態７に記載のキットもしくはパーツキットが、静脈内、筋肉内、皮下または皮内注射によって組織または生物に投与される、実施形態１２に記載の方法。
１４．対象において抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量の実施形態１１に記載のワクチンを対象に投与する工程を含む、対象において免疫応答を誘導する方法。
１５．有効用量のウイルス抗原をコードするｍＲＮＡを含む、対象のワクチン接種に使用するための、実施形態１乃至１４のいずれか１つに記載の組成物または実施形態７に記載のキットもしくはパーツキットを含む医薬組成物。
１６．（ｉ）免疫応答を誘導するため、（ｉｉ）抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するため、または好ましくは（ｉｉｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するための、実施形態１乃至１５のいずれか１つに記載の組成物または実施形態７に記載のキットもしくはパーツキットを含む医薬組成物の使用。
１７．感染性疾患を予防するための、または感染性疾患を予防するための医薬の製造における、実施形態１５に記載の医薬組成物の使用であって、前記医薬が、好ましくはワクチンである、使用。
１８．実施形態１乃至１７のいずれか１つに記載の組成物または実施形態７に記載のキットもしくはパーツキットを、それを必要とする対象に投与する工程を含む、対象における疾患または状態を防止、改善または処置する方法。
１９．組成物の投与が、対象のリンパ球においてｍＲＮＡによってコードされる抗原の発現をもたらす、前記方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２０．組成物の投与が抗原特異的抗体応答をもたらし、好ましくは、抗原特異的抗体応答が血清中の抗原特異的抗体の存在によって測定される、前記方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態の第４のセット
１．式（Ｉ）によるカチオン性脂質および場合により１，２－ジヘプタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＨＰＣ）と組み合わせた、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）を含み、さらにペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列を含むｍＲＮＡを含む組成物であって、ペプチドまたはタンパク質が抗原であり、抗原が、好ましくは病原性抗原、腫瘍抗原、アレルゲン抗原もしくは自己免疫自己抗原、またはその断片もしくはバリアントから誘導され、好ましくは、抗原が細菌、ウイルス、真菌および原生動物抗原からなる群から選択される病原性抗原をコードする、組成物。
２．病原性抗原が、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、またはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））から誘導される、実施形態１に記載の組成物。
３．感染性疾患の処置または予防に使用するための、実施形態１または２に記載の組成物。
４．疾患、障害または状態の処置または防止に使用するための少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む、少なくとも１つのコードＲＮＡを含み、それを必要とする対象に筋肉内または皮内注射を介して投与される、実施形態１乃至３のいずれか１つに記載の組成物。
５．場合により、可溶化のための液体ビヒクル、および場合により、成分の用法および用量についての情報を提供する技術的説明書を含む、実施形態１乃至４のいずれか１つに記載の組成物のいずれか１つを含む、キットまたはパーツキット。
６．医薬として使用するための、実施形態１乃至５のいずれか１つに記載の組成物または実施形態５に記載のキットもしくはパーツキット。
７．医薬が、ウイルス、細菌または原生動物学的感染性疾患を含む感染性疾患、がんまたは腫瘍疾患、肝臓疾患、自己免疫疾患、アレルギー、遺伝病を含む単一遺伝子疾患、遺伝子疾患全般、遺伝的背景を有し、典型的には定義される遺伝子欠陥によって引き起こされ、メンデルの法則に従って遺伝する疾患；心血管疾患、神経疾患、呼吸器系の疾患、消化器系の疾患、皮膚の疾患、筋骨格障害、結合組織の障害、新生物、免疫不全、内分泌、栄養および代謝疾患、眼疾患、耳疾患、およびペプチドまたはタンパク質欠損に関連する疾患から選択される疾患の防止、予防、処置および／または改善のためのものである、実施形態１乃至６のいずれか１つに記載の医薬として使用するための組成物。
８．医薬がワクチンである、実施形態１乃至７のいずれか１つに記載の医薬として使用するための組成物。
９．ウイルス、細菌または原生動物学的感染性疾患を含む感染性疾患、がんまたは腫瘍疾患から選択される疾患を防止、予防、処置および／または改善するための、実施形態１乃至８のいずれか１つに記載の組成物または実施形態５に記載のキットもしくはパーツキットを含むワクチン。
１０．感染性疾患；がんもしくは腫瘍疾患、障害もしくは状態；肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患；アレルギー；または自己免疫疾患、障害もしくは状態を処置または予防する方法であって、
ａ）実施形態１乃至９のいずれか１つに記載されるｍＲＮＡ、実施形態１乃至９のいずれか１つに記載される組成物、実施形態９に記載のワクチン、実施形態５に記載のキットまたはパーツキットを用意する工程と；
ｂ）ｍＲＮＡ、組成物、ワクチン、またはキットもしくはパーツキットを組織または生物に適用または投与する工程と
を含む方法。
１１．実施形態１乃至１０のいずれか１つに記載のｍＲＮＡ、組成物、実施形態９に記載のワクチン、または実施形態５に記載のキットもしくはパーツキットが、静脈内、筋肉内、皮下または皮内注射によって組織または生物に投与される、実施形態１０に記載の方法。
１２．対象において抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量の実施形態９に記載のワクチンを対象に投与する工程を含む、対象において免疫応答を誘導する方法。
１３．有効用量のウイルス抗原をコードするｍＲＮＡを含む、対象のワクチン接種に使用するための、実施形態１乃至１２のいずれか１つに記載の組成物または実施形態５に記載のキットもしくはパーツキットを含む医薬組成物。
１４．（ｉ）免疫応答を誘導するため、（ｉｉ）抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するため、または好ましくは（ｉｉｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するための、実施形態１乃至１３のいずれか１つに記載の組成物または実施形態５に記載のキットもしくはパーツキットを含む医薬組成物の使用。
１５．感染性疾患を予防するための、または感染性疾患を予防するための医薬の製造における、実施形態１３に記載の医薬組成物の使用であって、前記医薬が、好ましくはワクチンである、使用。
１６．実施形態１乃至１５のいずれか１つに記載の組成物または実施形態５に記載のキットもしくはパーツキットを、それを必要とする対象に投与する工程を含む、対象における疾患または状態を防止、改善または処置する方法。
１７．組成物の投与が、対象のリンパ球においてｍＲＮＡによってコードされる抗原の発現をもたらす、前記方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１８．組成物の投与が抗原特異的抗体応答をもたらし、好ましくは、抗原特異的抗体応答が血清中の抗原特異的抗体の存在によって測定される、前記方法実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態の第５のセット
１．式（Ｉ）によるカチオン性脂質：
Ｒａ－Ａ－Ｒｂ 式（Ｉ）
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは立体異性体
（式中、
Ｒａは、
－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４
から選択され；
Ｒｂは、
－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４、または
－Ｒ１－Ｎ（ＣＨ３）２
から選択され；
Ａは－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｓ－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－であり；
Ｒ１はエタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、または２～８個の炭素原子を有する直鎖もしくは非分岐アルカンジイルであり、各置換可能な炭素原子は非置換であるか、または１つもしくは複数のＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルケニレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキレン、もしくはＣ３～Ｃ８シクロアルケニレンで置換されており；
Ｒ２は２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｒ３は任意選択であり、存在する場合、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｒ５－ＯＣ（Ｏ）－ＮＨ－、またはＲ５－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり；
Ｒ４は１２～３６個の炭素原子を有する親油性置換基であり、１２～３６個の炭素原子を有する親油性置換基は、（ｉ）１２～２５個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐のアルキルもしくはアルケニルであるか、または（ｉｉ）トコフェロールもしくはトコトリエノールから誘導され；
Ｒ５は１～６個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
Ｘは水素原子と結合した炭素原子（ＣＨ）または窒素原子であり；
全ての選択は互いに独立している）。
２．Ｒ４が、（ｉ）１２～２５個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐のアルキルもしくはアルケニルであるか、または（ｉｉ）スキーム１に示されるトコフェロールおよびトコトリエノールの誘導体の群から選択される、実施形態１に記載のカチオン性脂質。
３．Ｒ４が、
からなる群から各出現で独立に選択される、実施形態１または実施形態２に記載のカチオン性脂質。
４．（ｉ）Ｒ３が－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－として存在し、（ｉｉ）Ｒ１およびＲ２が直鎖非置換エタンジイルであり、（ｉｉｉ）Ｒ５が直鎖非置換エタンジイル、直鎖非置換プロパンジイルまたは直鎖非置換ブタンジイルであり、（ｉｖ）Ａが－Ｓ－Ｓ－であり、（ｖ）ＲａおよびＲｂが同一である場合、Ｒ４が
ではなく、さらに（ｉ）Ｒ３が非存在であり、（ｉｉ）Ｒ１およびＲ２が直鎖非置換エタンジイルであり、（ｉｉｉ）Ａが－Ｓ－Ｓ－であり、（ｉｖ）ＲａおよびＲｂが同一である場合、Ｒ４が
ではなく、
ではない、実施形態１乃至３のいずれか１つに記載のカチオン性脂質。
５．Ａが－Ｓ－である、実施形態１乃至３のいずれか１つに記載のカチオン性脂質。
６．Ｒ３が存在し、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｒ５－ＯＣ（Ｏ）－ＮＨ－、およびＲ５－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－からなる群から選択され；
Ｒ４が１２～２５個の炭素原子を有する直鎖または分岐のアルキルまたはアルケニルである、実施形態１または実施形態２に記載のカチオン性脂質。
７．ＲａおよびＲｂが
（ＸはＣＨまたは－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４である）
から独立に選択される、実施形態１乃至６のいずれか１つに記載のカチオン性脂質。
８．ＲａおよびＲｂの各々が
（ＸはＣＨである）
であり；
Ｒ３が存在し、Ｒ５が各出現で独立に選択される、２～６個の炭素原子を有するアルカンジイルである、実施形態１乃至７のいずれか１つに記載のカチオン性脂質。
９．Ｒ３が存在し、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－または－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｒ４が
であり；
ＲａおよびＲｂが同一である、
実施形態１乃至８のいずれか１つに記載のカチオン性脂質。
１０．Ｒ３が存在し、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－または－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｒ４が
であり；
ＲａおよびＲｂが同一である、
実施形態１乃至８のいずれか１つに記載のカチオン性脂質。
１１．Ｒ３が－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－である、実施形態９または実施形態１０に記載のカチオン性脂質。
１２．Ｒ１がエタンジイルである、実施形態７または８に記載のカチオン性脂質。
１３．各出現で独立に選択される、以下の特徴：
（ｉ）Ｒ１が非置換エタンジイル、プロパンジイル、またはブタンジイルである；
（ｉｉ）Ｒ２が２～８個の炭素原子を有する直鎖、非分岐アルカンジイルである；
（ｉｉｉ）Ｒ３が－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－または－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－である；
（ｉｖ）Ｒ５が２～６個の炭素原子を有するアルカンジイルである；および／または
（ｖｉ）ＸがＣＨである、
の１つまたは複数をさらに示す、実施形態１乃至１２のいずれか１つに記載のカチオン性脂質。
１４．表１に列挙される化合物の１つから選択される、実施形態１に記載のカチオン性脂質。
１５．（ｉ）実施形態１乃至１４のいずれか１つに記載のカチオン性脂質；
（ｉｉ）表１に列挙されるカチオン性脂質Ｃ１５；
（ｉｉｉ）表１に列挙されるカチオン性脂質Ｃ２；または
（ｉｖ）表１に列挙されるカチオン性脂質Ｃ２６
を含む組成物。
１６．以下の賦形剤：
（ｉ）ステロイド、好ましくはコレステロール；
（ｉｉ）中性脂質
（前記中性脂質は、好ましくは場合により中性脂質１，２－ジヘプタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＨＰＣ）と組み合わせた１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）である；または前記中性脂質は双性イオン性化合物、場合によりペンタノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル、ノナノイル（ｎｏｎａｏｙｌ）およびデカノイルから選択される２つの脂肪酸部分を有する双性イオン性化合物と組み合わせた、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイルおよびオレオイル（ｏｌｅｙｏｌ）から選択される２つの脂肪酸部分を有する双性イオン性化合物である）；
および／または
（ｉｉｉ）ポリマーコンジュゲート脂質
（前記ポリマーコンジュゲート脂質は式（ＩＩ）による化合物：
Ｐ－Ａ－Ｌ 式（ＩＩ）
（式中、Ｐは親水性ポリマー部分であり、Ａは任意選択のリンカーであり、Ｌは脂質部分である）
であり、
好ましくは、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質である）
の１つまたは複数をさらに含む、実施形態１５に記載の組成物。
１７．以下の賦形剤：
（ｉ）実施形態１乃至１４のいずれか１つに記載のカチオン性脂質または第３級もしくは第４級窒素／アミノ基を含むカチオン性脂質または生理的ｐＨで正味の正の電荷を有するカチオン性脂質；
（ｉｉ）ステロイド、好ましくはコレステロール；
（ｉｉｉ）実施形態１６の部分項目（ｉｉ）に記載される中性脂質；ならびに／あるいは
（ｉｖ）ポリマーコンジュゲート脂質（前記ポリマーコンジュゲート脂質は式（ＩＩ）による化合物：
Ｐ－Ａ－Ｌ 式（ＩＩ）
（式中、Ｐは親水性ポリマー部分であり、Ａは任意選択のリンカーであり、Ｌは脂質部分である）
であり、
好ましくは、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質であり；
より好ましくは、脂質部分Ｌは８、１０、または１２個の炭素原子、好ましくは８または１０個の炭素原子を含む少なくとも１つの脂肪酸（「尾部」）を含み；
さらにより好ましくは、ペグ化脂質は１，２－ジカプリル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレングリコール２０００（Ｃ１０－ＰＥＧ２０００）；およびＮ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝（Ｃｅｒ８－ＰＥＧ２０００）からなる群から選択される）
の１つまたは複数を含む組成物。
１８．以下の賦形剤：
（ｉ）実施形態１７の部分項目（ｉ）に記載されるカチオン性脂質；
（ｉｉ）ステロイド、好ましくはコレステロール；
（ｉｉｉ）実施形態１６の部分項目（ｉｉ）に記載される中性脂質、または好ましくは２つの中性脂質の組合せであって、組合せは、少なくとも２つのアルキル鎖を有する中性脂質またはリン脂質であって、各アルキル鎖は独立に、好ましくはＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、またはＣ１０の長さを有し、より好ましくはＣ６、Ｃ７、Ｃ８の長さを有し、最も好ましくはＣ７の長さを有する、中性脂質またはリン脂質を含み、さらに最も好ましくは、０５：０ＰＣ（１，２－ジペンタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、０４：０ＰＣ（１，２－ジブチリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、０６：０ＰＣ（ＤＨＰＣ、１，２－ジヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、０８：０ＰＣ（１，２－ジオクタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、および０９：０ＰＣ（１，２－ジノナノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）からなる群から選択されるリン脂質を含む、組合せ；および／または
（ｉｖ）ポリマーコンジュゲート脂質（前記ポリマーコンジュゲート脂質は式（ＩＩ）による化合物：
Ｐ－Ａ－Ｌ 式（ＩＩ）
（式中、Ｐは親水性ポリマー部分であり、Ａは任意選択のリンカーであり、Ｌは脂質部分である）
であり、
好ましくは、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質であり；
より好ましくは、ペグ化脂質は１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）である）
の１つまたは複数を含む組成物。
１９．好ましくは、
（ａ－ｉ）３０～７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２０～５０ｍｏｌ％の量のステロイド；５～２５ｍｏｌ％の量の中性脂質；および０．５～５ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ａ－ｉｉ）４０～７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２０～５０ｍｏｌ％の量のステロイド；５～１５ｍｏｌ％の量の中性脂質；および０．５～５ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ａ－ｉｉｉ）２０～６０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２５～５５ｍｏｌ％の量のステロイド；５～２５ｍｏｌ％の量のリン脂質；および０．５～１５ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ａ－ｉｖ）４５～６５ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２５～４５ｍｏｌ％の量のステロイド；８～１２ｍｏｌ％の量のリン脂質；および１～３ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ａ－ｖ）４５～６５ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２５～４５ｍｏｌ％の量のコレステロール；８～１２ｍｏｌ％の量の中性脂質；および１～３ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ａ－ｖｉ）４５～６５ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２５～４５ｍｏｌ％の量のコレステロール；８～１２ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥおよび場合により１～１０ｍｏｌ％の量のＤＨＰＣ；ならびに１～３ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；ならびに
（ａ－ｖｉｉ）４５～６５ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２５～４５ｍｏｌ％の量のコレステロール；８～１２ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥおよび場合により１～１０ｍｏｌ％の量のＤＨＰＣ；ならびに１～３ｍｏｌ％の量のＰＥＧ－ＤＭＧ２０００
からなる群から選択される比の賦形剤を含むか、
または
より好ましくは、
（ｂ－ｉ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のステロイド；１０ｍｏｌ％の量の中性脂質；および１．７ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ｂ－ｉｉ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；１０ｍｏｌ％の量の中性脂質；および１．７ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ｂ－ｉｉｉ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；１０ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥ；および１．７ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ｂ－ｉｖ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；１０ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥ；および１．７％の量のＣ１０－ＰＥＧ２０００；
（ｂ－ｖ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；１０ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥ；および１．７％の量のＣｅｒ８－ＰＥＧ２０００；
（ｂ－ｖｉ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２８．３ｍｏｌ％の量のステロイド；１１ｍｏｌ％の量の中性脂質；および１．７ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ｂ－ｖｉｉ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２８．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；１１ｍｏｌ％の量の中性脂質；および１．７ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ｂ－ｖｉｉｉ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２８．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；１０ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥおよび１ｍｏｌ％の量のＤＨＰＣ；ならびに１．７ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ｂ－ｉｘ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２８．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；１０ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥおよび１ｍｏｌ％の量のＤＨＰＣ；ならびに１．７％の量のＣ１０－ＰＥＧ２０００；ならびに
（ｂ－ｘ）５９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２８．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；１０ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥおよび１ｍｏｌ％の量のＤＨＰＣ；ならびに１．７％の量のＣｅｒ８－ＰＥＧ２０００；
（ｂ－ｘｉ）４９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のステロイド；２０ｍｏｌ％の量の中性脂質；および１．７ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ｂ－ｘｉｉ）４９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；２０ｍｏｌ％の量の中性脂質；および１．７ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ｂ－ｘｉｉｉ）４９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；１０ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥおよび１０ｍｏｌ％の量のＤＨＰＣ；ならびに１．７ｍｏｌ％の量のポリマーコンジュゲート脂質；
（ｂ－ｘｉｖ）４９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；１０ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥおよび１０ｍｏｌ％の量のＤＨＰＣ；ならびに１．７％の量のＣ１０－ＰＥＧ２０００；ならびに
（ｂ－ｘｖ）４９ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質；２９．３ｍｏｌ％の量のコレステロール；１０ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥおよび１０ｍｏｌ％の量のＤＨＰＣ；ならびに１．７％の量のＣｅｒ８－ＰＥＧ２０００
からなる群から選択される比の賦形剤を含み；
（各量は脂質ナノ粒子の全ての脂質賦形剤の総モル量に対するものである）
より好ましくは、
（ｃ－ｉ）表Ｆに開示されるＦ１～Ｆ６２からなる群から選択されるｍｏｌパーセンテージの表Ｅに開示されるＥ１～Ｅ１０８からなる群から選択される脂質賦形剤組合せ
からなる群から選択される比の賦形剤を含む、
実施形態１５乃至１８のいずれか１つに記載の組成物。
２０．好ましくは、
（ｉ）５９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ２３（ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ）、２９．３ｍｏｌ％のコレステロール、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；
（ｉｉ）５９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ２、２９．３ｍｏｌ％のコレステロール、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；
（ｉｉｉ）５９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ１５、２９．３ｍｏｌ％のコレステロール、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；
（ｉｖ）５９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ２６、２９．３ｍｏｌ％のコレステロール、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；
（ｖ）５９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ２３（ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ）、２８．３ｍｏｌ％のコレステロール、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥ、１ｍｏｌ％のＤＨＰＣおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；
（ｖｉ）５９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ２、２８．３ｍｏｌ％のコレステロール、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥ、１ｍｏｌ％のＤＨＰＣおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；
（ｖｉｉ）５９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ１５、２８．３ｍｏｌ％のコレステロール、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥ、１ｍｏｌ％のＤＨＰＣおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；
（ｖｉｉｉ）５９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ２６、２８．３ｍｏｌ％のコレステロール、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥ、１ｍｏｌ％のＤＨＰＣおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；
（ｉｘ）４９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ２３（ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ）、２９．３ｍｏｌ％のコレステロール、１０ｍｏｌ％のＤｐｈｙＰＥ、１０ｍｏｌ％のＤＨＰＣおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；
（ｘ）４９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ２、２９．３ｍｏｌ％のコレステロール、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥ、１０ｍｏｌ％のＤＨＰＣおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；
（ｘｉ）４９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ１５、２９．３ｍｏｌ％のコレステロール、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥ、１０ｍｏｌ％のＤＨＰＣおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；または
（ｘｉｉ）４９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ２６、２９．３ｍｏｌ％のコレステロール、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥ、１０ｍｏｌ％のＤＨＰＣおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００
の比の賦形剤を含む、実施形態１５乃至１９のいずれか１つに記載の組成物。
２１．生物活性成分をさらに含む、実施形態１５乃至２０のいずれか１つに記載の組成物。
２２．生物活性成分が、人工ｍＲＮＡ、少なくとも１つのコード配列を含む化学修飾もしくは非修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、自己複製ＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、およびレプリコンＲＮＡ；またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される核酸化合物であり、好ましくは生物活性成分がｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ化合物である、実施形態２１に記載の組成物。
２３．脂質ナノ粒子が
（ｉ）１０～２０の範囲のＮ／Ｐ比を達成するような量；または
（ｉｉ）２０～６０、好ましくは約３～約１５、５～約１３、約４～約８または約７～約１１の範囲の脂質：ｍＲＮＡ重量比を達成するような量
のｍＲＮＡを含む、実施形態１５乃至２２のいずれか１つに記載の組成物。
２４．無菌液体担体で再構成するための無菌固体組成物であり、ｐＨ修正剤、増量剤、安定剤、非イオン性界面活性剤および抗酸化剤から選択される１種または複数の不活性成分をさらに含み、無菌液体担体が水性担体である、実施形態１５乃至２３のいずれか１つに記載の組成物。
２５．無菌液体組成物であり、脂質ナノ粒子が、約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、または約６０ｎｍ～約２５０ｎｍ、または約６０ｎｍ～約２００ｎｍ、または約７０～２００ｎｍ、または約７５ｎｍ～約１６０、または約９０ｎｍ～約１４０ｎｍ、または約１００ｎｍ～約１４０ｎｍの動的光散乱によって決定される平均流体力学的径を有する、実施形態１５乃至２４のいずれか１つに記載の組成物。
２６．脂質ナノ粒子が－５０ｍＶ～＋５０ｍＶの範囲のゼータ電位を示す、実施形態１５乃至２５のいずれか１つに記載の組成物。
２７．ｍＲＮＡ化合物がモノ、バイ、またはマルチシストロン性ｍＲＮＡである、実施形態２２乃至２６のいずれか１つに記載の組成物。
２８．ｍＲＮＡ化合物が少なくとも１つの化学修飾を含む、実施形態２２乃至２６のいずれか１つに記載の組成物。
２９．化学修飾が塩基修飾、糖修飾、骨格修飾および脂質修飾からなる群から選択され、好ましくは、化学修飾が塩基修飾であり、より好ましくは、塩基修飾が、好ましくは、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウラシル（Ｎ１Ｍψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、実施形態２８に記載の組成物。
３０．ｍＲＮＡ化合物がペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域を含み、コード領域が配列修飾を示す、実施形態２２乃至２９のいずれか１つに記載の組成物。
３１．配列修飾が配列のＧ／Ｃ含量修飾、コドン修飾、コドン最適化またはＣ最適化から選択され；好ましくは、
対応する野生型ｍＲＮＡのコード領域と比較して、
－ コード領域のＧ／Ｃ含量が増加している；
－ コード領域のＣ含量が増加している；
－ コード領域のコドン使用頻度がヒトコドン使用頻度に適合されている；および／またはコドン適応指標（ＣＡＩ）がコード領域で増加もしくは最大化している、実施形態３０に記載の組成物。
３２．ｍＲＮＡ化合物が、
ａ）５’キャップ構造；
ｂ）好ましくは、マイクロＲＮＡ結合部位がｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、ｍｉＲ－２６ａ、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択されるマイクロＲＮＡのためのものである、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列；
ｃ）少なくとも１つの５’－ＵＴＲエレメント；
ｄ）少なくとも１つのポリ（Ａ）配列；
ｅ）少なくとも１つのポリ（Ｃ）配列；
ｆ）少なくとも１つの３’－ＵＴＲエレメント；
またはこれらの任意の組合せ
をさらに含む、実施形態２２乃至３１のいずれか１つに記載の組成物。
３３．少なくとも１つのコードＲＮＡが、５’キャップ構造、好ましくはｍ７Ｇ、キャップ０、キャップ１、キャップ２、修飾キャップ０または修飾キャップ１構造を含む、実施形態２２乃至３２のいずれか１つに記載の組成物。
３４．少なくとも１つのコードＲＮＡが少なくとも１つの異種５’－ＵＴＲおよび／または少なくとも１つの異種３’－ＵＴＲを含み、好ましくは、少なくとも１つの異種５’－ＵＴＲが、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＲＰＬ３２、ＡＳＡＨ１、ＡＴＰ５Ａ１、ＭＰ６８、ＮＤＵＦＡ４、ＮＯＳＩＰ、ＲＰＬ３１、ＳＬＣ７Ａ３、ＴＵＢＢ４ＢおよびＵＢＱＬＮ２から選択される遺伝子の５’－ＵＴＲ、またはこれらの遺伝子のいずれか１つのホモログ、断片もしくはバリアントから誘導される核酸配列を含む；および／または
好ましくは、少なくとも１つの異種３’－ＵＴＲが、ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ７、アルファ－グロビン、ＣＡＳＰ１、ＣＯＸ６Ｂ１、ＧＮＡＳ、ＮＤＵＦＡ１およびＲＰＳ９から選択される遺伝子の３’－ＵＴＲ、またはこれらの遺伝子のいずれか１つのホモログ、断片もしくはバリアントから誘導される核酸配列を含む、実施形態２２乃至３３のいずれか１つに記載の組成物。
３５．少なくとも１つのコードＲＮＡが、（ｉ）ＨＳＤ１７Ｂ４ ５’－ＵＴＲおよびＰＳＭＢ ３’－ＵＴＲ、または（ｉｉ）ＲＰＬ３２ ５’－ＵＴＲおよびＡＬＢ７ ３’－ＵＴＲを含む、実施形態２２乃至３４のいずれか１つに記載の組成物。
３６．５’→３’方向に、以下のエレメント：
ａ）好ましくはｍ７Ｇ（５’）、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）およびｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）からなる群から選択される、５’キャップ構造；
ｂ）ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲから誘導される核酸配列を含む５’－ＵＴＲエレメント（前記核酸配列は、好ましくは、配列番号２２、２４、２６による核酸配列、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントに対応するＲＮＡ配列を含む）；
ｃ）少なくとも１つのコード配列；
ｄ）α－グロビン遺伝子から誘導される核酸配列を含む３’－ＵＴＲエレメント（前記核酸配列は、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０による核酸配列、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントに対応するＲＮＡ配列を含む）；および／またはアルブミン遺伝子から誘導される核酸配列を含む３’－ＵＴＲエレメント（前記核酸配列は、好ましくは、配列番号１８による核酸配列、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントに対応するＲＮＡ配列を含む）；
ｅ）場合により、好ましくは１０～２００、１０～１００、４０～８０、または５０～７０個のアデノシンヌクレオチドからなる、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列；
ｆ）場合により、好ましくは１０～２００、１０～１００、２０～７０、２０～６０または１０～４０個のシトシンヌクレオチドからなる、少なくとも１つのポリ（Ｃ）配列；ならびに
ｇ）場合により、好ましくは配列番号４によるＲＮＡ配列を含む、少なくとも１つのヒストンステムループ
を含む、実施形態２２乃至３５のいずれか１つに記載の組成物。
３７．生物活性成分が、
（ａ）ペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列を含むｍＲＮＡであって、ペプチドまたはタンパク質が抗原であり、抗原が、好ましくは、病原性抗原、腫瘍抗原、アレルゲン抗原もしくは自己免疫自己抗原、またはその断片もしくはバリアントから誘導される、ｍＲＮＡ；または
（ｂ）治療用タンパク質、またはその断片もしくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列を含むｍＲＮＡであって、治療用タンパク質が、
（ｉ）代謝、内分泌もしくはアミノ酸障害を処置するための酵素補充療法に使用するため、または非存在、欠損もしくは変異タンパク質の置換に使用するための治療用タンパク質；
（ｉｉ）血液障害、循環系の疾患、呼吸器系の疾患、感染性疾患または免疫不全の処置に使用するための治療用タンパク質；
（ｉｉｉ）がんまたは腫瘍疾患の処置に使用するための治療用タンパク質；
（ｉｖ）ホルモン補充療法に使用するための治療用タンパク質；
（ｖ）体細胞を多能性または全能性幹細胞に再プログラミングするのに使用するための治療用タンパク質；
（ｖｉ）アジュバントまたは免疫賦活として使用するための治療用タンパク質；
（ｖｉｉ）治療用抗体である治療用タンパク質；
（ｖｉｉｉ）遺伝子編集剤である治療用タンパク質；および
（ｉｘ）肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患の処置または防止に使用するための治療用タンパク質
からなる群から選択される、ｍＲＮＡ
である、実施形態２１乃至３６のいずれか１つに記載の組成物。
３８．抗原が、細菌、ウイルス、真菌および原生動物抗原からなる群から選択される病原性抗原をコードする、実施形態３７部分項目（ａ）に記載の組成物。
３９．病原性抗原が、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、またはマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ））から誘導される、実施形態３８に記載の組成物。
４０．（ｉ）感染性疾患；がんもしくは腫瘍疾患、障害もしくは状態；肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患；アレルギー；または自己免疫疾患、障害もしくは状態の処置または予防において；および／または
（ｉｉ）代謝もしくは内分泌障害を処置するための酵素補充療法に使用するための、または非存在、欠損もしくは変異タンパク質の置換に使用するための、
使用するための、実施形態１５乃至３９のいずれか１つに記載の組成物。
４１．感染性疾患の処置または予防に使用するための、実施形態１５乃至３９のいずれか１つに記載の組成物。
４２．疾患、障害または状態の処置または防止に使用するための少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む、少なくとも１つのコードＲＮＡを含み、それを必要とする対象に筋肉内または皮内注射を介して投与される、実施形態４０または４１に記載の使用するための組成物。
４３．場合により、可溶化のための液体ビヒクル、および場合により、成分の用法および用量についての情報を提供する技術的説明書を含む、実施形態２１乃至４２に記載の組成物のいずれか１つを含む、キットまたはパーツキット。
４４．医薬として使用するための、実施形態２１乃至４２のいずれか１つに記載の組成物または実施形態４３に記載のキットもしくはパーツキット。
４５．医薬が、ウイルス、細菌または原生動物学的感染性疾患を含む感染性疾患、がんまたは腫瘍疾患、肝臓疾患、自己免疫疾患、アレルギー、遺伝病を含む単一遺伝子疾患、遺伝子疾患全般、遺伝的背景を有し、典型的には定義される遺伝子欠陥によって引き起こされ、メンデルの法則に従って遺伝する疾患；心血管疾患、神経疾患、呼吸器系の疾患、消化器系の疾患、皮膚の疾患、筋骨格障害、結合組織の障害、新生物、免疫不全、内分泌、栄養および代謝疾患、眼疾患、耳疾患、およびペプチドまたはタンパク質欠損に関連する疾患から選択される疾患を防止、予防、処置および／または改善するためのものである、実施形態４４に記載の医薬として使用するための組成物。
４６．医薬がワクチンである、実施形態４４または４５に記載の医薬として使用するための組成物。
４７．ウイルス、細菌または原生動物学的感染性疾患を含む感染性疾患、がんまたは腫瘍疾患から選択される疾患を防止、予防、処置および／または改善するための、実施形態１５乃至４２のいずれか１つに記載の組成物または実施形態４３に記載のキットもしくはパーツキットを含むワクチン。
４８．感染性疾患；がんもしくは腫瘍疾患、障害もしくは状態；肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患；アレルギー；または自己免疫疾患、障害もしくは状態を処置または予防する方法であって、
ａ）上記実施形態のいずれか１つに記載されるｍＲＮＡ、上記実施形態のいずれか１つに記載される組成物、実施形態４７に記載のワクチン、実施形態４３に記載のキットまたはパーツキットを用意する工程と；
ｂ）ｍＲＮＡ、組成物、ワクチン、またはキットもしくはパーツキットを組織または生物に適用または投与する工程と
を含む方法。
４９．実施形態１５乃至４２のいずれか１つに記載のｍＲＮＡ、組成物、実施形態４７に記載のワクチン、または実施形態４３に記載のキットもしくはパーツキットが、静脈内、筋肉内、皮下または皮内注射によって組織または生物に投与される、実施形態４８に記載の方法。
５０．対象において抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量の実施形態４７に記載のワクチンを対象に投与する工程を含む、対象において免疫応答を誘導する方法。
５１．有効用量のウイルス抗原をコードするｍＲＮＡを含む、対象のワクチン接種に使用するための、実施形態１５乃至４２のいずれか１つに記載の組成物または実施形態４３に記載のキットもしくはパーツキットを含む医薬組成物。
５２．（ｉ）免疫応答を誘導するため、（ｉｉ）抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するため、または好ましくは（ｉｉｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するための、実施形態１５乃至４２のいずれか１つに記載の組成物または実施形態４３に記載のキットもしくはパーツキットを含む医薬組成物の使用。
５３．感染性疾患を予防するための、または感染性疾患を予防するための医薬の製造における、実施形態５２に記載の医薬組成物の使用であって、前記医薬が、好ましくはワクチンである、使用。
５４．実施形態１５乃至４２のいずれか１つに記載の組成物または実施形態４３に記載のキットもしくはパーツキットを、それを必要とする対象に投与する工程を含む、対象における疾患または状態を防止、改善または処置する方法。
５５．組成物の投与が、対象のリンパ球においてｍＲＮＡによってコードされる抗原の発現をもたらす、実施形態４８乃至５０および５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．組成物の投与が抗原特異的抗体応答をもたらし、好ましくは、抗原特異的抗体応答が血清中の抗原特異的抗体の存在によって測定される、実施形態４８乃至５０、５４および５５のいずれか１つに記載の方法。
５７．Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３もしくはＣ１４の長さを有する、好ましくはＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、もしくはＣ１０の長さを有する、より好ましくはＣ６、Ｃ７、Ｃ８の長さを有する、最も好ましくはＣ７の長さを有する少なくとも１つのアルキル鎖を有する中性脂質もしくはリン脂質を含む、またはさらに最も好ましくは２つの中性脂質の組合せを含み、組合せは、少なくとも２つのアルキル鎖を有する中性脂質またはリン脂質であって、各アルキル鎖は独立に、好ましくはＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、またはＣ１０の長さを有する、より好ましくはＣ６、Ｃ７、Ｃ８の長さを有する、最も好ましくはＣ７の長さを有する、中性脂質またはリン脂質を含み、さらに最も好ましくは、ＤＨＰＣ（１，２－ジヘプタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、０５：０ＰＣ（１，２－ジペンタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、０４：０ＰＣ（１，２－ジブチリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、０６：０ＰＣ（ＤＨＰＣ、１，２－ジヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、０８：０ＰＣ（１，２－ジオクタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、および０９：０ＰＣ（１，２－ジノナノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）からなる群から選択されるリン脂質を含む、実施形態１５乃至３９のいずれか１つに記載の組成物。
５８．組成物が、少なくとも２つのアルキル鎖を有する中性脂質またはリン脂質（各アルキル鎖は独立に、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３もしくはＣ１４の長さを有する、好ましくはＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、もしくはＣ１０の長さを有する、より好ましくはＣ６、Ｃ７、Ｃ８の長さを有する、最も好ましくはＣ７の長さを有する）を含む、またはさらに最も好ましくは、組成物が、２つの中性脂質の組合せを含み、組合せは、少なくとも２つのアルキル鎖を有する中性脂質またはリン脂質であって、各アルキル鎖は独立に、好ましくはＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、またはＣ１０の長さを有する、より好ましくはＣ６、Ｃ７、Ｃ８の長さを有する、最も好ましくはＣ７の長さを有する、中性脂質またはリン脂質を含み、さらに最も好ましくは、ＤＨＰＣ（１，２－ジヘプタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、０５：０ＰＣ（１，２－ジペンタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、０４：０ＰＣ（１，２－ジブチリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、０６：０ＰＣ（ＤＨＰＣ、１，２－ジヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、０８：０ＰＣ（１，２－ジオクタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、および０９：０ＰＣ（１，２－ジノナノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）からなる群から選択されるリン脂質を含む、実施形態１５乃至３９のいずれか１つに記載の組成物。
以下の節では、本発明の様々な実施形態および態様を例示する特定の実施例を提示する。しかしながら、本発明は、例示される実施形態によって範囲が限定されず、これらの実施形態は単に本発明の単一態様の例示として意図されているものであり、機能的に等価な方法は本発明の範囲内にある。実際、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の様々な修正が、以下の説明、不随する図面および以下の実施例から当業者に容易に明らかとなろう。全てのこのような修正が本明細書に開示される特許請求の範囲の範囲に入る。
実施例１：ＲＮＡ構築物の作製
本実施例は本発明のＲＮＡを得る方法を提供する。
実施例１．１：ＤＮＡ鋳型の調製
所望のタンパク質、例えばホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ（ＰｐＬｕｃ）をコードするＤＮＡ配列を調製し、その後のＲＮＡインビトロ転写に使用した。例示的には、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ（ＰｐＬｕｃ）をコードするＧ／Ｃ最適化ｍＲＮＡ配列、すなわち、５’キャップ－３２Ｌ－５’－ＵＴＲ（ＲＰＬ３２）－ＧＣ最適化ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼＯＲＦ－アルブミン７－３’－ＵＴＲ－ポリ（Ａ）配列－ポリ（Ｃ）配列－ヒストンステムループ配列；３’末端の６４×アデノシン（ポリＡ尾部）；５個のヌクレオチド、３’末端の３０×シトシン（ポリＣ尾部）および５個の追加のヌクレオチド（配列番号２７）が本明細書で使用される。
前記（ＤＮＡ）配列を、場合により、ＧＣ最適化ＣＤＳを導入することによって野生型ＣＤＳ配列を修飾することによって調製した。配列を、ＵＴＲ配列、アデノシンの伸長、場合によりヒストンステムループ構造、および場合により、３０個のシトシンの伸長を含むプラスミドベクターに導入した。得られたプラスミドＤＮＡを、一般的なプロトコルを使用して、細菌で形質転換および増殖させ、プラスミドＤＮＡを抽出し、精製し、以下に概説されるその後のＲＮＡインビトロ転写に使用した。
実施例１．２：プラスミドＤＮＡ鋳型からのＲＮＡインビトロ転写－ｍＲＮＡの調製
実施例１．１により調製したＤＮＡプラスミドを、制限酵素／ＥｃｏＲＩを使用して酵素的に線状化し、適切な緩衝液条件下、ヌクレオチド混合物（ＡＴＰ／ＧＴＰ／ＣＴＰ／ＵＴＰ）およびキャップアナログ（例えば、ｍ７ＧｐｐｐＧまたはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧまたはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ））の存在下で、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したＤＮＡ依存性ＲＮＡインビトロ転写に使用した。得られたＲＮＡを、ＲＰ－ＨＰＬＣ（ＰｕｒｅＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）、国際公開第２００８／０７７５９２号による）を使用して精製し、さらなる実験に使用した。得られたｍＲＮＡを、商業的ポリアデニル化キットを使用して酵素的にポリアデニル化した。
実施例２：ＨＥＸＡおよびＨＥＡＤ脂質の合成
本実施例は、本発明の脂質化合物を得るための方法および情報ならびに本発明の組成物を作製および分析する方法を提供する。
実施例２．１：ＨＥＸＡ脂質－ＨＥＸＡ脂質の合成
ＨＥＸＡ脂質を、キロブロック社（ＣｈｉｒｏＢｌｏｃｋ ＧｍｂＨ）（ドイツ、ビターフェルト＝ヴォルフェン（Ｂｉｔｔｅｒｆｅｌｄ－Ｗｏｌｆｅｎ）所在）の一般的なプロトコルに従って合成した。表実施例１（Ｔａｂｌｅ Ｅｘ－１）および図１に示される９種のＨＥＸＡ脂質を合成し、さらなる脂質を上記表１に示す。
ＨＥＸＡ脂質の純度および構造同一性を、核磁気共鳴分光法（Ｈ－ＮＭＲ、５００．１３ＭＨｚ）および質量分析（エレクトロスプレーイオン化－ＥＳＩまたは大気圧化学イオン化－ＡＰＣＩ、直接注入を介する）によって確認した。
実施例２．１．１：ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）マイクロ流体システムを使用したＬＮＰの調製
ナノリットルスケールでのナノ粒子成分のミリ秒混合を可能にするカスタム仕様マイクロ流体混合チップを介して、ナノ粒子の制御された、ボトムアップ式、分子自己組織化を可能にする標準的なプロトコルに従って、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）マイクロ流体システム（プレシジョンナノシステムズ社（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）所在）を使用してＬＮＰを調製した。
カチオン性脂質ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ（以前の名称：ＳＳ－３３／４ＰＥ－１５；エヌオーエフコーポレーション（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、日本東京所在；表１の化合物Ｃ２３参照、表実施例２参照）を含むＧＮ０１－ＬＮＰは、ｓ．ｃ．注射後にＴ細胞を効率的に活性化することが示された（データは示さない）。実施例の文脈において、「ＳＳ－ＥＣ」のみが示される場合、上記ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣが参照される。
本実施例では、表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ１～Ｃ２２（キロブロック社（ＣｈｉｒｏＢｌｏｃｋ ＧｍｂＨ）（ドイツ、ビターフェルト＝ヴォルフェン（Ｂｉｔｔｅｒｆｅｌｄ－Ｗｏｌｆｅｎ）所在、カスタム合成）およびＣ２４～Ｃ２７（シメレス社（Ｓｙｍｅｒｅｓ）、オランダフローニンゲン（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ）所在、カスタム合成）またはそれぞれＨＥＸＡ脂質、またはＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ（エヌオーエフコーポレーション（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、日本東京所在；表１の化合物Ｃ２３）を脂質ナノ粒子組成物の調製に使用した。さらに、コレステロール（アバンティポーラリピッド社（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）；アラバマ州アラバスター（Ａｌａｂａｓｔｅｒ）所在）、中性脂質／リン脂質ＤＰｈｙＰＥ（アバンティポーラリピッド社（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）；アラバマ州アラバスター（Ａｌａｂａｓｔｅｒ）所在）およびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（エヌオーエフコーポレーション（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、日本東京所在）を使用した。
実施例およびまた本発明の開示の文脈において、「ＤＭＧ－ＰＥＧ」／「ＤＳＧ－ＰＥＧ」または「ＤＭＧ－ｍＰＥＧ」／「ＤＳＧ－ｍＰＥＧ」のみが示される場合、本明細書においてはそれぞれ１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－（ｍ）ＰＥＧ２０００）およびジステアロイル－ｒａｃ－グリセロール－ＰＥＧ２０００（ＤＳＧ－（ｍ）ＰＥＧ２０００）が参照される。
脂質を標準的な手順に従ってアルコール性溶液（エタノール）に可溶化した。対応する脂質ナノ粒子組成物を以下の表実施例２で詳述する。
詳細には、適切な体積のエタノール緩衝液中脂質ストック溶液を、適切な量の本明細書に示されるｍＲＮＡを含有する水相（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）と混合することによって、ＬＮＰを調製した；コレステロール、リン脂質およびポリマーコンジュゲート脂質：ＥｔＯＨ中２０ｍｇ／ｍｌ、カチオン性脂質、ＧＮ０１を除く：ＥｔＯＨ中２０ｍｇ／ｍｌ、ＧＮ０１脂質：ｔｅｒｔ－ブタノール中３０ｍｇ／ｍｌならびに脂質Ｃ２４、Ｃ２５、Ｃ２６およびＣ２７も３０ｍｇ／ｍｌ ｔ－ブタノールに可溶化し、脂質のエタノールプレミックスに添加した。
手短に言えば、ｍＲＮＡを、１０～５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ４中０．０５～０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。シリンジポンプをＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）（プレシジョンナノシステムズ社（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）所在）の入口部分に取り付け、使用して、エタノール性脂質溶液とｍＲＮＡ水溶液を約１４ｍｌ／分～約１８ｍｌ／分の総流量において約１：５～１：３（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比で混合した。
次いで、エタノールを除去し、外部緩衝液を透析（Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ、サーモフィッシャー社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））によってＰＢＳ／スクロース緩衝液（ｐＨ７．４、７５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭスクロース）と交換した。最後に、脂質ナノ粒子を、０．２μｍ孔滅菌フィルタを通して濾過した。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（マルバーンインストルメンツ社（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．）；英国マルバーン（Ｍａｌｖｅｒｎ）所在）を使用して準弾性光散乱によって決定すると、脂質ナノ粒子の粒子直径サイズは約９０ｎｍ～約１４０ｎｍであった。本明細書で言及される他のカチオン性脂質化合物についても、製剤化工程は同様である。次いで、エタノールを除去し、緩衝液を、９％スクロースを含む１０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４と交換した。
上記のように、「ＧＮ０１」という用語は、５９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ２３、すなわち、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ（以前の名称：本実施例節から明らかなようにＳＳ－３３／４ＰＥ－１５）、２９．３ｍｏｌ％のステロイドとしてのコレステロール、１０ｍｏｌ％の中性脂質／リン脂質としてのＤＰｈｙＰＥおよび１．７ｍｏｌ％のポリマーコンジュゲート脂質としてのＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含む脂質ナノ粒子に似ている。「ＧＮ０１」について、Ｎ／Ｐ（脂質対ｍＲＮＡ ｍｏｌ比）は、好ましくは１４であり、全脂質／ｍＲＮＡ質量比は、好ましくは４０である。
さらに、上記のように、「ＧＮ０２」は、５９ｍｏｌ％の表１に開示されるカチオン性脂質Ｃ２脂質（すなわち、実施例節、図１Ｂから明らかなようにＨＥＸＡ－Ｃ５ＤＥ－ＰｉｐＳＳ）、２９．３ｍｏｌ％のステロイドとしてのコレステロール、１０ｍｏｌ％の中性脂質／リン脂質としてのＤＰｈｙＰＥおよび１．７ｍｏｌ％のポリマーコンジュゲート脂質としてのＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含む脂質ナノ粒子に似ている。「ＧＮ０２」について、Ｎ／Ｐ（脂質対ｍＲＮＡ ｍｏｌ比）は、好ましくは１７．５であり、全脂質／ｍＲＮＡ質量比は、好ましくは４０である。
実施例２．１．２：脂質ナノ粒子組成物の生物物理学的特性評価／ＨＥＸＡ脂質
各ＬＮＰを、粒径、ゼータ電位、カプセル化効率／％カプセル化（ＥＥ）、ＲＮＡ含量（基本的には本発明の文脈内のｍＲＮＡ含量に対応する）およびプロトン化プロファイル／ｐＫａに関して特徴付けた。
ＨＥＸＡ脂質のプロトン化プロファイル／ｐＫａを測定するために、表実施例１に開示される脂質１～９を、異なる脂質組成物（表実施例３に示される）を使用してＬＮＰとして調製した。これによると、表実施例１から明らかなＨＥＸＡ脂質化合物１～９を異なる比の中性リン脂質ＤＰｈｙＰＥ（１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、中性ステロイドコレステロール（Ｃｈｏｌ）およびポリマーコンジュゲート脂質ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と混合した。
目的のｍＲＮＡ（例えば、上記のＰｐＬｕｃ）をＨＥＸＡ脂質ＬＮＰに製剤化するために、ＲＮＡ／脂質比３および硝酸塩／リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比１４を使用した。
ｐＫａは、溶液の酸解離定数（Ｋａ）の負の常用対数、すなわち、ｐＫａ＝－ｌｏｇ（Ｋａ）である。ｐＫａ値を、蛍光色素２－ｐ－トルイジニルナフタレン－６－スルホネート（ＴＮＳ）を用いた標準的な手続きに従って測定した。ＨＥＸＡ脂質化合物のプロトン化プロファイル／ｐＫａを図２またはそれぞれ表実施例４に示す。
さらに、透析後のＬＮＰの平均直径およびゼータ電位は、それぞれＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（マルバーンインストルメンツ社（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．）；英国マルバーン所在）を使用して、動的光散乱およびレーザードップラ微小電気泳動法によって決定される通りであった。カプセル化効率（ＥＥ［％］）は、以下の式：％カプセル化＝（Ｆｔ－Ｆｉ）／Ｆｔ×１００；Ｆｉ＝ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）所在）のＬＮＰアリコートへの添加によって決定される遊離非カプセル化ＲＮＡおよびＦｔ＝ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）所在）の、０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００とのインキュベーションによって達成される溶解ＬＮＰのアリコートへの添加によって測定される総含量ＲＮＡ含量）によって計算した。
これらの分析の結果を表実施例４および表実施例５において本明細書で以下に示す。
実施例２．２：ＨＥＡＤ脂質－ＨＥＡＤ脂質の合成
ＨＥＡＤ脂質を、キロブロック社（ＣｈｉｒｏＢｌｏｃｋ ＧｍｂＨ）（ドイツ、ビターフェルト＝ヴォルフェン（Ｂｉｔｔｅｒｆｅｌｄ－Ｗｏｌｆｅｎ）所在）の一般的なプロトコルに従って合成した。この実施例において、３種のＨＥＡＤ脂質を合成した（表実施例６および図３に示される）。
ＨＥＡＤ脂質の純度および構造同一性を、核磁気共鳴分光法（Ｈ－ＮＭＲ、５００．１３ＭＨｚ）および質量分析（エレクトロスプレーイオン化－ＥＳＩまたは大気圧化学イオン化－ＡＰＣＩ、直接注入を介する）によって確認した。
実施例２．２．１：ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）マイクロ流体システムを使用したＬＮＰの調製／ＨＥＡＤ脂質
ＨＥＸＡ脂質と同様に、標準的なプロトコルに従って（上記、実施例２．１．１参照）、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）マイクロ流体システム（プレシジョンナノシステムズ社（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）所在）を使用して、ＨＥＡＤ脂質をＬＮＰとして製剤化した。
実施例２．２．２：脂質ナノ粒子組成物の生物物理学的特性評価／ＨＥＡＤ脂質
各ＬＮＰを、前記の脂質ナノ粒子組成物の生物物理学的特性評価と同様に（上記、実施例２．１．２参照）、粒径、ゼータ電位、カプセル化効率（％カプセル化；ＥＥ）、ＲＮＡ含量およびプロトン化プロファイル／ｐＫａに関して特徴付けた。
ＨＥＡＤ脂質のプロトン化プロファイル／ｐＫａを測定するために、ＨＥＡＤ脂質を、異なる脂質組成物（表実施例７および表実施例８に示される）を使用してＬＮＰとして調製し、ＧＮ０１と一緒に測定した。
ＨＥＡＤ脂質化合物の得られたプロトン化プロファイル／ｐＫａを図４またはそれぞれ表実施例９に示す。
透析後の平均直径およびゼータ電位を、上記のように動的光散乱およびレーザードップラ微小電気泳動法によって決定した。
ｍＲＮＡ（例えば、上記のＰｐＬｕｃおよび他の目的のｍＲＮＡ）のＨＥＡＤ脂質ＬＮＰへの製剤化のために、ＲＮＡ／脂質比３および硝酸塩／リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比１４を使用した。
これらの分析の結果を表実施例９において本明細書で以下に示す。
実施例３：ＨＥＸＡ脂質およびＨＥＡＤ脂質のインビトロ分析
本実施例は、本発明の組成物および脂質のインビトロ分析についての詳細を提供する。
実施例３．１：ＨＥＸＡ脂質のインビトロ分析
実施例３．１．１：ＨＥＸＡ脂質を使用したＨｅＬａおよびＨｅｐＧ２におけるＰｐＬｕｃ発現
ＨＥＸＡ脂質を含む本発明による様々なＬＮＰ組成物のインビトロ発現、トランスフェクションおよび発現効率を決定するために、ＰｐＬｕｃ ｍＲＮＡを、ＨｅｐＧ２細胞、肝細胞癌細胞株およびＨｅＬａ細胞、不死化子宮頸がん細胞株において陽性対照および陰性対照と比較した。
ＨＥＸＡ脂質の発現効率を分析するために、記載される異なる脂質組成物をＰｐＬｕｃ ｍＲＮＡ（配列については実施例１．１参照、酢酸塩５０ｍＭ ｐＨ４中）を用いて製剤化した。ＨｅＬａ細胞またはＨｅｐＧ２細胞を１２ウェルフォーマットに１０００００個細胞／ウェルで播種し、ＬＮＰおよびＰｐＬｕｃ ０．１２５μｇ／ｍｌ（１２５ｎｇ／ウェル）によるトランスフェクション前に一晩インキュベートした。ＰｐＬｕｃ読み取りをトランスフェクション２４時間後に実施した（図５参照）。製剤の詳細は表実施例３に記載される通りである。
結果：
ＨｅＬａ細胞において、ＬＮＰ１～ＬＮＰ６は、ＧＮ０１と比較して劣ったＰｐＬｕｃ発現を実証した。しかしながら、中性脂質が異なる、すなわち、ＤＳＰＣの代わりにＤＰｈｙＰＥであることを除いて同じ脂質を含むＬＮＰ８～ＬＮＰ１３は、非常に優れた、およびＧＮ０１と比較してもさらに優れた発現を示した。ＨｅｐＧ２細胞において、ＬＮＰ１～ＬＮＰ５は、ＧＮ０１と比較してまずまずの発現を実証した。しかしながら、ここでも、ＬＮＰ８～ＬＮＰ１３は、ＧＮ０１と比較してもはるかに強力な発現を示した（ＬＮＰ８～ＬＮＰ１２はさらに優れている）、すなわち、ここでも同様に、ＬＮＰ１～ＬＮＰ５とＬＮＰ８～ＬＮＰ１２との間の唯一の違いは、ＤＳＰＣの代わりにＤＰｈｙＰＥを使用したことであった。
したがって、ＤＰｈｙＰＥの使用はまた、ほぼ全ての先行技術のＬＮＰ組成物で標準的な中性脂質として当技術分野において現在まで使用されているＤＳＰＣに対する明確な利点をもたらした。
実施例３．２：ＨＥＡＤ脂質のインビトロ分析
実施例３．２．１：ＨＥＡＤ脂質を使用したＨｅＬａおよびＨｅｐＧ２におけるＨＥＡＤ脂質のＰｐＬｕｃ発現
この実施例は、ＨｅＬａ細胞における、陽性対照および陰性対照と比較した、ＨＥＡＤ脂質およびＰｐＬｕｃ ｍＲＮＡを含む本発明による様々なＬＮＰ組成物のトランスフェクション効率を示す。
ＨＥＡＤ脂質の発現効率を分析するために、異なる脂質組成物を、ＰｐＬｕｃ ｍＲＮＡ（配列については実施例１．１参照、酢酸塩５０ｍＭ ｐＨ４中）を用いて製剤化した。ＨｅＬａ細胞を１２ウェルフォーマットに１０００００個細胞／ウェルで播種し、ＬＮＰおよびＰｐＬｕｃ ０．１２５μｇ／ｍｌ（１２５ｎｇ／ウェル）によるトランスフェクション前に一晩インキュベートした。ＰｐＬｕｃ読み取りをトランスフェクション２４時間後に実施した（図６参照）。
結果：
これによると、組成物Ｂは、全３種のＨＥＡＤ脂質についてより高い発現速度を示した。ＧＮ０１および組成物Ｂを含むＣＰＺＰは、最も高い発現速度（１×１０６ＲＬＵ）を示した。したがって、ＤＰｈｙＰＥの使用はここでも、ほぼ全ての先行技術のＬＮＰ組成物で標準的な中性脂質として当技術分野において現在まで使用されているＤＳＰＣに対する明確な利点をもたらした。
実施例４：ＨＥＸＡ脂質およびＨＥＡＤ脂質のインビボおよびインビトロ分析
本実施例は、本発明の組成物および脂質のインビボおよびインビトロ分析についての詳細を提供する。
実施例４．１：ＨＥＸＡ脂質のインビボおよびインビトロ分析
実施例４．１．１：ＧＮ０１ ＬＮＰを含むＨＥＸＡ脂質を使用したＨｅＬａ細胞およびマウスにおけるｈＥＰＯ発現
ＨＥＸＡおよびＨＥＡＤ脂質を含む本発明による様々なＬＮＰ組成物のインビトロおよびインビボ発現、トランスフェクションならびに発現効率を決定するために、以下に記載される異なるｍＲＮＡを以下に詳述されるある特定の対照と比較した。
インビボ分析のために、ヒトエリスロポエチンコードｍＲＮＡ（ｈＥｐｏ）を使用した（配列番号２８）。
ｈＥｐｏ ｍＲＮＡを標準的な手続きに従って酵素的にキャッピングした；メチル基を第２の工程で付加してキャップ１（ＣＡＰ１）を得て、ｍＲＮＡを、商業的に入手可能なポリアデニル化キットおよび当技術分野で公知の対応するプロトコルを使用して、さらに酵素的にアデニル化した。
ＬＮＰを上記のようにおよび表実施例１０に示されるように調製した。対照として、ｈＥｐｏ ｍＲＮＡを含むＬＮＰをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。インビトロトランスフェクション分析のために、ＨｅＬａ細胞を１２ウェルフォーマットに１０００００個細胞／ウェルで播種し、製剤化ＬＮＰ（最終濃度０．１２５μｇ／ｍｌ／ウェル）によるトランスフェクション前に一晩インキュベートした。ｈＥｐｏ ＥＬＩＳＡをトランスフェクション２４時間後に実施した。
全体として、全ての製剤がＨｅＬａ細胞において安定なｈＥｐｏ発現を示した（図７）。
インビボ分析のために、６～８週齢Ｂａｌｂ／Ｃマウス（５匹／群）に０．５ｍｇ／ｋｇ ＬＮＰ製剤化ｈＥｐｏ（表実施例１０参照）を注射した。ＥＤＴＡ血漿サンプリングを注射６時間後および２４時間後に実施した。
結果：
ＬＮＰ８～ＬＮＰ１２（ＨＥＸＡ脂質Ｃ１～Ｃ５）およびＧＮ０１のインビボ分析によって、注射６時間後および２４時間後で明確な高いｈＥｐｏ発現を示すインビトロ実験の結果が確認された（図８）。
実施例４．１．２：ＨＥＸＡ脂質の忍容性－ＡＬＴ／ＡＳＴおよびサイトカイン測定
アミノトランスフェラーゼＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）およびＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）の活性を測定することによって、ＨＥＸＡ脂質化合物Ｃ１～Ｃ９およびＳＳ－ＥＣ（表実施例１参照）の忍容性をさらに分析した。このために、ＨＥＸＡ脂質およびＳＳ－ＥＣ含有ＬＮＰ（０．５ｍｇ／ｋｇ）をＢａｌｂ／Ｃに静脈内注射し、標準的な手続きに従って、注射２４時間後にＡＬＴおよびＡＳＴ活性を測定することによって分析した（図９）。脂質化合物Ｃ２については、異なるｍ／ｍ比の忍容性も測定した（図１０）。
結果１：
動物のいずれも、緩衝液対照と比較して有意に上昇したＡＳＴおよびＡＬＴ肝臓酵素活性を示さなかった（図９）。さらに、処置した動物の体重減少は５％未満であった（データは示さない）。
早い時点でのＨＥＸＡ脂質Ｃ１～Ｃ９の免疫賦活特性を分析するために、ＥＤＴＡ血漿サイトカイン分析を注射６時間後に実施した。したがって、ＨＥＸＡ脂質による処置の６時間後にマウスから採取した血清試料を用いたＣＢＡアッセイは、以下のサイトカイン／ケモカイン：ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１、ＭＩＰ－１、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－６、ＴＮＦ、ＩＬ－１β、ＩＦＮ－γのレベルを明らかにした。さらに、血清中のＩＦＮ－αのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。血清中のマウスＩＦＮ－αの分析を、試薬希釈剤中５０μｌ血清（１：２０）を用いて、製造業者の説明書に従って実施した（図１０Ａ～図１０Ｄ）。脂質化合物２について測定される異なるｍ／ｍ比の免疫賦活特性も測定した（図１０Ｅ～図１０Ｈ）。
結果２：
示される図から明らかなように、試験した脂質化合物のいずれも有意に上昇したサイトカインレベルを誘導しなかった。
実施例４．２：ＨＥＸＡおよびＨＥＡＤ脂質のインビボ分析
実施例４．２．１：予防的および治療的ワクチンアプローチ－ＨＥＸＡ脂質、ＨＥＡＤ脂質、ＧＮ０１およびＧＮ０２ ＬＮＰを使用したマウスにおける腫瘍抗原ｔｒｐ２
ＧＮ０１およびＧＮ０２ ＬＮＰを含む、ＨＥＸＡおよびＨＥＡＤ脂質を含むＬＮＰの予防的および治療的能力を試験するために、インビボ分析を実施した。このために、ｔｒｐ２ ｍＲＮＡ（腫瘍抗原Ｔｒｐ２をコードする）を上記の手順に従って作製し、ＣｌｅａｎＣａｐ ＡＧ、３２Ｌ４－５’－ＵＴＲリボソーム５’ＴＯＰ ＵＴＲ（３２Ｌ４）；３’末端の６４×アデノシン（ポリＡ尾部）；５個のヌクレオチド、３’末端の３０×シトシン（ポリＣ尾部）および５個の追加のヌクレオチド（配列番号２９）を含むｔｒｐ２ ｍＲＮＡを得た。
ＬＮＰについての組成物および製剤の手順は上、例えば実施例２．１．１、実施例２．２．２、表実施例２、および表実施例６に記載される。
免疫化のために、７～８週齢雌Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５匹／群）に、表実施例１１に示される組成物詳細に従って、上に示される腫瘍抗原Ｔｒｐ２をコードする製剤化ｍＲＮＡを、背中に皮内（ｉ．ｄ．）注射した。
免疫化は０日目、７日目および１４日目に行われた。血液試料を第１のワクチン接種１４時間後および２１日後に採取し；臓器試料を２１日後に採取した。ＥＬＩＳＡを使用して、Ｔ細胞応答および液性免疫応答を測定した（結果を図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃおよび図１１Ｄに示す）。
結果：
図１１Ａおよび図１１Ｂによると、ｔｒｐ２ ｍＲＮＡを含むＧＮ０１、ＧＮ０２およびＣＩＳＥ ＬＮＰを使用したワクチン接種は、安定なＩｇＧ１およびＩｇＧ２価を示した。さらに、図１１Ｃおよび図１１Ｄによると、ＧＮ０１、ＧＮ０２およびＣＩＳＥ ＬＮＰは低いＴ細胞応答を示した。
実施例４．２．２：ＨＥＡＤ脂質の忍容性－ＡＬＴ／ＡＳＴおよびサイトカイン測定
アミノトランスフェラーゼＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）およびＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）の活性を測定することによって、ＨＥＡＤ脂質ＣＩＳＥ、ＣＰＺＥおよびＥＳＴＥＲ（表実施例６参照）の忍容性をさらに分析した。このために、ＨＥＡＤ脂質含有ＬＮＰおよびＳＳ－ＥＣ含有ＬＮＰ（０．５ｍｇ／ｋｇ）をＢａｌｂ／Ｃに静脈内注射し、注射２４時間後にＡＬＴおよびＡＳＴを測定することによって分析した。脂質化合物Ｃ２については、異なるｍ／ｍ比の忍容性も測定した。
結果：
動物のいずれも、緩衝液対照と比較して有意に上昇したＡＳＴおよびＡＬＴを示さなかった（図１２．１）。さらに、処置した動物の体重減少は２％未満であった（データは示さない）。
本明細書において上記のＨＥＸＡ脂質についてのサイトカイン測定と同様に、ＨＥＡＤ脂質についてのサイトカイン分析を実施した。明らかなように、試験した脂質化合物のいずれも有意に上昇したサイトカインレベルを誘導しなかった（図１２．２Ａ～図１２．２Ｄ）。
実施例５：本発明の組成物／ＬＮＰ（ＧＮ０１）の安定性データ
本発明の組成物／ＬＮＰの安定性を分析するために、異なる特性および生物活性を、例えば長期間にわたる貯蔵で、以下に記載されるように測定した。
実施例５．１：ＧＮ０１製剤化ｈＥＰＯ ｍＲＮＡの完全性および生物物理学的特性の分析
ＧＮ０１ ＬＮＰを、実施例４．１．１（ＧＮ０１ ＬＮＰを含むＨＥＸＡ脂質を使用したＨｅＬａ細胞およびマウスにおけるｈＥＰＯ発現）において上に記載されるようにｈＥＰＯ ｍＲＮＡを用いて製剤化し、４℃および－８０℃で１．５か月間および６か月間貯蔵した。ゲル電気泳動を介してＬＮＰ内に含まれるｍＲＮＡを分析するために、当技術分野で公知の日常的な手続きに従って、組み込まれたｍＲＮＡがゲル上にディスプレイされ得るように、ＬＮＰを脱製剤化（ｄｅｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）／破壊した。
結果：
粒径、多分散指数（ＰＤＩ）、電荷／ゼータ電位およびＥＥ％ならびにＲＮＡ含量を測定した。ＧＮ０１ ＬＮＰは、１．５か月間および６か月間の貯蔵で、安定な粒径、ゼータ電位およびＥＥ％値を示した。ｍＲＮＡの完全性は、最大６か月間、アガロースゲル電気泳動によって示されるように保たれた。－８０℃で１．５か月間の貯蔵後のＬＮＰ中のｍＲＮＡの活性を試験し、新たに調製したＬＮＰと比較した。
結果を４℃および－８０℃で１．５か月間（図１３Ａ）および６か月間（図１３Ｂ）の貯蔵について示す。ＬＮＰの分解のために、２つの条件を使用した：分解条件１（ヘパリンとトリトンの組合せを使用してＬＮＰを分解した；図のＣ１）または分解条件２（ヘパリンとＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の組合せおよび１５分間、４５℃への加熱を使用してＬＮＰを分解した；図のＣ２）。６か月間の分析については、条件Ｃ１を適用した。
結果：
有意な差は観察されなかった（詳細な結果については、下記の表実施例１２および実施例５．２参照）。
実施例５．２：最大１０週間の－８０℃での貯蔵後のＧＮ０１ ＬＮＰの生物活性
ＧＮ０１ ＬＮＰ中の製剤化ｍＲＮＡの貯蔵後の生物活性を評価するために、前記ＧＮ０１ ＬＮＰをｈＥｐｏ ｍＲＮＡを用いて製剤化し、Ｂａｌｂ／Ｃマウスへの静脈内注射（１０μｇ ｍＲＮＡ、５匹／群）前に１週間凍結した。前記ＬＮＰの投与後、血液試料を採取し、ＥＤＴＡ血漿のために処理した（投与６時間後および２４時間後）。残っているＧＮ０１ ＬＮＰを凍結し、－８０℃で最大１０週間貯蔵した。この期間後、ＬＮＰを新たな動物のセットに注射した。
結果：
１０週間の貯蔵後、ＧＮ０１ ＬＮＰは同様のレベルを示し、貯蔵がＬＮＰの生物活性を損なわないことを示した（１週間の貯蔵と比較した場合の注射６時間後および２４時間後；図１４．１参照）。
第２の評価では、血漿試料を、１凍結／解凍サイクル（１Ｆ／Ｔ）後に分析し、２Ｆ／Ｔサイクル後の血漿試料と比較した：共に－８０℃で１週間の貯蔵後。ＨｓＥｐｏ生物活性についての優れた再現性を全ての試験アプローチについて示すことができた（図１４．２Ａおよび図１４．２Ｂ参照）。
実施例６：ＬＮＰトランスフェクションに対するリン脂質の効果
ＬＮＰトランスフェクションに対する異なるリン脂質の効果を分析するために、ＤＰｈｙＰＥ、ＤＳＰＣ、およびＤＰｈｙＰＥ＋ＤＳＰＣの１：１混合物を、表実施例１３に示されるように、脂質化合物番号１（表実施例１参照）およびＧＮ０１を用いて製剤化した。上記のＰｐＬｕｃをＬＮＰのためのカーゴとして使用した（０．１２５μｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ウェル）。得られた組成物をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。これによると、１０００００個のＨｅＬａ細胞／ウェルを１２ウェルフォーマットに播種した。
ＰｐＬｕｃ活性を上記の標準的な手続きに従って２４時間後に測定した。結果を図１５．１Ａに示す。ＬＮＰのｐＫａに対する中性リン脂質の影響を、蛍光色素２－ｐ－トルイジニルナフタレン－６－スルホネート（ＴＮＳ）を用いた標準的な手続きに従って測定した。ＨＥＸＡ脂質化合物のプロトン化プロファイル／ｐＫａを図１５．１ＢまたはそれぞれｐＫａを表実施例１３に示す。
結果：
ＤＰｈｙＰＥ、またはＤＰｈｙＰＥとＤＳＰＣの１：１組合せの組み込みは、カチオン性脂質Ｃ１とＧＮ０１の両方について中性脂質ＤＳＰＣについての発現よりも高い発現を示した。本明細書において上に示されるように、本発明者らは、驚くべきことに、膜融合リン脂質がＤＳＰＣと比較してはるかに優れた性能を示すことを見出した；ＤＳＰＣは、当技術分野において脂質ナノ粒子の大部分に使用されているリン脂質である。さらに、ｐＫａに対するリン脂質の大きな効果が示された（表実施例１３）。
実施例７：ポリマーコンジュゲート脂質成分の効果
ＬＮＰトランスフェクションに対するＰＥＧ成分およびそのアルキル尾部の効果を分析するために、異なる量のセラミド８ＰＥＧ（すなわち、Ｃ８尾部を含む；Ｃｅｒ８－ＰＥＧ；Ｎ－オクタノイル－Ｄ－エリスロ－スフィンゴシンを含む）およびＣ１４－ＤＭＧ－ＰＥＧ（すなわち、Ｃ１４尾部を含む、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）ならびにこれらの組合せ（１％Ｃｅｒ８と０．７％Ｃ１４－ＤＭＧ－ＰＥＧ）を、ＳＳ－ＥＣ、コレステロールおよびＤＰｈｙＰＥを用いて製剤化し（基本的には、上記ＧＮ０１製剤であるが、ポリマーコンジュゲート脂質賦形剤が異なる）、結果として、ＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトした；組成物は表実施例１４に示される通りであった。全ての組成物についてのＮ／Ｐ比は１４に設定した；全ての組成物についての脂質／ｍＲＮＡ質量比は４０に設定した。
このために、１００００個のＨｅｐＧ２細胞／ウェルを９６ウェルフォーマットに播種した。上記のＰｐＬｕｃ ｍＲＮＡ（０．１２５μｇ／ｍｌ；２５ｎｇ／ウェル）をＬＮＰに製剤化し、ＯｐｔｉＭＥＭまたは完全培地中で１時間または４時間、ＨｅｐＧ２細胞とインキュベートした。
ＨｅｐＧ２細胞についてのＰｐＬｕｃ活性を１時間後または４時間後に測定した（結果を図１５．２に示す）。
結果：
明らかなように、本発明の発明者らは、驚くべきことに、より短いアルキル鎖を有するポリマーコンジュゲート脂質（例えば、Ｃｅｒ８）を含む組成物が、より長いアルキル鎖を含むポリマーコンジュゲート脂質（例えば、Ｃ１４－ＤＭＧ－ＰＥＧ）を含む組成物よりも効率的であることを見出した。５％Ｃｅｒ８ポリマーコンジュゲート脂質の使用は、驚くべきことに、ＰｐＬｕｃ活性をさらに増強した。
実施例８：単回ｉ．ｖ．注射後のＧＮ０１ ＬＮＰに製剤化された抗狂犬病モノクローナル抗体の発現
ＧＮ０１ ＬＮＰに製剤化されたｍＲＮＡの発現効率をさらに分析するために、ＮＩＨスイスアルビノ（ｎ＝６）マウスに、抗狂犬病モノクローナル抗体（ｍＡｂ；Ｓ０５７、トランら（Ｔｈｒａｎ ｅｔ ａｌ．）、ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ（２０１７）９：１４３４－１４４７）をコードするｍＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）を注射した。抗狂犬病ｍＡｂ ｍＲＮＡは、ＨＳＤ１７Ｂ４由来の５’－ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３由来の３’－ＵＴＲ、３’末端の６４×アデノシン（ポリＡ尾部）；５個のヌクレオチド、３’末端の３０×シトシン（ポリＣ尾部）および５個の追加のヌクレオチドを含んでいた。ｍＲＮＡを、製造業者の説明書に従って、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ（商標）ｍ７Ｇ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（セルスクリプト社（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ）、米国ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在）を使用してさらに酵素的にキャッピングし、商業的ポリアデニル化キット（配列番号３０＝重鎖、配列番号３１＝軽鎖）を使用して酵素的にポリアデニル化した。
ｍＲＮＡのＧＮ０１ ＬＮＰへの製剤化を上記のように実施した。
マウスに、２０μｇのＬＮＰ製剤化抗狂犬病ｍＡｂコードｍＲＮＡを静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、６時間および２４時間で出血させた。ＩｇＧ血清ＥＬＩＳＡを使用して、１：５０００希釈に基づく抗体価の分析を実施した（結果を図１６に示す）。
結果：
図１６から明らかなように、ｉ．ｖ．注射後６時間後および２４時間後で非常に強力な抗狂犬病ｍＡｂ発現を検出することができた。
実施例９：筋肉内投与を使用したＲＡＢＶ－Ｇワクチン接種用のＧＮ０１およびＧＮ０２製剤化ＬＮＰ
ＧＮ０１およびＧＮ０２製剤化ＬＮＰの免疫原性を分析するために、ＲＡＢＶ－Ｇ（またはＲＡＶ－Ｇ、狂犬病ウイルス糖タンパク質）ｍＲＮＡを上記の手順に従って作製して、ｍＣａｐ、ｍｕａｇ－３’－ＵＴＲ；３’末端の６４×アデノシン（ポリＡ尾部）；５個のヌクレオチド、３’末端の３０×シトシン（ポリＣ尾部）および５個の追加のヌクレオチド（配列番号３２）を含むＲＡＢＶ－Ｇ ｍＲＮＡを得た。
７週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝６）に、上記のＲＡＢＶ－Ｇ ｍＲＮＡを含む表実施例１５による製剤を、０日目および２１日目に筋肉内注射した。比較目的のために、ＫＣ２脂質含有ＬＮＰも同様に製剤化した。ＫＣ２対照ＬＮＰは、５７．１ｍｏｌ％のカチオン性脂質としてのＤＬｉｎ ＫＣ２－ＤＭＡ、７．１ｍｏｌ％のＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン；アバンティポーラリピッド社（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）；アラバマ州アラバスター（Ａｌａｂａｓｔｅｒ）所在）、３４．４ｍｏｌ％のコレステロール（シグマ－アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）；メルク株式会社（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）、ドイツダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）所在）および１．４ｍｏｌ％のＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡを含んでいた。
血清中の狂犬病ウイルスに対する抗体のレベルを決定するために、古典的ウイルス中和試験を実施した（蛍光抗体ウイルス中和（ＦＡＶＮ）アッセイ）。
したがって、第１のｍＲＮＡ投与の３５日後に、マウスを屠殺し、血液および臓器試料（肝臓）をさらなる分析、すなわち、ＦＡＶＮアッセイを介したウイルス中和抗体（ＶＮＡ）分析のために回収した。前記免疫原性アッセイのために、ＶＮＴを前記のように測定した、すなわち、血清中の抗狂犬病ウイルス中和価（ＶＮＴ）を、ＦＡＶＮアッセイを使用したＥｕｒｏｖｉｒ（登録商標）Ｈｙｇｉｅｎｅ－Ｌａｂｏｒ ＧｍｂＨ、ドイツおよびＷＨＯプロトコルによるＳｔａｎｄａｒｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ Ｖｉｒｕｓ ＣＶＳ－１１によって分析した。
さらに、肝臓試料を、Ｔ細胞応答（ＣＤ４およびＣＤ８）を分析するために採取した、すなわち、ＣＤ４ Ｔ細胞免疫応答（ＩＦＮγ／ＴＮＦα産生ＣＤ４ Ｔ細胞）およびＣＤ８ Ｔ細胞免疫応答（ＩＦＮγ／ＴＮＦα産生ＣＤ８ Ｔ細胞およびＣＤ１０７＋ＩＦＮγ産生ＣＤ８ Ｔ細胞）を評価し；細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を使用して、抗原特異的Ｔ細胞の誘導を決定した。アッセイを前記のように実施した；結果を図１７Ａ、図１７Ｂおよび図１７Ｃに示す。
結果：
図１７Ａは、すでに５μｇのＧＮ０１－およびＧＮ０２－ＬＮＰ製剤化ＲＡＢＶ－Ｇ－ｍＲＮＡによる単回ｉ．ｍ．免疫化が、プライムワクチン接種後３５日目に、全ての動物において、０．５ＩＵ／ｍｌの防御価（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｔｉｔｅｒ）を十分上回る非常に堅牢なＶＮＴを誘導したことを示している。
図１７Ｂおよび図１７Ｃは、本発明のＧＮ０１およびＧＮ０２－ＬＮＰ製剤化ＲＡＢＶ－Ｇ ｍＲＮＡワクチンがワクチン接種後に特異的細胞応答、対照ＬＮＰワクチン接種動物においては観察されなかった効果を誘導したことを示している。ｍＲＮＡ製剤ＧＮ０１とＧＮ０２の両方でＲＡＢＶ－Ｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１７Ｂ）が観察された。これはＲＡＢＶ－Ｇ特異的ＣＤ８＋Ｔについても当てはまっていた（図１７Ｃ）。
実施例１０：ワクチンとして使用されるモノトープアプローチのためのＧＮ０１
ワクチン接種の状況におけるＧＮ０１をさらに分析するために、ペプチドｈｕＣＴＬＡ４（１～３５）、ヘルパー脂質ＰＡＤＲＥ、リンカー（Ｇ４Ｓ）２をコードするｍＲＮＡを設計した（詳細を表実施例１６に示す）。
ＰｐＬｕｃ ｍＲＮＡ（配列番号３３）を対照として使用した。対応するｍＲＮＡを上記のようにＧＮ０１ ＬＮＰに製剤化し、結果として、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに注射した（実験詳細は表実施例１７に示す）。
１日目の第１のワクチン接種については、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに５μｇのＧＮ０１ ＬＮＰ製剤化ＲＮＡを皮内ワクチン接種した。７日目に、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、２度目の５μｇのＧＮ０１ ＬＮＰ製剤化ＲＮＡを皮内ワクチン接種すると同時に、出血後に血清を回収した。１４日目の第３のワクチン接種についても、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに再びワクチン接種した。分析を２１日目に行い、脾細胞を脾臓から単離し、全てのそれぞれのエピトープペプチド（２９ｍｅｒ）で再刺激、または対照群の全てのペプチドで再刺激した（ＥＬＩＳＰＯＴ／ＩＣＳ）。単一細胞についてのサイトカイン分泌の頻度を、酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイを使用して定量的に測定した。単一細胞レベルで抗原特異的、サイトカイン分泌Ｔ細胞（ＣＤ１０７ａおよびＩＮＦγおよびＴＮＦ）を識別するために、フローサイトメトリに基づく方法であるＩＣＳ（細胞内サイトカイン染色）アッセイを使用した。
結果：
ＧＮ０１製剤化ＲＮＡの高い反応原性が観察された。ＧＮ０１ ＬＮＰを介したＰＡＤＲＥを含有するモノトープ構築物によるワクチン接種によって脾細胞数が増加する（図１８Ａ参照）。モノトープ構築物は、ＧＮ０１製剤化および皮内施用と組み合わせて、一般的に、組み込まれた強力な抗原に対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導するのに非常に強力である。Ｐｍｅｌ、Ｔｒｐ１およびＯｂｓｌ１に対する強力なＣＤ８ Ｔ細胞応答を検出することができた（図１８Ｂ、図１８Ｃおよび図１８Ｄ参照）。
実施例１１：インフルエンザ／インフルワクチン接種用のＧＮ０１－Ｈ３Ｎ２
ＧＮ０１製剤化ＬＮＰの免疫原性を分析するために、ＨＡ（Ｈ３Ｎ２ Ａ／香港／４８０１／２０１４）ｍＲＮＡを上記の手順に従って作製して、ｍＣａｐ、ｍｕａｇ－３’－ＵＴＲ；３’末端の６４×アデノシン（ポリＡ尾部）；５個のヌクレオチド、３’末端の３０×シトシン（ポリＣ尾部）；ヒストンステムループおよび５個の追加のヌクレオチド（配列番号３７）を含むＨＡ ｍＲＮＡを得た。
７週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝５）に、表実施例１８に示されるワクチン接種スキームに従って、０日目および２１日目（プライム／ブースト）に筋肉内注射した。ｍＲＮＡのＧＮ０１製剤化は上記のように達成した；対照群はＮａＣｌ緩衝液を受けた。液性免疫応答を決定するために、血清試料を２１日目および３５日目に採取した。
免疫原性アッセイのために、赤血球凝集抑制（ＨＩ）価をプライム３週間後およびブースト２週間後に血清で分析した。
赤血球凝集抑制アッセイ：
機能的抗ＨＡ抗体価を分析するために、赤血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイを使用した。マウス血清を熱不活性化し（５６℃、３０分間）、カオリン（カールルス社（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）、ドイツ）とインキュベートし、ニワトリ赤血球（ＣＲＢＣ；ローマンティアズフト社（Ｌｏｈｍａｎｎ Ｔｉｅｒｚｕｃｈｔ）、ドイツ）に事前吸着させた。５０μｌの前処理血清の２倍希釈液を、４赤血球凝集単位（ＨＡＵ）の不活性化インフルエンザＡ／香港／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）ウイルス（ＮＩＢＳＣ、英国）と４５分間インキュベートし、５０μｌの０．５％ＣＲＢＣを添加した。ＨＩ価を、赤血球凝集を抑制することができる血清の最大希釈倍率の逆数によって決定した。ＨＩアッセイの結果を図１９に示す。
結果：
図１９は、すでに１０μｇのＧＮ０１ ＬＮＰ製剤化ＨＡ－ｍＲＮＡによる単回ｉ．ｍ．免疫化が、プライムワクチン接種後２１日目に全ての動物において４０の防御価を十分に上回る防御ＨＩ価を誘導し、１０μｇのＧＮ０１ ＬＮＰ製剤化ＨＡ－ｍＲＮＡによるブーストが液性免疫応答の多重増加を誘導したことを示している。
実施例１２：大型動物（子ウシ）のインビボ狂犬病ワクチン接種用のＧＮ０１
大型動物における狂犬病ワクチンの状況におけるＧＮ０１ ＬＮＰを分析するために、ＲＡＢＶ－Ｇ ｍＲＮＡを使用して体重約１００ｋｇの子ウシで試験を実施した。ＧＮ０１製剤化ＬＮＰの免疫原性を分析するために、ＲＡＢＶ－Ｇ ｍＲＮＡを上記の手順に従って作製して、ｍＣａｐ、ｍｕａｇ－３’－ＵＴＲ；３’末端の６４×アデノシン（ポリＡ尾部）；５個のヌクレオチド、３’末端の３０×シトシン（ポリＣ尾部）；ヒストンステムループおよび５個の追加のヌクレオチド（配列番号３２）を含むＲＡＢＶ－Ｇ ｍＲＮＡを得た。
得られたｍＲＮＡを前記のようにＧＮ０１ ＬＮＰに製剤化し、０日目および２１日目に子ウシに筋肉内注射した（詳細なスキームは表実施例１９に示す）。陽性対照として、Ｒａｂｉｓｉｎ（登録商標）（不活性化狂犬病ウイルス、メリアル社（Ｍｅｒｉａｌ ＧｍｂＨ））を使用した。血液試料を０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目および３５日目に採取した。各時点でＶＮＴを分析した。実験結果を図２０に示す。
結果：
図２０で証明されるように、ＧＮ０１製剤化ＲＡＢＶ－ＧコードｍＲＮＡによる子ウシの筋肉内ワクチン接種は、驚くべきことに、すでにプライムワクチン接種後１４日後に、およびすでにわずか３０μｇのｍＲＮＡの投与により、中和抗体の非常に強力な誘導をもたらした。０．５ＩＵ／ｍｌのＷＨＯ標準をグラフ中破線によって示す。したがって、０．３μｇ／ｋｇのＧＮ０１製剤化ＲＡＢＶ－Ｇ ｍＲＮＡの投与は、プライムワクチン接種後に、非製剤化ｍＲＮＡを用いた以前の実験と比較して有意に高い応答を誘導した（データは示さない）。ＶＮＴはブーストワクチン接種後にさらに増加した（図２０）；データは中央値－マン－ホイットニーによる検定を示す。
実施例１３：インビボマラリアワクチン接種用のＧＮ０１
本実施例は、ＣＳＰをコードするマラリアｍＲＮＡワクチンが、マウスにおいて強力な液性および細胞性免疫応答を誘導することを示す。
ＣＳＰ ｍＲＮＡは、ＨＳＤ１７Ｂ４由来の５’－ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３由来の３’－ＵＴＲ、３’末端の６４×アデノシン（ポリＡ尾部）；５個のヌクレオチド、３’末端の３０×シトシン（ポリＣ尾部）、ヒストンステムループ、および５個の追加のヌクレオチドを含んでいた。ｍＲＮＡを、製造業者の説明書に従って、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ（商標）ｍ７Ｇ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（セルスクリプト社（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ）、米国ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在）を使用してさらに酵素的にキャッピングし、商業的ポリアデニル化キットを使用して酵素的にポリアデニル化して、配列番号３８を得た。
得られたｍＲＮＡ構築物を前記のようにＧＮ０１脂質ナノ粒子に製剤化した。
ＧＮ０１－ＬＮＰ製剤を、表実施例２０に示されるＲＮＡの用量、製剤、および対照群により０日目および２１日目に筋肉内（ｉ．ｍ．；脛骨筋）施用した。陰性対照群は、ＧＮ０１－ＬＮＰに製剤化された無関係のＲＮＡによるワクチン接種を受けた。血清試料をＥＬＩＳＡのために２１日目および３５日目に採取した。
ＥＬＩＳＡによる特異的液性免疫応答の決定：
コーティングのためにマラリア［ＮＡＮＰ］７ペプチドまたはＣ末端ペプチドを使用してＥＬＩＳＡを実施した。コーティングプレートを、それぞれの血清希釈を使用してインキュベートし、特異抗体のそれぞれのマラリア［ＮＡＮＰ］７ペプチドまたはＣ末端ペプチドへの結合をビオチン化アイソタイプ特異抗マウス抗体、引き続いて基質としてのＡｍｐｌｅｘ（商標）Ｒｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔによるストレプトアビジン－ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）を使用して検出した。マラリア［ＮＡＮＰ］７またはＣ末端ペプチドに対して向けられたエンドポイント抗体価（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）をプライム後２１日目および３５日目にＥＬＩＳＡによって測定した。結果を図２１．１Ａおよび図２１．１Ｂに示す。
細胞内サイトカイン染色：
ワクチン接種したマウス由来の脾細胞を、当技術分野で公知の標準的なプロトコルに従って、３５日目に単離した。手短に言えば、単離した脾臓を、セルストレーナを通して粉砕し、ＰＢＳ／１％ＦＢＳ中で洗浄し、引き続いて赤血球を溶解した。ＰＢＳ／１％ＦＢＳによる大規模な（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）洗浄工程後、脾細胞を９６ウェルプレートに播種した（２×１０６個の細胞／ウェル）。細胞を、３７℃で６時間、２．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体（ビーディーバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））およびタンパク質輸送阻害剤の存在下、ＣＰＳペプチドの混合物（１μｇ／ｍｌ）で刺激した。刺激後、細胞を洗浄し、製造業者の説明書に従って、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）試薬（ビーディーバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用して細胞内サイトカインについて染色した。以下の抗体：Ｔｈｙ１．２－ＦＩＴＣ（１：１００）、ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７（１：２００）、ＴＮＦ－ＰＥ（１：１００）、ＩＦＮγ－ＡＰＣ（１：１００）（イーバイオサイエンス社（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、ＣＤ４－ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｖ４５０（１：２００）（ビーディーバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を染色に使用し、１：１００希釈したＦｃγブロックとインキュベートした。Ａｑｕａ Ｄｙｅを使用して生／死細胞を区別した（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータ（ベクトンディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を使用して細胞を獲得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ツリースター社（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．））を使用して、フローサイトメトリデータを分析した。結果を図２１．２に示す。
結果：
図２１．２に示されるように、ＬＮＰ製剤化ＣＳＰ ｍＲＮＡワクチンは、マウスにおいて強力な液性免疫応答を誘導した。試験した条件下で、Ａ群に施用されたＬＮＰ製剤化ワクチン（１μｇ用量）は、非常に強力な免疫応答を誘導した。
図２１．２に示されるように、ＬＮＰ製剤化ＣＳＰ ｍＲＮＡワクチンは、マウスにおいて細胞性免疫応答（ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞応答）を誘導した。
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、マラリア原虫によって引き起こされる細胞内感染症に対する主要な防御免疫機序であるので、有効なマラリアワクチンは、強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導すべきである。したがって、これらの所見は、本発明のＧＮ０１製剤の有利な特徴の１つを強調している。
実施例１４：ＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡのｉ．ｖ．注射後のインビボＦＧＦ２１発現
異なるＨＥＸＡ脂質を含む様々なＬＮＰ組成物（表実施例２１に示される）のトランスフェクション、インビボ発現および発現効率を決定するために、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）をコードするｍＲＮＡを製剤化し、ＣＤ－１マウスに静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。さらに、毒性、サイトカイン放出および発現とサイトカイン放出の相関を決定した。
このために、より高い安定性およびより低いタンパク質分解のためのいくつかのアミノ酸交換をヒトＦＧＦ２１に導入した（Ｌ１２６Ｒ、Ｐ１９９Ｇ、Ａ２０８Ｅ；本願明細書に援用する、国際公開第２０１８／１０４５３８号に開示されるのと同様）。対応するｍＲＮＡ配列は、ＨＳＤ１７Ｂ４由来の５’－ＵＴＲおよびＰＳＭＢ３由来の３’－ＵＴＲを含んでいた（配列番号３９）。
さらに、ｍＲＮＡを標準的な手続きに従って酵素的にキャッピングした；メチル基を第２の工程で付加してキャップ１を得て、ｍＲＮＡを、商業的に入手可能なポリアデニル化キットおよび当技術分野で公知の対応するプロトコルを使用してさらに酵素的にアデニル化した。さらに、ｍＲＮＡを化学修飾した（すなわち、シュードウリジン（ψ）によるウリジンの完全置換）。ｍＲＮＡのＬＮＰへの製剤化を上記のように、および表実施例２１に示されるように実施した。
ＣＤ－１マウス（４匹／群）に、単回ｉ．ｖ．低または高ｍＲＮＡ用量（０．２５ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ）を注射し、注射６時間後で出血させた。抗ＦＧＦ２１タンパク質ＥＬＩＳＡを使用して、ＦＧＦ２１タンパク質発現の分析を実施した（結果を図２２および図２３に示す）。
アミノトランスフェラーゼＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）およびＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）の活性を測定することによって、様々なＬＮＰ組成物（表実施例２１参照）の忍容性をさらに分析する。ＡＬＴおよびＡＳＴレベルを注射６時間後および２４時間後に測定した。
サイトカイン放出を分析するために、ＥＤＴＡ血漿サイトカイン分析を注射６時間後に実施した。したがって、様々なＬＮＰ製剤（表実施例２１参照）による処置の６時間後にマウスから採取した血清試料を用いたＣＢＡアッセイは、以下のサイトカイン／ケモカイン：ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１、ＭＩＰ－１、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－６、ＴＮＦ、ＩＬ－１β、ＩＦＮ－γのレベルを明らかにした。さらに、血清中のＩＦＮ－αのレベルをＥＬＩＳＡによって決定する。血清中のマウスＩＦＮ－αの分析を、５０μｌの試薬希釈液中血清（１：２０）を用いて、製造業者の説明書に従って実施する。
結果：
ＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡの低用量ｉ．ｖ．注射（０．２５ｍｇ／ｋｇ）の６時間後に、ＦＧＦ２１タンパク質レベルの発現が全ての製剤について検出可能であった（図２２）。ＦＧＦ２１をコードするｍＲＮＡの低ｉ．ｖ．注射後に、ＬＮＰ－Ｃ１４、ＬＮＰ－Ｃ１５、ＬＮＰ－２１およびＬＮＰ－ＧＮ０１はＦＧＦ１２タンパク質の優れた発現レベルを示した。１ｍｇ／ｋｇによる処置後に、製剤ＬＮＰ－Ｃ１４、ＬＮＰ－Ｃ１５、ＬＮＰ－２１およびＬＮＰ－ＧＮ０１について非常に強力なタンパク質発現が検出された（図２３）。全てのＬＮＰ製剤がビヒクルと比較して高いタンパク質レベルを示した。ＬＮＰ－Ｃ１５で最高のタンパク質レベルを測定した。驚くべきことに、タンパク質レベルは、低用量処置と比較しておよそ３５倍高かった。
実施例１５：ＨＥＸＡ－Ｃ４ＤＥ－ＰｉｐＳＳの合成
実施例１５．１
４－（２－ヘキシルデコキシ）－４－オキソ－ブタン酸の合成
２－ヘキシル－１－デカノール（１０ｇ）を、室温で、脱水（ｄｒｙ）ジクロロメタン１００ｍｌに溶解する。コハク酸無水物（４．９９ｇ）およびジメチルアミノピリジン（６．１ｇ）を添加し、反応混合物を、窒素下、室温で一晩攪拌する。溶媒を蒸発させ、粗残渣を、勾配ジクロロメタン→ジクロロメタン：メタノール９５：５で溶出するシリカフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。生成物を含有する画分を合わせ、濃縮すると、標的化合物が、黄色がかった油（９．３２ｇ、収率６５．８％）として得られる。
実施例１５．２
Ｏ１－［２－（１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－４－ピペリジル）エチル］Ｏ４－（２－ヘキシルデシル）ブタンジオエートの合成
実施例１５．１からの生成物（２．５ｇ）およびｔｅｒｔ－ブチル４－（２－ヒドロキシエチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（１．８５２ｇ）を、室温で、脱水ジクロロメタン３０ｍｌに溶解して、透明な溶液を得る。Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．６６６ｇ）を添加し、反応混合物を室温で一晩攪拌する。形成した白色沈殿を濾別し、少量の石油エーテルで洗浄する。合わせた濾液を真空中で濃縮し、残渣を、純粋な石油エーテルから石油エーテル：酢酸エチル８０：２０までの溶媒勾配を用いたシリカフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。生成物の純粋な画分を合わせ、濃縮すると、標的化合物がわずかに黄色の油（３．３１ｇ、収率８１．４％）として得られる。
実施例１５．３
Ｏ４－（２－ヘキシルデシル）Ｏ１－［２－（４－ピペリジル）エチル］ブタンジオエートの合成
実施例１５．２からの生成物（３．３ｇ）を、室温で、脱水ジクロロメタン１０ｍｌに溶解する。トリフルオロ酢酸（４ｍｌ）を添加し、混合物を室温で２時間攪拌する。混合物を飽和炭酸水素ナトリウムで２回洗浄し、水相をジクロロメタンで逆抽出する。合わせた有機溶液をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、標的化合物がトリフルオロ酢酸塩（黄色油３．０８ｇ、収率９１％）として得られる。生成物をさらに精製することなく次の工程に使用した。
実施例１５．４
Ｏ４－（２－ヘキシルデシル）Ｏ１－［２－［１－（２－スルファニルエチル）－４－ピペリジル］エチル］ブタンジオエートの合成
実施例１５．３からの粗生成物（１．３ｇ）を脱水トルエン１０ｍｌに溶解する。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．５２６ｍｌ）を室温で添加すると、透明な溶液が得られる。混合物を圧力バイアルに移し、エチレンスルフィド０．７ｍｌを添加する。バイアルを密封し、６５℃の油浴中で一晩加熱する。室温に冷却した後、複合反応混合物を濃縮し、得られたままの状態でその後の工程に使用する。
実施例１５．５
Ｏ１－［２－［１－［２－［２－［４－［２－［４－（２－ヘキシルデコキシ）－４－オキソ－ブタノイル］オキシエチル］－１－ピペリジル］エチルジスルファニル］エチル］－４－ピペリジル］エチル］Ｏ４－（２－ヘキシルデシル）ブタンジオエートの合成
実施例１５．４からの粗生成物混合物をアセトニトリル１５ｍｌに溶解する。ヨウ素のアセトニトリル：水９：１中溶液を、褐色が残るまで、攪拌しながら室温で滴加する。反応混合物を濃縮し、酢酸エチルに溶解する。その後、この溶液を炭酸水素ナトリウム溶液、チオ硫酸ナトリウム溶液およびブラインで洗浄する。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。標的化合物を、勾配クロロホルム→クロロホルム：メタノール８０：２０で溶出する、シリカフラッシュクロマトグラフィーによって単離する。それぞれの画分を合わせ、溶媒を蒸発させると、純粋な標的化合物が黄色油（２７２ｍｇ、２工程にわたる収率１１％）として得られる。
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：４．１５ｐｐｍ（４Ｈ），４．０１ｐｐｍ（４Ｈ），３．２－２．５ｐｐｍ（２０Ｈ），２．２－１．９ｐｐｍ（４Ｈ），１．８－１．５ｐｐｍ（１０Ｈ），１．５－１．１ｐｐｍ（５４Ｈ），０．９１（１２Ｈ）
実施例１６：ＨＥＸＡ－Ｃ５ＤＥ－ＰｉｐＳＳの合成
実施例１６．１
５－（２－ヘキシルデコキシ）－５－オキソ－ペンタン酸の合成
２－ヘキシル－１－デカノール（１５０ｇ）およびグルタル酸無水物（７４．１３ｇ）の脱水ジクロロメタン１０００ｍｌ中溶液に、ジメチルアミノピリジン（９０．７１ｇ）を添加し、反応混合物を、窒素下、室温で６５時間攪拌する。形成した白色沈殿を濾別し、捨てる。濾液を真空中で濃縮し、石油エーテル２００ｍｌと４０分間混合すると、白色懸濁液が得られる。沈殿を濾別し、濾液を濃縮する。粗生成物を１Ｎ塩酸３００ｍｌと酢酸エチル５００ｍｌに分配する。有機相を分離し、水５００ｍｌで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させる。硫酸ナトリウムを濾別し、溶媒を真空中で蒸発させる。粗残渣を、勾配ジクロロメタン→ジクロロメタン：メタノール９０：１０で溶出するシリカフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。生成物を含有する画分を合わせ、濃縮すると、純粋な標的化合物が黄色油（１２３．９ｇ、収率５６．１％）として得られる。
実施例１６．２
Ｏ１－［２－（１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－４－ピペリジル）エチル］Ｏ５－（２－ヘキシルデシル）ペンタンジオエートの合成
実施例１６．１からの生成物（５２．６ｇ）およびｔｅｒｔ－ブチル４－（２－ヒドロキシエチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（３７．２ｇ）を、室温で、ジクロロメタン６００ｍｌに溶解すると、透明な黄色溶液が得られる。Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（３３，４８．６ｇ）を添加し、反応混合物を室温で２２時間攪拌する。さらなるＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（１５．２ｇ）を添加し、混合物を室温でさらに４２時間攪拌する。形成した白色沈殿を濾別し、少量の石油エーテルで洗浄する。合わせた濾液を真空中で濃縮し、残渣を、純粋な石油エーテルから石油エーテル：酢酸エチル９０：１０までの溶媒勾配を用いるシリカフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。生成物の純粋な画分を合わせ、濃縮すると、標的化合物が油（３２．８ｇ、収率３９．２％）として得られる。
実施例１６．３
Ｏ５－（２－ヘキシルデシル）Ｏ１－［２－（４－ピペリジル）エチル］ペンタンジオエートの合成
実施例１６．２からの生成物（３２．８ｇ）を、室温で、ジクロロメタン１０００ｍｌに溶解する。溶液を氷浴中で冷却し、トリフルオロ酢酸（３５．６ｍｌ）を約０℃でゆっくり添加する。混合物を室温まで加温させ、一晩攪拌する。混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、水相をジクロロメタンで逆抽出する。合わせた有機溶液をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、標的化合物が黄色油（２７．１５ｇ、定量的収率）として得られる。生成物をさらに精製することなく次の工程に使用した。
実施例１６．４
Ｏ５－（２－ヘキシルデシル）Ｏ１－［２－［１－（２－スルファニルエチル）－４－ピペリジル］エチル］ペンタンジオエートの合成
実施例１６．３からの粗生成物（１．３７ｇ）を脱水トルエン１０ｍｌに溶解する。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．５３３ｍｌ）を室温で添加すると、透明な溶液が得られる。混合物を圧力バイアルに移し、エチレンスルフィド０．７ｍｌを添加する。バイアルを密封し、６５℃の油浴中で一晩加熱する。室温に冷却した後、複合反応混合物を濃縮し、得られたままの状態でその後の工程に使用する。
実施例１６．５
Ｏ１－［２－［１－［２－［２－［４－［２－［５－（２－ヘキシルデコキシ）－５－オキソ－ペンタノイル］オキシエチル］－１－ピペリジル］エチルジスルファニル］エチル］－４－ピペリジル］エチル］Ｏ５－（２－ヘキシルデシル）ペンタンジオエートの合成
実施例１６．４からの粗生成物混合物をアセトニトリル１５ｍｌに溶解する。ヨウ素のアセトニトリル：水９：１中溶液を、褐色が残るまで、攪拌しながら室温で滴加する。反応混合物を濃縮し、酢酸エチルに溶解する。その後、この溶液を炭酸水素ナトリウム溶液およびチオ硫酸ナトリウム溶液で洗浄する。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。標的化合物を、勾配クロロホルム→クロロホルム：メタノール８０：２０で溶出するシリカフラッシュクロマトグラフィーによって単離する。それぞれの画分を合わせ、溶媒を蒸発させると、純粋な標的化合物が黄色油（５６２ｍｇ、２工程にわたる収率２２％）として得られる。
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：４．１１ｐｐｍ（４Ｈ），３．９８ｐｐｍ（４Ｈ），３．１５－２．５ｐｐｍ（１２Ｈ），２．３７（８Ｈ），２．１７－１．８４ｐｐｍ（８Ｈ），１．８１－１．５ｐｐｍ（１０Ｈ），１．４９－１．０８ｐｐｍ（５４Ｈ），０．８８（１２Ｈ）
実施例１７：ＨＥＸＡ－Ｃ５ＤＥ－ＰｉｐＣ３ＳＳの合成
実施例１７．１
［３－ブロモプロピルスルファニル（ジフェニル）メチル］ベンゼンの合成
トリフェニルメタンチオール（１２ｇ）および１，３－ジブロモプロパン（２２ｍｌ）の脱水テトラヒドロフラン２２５ｍｌ中溶液に、炭酸カリウム（６．６ｇ）を添加した。反応混合物を、窒素下、５０℃で２日間および６０℃でさらに４日間攪拌する。不溶性塩を濾別し、濾液を真空中で濃縮する。残渣のジクロロメタン１５０ｍｌ中溶液を水５００ｍｌで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮する。残渣を、石油エーテル：ジクロロメタン４：１で溶出するシリカフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。関連する画分を合わせ、溶媒を真空中で蒸発させると、純粋な標的化合物が固体（４．２ｇ、収率２４．３％）として得られる。
実施例１７．２
Ｏ５－（２－ヘキシルデシル）Ｏ１－［２－［１－（３－トリチルスルファニルプロピル）－４－ピペリジル］エチル］ペンタンジオエートの合成
実施例１６．３からの生成物（４ｇ）および実施例１７．１からの生成物（３．４ｇ）を、室温で、アセトニトリル８５ｍｌと混合して、懸濁液を得る。ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）を添加し、混合物を５５℃で１６時間およびさらに６５℃で２４時間攪拌する。炭酸カリウム（６００ｍｇ）を添加し、混合物をさらに３時間攪拌する。反応混合物を濾過し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、溶離液としてジクロロメタン：メタノール９０：１０）によって精製すると、一部の残留ジメチルホルムアミドを含有する本質的に純粋な標的化合物（３．５５ｇ、収率５２．９％）が得られる。
実施例１７．３
Ｏ５－（２－ヘキシルデシル）Ｏ１－［２－［１－（３－スルファニルプロピル）－４－ピペリジル］エチル］ペンタンジオエートの合成
実施例１７．２からの生成物（１ｇ）を脱水ジクロロメタン５ｍｌに溶解し、溶液を氷浴中で０℃に冷却する。その後、トリフルオロ酢酸（１．９６５ｍｌ）およびトリエチルシラン（０．２０６ｍｌ）を添加すると、わずかに褐色がかった溶液が得られる。反応混合物を０℃で３０分間攪拌し、ジクロロメタン５０ｍｌで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液１００ｍｌで洗浄する。有機相を分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮する。残渣を、勾配ジクロロメタン→ジクロロメタン：メタノール９５：５で溶出するシリカフラッシュクロマトグラフィーによって精製すると、標的化合物（０．４７ｇ、収率６８％）が得られる。
実施例１７．４
Ｏ１－［２－［１－［３－［３－［４－［２－［５－（２－ヘキシルデコキシ）－５－オキソ－ペンタノイル］オキシエチル］－１－ピペリジル］プロピルジスルファニル］プロピル］－４－ピペリジル］エチル］Ｏ５－（２－ヘキシルデシル）ペンタンジオエートの合成
実施例１７．３からの生成物（０．４７ｇ）をアセトニトリル１０ｍｌに溶解する。ヨウ素のアセトニトリル：水９：１中溶液を、褐色が残るまで、室温で滴加する。反応混合物を室温で５８時間攪拌し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン→ジクロロメタン：メタノール９５：５）によって精製すると、標的化合物がヨウ化水素酸塩（２４０ｍｇ、収率４５．８％）として得られる。
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：１０．０１ｐｐｍ（２Ｈ），４．１５ｐｐｍ（４Ｈ），３．９９ｐｐｍ（４Ｈ），３．８３ｐｐｍ（４Ｈ），３．２８ｐｐｍ（４Ｈ），２．９４－２．８０ｐｐｍ（８Ｈ），２．５３－２．４４ｐｐｍ（４Ｈ），２．４３－２，３６ｐｐｍ（８Ｈ），２．２１－２．０９ｐｐｍ（４Ｈ），２．０４－１．９１ｐｐｍ（８Ｈ），１．８４－１．６７ｐｐｍ（６Ｈ），１．３６－１．２ｐｐｍ（５０Ｈ），０．９０ｐｐｍ（１２Ｈ）
実施例１８：ＨＥＸＡＣＡ－Ｃ５ＤＥ－ＰｉｐＳＳの合成
実施例１８．１
２－ヘキシルデカノイルクロリドの合成
２－ヘキシルデカン酸（２５ｇ）の脱水ジクロロメタン２５０ｍｌ＋ジメチルホルムアミド０．１ｍｌ中溶液を氷浴中で０℃に冷却し、塩化オキサリル（１２．５４ｍｌ）をこの温度で滴加する。混合物を室温に加温し、３時間攪拌する。溶媒を真空中で除去すると、黄色油（２６．５ｇ）が得られ、これをさらに精製することなく次の工程に使用する。
実施例１８．２
５－ヒドロキシペンチル２－ヘキシルデカノエートの合成
１，５－ペンタンジオール（５１．０７ｇ）およびトリエチルアミンの脱水テトラヒドロフラン２５０ｍｌ中溶液を、氷浴中、０℃で攪拌する。実施例１８．１からの生成物（２６．５ｇ）の脱水テトラヒドロフラン２５０ｍｌ中溶液をこの温度で８０分間にわたってゆっくり添加する。反応混合物を室温に加温し、一晩攪拌する。溶媒を真空中で蒸発させ、得られた褐色油をジクロロメタン３００ｍｌに溶解し、水５００ｍｌで２回洗浄する。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮する。粗生成物を、ジクロロメタン：メタノール９５：５で溶出するシリカフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。関連する画分をプールし、溶媒を蒸発させると、標的化合物が、わずかに褐色がかった油（２７．３６ｇ、収率８１．９％）として得られる。
実施例１８．３
５－（２－ヘキシルデカノイルオキシ）ペンタン酸の合成
濃硫酸（１５８．３６ｇ）を酸化クロム（ＶＩ）（８６．０６ｇ）の水２５８ｍｌ中冷却溶液（５℃）に滴加して、深橙色溶液を得ることによって、ジョーンズ試薬の溶液を新たに調製する。この溶液を、０℃で、実施例１８．２からの化合物（１９．７５ｇ）のアセトン２５８ｍｌ中溶液に７０分間にわたってゆっくり添加する。混合物を１時間攪拌し、イソプロパノール１２０ｍｌを慎重に添加することによって（発熱）、反応物をクエンチすると、粘着性沈殿が形成される。溶液をデカントし、ジクロロメタン４００ｍｌと水３００ｍｌに分配する。ジクロロメタン溶液を分離する。粘着性沈殿を、ジクロロメタン５００ｍｌおよび水５００ｍｌを用いて攪拌する。有機相を分離し、前に得られたジクロロメタン溶液と合わせ、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮する。残渣をシリカフラッシュクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン：メタノール９６：４）によって精製すると、溶媒の蒸発後に、標的化合物が、黄色がかった油（１６．３８ｇ、収率７９．７％）として得られる。
実施例１８．４
ｔｅｒｔ－ブチル４－［２－［５－（２－ヘキシルデカノイルオキシ）ペンタノイルオキシ］エチル］ピペリジン－１－カルボキシレートの合成
実施例１８．３からの化合物（１０ｇ）の脱水ジクロロメタン２００ｍｌ中溶液を脱水ジメチルホルムアミド２０ｍｇおよび塩化オキサリル（３．６ｍｌ）で処理する。混合物を２０℃で１時間攪拌し、真空中で濃縮し、脱水ジクロロメタン１００ｍｌに再溶解する。この溶液を、室温で、ｔｅｒｔ－ブチル４－（２－ヒドロキシエチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（７．０８ｇ）およびトリエチルアミン（５．６７ｇ）のジクロロメタン１００ｍｌ中溶液に滴加する。反応混合物を一晩攪拌し、次いで、真空中で濃縮する。残渣を、酢酸エチル：石油エーテル１：５で溶出する、シリカフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。関連する画分を合わせ、溶媒を蒸発させると、純粋な標的化合物（１３．０５ｇ、収率８１．９％）がわずかに黄色の油として得られる。
実施例１８．５
［５－オキソ－５－［２－（４－ピペリジル）エトキシ］ペンチル］２－ヘキシルデカノエートの合成
実施例１８．４からの生成物（５ｇ）を、室温で、ジクロロメタン１２０ｍｌに溶解する。トリフルオロ酢酸（１０．０４ｇ）を添加し、混合物を一晩攪拌する。全ての揮発性物質を真空中で除去し、残渣（６．２８ｇ、定量的収率）をさらに精製することなくその後の工程に使用する。
実施例１８．６
［５－オキソ－５－［２－［１－（２－スルファニルエチル）－４－ピペリジル］エトキシ］ペンチル］２－ヘキシルデカノエートの合成
実施例１８．５からの粗生成物（３ｇ）を脱水トルエン３５ｍｌに溶解する。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５．６ｍｌ）を室温で添加すると、透明な溶液が得られる。混合物を圧力バイアルに移し、エチレンスルフィド１．９１ｍｌを添加する。バイアルを密封し、６５℃の油浴中で一晩加熱する。室温に冷却した後、反応混合物を濃縮し、得られた状態のままで次の工程に使用する。
実施例１８．７
［５－［２－［１－［２－［２－［４－［２－［５－（２－ヘキシルデカノイルオキシ）ペンタノイルオキシ］エチル］－１－ピペリジル］エチルジスルファニル］エチル］－４－ピペリジル］エトキシ］－５－オキソ－ペンチル］２－ヘキシルデカノエートの合成
実施例１８．６からの粗生成物混合物をアセトニトリル３０ｍｌに溶解する。ヨウ素（８１４ｍｇ）のアセトニトリル２０ｍｌ中溶液を、褐色が残るまで、室温で滴加する。反応混合物を室温で９０分間攪拌し、次いで、真空中で濃縮する。残渣をクロロホルム５０ｍｌに溶解し、その後、溶液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液５０ｍｌおよびチオ硫酸ナトリウム溶液で洗浄する。有機相を分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。標的化合物を、シリカフラッシュクロマトグラフィー（溶離液ジクロロメタン：メタノール２０：１＋１％アンモニア水）によって単離する。純粋な生成物を含有する画分を合わせ、溶媒を蒸発させると、標的化合物が黄色油（６８０ｍｇ、２工程にわたる収率１０％）として得られる。
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：４．１５－４．０２ｐｐｍ（８Ｈ），２．９２ｐｐｍ（４Ｈ），２．８３ｐｐｍ（４Ｈ），２．６６ｐｐｍ（４Ｈ），２．３６－２．２６ｐｐｍ（６Ｈ），２．０ｐｐｍ（４Ｈ），１．７４－１．６２（１２Ｈ），１．６１－１．５２ｐｐｍ（８Ｈ），１．４６－１．１７ｐｐｍ（５０Ｈ），０．８６ｐｐｍ（１２Ｈ）
実施例１９：ＨＥＸＡ－Ｃ５ＤＥ－Ｐｉｐ－チオエーテルの合成
実施例１９．１
Ｏ５－（２－ヘキシルデシル）Ｏ１－［２－［１－（２－ヒドロキシエチル）－４－ピペリジル］エチル］ペンタンジオエートの合成
ジメチルホルムアミド６５．８ｍｌ中の実施例１６．３からの生成物（４ｇ）、２－ブロモエタノール（２．１４ｇ）および炭酸カリウム（２．３７ｇ）の混合物を５０℃で一晩攪拌する。反応混合物を室温に冷却し、水５００ｍｌで希釈し、それぞれジクロロメタン２５０ｍｌで３回抽出する。合わせた有機抽出物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮する。得られた粗標的化合物（３．３ｇ）をさらに精製することなくその後の工程に使用する。
実施例１９．２
Ｏ１－［２－［１－（２－クロロエチル）－４－ピペリジル］エチル］Ｏ５－（２－ヘキシルデシル）ペンタンジオエートの合成
実施例１９．１からの粗生成物（３．３ｇ）のトルエン６０ｍｌ中溶液に、室温で、塩化チオニル（１．５８ｇ）を滴加する。反応混合物を９０分間攪拌し、次いで、濃縮する。生成物を、勾配ジクロロメタン→ジクロロメタン：メタノール９０：１０で溶出するシリカフラッシュクロマトグラフィーによって予備精製する。標的化合物（塩酸塩として）を含有する画分を合わせ、溶媒を蒸発させる。溶離液として酢酸エチル→酢酸エチル：メタノール９８：２を使用する第２のシリカフラッシュクロマトグラフィーによって、最終的な精製を達成する。溶媒を真空中で除去し、残渣をジクロロメタン１００ｍｌに溶解する。この溶液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液１００ｍｌおよびブラインで徹底的に洗浄する。有機相を分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、標的化合物が遊離塩基（１．９５ｇ、収率５７％）として得られる。
実施例１９．３
Ｏ５－（２－ヘキシルデシル）Ｏ１－［２－［１－（２－スルファニルエチル）－４－ピペリジル］エチル］ペンタンジオエートの合成
実施例１６．３からの粗生成物（１２．５ｇ）を脱水トルエン７５ｍｌに溶解する。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１４ｍｌ）を室温で添加すると、透明な溶液が得られる。エチレンスルフィド（７．９６ｍｌ）を添加し、混合物を、アルゴン雰囲気下、５５℃で８時間および室温で一晩攪拌する。混合物を濃縮し、勾配ジクロロメタン→ジクロロメタン：メタノール９５：５で溶出するシリカフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。主に標的化合物を含有する画分を合わせ、溶媒を蒸発させる。生成物（１．９５ｇ、収率１２．４％）はいくらかのそれぞれのジスルフィド（空気による酸化から生じる）を含有している。
実施例１９．４
Ｏ１－［２－［１－［２－［２－［４－［２－［５－（２－ヘキシルデコキシ）－５－オキソ－ペンタノイル］オキシエチル］－１－ピペリジル］エチルスルファニル］エチル］－４－ピペリジル］エチル］Ｏ５－（２－ヘキシルデシル）ペンタンジオエートの合成
実施例１９．３からの生成物（１ｇ）をジメチルホルムアミド１０ｍｌ＋水２滴に溶解する。溶液を、交互に真空を印加する／アルゴンでパージする３サイクルで脱気する。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（０．５４３ｇ）を添加し、混合物を室温で３日間攪拌する。反応混合物を脱気ジクロロメタン２５０ｍｌで希釈し、脱気炭酸水素ナトリウム溶液および脱気ブライン（それぞれ２００ｍｌ）で洗浄する。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮する。
残渣を脱気ジメチルホルムアミド１０ｍｌに溶解し、実施例１９．２からの生成物（１．００５ｇ）の脱気ジメチルホルムアミド５ｍｌおよびトリエチルアミン（０．７２ｍｌ）中溶液を添加する。反応混合物を、アルゴン下、室温で１８時間攪拌する。ジメチルホルムアミドのほとんどを、減圧下、５５℃で留去する。残渣を、複数回フラッシュクロマトグラフィーによって精製して混合画分を後処理する。使用するシリカを溶離液（ジクロロメタン：メタノール：アンモニア水９７：２．８５：０．１５）で事前調整する。純粋な画分を合わせ、溶媒を真空中で除去すると、清澄な標的化合物（１２０ｍｇ、収率５．９％）が得られる。
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：４．１１ｐｐｍ（４Ｈ），３．９８ｐｐｍ（４Ｈ），３．０７－２．８４ｐｐｍ（４Ｈ），２．７５－２．５１ｐｐｍ（８Ｈ），２．３７（８Ｈ），２．１０－１．８８ｐｐｍ（８Ｈ），１．６９－１．５４ｐｐｍ（１０Ｈ），１．４４－１．１５ｐｐｍ（５４Ｈ），０．８８（１２Ｈ）
実施例２０：ＨＥＸＡおよびＨＥＡＤ脂質の合成
本実施例は、本発明の脂質化合物を得るための方法および情報ならびに本発明の組成物を調製する方法および分析する方法を提供する。
実施例２０．１：ＨＥＸＡ脂質－ＨＥＸＡ脂質の合成
ＨＥＸＡ脂質をキロブロック社（ＣｈｉｒｏＢｌｏｃｋ ＧｍｂＨ）（ドイツビターフェルト＝ヴォルフェン（Ｂｉｔｔｅｒｆｅｌｄ－Ｗｏｌｆｅｎ）所在）の一般的なプロトコルに従って合成した。表実施例２２および図２４に示される２種のＨＥＸＡ脂質を合成した。実施例２３および２４を参照されたい。
ＨＥＸＡ脂質の純度および構造同一性を核磁気共鳴分光法（Ｈ－ＮＭＲ、５００．１３ＭＨｚ）および質量分析（エレクトロスプレーイオン化－ＥＳＩまたは大気圧化学イオン化－ＡＰＣＩ、直接注入を介する）によって確認した。
Ｃ２４についてのＮＭＲデータは以下の通りであった：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃ６Ｄ６）δ４．２８－４．１４（８Ｈ），２．８３（４Ｈ），２．７０－２．６１（４Ｈ），２．４８（４Ｈ），２．３１（８Ｈ），２．０３（４Ｈ），１．８８（４Ｈ），１．７６－１．６１（６Ｈ），１．５７－１．２０（５８Ｈ），１．０３（１２Ｈ）
Ｃ２５についてのＮＭＲデータは以下の通りであった：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃ６Ｄ６）δ４．２１－４．０８（８Ｈ），２．８４（４Ｈ），２．６２（４Ｈ），２．４１（４Ｈ），２．３１（８Ｈ），２．０４（４Ｈ），１．８４（８Ｈ），１．７１（２Ｈ），１．５９－１．２１（６２Ｈ），１．０３（１２Ｈ）
実施例２０．１．１：ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）マイクロ流体システムを使用したＬＮＰの調製
ＬＮＰを、表実施例２３で以下に示されるＬＮＰ１９～ＬＮＰ２４について、表実施例２の「組成物２」と題された一般的な製剤で実施例２．１．１に示されるように調製した。ＬＮＰ２５～ＬＮＰ２７も実施例２．１．１に示されるように調製した。よって、標準的なプロトコルに従って、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）マイクロ流体システム（プレシジョンナノシステムズ社（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）所在）を使用して、カチオン性脂質をＬＮＰとして製剤化した。
アバンティポーラリピッド社（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）（アラバマ州アラバスター（Ａｌａｂａｓｔｅｒ）所在）製の（０７：０）ＰＣ（ＤＨＰＣ－１，２－ジヘプタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）の構造は以下の通りである：
実施例２０．１．２：脂質ナノ粒子組成物の生物物理学的特性評価／ＨＥＸＡ脂質
表実施例２３に示されるＬＮＰを、実施例２．１．２に論じられるラインに沿って製剤化および特性評価した。特性評価は、表実施例２３のＬＮＰが実施例２．１．２のＬＮＰと同様の特徴を示す、すなわち、得られた特性評価の結果が基本的に実施例２．１．２のＬＮＰの範囲内にあることを示した。
実施例２０．２：ＨＥＡＤ脂質－ＨＥＡＤ脂質の合成
ＨＥＡＤ脂質をキロブロック社（ＣｈｉｒｏＢｌｏｃｋ ＧｍｂＨ）（ドイツビターフェルト＝ヴォルフェン（Ｂｉｔｔｅｒｆｅｌｄ－Ｗｏｌｆｅｎ）所在）の一般的なプロトコルに従って合成した。この実施例において、２種のＨＥＡＤ脂質を合成した（表実施例２４および図２５に示される）。実施例２５および２６を参照されたい。
ＨＥＡＤ脂質の純度および構造同一性を核磁気共鳴分光法（Ｈ－ＮＭＲ、５００．１３ＭＨｚ）および質量分析（エレクトロスプレーイオン化－ＥＳＩまたは大気圧化学イオン化－ＡＰＣＩ、直接注入を介する）によって確認した。
ＴＨＩＯＥＴＨＥＲについてのＮＭＲデータは以下の通りであった：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃ６Ｄ６）δ４．１６（４Ｈ），２．８５－２．６７（１２Ｈ），２．６４－２．５２（８Ｈ），２．４４（４Ｈ），２．３５（６Ｈ），２．２３（１２Ｈ），１．８４（４Ｈ），１．６４（１６Ｈ），１．５５－１．１７（５０Ｈ），１．０４（２４Ｈ）
Ｃ３ＳＳについてのＮＭＲデータは以下の通りであった：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃ６Ｄ６）δ４．１７（４Ｈ），２．８５－２．７１（１２Ｈ），２．６３－２．５２（４Ｈ），２．４５（４Ｈ），２．３４（１０Ｈ），２．２３（１２Ｈ），１．９２（４Ｈ），１．７９（４Ｈ），１．７３－１．１５（６８Ｈ），１．０１（２４Ｈ）
実施例２０．２．１：ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）マイクロ流体システムを使用したＬＮＰの調製／ＨＥＡＤ脂質
ＬＮＰ２８～ＬＮＰ３２を、表実施例７の「組成物Ｂ」と題された一般的な製剤で実施例２．１．１に示されるように調製した。ＬＮＰ－Ｃを、表実施例７の「組成物Ａ」と題された一般的な製剤で実施例２．１．１に示されるように調製した。よって、標準的なプロトコルに従って、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）マイクロ流体システム（プレシジョンナノシステムズ社（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）所在）を使用して、カチオン性脂質をＬＮＰとして製剤化した。
実施例２０．２．２：脂質ナノ粒子組成物の生物物理学的特性評価／ＨＥＡＤ脂質
表実施例２５に示されるＬＮＰを、実施例２．２．２に論じられるラインに沿って製剤化および特性評価した。特性評価は、表実施例２５のＬＮＰが実施例２．２．２のＬＮＰと同様の特徴を示す、すなわち、得られた特性評価の結果が基本的に実施例２．２．２のＬＮＰの範囲内にあることを示した。
実施例２１：筋肉内投与を使用したＲＡＢＶ－Ｇワクチン接種用の実施例２０のＬＮＰ
実施例２０によるＬＮＰの免疫原性を分析するために、ＲＡＢＶ－Ｇ（狂犬病ウイルス糖タンパク質）ｍＲＮＡを上記の手順に従って作製して、ｍＣａｐ、ｍｕａｇ－３’－ＵＴＲ；３’末端の６４×アデノシン（ポリＡ尾部）；５個のヌクレオチド、３’末端の３０×シトシン（ポリＣ尾部）および５個の追加のヌクレオチド（配列番号３２）を含むＲＡＢＶ－Ｇ ｍＲＮＡを得た。
７週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（表実施例２６および実施例２７の各群についてｎ＝８；表実施例２８の各群についてｎ＝６）に、上記ＲＡＢＶ－Ｇ ｍＲＮＡを含む表実施例２６、表実施例２７および表実施例２８による製剤を、０日目および２１日目に筋肉内注射した。
血清中の狂犬病ウイルスに対する抗体のレベルを決定するために、表実施例２６、実施例２７および実施例２８の群について、古典的ウイルス中和試験を実施した（蛍光抗体ウイルス中和（ＦＡＶＮ）アッセイ）。
第１のｍＲＮＡ投与の２８日後に、マウスを屠殺し、血液および臓器試料（脾臓）をさらなる分析のために回収した。この点については、この工程で得られた脾細胞試料における狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＡＢＶ－Ｇ）特異的細胞応答をＲＡＢＶ－Ｇ特異的Ｔ細胞活性化として測定した。以下の通り細胞内サイトカイン染色および標準的なプロトコルによるフローサイトメトリによるその後の分析によってこれを分析した：脾細胞を、抗ＣＤ１０７ａ（バイオレジェンド社（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、米国サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）所在）および抗ＣＤ２８（ビーディーバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、米国サンノゼ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）所在）の存在下、ＲＡＢＶ－Ｇペプチドカクテルで刺激した。非刺激脾細胞は、同じ方法で処理したが、ペプチドカクテルを補充しなかった。追加の対照は、ＰＭＡ／イオノマイシン（抗ＣＤ２８なし；ＰＭＡおよびシグマ－アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）；メルク社（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）、ドイツダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）所在製のイオノマイシン）で刺激した脾細胞（陽性細胞）およびフルオロフォアコンジュゲート抗体によって未染色のままにした脾細胞（陰性対照）とした。刺激手順後、脾細胞を表面および細胞内、フルオロフォアコンジュゲート抗体で染色し、フローサイトメトリによって分析した。
血清試料もブースト前２１日目に採取し、２１日目の血清試料を、ＦＡＶＮアッセイを介したウイルス中和抗体（ＶＮＡ）分析について分析した。さらに、ＬＮＰで製剤化したＲＡＢＶ－ＧコードｍＲＮＡで免疫化したマウスの血清中のサイトカインレベルの早期分析のために製剤の第１の施用（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）１８時間後に血清試料を採取した。
前記免疫原性アッセイのために、ＶＮＴを前記のように測定した、すなわち、血清中の抗狂犬病ウイルス中和価（ＶＮＴ）を、ＦＡＶＮアッセイを使用したＥｕｒｏｖｉｒ（登録商標）Ｈｙｇｉｅｎｅ－Ｌａｂｏｒ ＧｍｂＨ、ドイツおよびＷＨＯプロトコルによるＳｔａｎｄａｒｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ Ｖｉｒｕｓ ＣＶＳ－１１によって分析した。
アレイに含まれる以下のサイトカイン／ケモカイン：ＭＩＧ、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－６、ＴＮＦ、ＩＬ－１β、ＩＦＮ－γで、ＬＮＰ製剤化抗原コードｍＲＮＡによる免疫化の１８時間後にマウスから採取した血清試料を用いてＣＢＡアッセイを実施した。さらに、血清中のＩＦＮ－αのレベルを標準的なプロトコルによるＥＬＩＳＡによって決定した。
さらに、表実施例２６の群について、２８日目に採取した脾臓試料をＲＡＢＶ－Ｇペプチドライブラリーで再刺激し、Ｔ細胞応答（ＣＤ４およびＣＤ８）、すなわち、ＣＤ４ Ｔ細胞免疫応答（ＩＦＮγ／ＴＮＦα産生ＣＤ４ Ｔ細胞）およびＣＤ８ Ｔ細胞免疫応答（ＩＦＮγ／ＴＮＦα産生ＣＤ８ Ｔ細胞およびＣＤ１０７＋ＩＦＮγ産生ＣＤ８ Ｔ細胞）についてアッセイした；細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を使用して、抗原特異的Ｔ細胞の誘導を決定した。アッセイを前記のように実施した。
結果を図２６（表実施例２７の群に関する）、図２７Ａ、図２７Ｂおよび図２７Ｃ（表実施例２６の群に関する）、ならびに図２８（表実施例２８の群に関する）に示す。
結果：
図２６、図２７Ａおよび図２８は、表実施例２７（図２６）、表実施例２６（図２７Ａ）および表実施例２８（図２８）に示される、それぞれＬＮＰに製剤化された５μｇのＲＡＢＶ－Ｇ－ｍＲＮＡおよび１μｇのＲＡＢＶ－Ｇ－ｍＲＮＡによる単回ｉ．ｍ．免疫化が、プライムワクチン接種後２１日目に、全ての動物において、０．５ＩＵ／ｍｌの防御価を十分に上回る非常に堅牢なＶＮＴをすでに誘導したことを示している。
図２７Ｂおよび図２７Ｃは、表実施例２６のＬＮＰ－ＲＡＢＶ－Ｇ ｍＲＮＡワクチンが、すなわちＲＡＢＶ－Ｇペプチドライブラリーで再刺激した脾細胞において、ワクチン接種後に特異的細胞応答を誘導したことを示している（非刺激脾細胞による対照も示す）。これらの効果は、緩衝液をｉ．ｍ．注射した対照動物においては観察されなかった。ＲＡＢＶ－Ｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２７Ｂ）およびＲＡＢＶ－Ｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ（図２７Ｃ）は全ての製剤について観察された。
実施例２２：インビボマラリアワクチン接種のための本発明の脂質を含む異なるＬＮＰ
ＣＳＰ ｍＲＮＡは、ＨＳＤ１７Ｂ４由来の５’－ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３由来の３’－ＵＴＲ、３’末端の６４×アデノシン（ポリＡ尾部）；５個のヌクレオチド、３’末端の３０×シトシン（ポリＣ尾部）、ヒストンステムループ、および５個の追加のヌクレオチドを含んでいた。ｍＲＮＡを、製造業者の説明書に従って、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ（商標）ｍ７Ｇ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（セルスクリプト社（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ）、米国ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在）を使用してさらに酵素的にキャッピングし、商業的ポリアデニル化キットを使用して酵素的にポリアデニル化して、配列番号３８を得た。
得られたｍＲＮＡ構築物を、表実施例２９～実施例３１に示される脂質ナノ粒子に製剤化し、その中では以下の脂質の構造（全て商業的に入手可能）が参照される（（０７：０）ＰＣ（ＤＨＰＣ）の構造については実施例２０．１．１参照）：
Ｃ８－ＰＥＧ２０００（Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝、アバンティポーラリピッド社（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）；アラバマ州アラバスター（Ａｌａｂａｓｔｅｒ）所在）：
Ｃ１０－ＰＥＧ２０００（エヌオーエフコーポレーション（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、日本東京所在）：
表実施例２９および実施例３０ならびに実施例２５の一部によるＬＮＰ製剤を、表実施例３２～実施例３４に示される用量のＲＮＡ、製剤、および対照群を用いて０日目および２１日目に筋肉内施用（ｉ．ｍ．；脛骨筋）した。陰性対照群は緩衝液のみを受けた。血清試料をＥＬＩＳＡのために２１日目および３５日目に採取した。
ＥＬＩＳＡによる特異的液性免疫応答の決定：
コーティングのためのマラリア［ＮＡＮＰ］７ペプチドを使用してＥＬＩＳＡを実施した。コーティングしたプレートを、それぞれの血清希釈を使用してインキュベートし、特異抗体のそれぞれのマラリア［ＮＡＮＰ］７ペプチドへの結合を、ビオチン化アイソタイプ特異的抗マウス抗体、引き続いて基質としてのＡｍｐｌｅｘ（商標）Ｒｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔによるストレプトアビジン－ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）を使用して検出した。マラリア［ＮＡＮＰ］７ペプチドに対して向けられたエンドポイント抗体価（全ＩｇＧまたはそれぞれの図に示されるＩｇＧ）を、プライム後３５日目にＥＬＩＳＡによって測定した。結果を図３１、図３４および図３５に示す。
細胞内サイトカイン染色：
ワクチン接種マウス由来の脾細胞を、当技術分野で公知の標準的なプロトコルに従って、３５日目に単離した。手短に言えば、単離した脾臓を、セルストレーナを通して粉砕し、ＰＢＳ／１％ＦＢＳ中で洗浄し、引き続いて赤血球を溶解した。ＰＢＳ／１％ＦＢＳによる大規模な洗浄工程後、脾細胞を９６ウェルプレートに播種した（２×１０６個の細胞／ウェル）。細胞を、３７℃で６時間、２．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体（ビーディーバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））およびタンパク質輸送阻害剤の存在下、ＣＳＰペプチドの混合物（１μｇ／ｍｌ）で刺激した。刺激後、製造業者の説明書に従って、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）試薬（ビーディーバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用して、細胞を洗浄し、細胞内サイトカインについて染色した。以下の抗体：Ｔｈｙ１．２－ＦＩＴＣ（１：１００）、ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７（１：２００）、ＴＮＦ－ＰＥ（１：１００）、ＩＦＮγ－ＡＰＣ（１：１００）（イーバイオサイエンス社（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））、ＣＤ４－ＢＤ Ｈｏｒｉｓｏｎ Ｖ４５０（１：２００）（ビーディーバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を染色に使用し、１：１００希釈したＦｃγブロックとインキュベートした。Ａｑｕａ Ｄｙｅを使用して生／死細胞を区別した（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータ（ベクトンディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を使用して細胞を獲得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ツリースター社（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．））を使用してフローサイトメトリデータを分析した。結果を図２９、図３０、図３２、および図３３に示す。
結果：
図３１、図３４および図３５に示されるように、ＬＮＰ製剤化ＣＳＰ ｍＲＮＡワクチンは、マウスにおいて強力な液性免疫応答を誘導した（ＬＮＰ３３製剤を除く、図３１参照）。ＬＮＰ（ＬＮＰ２８およびＬＮＰ３２）を含むＣ２６脂質についてのＩｇＧ１濃度が、先行技術のＬＮＰ製剤（ＬＮＰ－Ｃ）と比較して高かったことに留意する。図３５参照。
図２９、図３０、図３２および図３３に示されるように、ＬＮＰ製剤化ＣＳＰ ｍＲＮＡワクチンは、マウスにおいて細胞性免疫応答を誘導した（ＣＤ４＋［図２９および図３２］およびＣＤ８＋［図３０および図３３］Ｔ細胞応答）。
ＣＤ８＋Ｔ細胞はマラリア原虫によって引き起こされる細胞内感染症に対する主要な防御免疫機序であるので、有効なマラリアワクチンは強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導すべきである。したがって、これらの所見は、本発明のＧＮ０１製剤の有利な特徴の１つを強調している。
実施例２３：ＨＥＸＡ－Ｃ５ＤＥ－逆－ＰｉｐＳＳの合成
ＨＥＸＡ－Ｃ５ＤＥ－逆－ＰｉｐＳＳ（ＨＥＸＡ－Ｃ５ＤＥ－ｉｎｖｅｒｔｅｄ－ＰｉｐＳＳ）を合成するために、チオ酢酸カリウムをトシレート１１でアルキル化して、チオアセテート誘導体１２を定量的収率で得た。ジスルフィド誘導体１３の形成をＭｅＯＨ中ＮａＯＨ水溶液で達成し、精製後、１３を８０％で得た。ＨＣｌによるＢｏｃ脱保護によって、１４を定量的収率で得た。２－ブロモメタノールによる化合物１６への直接アルキル化は失敗した。したがって、アルデヒド１９による１４の還元的アルキル化を行い、ＴＢＤＭＳ保護ジオール１６’を３７～４５％で得た。ＴＢＡＦによるその後の脱保護によって、１６へのきれいな変換を得た。生成物を残留ＴＢＡ塩から完全に分離することができなかったので、これをそのままカルボン酸２１との最終的なカップリングに使用した。このカルボン酸は、アルコール２０をグルタル酸無水物で処理することによって調製し、２１を３４～４０％で得た。２１と１６の最終的なカップリングを首尾よく試験し、ＨＥＸＡ－Ｃ５ＤＥ－逆－ＰｉｐＳＳを得たが、これを低い収率（２３％）および不純分な純度で単離した。スケールアップにより、最初に、ＨＥＸＡ－Ｃ５ＤＥ－逆－ＰｉｐＳＳをわずか９％で得た。しかしながら、大規模での抽出工程から、ただ１つの酸部分が１６にカップリングした中間体を含有するＭｅＣＮ層から物質を単離した。この物質を、同じ条件を使用して、最終生成物に向けたカップリングに首尾よく再使用し、不純なバッチと合わせたこの物質の精製によって、ＨＥＸＡ－Ｃ５ＤＥ－逆－ＰｉＰＳＳを４３％および所望の純度で得た。
反応スキーム：
実施例２４：ＨＥＸＡ－Ｃ５ＤＥ－Ｐｉｐ－Ｃ３チオエーテルの合成
ＨＥＸＡ－Ｃ５ＤＥ－Ｐｉｐ－Ｃ３チオエーテルに向けた経路は、ジオール２２のメシル化で始まり、これによりビスメシル化誘導体２３を９９％で得た。その後の置換により、ビスアミン２４を６８％で得た。カルボン酸２１による最終的なエステル化により、抽出およびフラッシュクロマトグラフィー後にＨＥＸＡ－Ｃ５ＤＥ－Ｐｉｐ－Ｃ３チオエーテルを２３％で得た。
反応スキーム：
実施例２５：ＴＨＩＯＥＴＨＥＲの合成
ＴＨＩＯＥＴＨＥＲを合成するために、ジカルボン酸誘導体３と４－ピペリジンエタノールのカップリングによってビスアミド４を８６％で得た。ＬｉＡＨ４によるその後の還元により、フラッシュクロマトグラフィーによる精製後に５を２４％で得た。商業的に入手可能なビタミンＥ誘導体６との最終的なカップリングにより、ＴＨＩＯＥＴＨＥＲを５２％で得て、これをヘプタンとＭｅＣＮとの間の抽出、引き続いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
反応スキーム：
実施例２６：Ｃ３ＳＳの合成
Ｃ３ＳＳに向けた経路は、７の二量体化で始まり、これにより８を定量的収率で得た。メシル化により、フラッシュクロマトグラフィーによる精製後に９を７０％で得た。４－ピペリジンエタノールとのカップリングにより、１０を３３％で得た。６とのその後のカップリングにより、抽出およびフラッシュ精製後にＣ３ＳＳを５１％で得た。
反応スキーム：
実施例Ｐ１：ウサギにおける筋肉内注射は高い抗体レベルをもたらす ＨＥＸＡジェット注射
ウサギに、ＧＮ０１ ＬＮＰならびに上記ＨＥＸＡおよびＨＥＡＤ脂質に基づくＬＮＰに製剤化した異なるｍＲＮＡコード抗体をｉ．ｍ．注射した。注射のために、慣用的な針注射または無針注射を適用する；無針注射はジェット注射（ファーマジェット社（ＰｈａｒｍａＪｅｔ）ｉ．ｍ．デバイス）を使用することによって実施する。
各群は１０匹の動物からなる。ウサギを１０の時点で出血させる：０日目（注射前）、１日目、３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目、１４日目、２１日目、２８日目。血清中のＩｇＧ濃度を評価するために、ヒトＦｃ特異的ＥＬＩＳＡが、産生抗体の読出しとして役立つ（ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ）。
実施例Ｐ２：マウスにおける皮内および筋肉内注射後のポリマーコンジュゲート脂質成分のインビボ効果
インビボにおけるＰＥＧ成分の効果を分析するために、実施例７からのＬＮＰをインビボ設定において同様に使用した。ＰｐＬｕｃの代わりに、上記のｈＥｐｏ ｍＲＮＡをカーゴとして使用する。インビボ分析のために、６～８週齢Ｂａｌｂ／Ｃマウス（５匹／群）に０．５ｍｇ／ｋｇ ＬＮＰ製剤化ｈＥｐｏを注射する。ＥＤＴＡ血漿サンプリングを注射６時間後および２４時間後に実施する；ある群には皮内経路を介してｈＥｐｏを投与し、別の群には筋肉内経路を介してｈＥｐｏを投与する。
結果：
インビボ分析により、実施例７に示されるインビトロ実験の結果が確認される、すなわち、より短いアルキル鎖（Ｃ８）を有するポリマーコンジュゲート脂質の別個の効果、すなわち、注射６時間後および２４時間後でのより高いＥｐｏ発現が示される。
実施例Ｐ３
以下のワクチンを、インビボワクチン接種アッセイで使用される標準的なｍＲＮＡを用いて製剤化し、マウスにおけるインビボワクチン接種について試験する。

Claims (27)

  1. 式（Ｉ）によるカチオン性脂質：
    Ｒａ－Ａ－Ｒｂ 式（Ｉ）
    またはその薬学的に許容される塩、もしくは立体異性体
    （式中、
    Ｒａは、

    －Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４
    から選択され；
    Ｒｂは、

    －Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４、または
    －Ｒ１－Ｎ（ＣＨ３）２
    から選択され；
    Ａは－Ｓ－であり；
    Ｒ１はエタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、または２～８個の炭素原子を有する直鎖もしくは非分岐アルカンジイルであり、各置換可能な炭素原子は非置換であるか、または１つもしくは複数のＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルケニレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキレン、もしくはＣ３～Ｃ８シクロアルケニレンで置換されており；
    Ｒ２は２～８個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
    Ｒ３は存在する場合、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｒ５－ＯＣ（Ｏ）－ＮＨ－、またはＲ５－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり；
    Ｒ４は１２～３６個の炭素原子を有する親油性置換基であり、前記１２～３６個の炭素原子を有する親油性置換基は、（ｉ）１２～２５個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐のアルキルもしくはアルケニルであるか、または（ｉｉ）飽和したフィチル鎖を有するトコフェロールもしくはポリ－不飽和フィチル鎖を有するトコトリエノールから選択され；
    Ｒ５は１～６個の炭素原子を有するアルカンジイルであり；
    Ｘは水素原子と結合した炭素原子（ＣＨ）または窒素原子であり；
    全ての選択は互いに独立している）。
  2. Ｒ４が、（ｉ）１２～２５個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐のアルキルもしくはアルケニルであるか、または（ｉｉ）飽和したフィチル鎖を有するトコフェロールおよびポリ－不飽和フィチル鎖を有するトコトリエノールから選択される、請求項１に記載のカチオン性脂質。
  3. Ｒ４が、

    からなる群から各出現で独立に選択される、請求項１または請求項２に記載のカチオン性脂質。
  4. Ｒ３が存在し、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｒ５－ＯＣ（Ｏ）－ＮＨ－、およびＲ５－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－からなる群から選択され；かつＲ４が１２～２５個の炭素原子を有する直鎖または分岐のアルキルまたはアルケニルである、請求項１または請求項２に記載のカチオン性脂質。
  5. ＲａおよびＲｂが

    （ＸはＣＨである）、
    あるいは－Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３－Ｒ４、
    から独立に選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
  6. ＲａおよびＲｂの各々が

    （ＸはＣＨである）
    であり；
    Ｒ３が存在し、Ｒ５が各出現で独立に選択される、２～６個の炭素原子を有するアルカンジイルである、請求項１～５のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
  7. Ｒ３が存在し、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－または－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－であり；
    Ｒ４が

    であり；
    ＲａおよびＲｂが同一である、
    請求項１～６のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
  8. Ｒ３が存在し、－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－または－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－であり；
    Ｒ４が

    であり；
    ＲａおよびＲｂが同一である、
    請求項１～６のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
  9. Ｒ１がエタンジイルである、請求項５または請求項６に記載のカチオン性脂質。
  10. 各出現で独立に選択される、以下の特徴：
    （ｉ）Ｒ１が非置換エタンジイル、プロパンジイル、またはブタンジイルである；
    （ｉｉ）Ｒ２が２～８個の炭素原子を有する直鎖、非分岐アルカンジイルである；
    （ｉｉｉ）Ｒ３が－Ｒ５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－または－Ｒ５－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－である；
    （ｉｖ）Ｒ５が２～６個の炭素原子を有するアルカンジイルである；および
    （ｖｉ）ＸがＣＨである、
    のうちの１つ以上をさらに示す、請求項１～９のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
  11. 以下に列挙される化合物：


    からなる群より選択される、請求項１に記載のカチオン性脂質。

  12. である、請求項１に記載のカチオン性脂質。
  13. （ｉ）請求項１～１２のいずれか一項に記載のカチオン性脂質；
    または
    （ｉｉ）

    上記式であるカチオン性脂質Ｃ２６
    を含み、以下の賦形剤：
    （ｉ）ステロイド；
    （ｉｉ）中性脂質；および
    （ｉｉｉ）ポリマーコンジュゲート脂質であって、前記ポリマーコンジュゲート脂質は式（ＩＩ）による化合物：
    Ｐ－Ａ－Ｌ 式（ＩＩ）
    （式中、Ｐは親水性ポリマー部分であり、Ａは存在する場合、リンカーであり、かつＬは脂質部分である）であるポリマーコンジュゲート脂質、
    の１つまたは複数をさらに含む、組成物。
  14. 以下の賦形剤：
    （ｉ）請求項１～１２のいずれか一項に記載のカチオン性脂質；
    （ｉｉ）ステロイド；
    （ｉｉｉ）中性脂質；および
    （ｉｖ）ポリマーコンジュゲート脂質であって、前記ポリマーコンジュゲート脂質は式（ＩＩ）による化合物：
    Ｐ－Ａ－Ｌ 式（ＩＩ）
    （式中、Ｐは親水性ポリマー部分であり、Ａは存在する場合、リンカーであり、かつＬは脂質部分である）であるポリマーコンジュゲート脂質、
    を含む組成物。
  15. 以下の賦形剤：
    （ｉ）請求項１４の部分項目（ｉ）に記載のカチオン性脂質；
    （ｉｉ）ステロイド；
    （ｉｉｉ）中性脂質、または２つの中性脂質の組合せ；および
    （ｉｖ）ポリマーコンジュゲート脂質であって、前記ポリマーコンジュゲート脂質は式（ＩＩ）による化合物：
    Ｐ－Ａ－Ｌ 式（ＩＩ）
    （式中、Ｐは親水性ポリマー部分であり、Ａは存在する場合、リンカーであり、かつＬは脂質部分である）であるポリマーコンジュゲート脂質、
    を含む組成物。
  16. 前記組成物は、
    （ａ－ｉ）３０～７０ｍｏｌ％の量の前記カチオン性脂質；２０～５０ｍｏｌ％の量の前記ステロイド；５～２５ｍｏｌ％の量の前記中性脂質；および０．５～５ｍｏｌ％の量の前記ポリマーコンジュゲート脂質；
    （ａ－ｉｉ）４０～７０ｍｏｌ％の量の前記カチオン性脂質；２０～５０ｍｏｌ％の量の前記ステロイド；５～１５ｍｏｌ％の量の前記中性脂質；および０．５～５ｍｏｌ％の量の前記ポリマーコンジュゲート脂質；
    （ａ－ｉｉｉ）２０～６０ｍｏｌ％の量の前記カチオン性脂質；２５～５５ｍｏｌ％の量の前記ステロイド；５～２５ｍｏｌ％の量のリン脂質である前記中性脂質；および０．５～１５ｍｏｌ％の量の前記ポリマーコンジュゲート脂質；
    （ａ－ｉｖ）４５～６５ｍｏｌ％の量の前記カチオン性脂質；２５～４５ｍｏｌ％の量の前記ステロイド；８～１２ｍｏｌ％の量のリン脂質である前記中性脂質；および１～３ｍｏｌ％の量の前記ポリマーコンジュゲート脂質；
    （ａ－ｖ）４５～６５ｍｏｌ％の量の前記カチオン性脂質；２５～４５ｍｏｌ％の量のコレステロール；８～１２ｍｏｌ％の量の前記中性脂質；および１～３ｍｏｌ％の量の前記ポリマーコンジュゲート脂質；
    （ａ－ｖｉ）４５～６５ｍｏｌ％の量の前記カチオン性脂質；２５～４５ｍｏｌ％の量のコレステロール；８～１２ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥ；ならびに１～３ｍｏｌ％の量の前記ポリマーコンジュゲート脂質；ならびに
    （ａ－ｖｉｉ）４５～６５ｍｏｌ％の量の前記カチオン性脂質；２５～４５ｍｏｌ％の量のコレステロール；８～１２ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥ；ならびに１～３ｍｏｌ％の量のＰＥＧ－ＤＭＧ２０００
    からなる群から選択される比の賦形剤を含むか、あるいは、
    前記組成物は、
    （ｉｖ）５９ｍｏｌ％の量の前記カチオン性脂質Ｃ２６；２９．３ｍｏｌ％のコレステロール、１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；
    （ｖｉｉｉ）５９ｍｏｌ％の量の前記カチオン性脂質Ｃ２６；２８．３ｍｏｌ％のコレステロール；１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥ、１ｍｏｌ％のＤＨＰＣおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；ならびに
    （ｘｉｉ）４９ｍｏｌ％の量の前記カチオン性脂質Ｃ２６；２９．３ｍｏｌ％のコレステロール；１０ｍｏｌ％のＤＰｈｙＰＥ、１０ｍｏｌ％のＤＨＰＣおよび１．７ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、
    からなる群から選択される比の賦形剤を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記組成物は、
    （ａ－ｖｉ－１）４５～６５ｍｏｌ％の量の前記カチオン性脂質；２５～４５ｍｏｌ％の量のコレステロール；８～１２ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥ；１～１０ｍｏｌ％の量のＤＨＰＣ；ならびに１～３ｍｏｌ％の量の前記ポリマーコンジュゲート脂質；ならびに
    （ａ－ｖｉｉ－１）４５～６５ｍｏｌ％の量の前記カチオン性脂質；２５～４５ｍｏｌ％の量のコレステロール；８～１２ｍｏｌ％の量のＤＰｈｙＰＥ；１～１０ｍｏｌ％の量のＤＨＰＣ；ならびに１～３ｍｏｌ％の量のＰＥＧ－ＤＭＧ２０００、
    からなる群から選択される比の賦形剤を含む、請求項１６に記載の組成物。
  18. 生物活性成分をさらに含み、
    前記生物活性成分が、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ化合物、人工ｍＲＮＡ、少なくとも１つのコード配列を含む化学修飾もしくは非修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、自己複製ＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、およびレプリコンＲＮＡ；またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される核酸化合物である、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記カチオン性脂質および前記賦形剤は、脂質ナノ粒子内に存在するかあるいは脂質ナノ粒子の一部として存在し、前記脂質ナノ粒子はｍＲＮＡを含み、前記ｍＲＮＡは、
    （ｉ）１０～２０の範囲のＮ／Ｐ比を達成するような量；または
    （ｉｉ）２０～６０の範囲の脂質：ｍＲＮＡ重量比を達成するような量で含まれている；または
    前記組成物が無菌液体担体で再構成するための無菌固体組成物であり、ｐＨ修正剤、増量剤、安定剤、非イオン性界面活性剤および抗酸化剤から選択される１種または複数の不活性成分をさらに含み、前記無菌液体担体が水性担体である；または
    前記組成物が無菌液体組成物であり、前記脂質ナノ粒子が、５０ｎｍ～３００ｎｍ、または６０ｎｍ～２５０ｎｍ、または６０ｎｍ～２００ｎｍ、または７０～２００ｎｍ、または７５ｎｍ～１６０ｎｍ、または９０ｎｍ～１４０ｎｍ、または１００ｎｍ～１４０ｎｍの動的光散乱によって決定される平均流体力学的径を有する；または
    前記脂質ナノ粒子が－５０ｍＶ～＋５０ｍＶの範囲のゼータ電位を示す、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記ｍＲＮＡ化合物がモノ、バイ、またはマルチシストロン性ｍＲＮＡである；あるいは、
    前記ｍＲＮＡ化合物が塩基修飾、糖修飾、骨格修飾および脂質修飾からなる群から選択される少なくとも１つの化学修飾を含み、前記化学修飾が塩基修飾である場合、同塩基修飾は、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウラシル（Ｎ１Ｍψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記ｍＲＮＡ化合物がペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域を含み、前記コード領域が配列修飾を示し、
    前記配列修飾が、配列のＧ／Ｃ含量修飾、コドン修飾、コドン最適化またはＣ最適化から選択され；対応する野生型ｍＲＮＡのコード領域と比較して、
    前記コード領域のＧ／Ｃ含量が増加している；
    前記コード領域のＣ含量が増加している；
    前記コード領域のコドン使用頻度がヒトコドン使用頻度に適合されている；または
    コドン適応指標（ＣＡＩ）が前記コード領域で増加もしくは最大化している、請求項１９～２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記ｍＲＮＡ化合物が、
    ａ）５’キャップ構造；
    ｂ）マイクロＲＮＡ結合部位がｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、ｍｉＲ－２６ａ、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択されるマイクロＲＮＡのためのものである、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列；
    ｃ）少なくとも１つの５’－ＵＴＲエレメント；
    ｄ）少なくとも１つのポリ（Ａ）配列；
    ｅ）少なくとも１つのポリ（Ｃ）配列；
    ｆ）少なくとも１つの３’－ＵＴＲエレメント；
    またはこれらの任意の組合せ
    をさらに含む；または
    少なくとも１つのコードＲＮＡが、５’キャップ構造を含む；または
    少なくとも１つのコードＲＮＡが少なくとも１つの異種５’－ＵＴＲまたは少なくとも１つの異種３’－ＵＴＲを含み、前記少なくとも１つの異種５’－ＵＴＲが、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＲＰＬ３２、ＡＳＡＨ１、ＡＴＰ５Ａ１、ＭＰ６８、ＮＤＵＦＡ４、ＮＯＳＩＰ、ＲＰＬ３１、ＳＬＣ７Ａ３、ＴＵＢＢ４ＢおよびＵＢＱＬＮ２から選択される遺伝子の５’－ＵＴＲ、またはこれらの遺伝子のいずれか１つのホモログ、断片もしくはバリアントから誘導される核酸配列を含む；または
    前記少なくとも１つの異種３’－ＵＴＲが、ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ７、アルファ－グロビン、ＣＡＳＰ１、ＣＯＸ６Ｂ１、ＧＮＡＳ、ＮＤＵＦＡ１およびＲＰＳ９から選択される遺伝子の３’－ＵＴＲ、またはこれらの遺伝子のいずれか１つのホモログ、断片もしくはバリアントから誘導される核酸配列を含む；または
    少なくとも１つのコードＲＮＡが、（ｉ）ＨＳＤ１７Ｂ４ ５’－ＵＴＲおよびＰＳＭＢ ３’－ＵＴＲ、または（ｉｉ）ＲＰＬ３２ ５’－ＵＴＲおよびＡＬＢ７ ３’－ＵＴＲを含む；または
    前記組成物は、５’→３’方向に、以下のエレメント：
    ａ）５’キャップ構造；
    ｂ）ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲから誘導される核酸配列を含む５’－ＵＴＲエレメント；
    ｃ）少なくとも１つのコード配列；
    ｄ）α－グロビン遺伝子から誘導される核酸配列を含む３’－ＵＴＲエレメント；およびアルブミン遺伝子から誘導される核酸配列を含む３’－ＵＴＲエレメントの少なくとも一方；
    ｅ）１０～２００、１０～１００、４０～８０、または５０～７０個のアデノシンヌクレオチドからなる、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列；
    ｆ）１０～２００、１０～１００、２０～７０、２０～６０または１０～４０個のシトシンヌクレオチドからなる、少なくとも１つのポリ（Ｃ）配列；ならびに
    ｇ）配列番号４によるＲＮＡ配列を含む、少なくとも１つのヒストンステムループ
    を含む；または
    前記生物活性成分が、
    （ａ）ペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列を含むｍＲＮＡであって、前記ペプチドまたはタンパク質が抗原であり、前記抗原が、病原性抗原、腫瘍抗原、アレルゲン抗原もしくは自己免疫自己抗原、またはその断片もしくはバリアントから誘導される、ｍＲＮＡ；または
    （ｂ）治療用タンパク質、またはその断片もしくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列を含むｍＲＮＡであって、前記治療用タンパク質が、
    （ｉ）代謝、内分泌もしくはアミノ酸障害を処置するための酵素補充療法に使用するため、または非存在、欠損もしくは変異タンパク質の置換に使用するための治療用タンパク質；
    （ｉｉ）血液障害、循環系の疾患、呼吸器系の疾患、感染性疾患または免疫不全の処置に使用するための治療用タンパク質；
    （ｉｉｉ）がんまたは腫瘍疾患の処置に使用するための治療用タンパク質；
    （ｉｖ）ホルモン補充療法に使用するための治療用タンパク質；
    （ｖ）体細胞を多能性または全能性幹細胞に再プログラミングするのに使用するための治療用タンパク質；
    （ｖｉ）アジュバントまたは免疫賦活として使用するための治療用タンパク質；
    （ｖｉｉ）治療用抗体である治療用タンパク質；
    （ｖｉｉｉ）遺伝子編集剤である治療用タンパク質；および
    （ｉｘ）肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患の処置または防止に使用するための治療用タンパク質
    からなる群から選択される、ｍＲＮＡ
    であり；
    部分項目（ａ）の前記抗原が、細菌、ウイルス、真菌および原生動物抗原からなる群から選択される病原性抗原をコードし、
    前記病原性抗原が、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ｎＣｏｖ－２０１９コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ブニヤウイルス目ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、エボラウイルス、フラビウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラッサ・マムアレナウイルス（ＬＡＳＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス、結核菌、ニパウイルス、ノロウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、トラコーマクラミジア（すなわち、クラミジアを引き起こす細菌クラミジア）、または熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、または卵形マラリア原虫から選択されるマラリア原虫から誘導される、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. （ｉ）感染性疾患；がんもしくは腫瘍疾患、障害もしくは状態；肝線維症、肝硬変および肝臓がんからなる群から選択される肝臓疾患；アレルギー；または自己免疫疾患、障害もしくは状態の処置または予防において使用するための；あるいは
    （ｉｉ）代謝もしくは内分泌障害を処置するための酵素補充療法に使用するための、または非存在、欠損もしくは変異タンパク質の置換に使用するための、請求項１３～２２のいずれか一項に記載の組成物であって、
    前記組成物は、疾患、障害または状態の処置または防止に使用するための少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む、少なくとも１つのコードＲＮＡを含み、それを必要とする対象に筋肉内または皮内注射を介して投与される、組成物。
  24. 請求項１８～２３のいずれか一項に記載の組成物と、可溶化のための液体ビヒクルと、を含む、キットまたはパーツキット。
  25. 医薬として使用するための、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の組成物または請求項２４に記載のキットもしくはパーツキット。
  26. ウイルス、細菌または原生動物学的感染性疾患を含む感染性疾患、がんまたは腫瘍疾患から選択される疾患を防止、予防、処置または改善するための、請求項１３～２３のいずれか一項に記載の組成物または請求項２４に記載のキットもしくはパーツキットを含むワクチン。
  27. 有効用量のウイルス抗原をコードするｍＲＮＡを含む、対象のワクチン接種に使用するための、請求項１３～２３のいずれか一項に記載の組成物または請求項２４に記載のキットもしくはパーツキットを含む医薬組成物。
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