JP7828394B2

JP7828394B2 - 肢帯型筋ジストロフィー２ａを治療するための組換えアデノ随伴ウイルス産物及び方法

Info

Publication number: JP7828394B2
Application number: JP2024098061A
Authority: JP
Inventors: サヘンクザリフェ
Original assignee: リサーチインスティチュートアットネイションワイドチルドレンズホスピタル
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2024-06-18
Publication date: 2026-03-11
Anticipated expiration: 2039-06-28
Also published as: JP2021528983A; AU2025206429A1; JP7507697B2; IL279789A; AU2019295779A1; MX2020014119A; CO2021000914A2; MX2025008669A; US20260062681A1; US20210277362A1; KR20210028162A; EP3814514A1; AU2019295779B2; JP2024123110A; IL279789B1; TWI854984B; BR112020026853A2; CA3105216A1; TW202020161A; CL2020003384A1

Description

本出願は、２０１８年６月２９日出願の米国仮特許出願第６２／６９１，９３４号、及び２０１９年６月２１日出願の米国仮特許出願第６２／８６５，０８１号に対する優先権を主張するものであり、その両方は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書では、肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療するための産物及び方法が提供される。本方法では、組換えアデノ随伴ウイルスは、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを送達する。

配列表の参照による組み込み
本出願は、開示の別の部分として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、コンピュータ可読形態の配列表（ファイル名：５２６８４Ｐ２＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；２３，７５５バイト－２０１９年６月２６日に作成されたＡＳＣＩＩテキストファイル）を含む。

筋ジストロフィー（ＭＤ）は遺伝性疾患の一群である。この群は、運動を制御する骨格筋の進行性の進行性衰弱及び変性を特徴とする。乳児期又は小児期に発症するＭＤもあり、中年期以降まで出現しないＭＤもあり得る。筋力低下の分布及び程度（一部のＭＤは心筋にも影響する）、発症年齢、進行率、遺伝パターンの点で疾患は異なる。

ＭＤの一つのグループは、ＭＤの肢帯群（ＬＧＭＤ）である。ＬＧＭＤはまれな病態であり、発症年齢、筋力低下の部位、心臓及び呼吸の関与、進行率及び重症度に関して、異なる人で異なる症状を示す。ＬＧＭＤは小児期、青年期、若年成人期、又はそれ以降に発症することがある。性別は両方とも等しく影響を受ける。ＬＧＭＤは肩及び腰帯の衰弱を引き起こし、上脚及び上腕の近隣の筋肉もときに時間の経過とともに衰弱する。脚の衰弱は腕の衰弱の前に現れることがよくある。顔面筋は通常、影響を受けない。病状が進行するにつれて、歩行に問題が生じ、時間の経過とともに車椅子の使用が必要になることがある。肩及び腕の筋肉が関係すると、腕を頭の上に上げたり、物を持ち上げるのが困難になる可能性がある。ＬＧＭＤのいくつかの種類によっては、心臓と呼吸筋が関与している場合がある。

ＬＧＭＤには少なくとも１９の病型があり、これらの病型は関連する遺伝的欠陥によって分類される。
タイプ遺伝形式遺伝子または染色体
ＬＧＭＤ１Ａ常染色体優性ミオチリン遺伝子
ＬＧＭＤ１Ｂ常染色体優性ラミンＡ／Ｃ遺伝子
ＬＧＭＤ１Ｃ常染色体優性カベオリン遺伝子
ＬＧＭＤ１Ｄ常染色体優性染色体７
ＬＧＭＤ１Ｅ常染色体優性デスミン遺伝子
ＬＧＭＤ１Ｆ常染色体優性染色体７
ＬＧＭＤ１Ｇ常染色体優性染色体４
ＬＧＭＤ２Ａ常染色体劣性カルパイン－３遺伝子
ＬＧＭＤ２Ｂ常染色体劣性ジスフェリン遺伝子
ＬＧＭＤ２Ｃ常染色体劣性遺伝ガンマ－サルコグリカン遺伝子
ＬＧＭＤ２Ｄ常染色体劣性アルファ－サルコグリカン遺伝子
ＬＧＭＤ２Ｅ常染色体劣性ベータ－サルコグリカン遺伝子
ＬＧＭＤ２Ｆ常染色体劣性デルタ－サルコグリカン遺伝子
ＬＧＭＤ２Ｇ常染色体劣性テレトニン遺伝子
ＬＧＭＤ２Ｈ常染色体劣性ＴＲＩＭ３２
ＬＧＭＤ２Ｉ常染色体劣性ＦＫＲＰ遺伝子
ＬＧＭＤ２Ｊ常染色体劣性Ｔｉｔｉｎ遺伝子
ＬＧＭＤ２Ｋ常染色体劣性ＰＯＭＴ１遺伝子
ＬＧＭＤ２Ｌ常染色体劣性フクチン遺伝子

ＬＧＭＤの特殊検査は、現在、全国的な診断計画であるＮａｔｉｏｎａｌＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｉｎｇＧｒｏｕｐ（ＮＣＧ）を通じて実施されている。

カルパイン３遺伝子（ＣＡＰＮ３）の変異は、世界中で最も一般的な肢帯型筋ジストロフィーの一つであるＬＧＭＤ２Ａを引き起こす。現時点では、この遺伝性疾患に対する治療法はない。これまでの研究では、ＣＡＰＮ３欠損マウスの病理学的徴候を補正するためのＣＡＰＮ３遺伝子導入の可能性が示されている。しかし、デスミンプロモーターによって駆動されるＣＡＰＮ３の発現は、心毒性をもたらした［Ｂａｒｔｏｌｉ等、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１３：２５０－２５９（２００６）］。追跡調査試験では、遺伝子の骨格筋発現を検討した［Ｒｏｕｄａｕｔ等、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１２８：１０９４－１１０４（２０１３）］。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは長さが約４．７ｋｂであり、そのうち二つの１４５ヌクレオチド逆位末端配列（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶには複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ－１の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００２０７７に提供され；ＡＡＶ－２の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４５：５５５－５６４（１９８３）に提供され；ＡＡＶ－３の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿１８２９に提供され；ＡＡＶ－４の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００１８２９に提供され；ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ０８５７１６に提供され；ＡＡＶ－６の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００１８６２に提供され、少なくとも一部のＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８ゲノムは、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９に提供され；ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供され；ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１３（１）：６７－７６（２００６）に提供され；並びにＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供される。ＡＡＶｒｈ．７４ゲノムの配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４３４，９２８号に提供される。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージ化、及び宿主細胞染色体統合を指示するシス作用配列は、ＡＡＶＩＴＲ内に含まれる。三つのＡＡＶプロモーター（相対マップ位置についてｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と命名された）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする二つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。二つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、単一のＡＡＶイントロンのスプライシング（ヌクレオチド２１０７及び２２２７において）と結合し、ｒｅｐ遺伝子から四つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製を担う複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、三つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。代替的なスプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、三つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ、ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５８：９７－１２９（１９９２）にレビューされている。

ＡＡＶは、例えば遺伝子治療において、細胞に外来ＤＮＡを送達するためのベクターとして魅力的であるユニークな特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は無症候性である。さらに、ＡＡＶは多くの哺乳類細胞に感染するため、ｉｎｖｉｖｏで多くの異なる組織を標的にすることができる。さらに、ＡＡＶはゆっくりと分裂する細胞と分裂しない細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として、これらの細胞の寿命の間、本質的に持続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミドにクローン化ＤＮＡとして挿入され、組換えゲノムの構築を実行可能にする。さらに、ＡＡＶ複製及びゲノムカプシド形成を指示するシグナルは、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるため、およそ４．３ｋｂの内部ゲノムの一部又はすべて（コード複製及び構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐ）は、外来ＤＮＡで置換されてもよい。ＡＡＶベクターを生成するために、ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質をトランスに提供してもよい。ＡＡＶのもう一つの重要な特徴は、ＡＡＶが極めて安定しており、心臓のようなウイルスであることである。アデノウイルスを不活化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐えられるため、ＡＡＶの低温保存の重要度は低くなる。ＡＡＶは凍結乾燥されることもある。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に対して抵抗性ではない。

ＬＧＭＤ２Ａの治療に対する当技術分野でのニーズは依然として存在する。

Ｂａｒｔｏｌｉ等、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１３：２５０－２５９（２００６）

カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを送達するための方法及び産物が、本明細書に提供される。こうした方法及び産物は、様々な疾患、例えばＬＧＭＤ２Ａを治療するために使用され得る。

カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供される。組換えアデノ随伴ウイルスは、ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、例えば、配列番号２に対し少なくとも９０％同一であるか、又は配列番号２の配列を含む。

例えば、提供されるｒＡＡＶは、第一のＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び第二のＡＡＶＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含む。ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、例えば、配列番号２に対し少なくとも９０％同一である、又は配列番号２に対し少なくとも９１％同一である、配列番号２に対し少なくとも９２％同一である、配列番号２に対し少なくとも９３％同一である、配列番号２に対し少なくとも９４％同一である、配列番号２に対し少なくとも９５％同一である、配列番号２に対し少なくとも９６％同一である、又は配列番号２に対し少なくとも９７％同一である、配列番号２に対し少なくとも９８％同一である、配列番号２に対し少なくとも９９％同一である。ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２の配列を含む。

さらに、提供されるｒＡＡＶは、ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号７に対し少なくとも９０％同一である、又は配列番号７に対し少なくとも９１％同一である、配列番号７に対し少なくとも９２％同一である、配列番号７に対し少なくとも９３％同一である、配列番号７に対し少なくとも９４％同一である、配列番号７に対し少なくとも９５％同一である、配列番号７に対し少なくとも９６％同一である、又は配列番号７に対し少なくとも９７％同一である、配列番号７に対し少なくとも９８％同一である、配列番号７に対し少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ｒＡＡＶは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。

提供されるｒＡＡＶは、配列番号１に対し少なくとも９０％同一である、又は配列番号１に対し少なくとも９１％同一である、配列番号１に対し少なくとも９２％同一である、配列番号１に対し少なくとも９３％同一である、配列番号１に対し少なくとも９４％同一である、配列番号１に対し少なくとも９５％同一である、配列番号１に対し少なくとも９６％同一である、又は配列番号１に対し少なくとも９７％同一である、配列番号１に対し少なくとも９８％同一である、又は配列番号１に対し少なくとも９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。ｒＡＡＶは、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ヌクレオチド配列は、筋特異的プロモーターの転写制御下にある。例えば、筋特異的プロモーターは、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、デスミンプロモーター、骨格アルファ－アクチン（ＡＳＫＡ）プロモーター、トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモーター、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ結合要素、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、切断されたＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ハイブリッドａ－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）プロモーター、Ｃ５－１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速収縮性トロポニンｃ遺伝子要素、遅収縮性心筋トロポニンｃ遺伝子要素、遅収縮性トロポニンｉ遺伝子要素、低酸素誘導性核因子（ＨＩＦ）応答要素（ＨＲＥ）、ステロイド誘発性要素及び糖質コルチコイド応答要素（ｇｒｅ）の一つ以上を含む。一実施形態では、筋特異的プロモーターはｔＭＣＫプロモーターであり、配列番号３の配列を含む。

例えば、ｒＡＡＶは、一実施形態において、第一のＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、ｔＭＣＫプロモーター、カルパイン３活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び第二のＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）を含むポリヌクレオチドを含む。ＡＡＶＩＴＲ（例えば、第一及び／又は第二のＡＡＶＩＴＲ）は、例えば、ＡＡＶ２逆位末端配列である。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、例えば、ＡＡＶｒｈ．７４カプシドタンパク質又はＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む。

提供されるｒＡＡＶは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶｒｈ．７４及びＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質のうちの一つ以上を含む。

別の実施形態では、開示されたｒＡＡＶのいずれかを含む組成物が提供される。例えば、組成物は、筋肉内注射又は静脈内注射用に製剤化される。

対象に、治療有効量の開示されたｒＡＡＶのいずれか、又は開示されたｒＡＡＶを含む任意の組成物を投与することを含む対象における肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療する方法も提供される。提供される方法のいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、筋肉内注射又は静脈内注射により投与される。

例えば、これらの方法での治療では、（ａ）筋線維径の増加、（ｂ）小分葉筋線維数の減少、（ｃ）内核を有する線維数の減少、（ｄ）筋内膜結合組織含有量の減少、（ｅ）筋萎縮の補正、及び（ｆ）筋力生成の増加のうちの一つ以上が生じる。治療によって影響を受ける筋線維は、遅収縮性酸化（ＳＴＯ）筋線維、速収縮性酸化（ＦＴＯ）筋線維、及び速収縮性解糖（ＦＴＧ）線維のうちの一つ以上を含む。

さらに、いずれかの提供される方法において、治療によって、（ａ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％、又は４０％の１ｍｍ^２当たりの総筋線維数の減少、（ｂ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％の筋線維径の増加、（ｃ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、又は４２％の１ｍｍ^２当たりのＳＴＯ筋線維数の減少、（ｄ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％のＳＴＯ筋線維径の増加、（ｅ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、又は２０％の１ｍｍ^２当たりＦＴＯ筋線維数が減少、（ｆ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、又は２０％のＦＴＯ筋線維径の増加、（ｇ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％の１ｍｍ^２当たりのＦＴＧ筋線維数の減少、並びに（ｈ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％のＦＴＧ筋線維径の増加のうちの一つ以上が生じる。

提供される方法のいずれかにおいて、対象の心筋は、提供されるｒＡＡＶのいずれかから発現される最小又は低カルパイン３タンパク質、又は提供されるｒＡＡＶのいずれかを含む組成物を示す。組成物による治療によって影響を受ける筋線維は、遅収縮性酸化（ＳＴＯ）筋線維、速収縮性酸化（ＦＴＯ）筋線維、及び速収縮性解糖（ＦＴＧ）線維のうちの一つ以上を含む。

治療有効量の開示されたｒＡＡＶのいずれかを含む肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療するための組成物、又は開示されたｒＡＡＶのいずれかを含む組成物が提供される。肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療するためのこれらの組成物は、筋肉内注射又は静脈内注射による投与のために製剤化される。さらに、開示される組成物のいずれかによる肢帯型筋ジストロフィー２Ａの治療は、（ａ）筋線維径の増加、（ｂ）小分葉筋線維数の減少、（ｃ）内核を有する線維数の減少、（ｄ）筋内膜結合組織含有量の減少、（ｅ）筋萎縮の補正、及び（ｆ）筋力生成の増加のうちの一つ以上が生じる。組成物による治療によって影響を受ける筋線維は、遅収縮性酸化（ＳＴＯ）筋線維、速収縮性酸化（ＦＴＯ）筋線維、及び速収縮性解糖（ＦＴＧ）線維のうちの一つ以上を含む。

さらに、肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療するための開示される組成物のいずれかによる治療は、（ａ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％、又は４０％の１ｍｍ^２当たりの総筋線維数の減少、（ｂ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％の筋線維径の増加、（ｃ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、又は４２％の１ｍｍ^２当たりのＳＴＯ筋線維数の減少、（ｄ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％のＳＴＯ筋線維径の増加、（ｅ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、又は２０％の１ｍｍ^２当たりＦＴＯ筋線維数が減少、（ｆ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、又は２０％のＦＴＯ筋線維径の増加、（ｇ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％の１ｍｍ^２当たりのＦＴＧ筋線維数の減少、並びに（ｈ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％のＦＴＧ筋線維径の増加のうちの一つ以上が生じる。

肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療するための提供される組成物のいずれかによる治療によって、対象の心筋において、提供されるｒＡＡＶのいずれか、又は提供されるｒＡＡＶのいずれかを含む組成物から発現される最小又は低カルパイン３タンパク質が示される。ｒＡＡＶ投与後の心筋は、炎症、壊死及び／又は再生などの毒性作用を全く示さないか、ほとんど示さない。

本開示はまた、肢帯型筋ジストロフィー２Ａの治療のための薬剤の調製のために、開示されたｒＡＡＶ又は開示されたｒＡＡＶのいずれかを含む組成物の治療有効量の使用を提供する。例えば、薬剤は、筋肉内注射又は静脈内注射による投与用に製剤化される。

この用途のいずれかにおいて、この薬剤による治療は、（ａ）筋線維径の増加、（ｂ）小分葉筋線維数の減少、（ｃ）内核を有する線維数の減少、（ｄ）筋内膜結合組織含有量の減少、（ｅ）筋萎縮の補正、及び（ｆ）筋力生成の増加のうちの一つ以上が生じる。この薬剤による治療によって影響を受ける筋線維は、遅収縮性酸化（ＳＴＯ）筋線維、速収縮性酸化（ＦＴＯ）筋線維、及び速収縮性解糖（ＦＴＧ）線維のうちの一つ以上である。

さらに、治療有効量の開示されるｒＡＡＶのいずれか又は提供される組成物の用途のいずれかにおいて、この薬剤による治療は、（ａ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％、又は４０％の１ｍｍ^２当たりの総筋線維数の減少、（ｂ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％の筋線維径の増加、（ｃ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、又は４２％の１ｍｍ^２当たりのＳＴＯ筋線維数の減少、（ｄ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％のＳＴＯ筋線維径の増加、（ｅ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、又は２０％の１ｍｍ^２当たりＦＴＯ筋線維数が減少、（ｆ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、又は２０％のＦＴＯ筋線維径の増加、（ｇ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％の１ｍｍ^２当たりのＦＴＧ筋線維数の減少、並びに（ｈ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％のＦＴＧ筋線維径の増加のうちの一つ以上が生じる。

開示されたｒＡＡＶ又は提供される組成物の治療有効量の用途のいずれかは、薬剤を用いた治療の後、対象の心筋は、開示された又は開示された組成物から発現されるカルパイン３タンパク質が全くない、最小限又は低いことを示す。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
第一のＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び第二のＡＡＶＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
（項目２）
ＣＡＰＮ３活性を有する前記タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である、項目１に記載のｒＡＡＶ。
（項目３）
ＣＡＰＮ３活性を有する前記タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２と少なくとも９５％同一である、項目１又は２に記載のｒＡＡＶ。
（項目４）
ＣＡＰＮ３活性を有する前記タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２の配列を含む、項目１～３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
（項目５）
ＣＡＰＮ３活性を有する前記タンパク質が、配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含む、項目１～４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
（項目６）
ＣＡＰＮ３活性を有する前記タンパク質が、配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含む、項目１～４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
（項目７）
ＣＡＰＮ３活性を有する前記タンパク質が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、項目１～４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
（項目８）
前記ポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含む、項目１～７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
（項目９）
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１と少なくとも９５％同一である配列を含む、項目１～７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
（項目１０）
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１の配列を含む、項目１～７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
（項目１１）
前記プロモーターが筋特異的プロモーターである、項目１～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
（項目１２）
前記筋特異的プロモーターは、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、デスミンプロモーター、骨格アルファ－アクチン（ＡＳＫＡ）プロモーター、トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモーター、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ結合要素、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、切断されたＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ハイブリッドａ－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）プロモーター、Ｃ５－１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速収縮性トロポニンｃ遺伝子要素、遅収縮性心筋トロポニンｃ遺伝子要素、遅収縮性トロポニンｉ遺伝子要素、低酸素誘導性核因子（ＨＩＦ）応答要素（ＨＲＥ）、ステロイド誘発性要素及び糖質コルチコイド応答要素（ｇｒｅ）の一つ以上を含む、項目１１に記載のｒＡＡＶ。
（項目１３）
前記筋特異的プロモーターが、ＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、又はＭＨＣＫ７プロモーターである、項目１１に記載のｒＡＡＶ。
（項目１４）
前記筋特異的プロモーターが、配列番号３のヌクレオチド配列を含む切断されたＭＣＫプロモーターである、項目１１に記載のｒＡＡＶ。
（項目１５）
前記第一及び第二のＡＡＶ逆位末端配列が、ＡＡＶ２逆位末端配列である、項目１～１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
（項目１６）
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶｒｈ．７４及びＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質のうちの一つ以上を含む、項目１～１５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
（項目１７）
前記ｒＡＡＶが、ｒｈ．７４カプシドタンパク質又はＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む、項目１６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
（項目１８）
項目１～１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを含む組成物。
（項目１９）
項目１～１７のいずれか一項に記載の治療有効量のｒＡＡＶ又は項目１８に記載の組成物を対象に投与することを含む、前記対象における肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療する方法。
（項目２０）
前記治療によって、
（ａ）筋線維径の増加、
（ｂ）小分葉筋線維数の減少、
（ｃ）内核を有する線維数の減少、
（ｄ）筋内膜結合組織含有量の減少、
（ｅ）筋萎縮の補正、及び
（ｆ）筋力生成の増加のうちの一つ以上が生じる、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記筋線維が、遅収縮性酸化（ＳＴＯ）筋線維、速収縮性酸化（ＦＴＯ）筋線維、及び速収縮性解糖（ＦＴＧ）線維のうちの一つ以上を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記治療によって、
（ａ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％、又は４０％の１ｍｍ^２当たりの総筋線維数の減少
（ｂ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％の筋線維径の増加
（ｃ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、又は４２％の１ｍｍ^２当たりのＳＴＯ筋線維数の減少
（ｄ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％のＳＴＯ筋線維径の増加
（ｅ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、又は２０％の１ｍｍ^２当たりのＦＴＯ筋線維数の減少
（ｆ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、又は２０％のＦＴＯ筋線維径の増加
（ｇ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％の１ｍｍ^２当たりのＦＴＧ筋線維数の減少及び
（ｈ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％のＦＴＧ筋線維径の増加のうちの一つ以上が生じる、項目１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記投与が、筋肉内注射又は静脈内注射によるものである、項目１９～２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記対象の心筋が、項目１～１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ又は項目１８に記載の組成物から発現される最小又は低カルパイン３タンパク質を示す、項目１９～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
項目１～１７のいずれか一項に記載の治療有効量のｒＡＡＶ又は項目１８に記載の組成物を含む、肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療するための組成物。
（項目２６）
前記組成物による前記治療によって、
（ａ）筋線維径の増加、
（ｂ）小分葉筋線維数の減少、
（ｃ）内核を有する線維数の減少、
（ｄ）筋内膜結合組織含有量の減少、
（ｅ）筋萎縮の補正、及び
（ｆ）筋力生成の増加のうちの一つ以上が生じる、項目２５に記載の組成物。
（項目２７）
前記筋線維が、遅収縮性酸化（ＳＴＯ）筋線維、速収縮性酸化（ＦＴＯ）筋線維、及び速収縮性解糖（ＦＴＧ）線維のうちの一つ以上を含む、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）
前記組成物による前記治療によって、
（ａ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％、又は４０％の１ｍｍ^２当たりの総筋線維数の減少
（ｂ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％の筋線維径の増加
（ｃ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、又は４２％の１ｍｍ^２当たりのＳＴＯ筋線維数の減少
（ｄ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％のＳＴＯ筋線維径の増加
（ｅ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、又は２０％の１ｍｍ^２当たりのＦＴＯ筋線維数の減少
（ｆ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、又は２０％のＦＴＯ筋線維径の増加
（ｇ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％の１ｍｍ^２当たりのＦＴＧ筋線維数の減少及び
（ｈ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％のＦＴＧ筋線維径の増加のうちの一つ以上が生じる、項目２５～２７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２９）
前記組成物が、筋肉内注射又は静脈内注射による投与のために製剤化される、項目２５～２８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３０）
前記組成物による治療後、前記対象の前記心筋が、項目１～１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ又は項目１８に記載の組成物から発現される最小又は低カルパイン３タンパク質を示す、項目２５～２８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３１）
肢帯型筋ジストロフィー２Ａの前記治療のための薬剤の調製のための、項目１～１７のいずれか一項に記載の治療有効量のｒＡＡＶ又は項目１８に記載の組成物の使用。
（項目３２）
前記薬剤による前記治療によって、
（ａ）筋線維径の増加、
（ｂ）小分葉筋線維数の減少、
（ｃ）内核を有する線維数の減少、
（ｄ）筋内膜結合組織含有量の減少、
（ｅ）筋萎縮の補正、及び
（ｆ）筋力生成の増加のうちの一つ以上が生じる、項目３１に記載の使用。
（項目３３）
前記筋線維が、遅収縮性酸化（ＳＴＯ）筋線維、速収縮性酸化（ＦＴＯ）筋線維、及び速収縮性解糖（ＦＴＧ）線維のうちの一つ以上を含む、項目３２に記載の使用。
（項目３４）
前記薬剤による前記治療によって、
（ａ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％、又は４０％の１ｍｍ^２当たりの総筋線維数の減少
（ｂ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％の筋線維径の増加
（ｃ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、又は４２％の１ｍｍ^２当たりのＳＴＯ筋線維数の減少
（ｄ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％のＳＴＯ筋線維径の増加
（ｅ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、又は２０％の１ｍｍ^２当たりのＦＴＯ筋線維数の減少
（ｆ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、又は２０％のＦＴＯ筋線維径の増加
（ｇ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％の１ｍｍ^２当たりのＦＴＧ筋線維数の減少及び
（ｈ）投与４週後までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％のＦＴＧ筋線維径の増加のうちの一つ以上が生じる、項目３１～３３のいずれか一項に記載の使用。
（項目３５）
前記薬剤が、筋肉内注射又は静脈内注射による投与のために製剤化される、項目３１～３４のいずれか一項に記載の使用。
（項目３６）
前記薬剤による治療後、前記対象の前記心筋が、項目１～１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ又は項目１８に記載の組成物から発現される最小又は低カルパイン３タンパク質を示す、項目３１～３５のいずれか一項に記載の使用。

図１Ａ～図１Ｆは、遺伝子治療がＣＡＰＮ３－ＫＯ筋における再生障害を回復したことを示す。一本鎖ＡＡＶ９．ＣＡＰＮ３ｒＡＡＶの模式図を図１Ａに示す。５’及び３’一本鎖ＩＴＲ（逆位末端配列）の間で、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター（５６３ｂｐ）は、ＣＡＰＮ３オープンリーディングフレーム（２４６６ｂｐ）の発現を駆動する。ポリアデニル化部位（ポリＡ、５３ｂｐ）も標識される。まず、ＣＡＰＮ３－ＫＯマウス由来の前脛骨筋（ＴＡ）にＣＴＸを注射し、２週間後に１×１０^１１ｖｇのＡＡＶ．ＣＡＰＮ３を左ＴＡ（図１Ｂ）に、又はＰＢＳを右ＴＡ（図１Ｃ）に注射した。ｒＡＡＶ注射の４週間後、筋肉の直径は増加し、分葉線維は未治療のＣＡＰＮ３－ＫＯ筋肉と比較して少なかった。図１Ｄでは、筋細胞膜下の小器官のパターンを有する分葉線維、ミトコンドリア分布（矢印）は、より高い倍率で未治療のＣＡＰＮ３－ＫＯ筋における部分的な筋管の融合を示唆する。Ｂ～Ｄについては、スケールバー＝２０μｍであった。図１Ｅでは、ＣＡＰＮ３－ＫＯマウスから治療及び未治療のＴＡ筋の筋線維サイズ分布ヒストグラム（各群における３匹のマウスに由来する平均±ＳＥＭ／ｍｍ^２面積）は、治療によりより大きい直径の線維に移行し、未治療群に存在する小径の部分集団が増加することを示す。図１Ｆでは、遅収縮性酸化（ＳＴＯ）線維サイズ分布ヒストグラムは、治療したＣＡＰＮ３－ＫＯ筋肉と比較して、未治療のＣＡＰＮ３－ＫＯ筋肉における多数の小径の線維（例えば、３０μｍ以下の線維直径）を示す。

図２は、「ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３」と名付けられた、本開示のｒＡＡＶの模式図を示す。

図３Ａ～図３Ｂは、筋肉内注射（１Ｅ１１ｖｇ）及び全身注射（３Ｅ１２ｖｇ及び６Ｅ１２ｖｇ）によるＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３投与後のウエスタンブロット（パネルＡ）及びＲＴ－ＰＣＲ（パネルＢ）データを提供する。このデータを、正常なヒト筋溶解物（マウスの溶解物と比較して６０％の総タンパク質のゲル負荷）及び未治療のＣＡＰＮ３－ＫＯマウスと比較した。

図４は、ＣＡＰＮ３ＫＯ（注射されたＡＡＶ．ｈＣＡＰＮ３遺伝子及び未治療）及び野生型（ＷＴ）ＴＡ筋のＳＤＨ染色組織切片の代表的な画像を提供する。ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３で治療を受けたマウスのＴＡ筋において、遅収縮性酸化（ＳＴＯ、暗）、速収縮性酸化（ＦＴＯ、中間）及び速収縮性解糖（ＦＴＧ、明）線維の平均線維サイズがＷＴ値に対して正規化されたように見えた。治療ありとなしの場合の線維種のサイズが表４に示される。

図５は、低用量コホート（３Ｅ１２ｖｇ、Ｚ１８－１３、Ｚ１８－１５、Ｚ１８－１６、Ｚ１８－１７、Ｚ１８－１８）からのＷＴ（Ｚ１８－１４）及びＴＡ筋のＣＡＰＮ３タンパク質発現レベルを提供し、並びに高用量コホート（６Ｅ１２ｖｇ、Ｚ１８－２０、Ｚ１８－２１、Ｚ１８－２３、Ｚ１８－２４、Ｚ１８－２２）からの腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）、心臓、四頭筋、前脛骨筋（ＴＡ）及び三頭筋が示される（ＵＴ：未治療）。

図６は、以下の筋肉：四頭筋（ｑｕａｄ）、心臓、前脛骨筋（ＴＡ）、腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）三頭筋、及び肝臓における６Ｅ１２ベクターゲノム全身高用量コホートにおけるＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクターコピー／μｇゲノムＤＮＡを提供する。

図７は、３Ｅ１２及び６Ｅ１２ｖｇでのＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３の全身投与後の左ＴＡ筋からの遅収縮性酸化（ＳＴＯ、暗）、速収縮性酸化（ＦＴＯ、中間）及び速収縮性解糖（ＦＴＧ、明）線維の平均線維径を提供する。未治療のＣＡＰＮ３ＫＯ及びＷＴマウスからのデータを含めた。

図８は、ｒｕｎ－ｔｏ－ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ試験のデータを提供する。図８Ａは、３Ｅ１２ｖｇのＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３を投与された低用量コホート、及び６Ｅ１２ｖｇのＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３を全身投与の４週間後に投与された高用量コホートのデータを提供する。治療を受けたＣＡＰＮ３ＫＯマウスは、未治療のマウスと比較して、Ｒｕｎ－ｔｏ－Ｅｘｈａｓｔｉｏｎ試験でより良く遂行した。図８Ｂは、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３の６Ｅ１２ｖｇの全身投与の２０～２４週間後にマウス（ｎ＝５）に試験を行った高用量コホート及び未治療のマウス（ｎ－１６）のデータを提供する。同上。

図９は、３Ｅ１２ｖｇ及び６Ｅ１２ｖｇ用量のＡＡＶｒｈ７．４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクターの全身注射の４週間後のＣＡＰＮ３ＫＯマウスの代表的な心臓標本からの左心室のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色された新鮮な凍結切片を適合する未治療の対照と共に提供する。

図１０は、高用量コホート（ＡＡＶｒｈ７．４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３の６Ｅ１２ｖｇを投与された）からの心臓組織のウエスタンブロット分析を提供する。この解析では、治療を受けた動物の心臓に、検出可能なカルパイン３タンパク質が全くない、又は最小限であることが示された。動物識別番号Ｚ１８－１９及び２２は、未治療のＣＡＰＮ３ＫＯマウスからの溶解物を表す。

本明細書に提供される組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、第一のＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び第二のＡＡＶＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、ヌクレオチドはＣＡＰＮ３をコードする。実施形態は、限定されないが、ＣＡＰＮ３をコードするヌクレオチド配列、又はＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質を含むｒＡＡＶを含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２の配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％又は８９％同一である。追加の実施形態として、配列番号２に記載されるヌクレオチド配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一でありＣＡＰＮ３タンパク質分解活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶが挙げられるが、これらに限定されない。ＣＡＰＮ３タンパク質分解活性は、フォドリン及びＨＳＰ６０等の潜在的基質をタンパク質分解する活性、及び／又は自己融解的自己切断の活性として当技術分野で理解されている。したがって、本明細書で使用される場合、「カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質」という用語は、ＣＡＰＮ３タンパク分解活性を有するタンパク質を指し、これには、限定されないが、フォドリン及びＨＳＰ６０等のタンパク質分解基質の活性、及び／又は自己融解的自己切断の活性が含まれる。ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質は、全長カルパイン３タンパク質の完全活性又は部分活性を有し得る。一つの実施形態では、ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質は、全長ＣＡＰＮ３タンパク質の活性の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％を有する。別の実施形態では、ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質は、配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２の配列を含む。別の実施形態では、ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質は、配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ｒＡＡＶのポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列を含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号１と少なくとも９５％同一である配列を含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号１の配列を含む。

別の態様においては、ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質をコードし、及び／又は配列番号２の核酸配列又はその相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶが本明細書に記述されている。「ストリンジェント」という用語は、当技術分野で一般的に厳格と理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、主に温度、イオン強度、及びホルムアミド等の変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーション及び洗浄のためのストリンジェント条件の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム（６５℃～６８℃）又は０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、及び５０％ホルムアミド（４２℃）である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）。

本明細書に記載の組換えゲノムにおいて、ＣＡＰＮ３ポリヌクレオチドは、転写制御要素（プロモーター、エンハンサー、及び／又はイントロンを含むが、これらに限定されない）、特に目的の標的細胞において機能する転写制御要素に動作可能に結合される。例えば、様々な実施形態は、筋特異的転写制御要素を使用して筋細胞を形質導入する方法を提供し、限定されないが、アクチン及びｍｙｏＤ遺伝子ファミリー等のミオシン遺伝子ファミリーに由来するもの、例えば、から［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６１－７６６（１９９１）を参照のこと］、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ及びＯｌｓｏｎ、ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ，１１：４８５４－４８６２（１９９１））、ヒト骨格アクチン遺伝子に由来する制御要素［Ｍｕｓｃａｔ等、ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ，７：４０８９－４０９９（１９８７））、筋クレアチンキナーゼ配列要素［Ｊｏｈｎｓｏｎ等、ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ、９：３３９３－３３９９（１９８９）を参照のこと］、及びマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）要素、骨格の速収縮性トロポニンＣ遺伝子、遅収縮性心筋トロポニンＣ遺伝子及び遅収縮性トロポニンＩ遺伝子に由来する制御要素：低酸素誘発性核因子［Ｓｅｍｅｎｚａ等、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、８８：５６８０－５６８４（１９９１）］、糖質コルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含むステロイド誘発性要素及びプロモーター［Ｍａｄｅｒ及びＷｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：５６０３－５６０７（１９９３）を参照のこと］、ｔＭＣＫプロモーター［Ｗａｎｇ等、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、１５：１４８９－１４９９（２００８）参照のこと］、ＣＫ６プロモーター［Ｗａｎｇ等、上述］、及びその他の制御要素が挙げられる。一実施形態では、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、筋特異的プロモーターに動作可能に連結される。一実施形態において、筋特異的プロモーターは、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、デスミンプロモーター、骨格アルファ－アクチン（ＡＳＫＡ）プロモーター、トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモーター、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ結合要素、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、切断されたＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ハイブリッドａ－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）プロモーター、Ｃ５－１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速収縮性トロポニンｃ遺伝子要素、遅収縮性心筋トロポニンｃ遺伝子要素、遅収縮性トロポニンｉ遺伝子要素、低酸素誘導性核因子（ＨＩＦ）応答要素（ＨＲＥ）、ステロイド誘発性要素及び糖質コルチコイド応答要素（ｇｒｅ）の一つ以上を含む。別の実施形態では、筋特異的プロモーターはＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、又はＭＨＣＫ７プロモーターである。いくつかの実施形態では、筋特異的プロモーターはｔＭＣＫであり、配列番号３の配列のヌクレオチド配列を含む。

これまでの研究では、デスミンプロモーターによるＣＡＰＮ３の発現が心毒性をもたらすことが示された。フォローアップ試験では、遺伝子の選択的骨格筋発現により心臓欠陥が消失した。本明細書に開示されるＡＡＶゲノムは、筋特異的プロモーター、骨格筋へのＣＡＰＮ３発現を制限するｔＭＣＫを含み、遺伝子注射の４週間後に、６Ｅ１２ｖｇ（提案された初回高用量の２倍）のウイルスの全身送達後、心臓毒性を示さなかった。

本明細書に記載されるｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐＤＮＡを欠く。提供されるｒＡＡＶゲノムは、上述のＣＡＰＮ３ポリヌクレオチド、及びポリヌクレオチドに隣接する一つ以上のＡＡＶＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノムのＡＡＶＤＮＡは、組換えウイルスがＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶｒｈ．７４及びＡＡＶｒｈ．１０を含むがこれに限定されないから生じる可能性があるＡＡＶ血清型であってもよい。カプシド変異を有する他の種類のｒＡＡＶ変異体、例えばｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上述の背景技術の項で述べたように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は当技術分野で公知である。骨格筋特異的発現を促進するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９が使用され得る。

提供されるＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ＡＡＶのヘルパーウイルス（アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、又はヘルペスウイルスを含むが、これらに限定されない）の感染に許容される細胞に移され、ｒＡＡＶゲノムを感染性ウイルス粒子に集合させる。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子を産生する技術が、当該技術分野で標準である。ｒＡＡＶの産生は、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離された（すなわち、非存在下の）ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能という、単一細胞（本明細書においてパッケージング細胞として示される）内に以下の構成要素が存在することを必要とする。ＡＡＶＩＴＲ並びにｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスがｒＡＡＶゲノムＩＴＲよりも異なるＡＡＶ血清型から生じ得る、又は由来し得る任意のＡＡＶ血清型、限定されないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶｒｈ．１０及びＡＡＶｒｈ．７４に由来してもよい。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。したがって、一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶｒｈ．７４又はＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質のうちの一つ以上を含む。別の実施形態では、ｒＡＡＶはＡＡＶｒｈ．７４カプシドタンパク質又はＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む。

パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の生成に必要な全ての成分を安定的に発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離されたＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにネオマイシン耐性遺伝子等の選択マーカーを含むプラスミド（又は複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング等の手順によって細菌プラスミドに導入されている［Ｓａｍｕｌｓｋｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１（１９８２）］、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの追加［Ｌａｕｇｈｌｉｎ等、Ｇｅｎｅ、２３：６５－７３（１９８３）］、又は直接の鈍端連結によって細菌プラスミドに導入されている［Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５９：４６６１－４６６６（１９８４）］。次いで、パッケージング細胞株は、アデノウイルス等のヘルパーウイルスに感染する。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模生産に適していることである。適切な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム及び／又はｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するために、プラスミドではなくアデノウイルス又はバキュロウイルスを用いる。

ｒＡＡＶ生産の一般原則は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５３３－１５３９（１９９２）；及びＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．ＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌ．、１５８：９７－１２９（１９９２）にレビューされている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ等、Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）；Ｓａｍｕｌｓｋｉ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８（１９８９）；米国特許第５，１７３，４１４号；ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号；ＷＯ９５／１３３９２；ＷＯ９６／１７９４７；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００；ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）；ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）；ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）；ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）；ＷＯ９９／１１７６４；Ｐｅｒｒｉｎ等、Ｖａｃｃｉｎｅ、１３：１２４４－１２５０（１９９５）；Ｐａｕｌ等、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、４：６０９－６１５（１９９３）；Ｃｌａｒｋ等、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ３：１１２４－１１３２（１９９６）；米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、米国特許第６，２５８，５９５号、及びＭｃＣａｒｔｙ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１６（１０）：１６４８－１６５６（２００８）に記載されている。前述の文書は、参照によりその全体が本明細書に援用され、特にｒＡＡＶの生産に関する文書のこれらの項に重点が置かれる。

したがって、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞が提供される。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同族体２９３系統）等の安定的に形質転換された癌細胞であってもよい。別の実施形態では、パッケージング細胞は、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎臓細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ベロ細胞（サル腎臓細胞）及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル肺細胞）等の形質転換された癌細胞ではない細胞である。

したがって、本明細書に提供される組換えＡＡＶは、組換えゲノムを含む複製欠損、感染性、カプシド形成されたウイルス粒子である。例としては、ＣＡＰＮ３をコードする配列番号１に記載の配列を含むゲノム、ＣＡＰＮ３をコードする配列番号１に記載の配列から本質的に成るゲノムを含むｒＡＡＶ、ＣＡＰＮ３をコードする配列番号１に記載の配列から成るゲノムを含むｒＡＡＶ（「ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３」と命名される）が挙げられるが、これらに限定されない。ｒＡＡＶのゲノムはＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐＤＮＡを欠いており、すなわち、ｒＡＡＶゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶｒｅｐ又はｃａｐＤＮＡはない。

ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３配列の配列は、配列番号１に記載され、ＡＡＶ２ＩＴＲはヌクレオチド１～１２８に及び、ｔＭＣＫプロモーターはヌクレオチド１６５～８８４に及び、キメライントロンはヌクレオチド９３７－１０６９に及び、Ｋｏｚａｋ配列はヌクレオチド１１０１－１１０６に及び、ＣＡＰＮ３ポリヌクレオチドはヌクレオチド１１０７－３５７２に及び、ポリＡシグナルはヌクレオチド３５８１－３７８０に及び、第二のＡＡＶ２ＩＴＲは、ヌクレオチド３８５０－３９７７に及ぶ。

ｒＡＡＶは、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配等の当技術分野で公知の方法によって精製されてもよい。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製する方法は当該技術分野で公知であり、例えばＣｌａｒｋ等、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）；Ｓｃｈｅｎｐｐ及びＣｌａｒｋ，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｍｅｄ．，６９：４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、及びＷＯ９８／０９６５７に開示される方法が挙げられる。

別の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶを含む組成物が提供される。提供される組成物は、薬学的に許容可能な担体にｒＡＡＶを含む。組成物は、希釈剤及びアジュバント等の他の成分も含み得る。許容可能な担体、希釈剤及びアジュバントは、レシピエントにとって無毒性であり、使用される用量及び濃度では不活性であることが好ましく、リン酸塩、クエン酸塩、又はその他の有機酸；アスコルビン酸等の抗酸化剤；低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；アミノ酸、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類。及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含むその他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴｗｅｅｎ、プルロニックス又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。

本明細書に記載される方法において投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与形式、治療目標、個体、及び標的とされる細胞型（複数可）に応じて変化し得、当該技術分野の標準方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌ当たり約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３、約１×１０^１４、又はそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲にあり得る。用量はまた、ウイルスゲノムの単位（ｖｇ）で表現されてもよい。開示される例示的用量には、１Ｅ１１ｖｇ、３Ｅ１２ｖｇ及び６Ｅ１２ｖｇが含まれる。

ｉｎｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏにおいて、ｒＡＡＶを有する筋細胞等の標的細胞を形質導入する方法が本明細書で企図されている。ｉｎｖｉｖｏの方法は、本明細書に提供されるｒＡＡＶを含む組成物の有効用量又は有効反復投与量を、それを必要とする対象（例えば、限定されないが、ヒト患者を含む動物）に投与するステップを含む。疾患／疾患発症前に投与する場合、この投与は、予防的である。疾患／疾患発症後に投与する場合、この投与は、治療である。有効量は、治療される障害／疾患に関連する少なくとも一つの症状を緩和（除去又は低減）する用量であり、障害／疾患状態への進行を遅延又は予防し、障害／病状の進行を遅延又は予防し、疾患の程度を減少し、疾患の寛解（部分的又は全体）をもたらし、及び／又は生存期間を延長する用量である。治療前の対象に比べて、本明細書の治療は、筋線維径の増加、小分葉筋線維数の減少、内核を有する線維数の減少、筋内膜結合組織含有量の減少、筋萎縮の補正、及び筋力生成の増加のうちの一つ以上が生じる。一実施形態では、筋線維は、遅収縮性酸化（ＳＴＯ）筋線維、速収縮性酸化（ＦＴＯ）筋線維、及び速収縮性解糖（ＦＴＧ）線維のうちの一つ以上を含む。一実施形態において、治療によって、（ａ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％、又は４０％の１ｍｍ^２当たりの総筋線維数の減少、（ｂ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％の筋線維径の増加、（ｃ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、又は４２％の１ｍｍ^２当たりのＳＴＯ筋線維数の減少、（ｄ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％のＳＴＯ筋線維径の増加、（ｅ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、又は２０％の１ｍｍ^２当たりＦＴＯ筋線維数が減少、（ｆ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、又は２０％のＦＴＯ筋線維径の増加、（ｇ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％の１ｍｍ^２当たりのＦＴＧ筋線維数の減少、並びに（ｈ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％のＦＴＧ筋線維径の増加のうちの一つ以上が生じる。本開示の方法は、一実施形態では、ｒＡＡＶを投与された対象の心筋において、ｒＡＡＶから発現されるカルパイン３タンパク質が全くない、最小限又は低くする。

これらの結果を調べるためのアッセイは、当技術分野で理解され、及び／又は本明細書の実施例に記載されている。ＣＡＰＮ３活性の欠陥又はＣＡＰＮ３の発現の欠陥によって引き起こされる障害／疾患（例えば、筋ジストロフィー）を予防又は治療するための本明細書に記載の方法の使用が企図されている。ＬＧＭＤ２Ａは、方法による予防又は治療のために意図される疾患の一例である。

併用療法も企図されている。本明細書に使用される組み合わせは、同時治療又は連続治療の両方を含む。本明細書に記載される方法を標準的な医療治療（例えば、コルチコステロイド）と組み合わせることは、新規治療との組み合わせと同様に、特に企図される。

組成物の有効用量の投与は、限定されないが、筋肉内、非経口、静脈内、くも膜下腔内、経口、頬側、鼻腔、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、又は膣を含む、当技術分野の標準的な経路によることができる。ｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路（複数可）及び血清型（複数可）は、治療される感染及び／又は疾患状態、並びにＣＡＰＮ３を発現することになる標的細胞／組織（複数可）を考慮に入れて、当業者によって選択及び／又は適合され得る。一実施形態では、ｒＡＡＶは、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、皮膚上投与、膣内注射、皮内投与、又は経鼻投与によって投与される。別の実施形態では、ｒＡＡＶは筋肉内注射又は静脈内注射によって投与される。

特に、本明細書に記載のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用して達成され得る。投与には、筋肉、血流、及び／又は肝臓への直接の注射が含まれるが、これらに限定されない。ｒＡＡＶをリン酸緩衝生理食塩液に再懸濁するだけで、筋組織発現に有用なビヒクルを提供するのに充分なことが実証されており、担体又はｒＡＡＶと共投与することができるその他の成分に対する既知の制限はない。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉等の特定の標的組織を標的とするように改変されてもよい。例えば、ＷＯ０２／０５３７０３を参照されたく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。医薬組成物は、注射可能な製剤として、又は経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製され得る。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が以前に開発されており、この方法の実践に使用することができる。ｒＡＡＶは、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容可能な担体とともに使用することができる。

筋肉内注射の目的で、ゴマ又はピーナッツ油等のアジュバント中の溶液、又はプロピレングリコール水溶液、並びに滅菌水溶液を用いることができる。かかる水溶液は、所望であれば緩衝することができ、液体希釈剤は、最初に生理食塩水又はグルコースで等張性にすることができる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）又は薬理学的に許容可能な塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロックスプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。ｒＡＡＶの分散はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びその混合物、及び油中に調製され得る。通常の保存及び使用条件下では、これらの調製物は微生物の増殖を防ぐ防腐剤を含有する。この関連において、使用される滅菌水性媒体はすべて、当業者に周知の標準技術によって容易に入手可能である。

全身（例えば、静脈内）注射可能な使用に適した医薬品形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。いずれの場合でも、形態は無菌で、容易に注入できる範囲において液体でなければならない。製造及び保管の条件下で安定であり、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用に対して保存されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング剤の使用によって、分散液の場合に必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の様々な抗菌剤及び抗真菌剤によって提供される。多くの場合、例えば、糖類又は塩化ナトリウム等の等張剤を含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど、吸収を遅延する薬剤の使用によってもたらされ得る。

滅菌注射用溶液は、必要に応じて、適切な溶媒中の必要な量のｒＡＡＶを上記に列挙された様々なその他の成分と混合し、その後フィルター滅菌することにより調製される。概して、分散剤は、滅菌された有効成分を、基本分散媒体及び上記に列挙されたものから必要とされるその他の成分を含む滅菌媒体に混入することによって調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、いくつかの実施形態において、調製方法は、真空乾燥及び／又は凍結乾燥技術を含み、その各々は、有効成分の粉末と、その以前にフィルター滅菌された溶液から追加の所望の任意の成分とを生じさせることができる。

ｒＡＡＶを用いた形質導入もｉｎｖｉｔｒｏで実施してもよい。一実施形態では、所望の標的筋細胞を対象から除去し、ｒＡＡＶで形質導入し、対象に再導入する。あるいは、同系又は異種の筋細胞は、これらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生じさせない場合に使用することができる。

形質導入した細胞の対象への形質導入及び再導入の適切な方法は、当技術分野で公知である。一実施形態において、細胞は、例えば適切な培地中で、ｒＡＡＶを筋細胞と組み合わせ、及びサザンブロット及び／又はＰＣＲ等の従来の技術を用いて、又は選択マーカーを用いて、対象のＤＮＡを有するそれらの細胞をスクリーニングすることにより、ｉｎｖｉｔｒｏで形質導入され得る。次いで、形質導入細胞を医薬組成物に製剤化し、組成物は、例えば、筋肉内、静脈内、皮下及び腹腔内注射、又は例えばカテーテルを使用して平滑筋及び心筋への注射など、様々な技術によって対象に導入することができる。

本明細書に記載の方法によるｒＡＡＶを用いた細胞の形質導入は、ＣＡＰＮ３又はＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質を持続的に発現させる。したがって、ＣＡＰＮ３又はＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質を発現するｒＡＡＶを、対象、好ましくはヒトに投与するための方法が提供される。本開示の対象は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、齧歯類（例えば、ラット及びマウス）、並びに霊長類を含むがこれに限定されない。これらの方法には、本明細書に記載の一つ以上のｒＡＡＶを用いて組織を形質導入すること（筋肉、肝臓及び脳等の臓器、及び唾液腺等の腺などの組織を含むが、これらに限定されない）を含む。

筋組織は、重要な臓器ではなく、アクセスしやすいため、ｉｎｖｉｖｏＤＮＡ送達の魅力的な標的である。本明細書の方法は、形質導入した筋細胞からのＣＡＰＮ３の持続的な発現を提供する。

「筋肉細胞」、「筋線維」、又は「筋肉組織」とは、任意の種類の筋肉［例えば、骨格筋及び平滑筋（例えば、消化管、膀胱、血管又は心臓組織）に由来する細胞又は細胞の群を意味する。このような筋細胞は、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞及び心筋芽細胞等、分化又は未分化であり得る。

「形質導入」という用語は、ｉｎｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏのいずれかで、記載のｒＡＡＶを介して、レシピエント細胞へのＣＡＰＮ３の投与／送達を指すために使用され、レシピエント細胞によるＣＡＰＮ３の発現をもたらす。

したがって、ＣＡＰＮ３をコードする有効量（又は本質的に同時に投与される用量、又は一定間隔で投与される用量）のｒＡＡＶを、それを必要とする対象に投与する方法が提供される。

治療前の対象に比べて、本明細書の方法は、対象において、筋線維径の増加、小分葉遅収縮性酸化（ＳＴＯ）筋線維数の減少、内核を有する線維数の減少、筋内膜結合組織含有量の減少、筋萎縮の補正、及び筋力生成の増加のうちの一つ以上が生じる。

態様及び実施形態は、以下の実施例によって例示される。実施例１は、ＡＡＶ９．ＭＣＫ．ＣＡＰＮ３の産生を記載する。実施例２は、ＡＡＶ９．ＭＣＫ．ＣＡＰＮ３の筋肉内投与を記載する。実施例３は、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３の産生を記載する。実施例４は、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３の筋肉内投与を記載する。実施例５は、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３の静脈内投与を記載する。実施例６は、エンドポイント研究を示す。実施例７は、毒性試験及び体内分布試験を記載する。実施例８は、筋肉内注射後のｉｎｖｉｖｏ生物作用能試験を記載する。実施例９は、全身注射後のｉｎｖｉｖｏ生物作用能試験を記載する。実施例１０は、全身ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３遺伝子送達の評価を記載する。実施例１１は、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３ベクターの全身注射後の心臓毒性の評価を記載する。実施例１２は、ｉｎｖｉｖｏ生理学的分析を記載する。

実施例１
ＡＡＶ９．ＭＣＫ．ＣＡＰＮ３の産生
筋特異的ＭＣＫプロモーターの下にＣＡＰＮ３遺伝子を担持するＡＡＶベクター（ＡＡＶ．ＣＡＰＮ３と命名）を産生した（図１Ａ）。二つのＮｏｔ１制限部位間のマウスＣＡＰＮ３（ＮＭ＿００７６０１．３）のオープンリーディングフレームを含むＤＮＡを、ＥｕｒｏｆｉｎＧｅｎｏｍｉｃｓ、米国によって合成し、その後、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ等、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ、５：４５－５５（２００７）以前に記載されるＡＡＶ．ＭＣＫ（筋クレアチンキナーゼ）ベクターにサブクローニングする。ｒＡＡＶベクターは、修正されたクロスパッケージングアプローチによって産生され、それによってＡＡＶ２ベクターゲノムをＡＡＶカプシド血清型にパッケージすることができる。［Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ等、ＪＶｉｒｏｌ．７６（２）：７９１－８０１（２００２）］。産生は、ＨＥＫ２９３細胞を用いた標準的な三つのプラスミドＤＮＡ／ＣａＰＯ４沈殿法を用いて達成した。２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びペニシリン及びストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭに維持した。産生プラスミドは、（ｉ）ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏｄｙｓ、（ｉｉ）ｃａｐ血清型１、６、又は８様単離物をコードするｒｅｐ２－ｃａｐＸ改変ＡＡＶヘルパープラスミド、及び（ｉｉｉ）アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、及びＶＡＩ／ＩＩＲＮＡ遺伝子を発現するアデノウイルス５型ヘルパープラスミド（ｐＡｄｈｅｌｐｅｒ）であった。血清型間の比較を可能にするために、定量的ＰＣＲベースの滴定方法を使用して、Ｐｒｉｓｍ７５００Ｔａｑｍａｎ検出器システム（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、カプシド形成されたベクターゲノム（ｖｇ）力価を決定した。［Ｃｌａｒｋ等、ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ．１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）］。プライマー及び蛍光プローブは、ＭＣＫプロモーターを標的とし、以下のものであった：ＭＣＫフォワードプライマー、５－ＣＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＡＴＡＡＴＴ－３（配列番号４）；ＭＣＫリバースプライマー、５－ＧＣＴＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＴＧＴＴＧ－３（配列番号５）；ＭＣＫプローブ、５－ＦＡＭ－ＣＣＡＧＡＣＡＴＧＧＧＣＴＧＣＴＣＣＣＣ－ＴＡＭＲＡ－３（配列番号６）。最終力価（ｖｇｍｌ^－１）を、Ｐｒｉｓｍ７５００リアルタイム検出器システム（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国ニューヨーク州グランドアイランド）を使用したＭＣＫプロモーター用の特異的プライマー及びプローブを使用した定量的逆転写酵素ＰＣＲにより決定した。アリコートされたウイルスは、使用まで－８０℃に保持した。

実施例２
ＡＡＶ９．ＭＣＫ．ＣＡＰＮ３の筋肉内投与
ＷＴＣＡＰＮ３がＣＡＰＮ３ノックアウト（ＣＡＰＮ３－ＫＯ）マウスにおいて再生不全プロセスを回復できるかどうかを示すために、麻酔下のＣＡＰＮ３－ＫＯマウスのＴＡ筋（ｎ＝４）［Ｋｒａｍｅｒｏｖａ等、ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ１３（１３）：１３７３－１３８８（２００４）］に、最初に３０μｌのＣＴＸを注入し、２週間後に、筋肉内注射を介して、２０μｌの量の１ｘ１０^１１ｖｇのＡＡＶ９．ＭＣＫ．ＣＡＰＮ３を用いて、野生型ＣＡＰＮ３を発現するように形質導入した。対照としての役目を果たした別のＣＡＰＮ３－ＫＯコホート（ｎ＝４）のＴＡ筋は、ＣＴＸ注射の２週間後に同量のＰＢＳを受けた。

ＣＴＸ注射の６週間後にマウスを殺し、ＴＡ筋を除去し、クリオスタット切片のために処理した。ルーチンの病理組織学的評価のために、厚さ１２μｍの断面をまずＨ＆Ｅで染色し、筋線維型固有の直径測定値は、各群の３匹のマウスのＴＡのＳＤＨ染色断面から取得した。ＴＡの三つのランダム画像（動物１匹当たりの断面ごと）を２０倍で撮影し、ファイバー直径測定値及び線維型固有のヒストグラムを生成した。

コハク酸脱水素酵素（ＳＤＨ）酵素組織化学を用いて、代謝線維型分化［遅収縮性酸化（ＳＴＯ）、速収縮性酸化（ＦＴＯ）、速収縮性解糖（ＦＴＧ）］を評価した。筋線維型固有の直径測定値は、最終的なカルディオトキシン注入の４週間後及び１２週間後に、１２μｍ厚のＳＤＨ染色断面を用いて得られた。三つの画像は、それぞれ、腓腹筋（主にＳＴＯからなる深部ゾーン、ＳＴＯ、ＦＴＯ又はＦＴＧのチェッカーボードの外観を示す中間ゾーン、及び主にＦＴＧ線維からなる表層ゾーン）の三つの固有のゾーンを正中線軸（動物１頭当たり１断面当たり）に沿って、ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ４１顕微鏡及びＳＰＯＴカメラ（ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ６１、日本）を用いて２０倍率で撮影した。このアプローチは、再生中の代謝変化に応答して各ゾーンの線維の酸化状態の変化を捕捉するために選択された。ＺｅｉｓｓＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎＬＥ４ソフトウェア（ｖ．４．８）を用いて筋線維の最短距離を測定することにより、暗い（ＳＴＯ）、中間（ＦＴＯ）、及び明るい（ＦＴＧ）線維の直径を決定した。線維直径ヒストグラムは、ＳＴＯについて個別に作成され、ＦＴＧ及びＦＴＯは、組み合わされて、３匹の動物から得られ、筋内膜面積（平均±ＳＥＭ）のｍｍ^２当たりの数として表される総速収縮性線維集団（ＦＴＧ／Ｏ）を示した。平均線維径は、全３種類の線維型を合わせることから生じた。１群当たり平均９００～１７００本の線維が測定された。線維形成の評価にＴＡ筋を使用した（下記参照）。

ＡＡＶ９．ＭＣＫ．ＣＡＰＮ３注射の４週間後、内核の明らかな減少及び分葉パターンを有する小径線維のはるかに少ない数で、筋肉の直径の有意な増加が観察された（図１Ｂ）。未処理のＣＡＰＮ３－ＫＯ筋肉は、ｍｍ^２面積当たり３１．６％以上の線維を有し、主に小さい及び分葉状ＳＴＯ線維から構成され、治療によって、筋管融合が改善し、したがって単位面積当たり個々の小線維数が減少することを示す（図１、Ｃ及びＤ；表１）。

治療を受けたＴＡ筋の線維サイズ分布ヒストグラムは、治療と共により大きな直径の線維へのシフトを示し、未治療のＣＡＰＮ３－ＫＯ対照筋の小径線維の過剰な数はＳＴＯ組織化学的線維型であった（図１Ｅ及び１Ｆ）。まとめると、これらの知見は、ＣＡＰＮ３－ＫＯ筋における遺伝子治療を介したＣＡＰＮ３置換が、線維径の正常化及びＳＴＯ線維集団の数の減少によって証明された、再生欠損を救出したことを示す。

実施例３
ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３の産生
切断された筋特異的ＭＣＫプロモーター（ｔＭＣＫプロモーター）の下にＣＡＰＮ３遺伝子を担持するＡＡＶベクター（ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３と命名）を産生した。二つのＮｏｔ１制限部位間のマウスＣＡＰＮ３（ＮＭ＿００７６０１．３）のオープンリーディングフレームを含むＤＮＡを、ＥｕｒｏｆｉｎＧｅｎｏｍｉｃｓ、米国によって合成し、その後ＡＡＶ産生プラスミドに挿入した。プラスミドのマップを図２に示す。

その後、ｒＡＡＶベクターを、実施例１に記載されたアプローチにより作製した。

実施例４
ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３の静脈内投与
６月齢のＣＡＰＮ３－ＫＯマウスは、尾静脈への注射を介して低用量（３ｘ１０^１２ｖｇ）及び高用量（６ｘ１０^１２ｖｇ）のＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３を投与された。エンドポイント試験のために、マウスを遺伝子注射後２０週で殺した。年齢の一致するビヒクル処置されたＣＡＰＮ３－ＫＯマウスは、対照として提供される。

以下の実施例７に記載されるように実施されるエンドポイント研究には、筋肉生理学（ＴＡ力生成又はインビボ筋肉収縮性アッセイ、及び伸張性収縮からの保護）、筋肉組織病理、ｑＰＣＲを使用したｈＣＡＰＮ３検出、及びウエスタンブロット分析が含まれる。

実施例５
ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３の筋肉内投与
老若ＣＡＰＮ３－ＫＯ筋において、心臓毒（ＣＴＸ）誘発性の同期性壊死、続いてｒＡＡＶ治療を介したＣＡＰＮ３の再生筋への導入に対する再生反応が測定される。

若年（２月齢）及び高齢（６月齢）のマウスのコホートでは、ＣＴＸを両方のＴＡ筋に注射して、左ＴＡ筋にｒＡＡＶ注射する２週間前に同期性壊死を誘発する。ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３は、２０μｌの体積で１×１０^１１ｖｇで、筋肉内注射により投与される。エンドポイント試験は、遺伝子導入後８週目（１×１０^１１ｖｇ用量で、我々の過去の試験で確立した有効性と共に）に実施されて、定量的組織学及び生理学的転帰を左ＴＡから未治療の右ＴＡと比較することにより、再生欠損の補正を評価する。

ｒＡＡＶ注射の８週間後、以下の実施例６に記載されるように実施されたエンドポイント試験には、筋肉生理学（ＴＡ力の生成及び伸張性収縮からの保護）、定量的筋肉組織病理、ｑＰＣＲ及びウエスタンブロット分析を使用したｈＣＡＰＮ３検出が含まれる。

実施例６
エンドポイント試験
ＴＡ力の生成及び伸張性収縮からの保護
ＴＡ筋の機能転帰を評価するプロトコルは、マウスから抽出された筋肉に対して実施される［Ｗｅｉｎ等、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ、２０（９）：９９２－１０００（２０１４）］。マウスは、ケタミン／キシラジン混合物を使用して麻酔される。解剖鏡を用いて後肢の皮膚を切除して、ＴＡ筋及び膝蓋骨を露出させる。遠位ＴＡ腱を切開し、腱の周囲にできるだけ近くの筋肉に４－０縫合糸でダブルスクエアノットを結び、腱を切断する。露出した筋肉は生理食塩水で絶えず湿らせる。その後、マウスを熱制御されたプラットフォームに移し、３７℃に保つ。針を遠位ＴＡ腱縫合部である膝蓋靱帯に通してフォーストランスデューサ（ＡｕｒｏｒａＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｕｒｏｒａ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）の水平アームまで、膝をプラットフォームに固定し、足はテープで固定する。ＴＡ筋収縮は、双極白金電極を介して、坐骨神経を刺激することによって誘発される。筋肉が安定したら、最大収縮力が達成されるまで筋肉を徐々に伸ばすことによって最適な長さを決定した。３分間の静止期間後、ＴＡは５０、１００、１５０及び２００Ｈｚで刺激され、各刺激の間に１分間の静止期間を設けて最大強縮力を決定する。筋長を測定する。５分間の安静後、収縮誘発性損傷に対するＴＡ筋の感受性を評価する。５００ｍｓの刺激後、筋肉は最適長の１０％に伸長する。これには、１５０Ｈｚで７００ｍｓの筋肉の刺激が含まれる。刺激後、筋肉は最適な長さに戻る。サイクルを１分ごとに合計１０サイクル繰り返す。特定力は、最大テタニック力をＴＡ筋断面積で割ることによって算出する。伸張性収縮の後、マウスを安楽死させ、ＴＡ筋を切開し、秤量し、分析のために凍結する。データの解析は盲検下で実施するが、無作為に実施するものではない。

Ｉｎｖｉｖｏ筋肉収縮性アッセイ
このアッセイは、下肢の足底筋又は背屈筋のいずれかによって生成される総トルクを測定し、筋生理学装置（ＡｕｒｏｒａＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＯＮ、カナダ）を使用して実施される。イソフルランで麻酔する。動物は麻酔されると、クリッパーで必要に応じて後肢の毛が取り除かれる。クリッパーで脱毛が不充分であれば、薄層の脱毛クリーム（Ｎａｉｒ）を塗布し、ぬるま湯で十分に洗浄して不快感を防ぐ。測定する後肢をフットプレートに粘着テープで貼り付ける。肢を鈍的クランプで堅く固定する。坐骨神経の脛骨又は腓骨要素の何れかを、神経の近くの皮膚に皮下に挿入される二つの滅菌された使い捨ての２８ゲージ単極電極で刺激する。マウスの体温は、伝導性温度調節加熱パッド（３７℃に設定）又は放射熱源により維持され、温度プローブにより監視される。

病理組織学的検査
組織学的解析では、筋肉及び臓器はすべて７％のトラガカントゴムに埋め込まれ、液体窒素冷却イソペンタンに急速凍結される。凍結切片（１２μｍ）は、免疫組織化学検査及びウエスタンブロット分析用に採取される。

ヒトＣＡＰＮ３検出用ウエスタンブロット解析
マウス筋組織におけるＣＡＰＮ３タンパク質定量は、ウェスタンブロッティング法を用いて評価される。ＣＡＰＮ３酵素はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により溶解され、ＮＣＬ－ＣＡＬＰ－１２Ａ２のＮ末端を認識するＮｏｖｏｃａｓｔｒａの臨床グレードの抗体を用いて、約６０ｋＤａの自己溶解産物で９４ｋＤａのバンドとして遊走する。さらに、ＮＣＬ－ＣＡＬＰ－２Ｃ４抗体は、同ＣＡＰＮ３の分子量（９４ｋＤ）及び骨格筋中の追加の断片（３０ｋＤ）を認識し、両抗体ともタンパク質検出に適している。治療的ｒＡＡＶベクターの送達後のカルパインノックアウトマウスの試料内のＣＡＰＮ３タンパク質発現レベルの半定量的測定を実施し、未治療の対照と比較する。

定量的筋組織学
ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３で処置したＴＡ及び大腿四頭筋の断面及び未処置の対象の断面図をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、ＺｅｉｓｓＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎＬ４ソフトウェアを使用して撮影する（動物当たり、一つのセクション当たり４つのランダムな２０枚の画像）。処置したものとコントロール間で線維径が比較される。

統計解析
スチューデントｔ検定又は一元配置分散分析多重比較検定を適宜実施する。

実施例７
毒性試験／体内分布試験
毒性試験／体内分布試験は、確立された有効用量及び１ログの高用量を用いて実施する。毒性研究は、正常Ｃ５７Ｂｌ６正常マウスとの比較を含む、６～８週齢のＣＡＰＮ３－ＫＯマウスへのｒＡＡＶの全身（尾静脈）送達によって行われる。６～１０匹のマウスのコホートを含み、ＧＬＰ様の方法を用いて完全な剖検を行う。

血液サンプルから採取した血清は、血液生化学的検査：アラニンアミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ビリルビン（総及び直接）、血中尿素窒素、クレアチニン、クレアチンキナーゼ、グルコース及び総タンパク質に使用される。

完全剖検は、動物の内臓及び死体の完全な系統的検査及び切開で実施される。性腺、脳、脾臓、腎臓、空腸、結腸、膵臓、心臓、肺、胃、肝臓、鼠径リンパ節、脊髄腓腹筋、四頭筋を含む組織／臓器が回収される。病理組織学的研究用の組織／臓器を採取し、１０％の中性緩衝ホルマリン（１０％ＮＢＦ）に固定し、ただし、ＯＣＴを伴うブロック上に載置した全ての骨格筋検体は例外とし、凍結切片用に液体窒素冷却メチルブタンにおいて急速凍結する。

実施例８
筋肉内注射後のＩｎＶｉｖｏ生物作用能試験
生物作用能試験は、実施例５に上述したように、ＣＡＰＮ３ＫＯマウス（ｎ＝３）の前脛骨筋（ＴＡ）へのＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３（１Ｅ１１ｖｇ）の筋肉内（ＩＭ）注射後に実施された。

投与後４週目に、逆転写定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）及びウエスタンブロット解析により遺伝子送達を解析した。ウエスタンブロット分析のために、５０μｇの筋タンパク質抽出物全体に相当する試料を３～８％アクリルアミド、トリス－アセテートＳＤＳゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。免疫検出は、ヒトカルパイン３配列（Ｌｅｉｃａ）のＡＡ１～１９を含むｓ合成ペプチドに対して産生されたモノクローナル抗体、及び負荷対照として筋特異的アクチン抗体（Ｌｅｉｃａ）で行った。図３Ａは、筋肉内注射後のＴＡ筋における９４ｋＤのカルパイン３タンパク質の存在を示す。ＲＴ－ｑＰＣＲ解析は、ＷＴマウスと比較して、遺伝子導入の４週間後のヒトカルパイン３遺伝子の相対発現レベルが、正常レベルに戻ることを実証した（図３Ｂを参照）。マウスＧＡＰＤＨを参照遺伝子として使用し、ＷＴＣ５７ＢＬ／６を用いてＲＴ－ｑＰＣＲデータを較正した。

また、筋肉内投与後に定量的な病理組織学的解析を行った。示されるように、処置されたＣＡＰＮ３ＫＯマウスのＴＡ筋線維の直径を、未処置の対照（乳酸リンゲル注射されたＴＡ）筋の直径と比較した。ＡＡＶ．ｈＣＡＰＮ３を注入ＴＡ筋において、遅収縮性酸化（ＳＴＯ、暗）、速収縮性酸化（ＦＴＯ、中間）及び速収縮性解糖（ＦＴＧ、明）線維の平均線維サイズはＷＴ値に対して正規化されたように見えた。線維タイプのサイズの定量化は表４に示されており、治療に伴う増加を示す。

要約すると、ＣＡＰＮ３ＫＯマウス（ｎ＝２）において、ベクター（１Ｅ１１ｖｇ）を前脛骨筋（ＴＡ）にＩＭ注射した後のｉｎｖｉｖｏ生物作用能試験では、遺伝子送達後４週間で、１）ＲＴ－ｑＰＣＲ及びウエスタンブロット解析において、ＣＡＰＮ３転写物の発現及び９４ｋＤａの全長カルパイン３タンパク質の発現が示され、２）組織解析では、ＴＡの筋線維径が対照（Ｒｉｎｇｅｒ）と比較して増加したことが示された。

実施例９
全身注射後のＩｎＶｉｖｏ生物作用能試験
ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３（３Ｅ１２ｖｇ又は６Ｅ１２ｖｇ）をＣＡＰＮ３－ＫＯマウスの尾静脈を介して全身注射した後に、ｉｎｖｉｖｏ生物作用能試験を実施した。低用量ＣＡＰＮ３ＫＯコホート（ｎ＝５；マウスはＺ１８－１３、Ｚ１８－１５、Ｚ１８－１６、Ｚ１８－１７、Ｚ１８－１８と表示した）は、３００μｌの乳酸リンゲル液中３Ｅ１２ｖｇを投与された。遺伝子注射の４週間後、マウスを、ｒｕｎ－ｔｏ－ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎトレッドミル試験によりランニング疲労について評価し、次いで組織採取のために安楽死させた。上肢、下肢の筋肉（ＴＡ、腓腹筋（ＧＡＳ）、四頭筋、三頭筋）、心臓、肝臓、肺、脾臓、肺精巣を摘出し、組織検体をイソペンタンで凍結し、液体窒素に冷却した。

ＲＴ－ｑＰＣＲのＣＡＰＮ３発現をＴＡ筋で評価した。３Ｅ１２ｖｇ低用量では、ＣＡＰＮ３ｍＲＮＡ発現レベルは、高ＣＴ値（＞２７）で観察されたように低かった。ウエスタンブロット解析では、検出不能な対応するタンパク質バンドを示した。この組織では低用量で低発現データが認められたが、３Ｅ１２ｖｇの全身投与では機能的ベネフィットと組織学的ベネフィットの両方が示された。

続いて、高用量（６Ｅ１２ｖｇ）を全身投与し、より高い用量のベクター送達でタンパク質発現を検出できるかどうかを調べた。高用量コホート（マウスはＺ１８－２０、Ｚ１８－２１、Ｚ１８－２３、Ｚ１８－２４と表記される）ＣＡＰＮ３－ＫＯマウスに６Ｅ１２ｖｇＡＡＶｒｈ７．４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクター（尾静脈への全身注射を介して低用量コホートに使用された用量の２倍）を投与し、注射の４週間後に安楽死させた。ＲＴ－ｑＰＣＲでは、四頭筋、三頭筋、ＧＡＳ、ＴＡ及び心筋におけるＣＡＰＮ３発現の可変レベルが示された。

ＣＡＰＮ３ｍＲＮＡの相対的発現を決定するために、筋肉組織試料を、ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクターで治療したＣＡＰＮ３ＫＯマウスから、３Ｅ１２ｖｇ（低用量コホート１）及び６Ｅ１２ｖｇ（高用量コホート２）の用量で採取した。全ＲＮＡを両方のコホートから単離し、マウスＧＡＰＤＨに対するＣＡＰＮ３のｑＰＣＲを、ＩＭ注射（１Ｅ１１ｖｇ；実施例８の上記参照）を介してベクターを投与されたコホートからの以前のサンプルと共にアッセイした。

ＣＡＰＮ３の相対発現は、以下の方法によって決定された：
ＣＴ＝ＣＴ_{ＣＡＰＮ３}－ＣＴ_{ｍＧＡＰＤＨ}
ΔΔＣＴ＝ΔＣＴ－ΔＣＴ_{Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ＊}
ＣＡＰＮ３の相対発現＝２^{－ΔΔＣＴ}
各組織におけるＣＡＰＮ３の相対発現及び元のＣＴ値を以下の表５及び図５に示す。表５は、ＩＭ送達（マウス番号Ｚ１８－１１及びＺ１８－１２）及び全身投与についてのデータを提供する。

全体として、全身送達後のＣＡＰＮ３ＫＯ筋におけるＣＡＰＮ３ｍＲＮＡ発現は、動物及び組織特異的変動性を有し、１Ｅ１１ｖｇでのＩＭ送達と比較して相対的発現が低く（ＩＭ送達の＜１％）、これは３Ｅ１２低用量コホートで特にそうであった。したがって、全長９４ｋＤａタンパク質は、ウエスタンブロットによる検出限界未満であった。しかしながら、高用量コホートにおいて全身用量６Ｅ１２ｖｇの全身注射の後、堅牢な遺伝子発現及び顕著な量の全長カルパイン３タンパク質が示された。

実施例１０
全身ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３遺伝子送達の評価
６Ｅ１２ｖｇでのＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３の全身送達後のＣＡＰＮ３ＫＯマウス組織試料内のベクターゲノムコピーを計算するｑＰＣＲにより遺伝子導入効率を評価した。下肢及び上肢の骨格筋（四頭筋、ＴＡ筋、ｇａｓｔｒｏｃ、三頭筋）、心臓及び肝臓のベクターゲノム負荷を測定した。ゲノムＤＮＡを凍結組織試料から単離した。ｑＰＣＲアッセイは、以下のプライマーセットを用いてＡＢＩ７５００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で実施した。“５’－ＣＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＴＡＡＧ－３’（順方向；配列番号８）；
“５’－ＧＧＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＡＡＴＡＧ－３’（逆方向；配列番号９）。プライマー対は、ｈＣＡＰＮ３ＯＲＦの５’領域から産物を排他的に増幅し、イントロン要素の部分を含む発現ベクターに特有の下流領域を増幅する。最終結果は、ゲノムＤＮＡのマイクログラム当たりのＡＡＶｒｈ７４ベクターの平均コピー数として報告される。

図６に示すように、全身ベクター送達後、肝臓に、最も高いベクターゲノムコピー数が存在した。ベクターゲノム分布は筋群間で変動した。全体的には、他の筋肉と比較して、四頭筋及び心臓組織の方が高値であった。また、実験的変動性も指摘された。マウスＮｏ．Ｚ１８－２１は、その他の３匹のマウスと比較してすべての筋群において比較的低いコピー数を示した。

３Ｅ１２ｖｇ全身処理ＣＡＰＮ３ＫＯマウスでは、機能的特徴及び組織学的特徴の両方の改善が観察されたが、ＲＴ－ｑＰＣＲにより全ＲＮＡ分離株では低レベルの筋カルパイン３発現のみが検出され、特定の筋組織については、全長９４ｋＤａタンパク質はウエスタンブロットでは検出できなかった（図３Ａを参照）。しかしながら、６Ｅ１２ｖｇの全身投与の後、堅牢な遺伝子発現及び顕著な量の全長カルパイン３タンパク質が示された（図３Ｂを参照のこと）。データは、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３粒子の遺伝子導入の４週間後に、カルパイン３遺伝子発現がＷＴマウスと比較して正常レベルに戻ったことを実証している。参照遺伝子及びＷＴＣ５７ＢＬ／６としてマウスＧＡＰＤＨを使用してＲＴ－ｑＰＣＲデータを較正した。

病理組織学的検査
上述のように、注射後４週目に有効性の傾向が認められた。両方のコホート（３Ｅ１２及び６Ｅ１２）において、投与４週間後のＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３の全身送達後、ＣＡＰＮ３ＫＯマウスからのＴＡ筋において線維サイズの有意な増加が観察された。図７に示すように、全線維径は、未治療のＫＯ群と比較して両方の治療コホートで有意に増加した（ｐ＜０．００００１）。治療は線維サイズの正常化をもたらし、治療コホート間で用量に依存した差はなかった（ｐ＝０．７８０５８）。表６は、３Ｅ１２及び６Ｅ１２ｖｇでの全身ＡＡＶ．ｈＣＡＰＮ３遺伝子治療後の野生型及びＣＡＰＮ３
ＫＯマウスにおける筋線維サイズを提供する。

いずれのコホートでも、４週目のＡＡＶｒｈ７．４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクターの全身投与後の心臓毒性の病理組織学的エビデンスはなかった。心臓組織には様々な量のウイルスが認められたが、いずれのコホートでも、ウエスタンブロットにより心臓組織中にタンパク質バンドは検出されなかった。

機能性調査：Ｒｕｎ－ｔｏ－Ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ試験
Ｒｕｎ－ｔｏ－Ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ試験のためのデータ収集前に、マウス１５分間のランニングを１日１回１０ｍ／分で３日間、トレッドミル（ＣｏｌｕｍｂｕｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）に馴化した。使用したプロトコルでは、１５度の傾斜のトレッドミルにマウスを乗せる必要があった。トレッドミルを１ｍ／分の速度でオンにし、マウスが消耗するまで毎分１ｍずつ速度を上げた。マウスが少なくとも１５秒間、安静パッド上に座ったときに、疲労を判定した。時間、速度及び消耗までの距離を記録した。

図８Ａは、３Ｅ１２ｖｇのＡＡＶｒｈ．７．４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３を投与された低用量コホート、及び６Ｅ１２ｖｇのＡＡＶｒｈ．７．４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３を全身投与の４週間後に投与された低用量コホートのＲｕｎ－ｔｏ－Ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ試験のデータを提供する。両コホートの治療を受けたＣＡＰＮ３ＫＯマウスは、未治療のマウスと比較して、Ｒｕｎ－ｔｏ－Ｅｘｈａｓｔｉｏｎ試験でより良く遂行した。低用量コホートと高用量コホートの間では、Ｒｕｎ－ｔｏ－Ｅｘｈａｓｔｉｏｎ試験の性能に明らかな用量に依存した差は認められず、筋線維径に統計学的な差も認められなかった。

高用量コホート２（ｎ＝１６）からのマウスをさらに、ＡＡＶｒｈ７．４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３の６Ｅ１２ｖｇの投与の２０～２４週間後に分析した。図８Ｂに示されるように、治療を受けたＣＡＰＮ３ＫＯマウスは、未治療のマウスと比較して、Ｒｕｎ－ｔｏ－Ｅｘｈａｓｔｉｏｎ試験でより良く遂行し続けた（ｐ＜０．００００１）。

実施例１１
ＡＡＶｒｈ７．４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクターの全身注射後の心臓毒性の評価
コホートのマウスを投与後４週に安楽死させた後、血清及び臓器試料を採取した。低用量コホート１のＣＡＰＮ３ＫＯコホート（ｎ＝５）に、尾静脈注射を介してＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクターの３００μｌの乳酸リンゲル液の３Ｅ１２ｖｇを投与した。高用量コホート２ＣＡＰＮ３－ＫＯマウスに、６Ｅ１２ｖｇのＡＡＶｒｈ７．４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクターを尾静脈を介して投与し、両コホートを注射の４週間後に安楽死させた。心室の心尖部、浅層及び深層部の二つの切片を検査した。組織切片に炎症、壊死又は再生は見つからず、注射の４週間後の二つの異なる用量でのＡＡＶｒｈ７．４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクターの全身送達から、心筋に毒性作用が観察されなかったことを示す。マウス番号Ｚ１８－１９及びＺ１８－２２（乳酸リンゲル液を注射／未処置）は対照ＫＯ動物として用いた。図９は、Ｈ＆Ｅ染色した心臓からの新鮮な凍結切片を提供する。筋線維壊死、再生、炎症は認められなかった。心臓組織に様々な量のウイルスが存在したが、いずれのコホートでもウエスタンブロットによりタンパク質バンドは検出されなかった。図１０は、完全長カルパイン３タンパク質が、形質導入後の心臓組織における検出限界未満であることを示すウエスタンブロット分析を提供する。

実施例１２
ＩｎＶｉｖｏ生理学的分析
生理学的評価は、ＡＡＶｒｈ７．４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクターのＩＭ又は全身投与後に実施される。ｉｎｖｉｖｏ生理学的評価中、マウスは吸入イソフルランで麻酔される。動物が麻酔されると、クリッパーで必要に応じて背部及び後肢の毛が除去される。クリッパーで脱毛が不十分な場合は、脱毛クリームを薄く塗布する。ｉｎｖｉｖｏ生理学的力測定では、坐骨神経に最大上刺激を与えた後に、後肢のトルクを運動性を検出力に接続された非侵襲的力のフットプレート（ＡｕｒｏｒａＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｎａｄａ）で測定した。測定する後肢は、粘着テープでフットプレートに固定する。肢を鈍的クランプで堅く固定する。坐骨神経の脛骨又は腓骨成分の何れかを、神経の近くの皮膚に皮下に挿入される二つの滅菌された使い捨ての２８ゲージ単極電極で刺激する。マウスの体温は、伝導性温度調節加熱パッド（３７℃に設定）又は放射熱源により維持され、赤外線温度プローブにより監視される。

本開示は特定の実施形態を提供するが、当業者に変形及び修正がなされることが理解される。したがって、特許請求の範囲に記載されるような制限のみが、本発明になされるべきである。

本出願に言及されるすべての文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

Claims

配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を製造する方法であって、細胞を請求項１に記載のポリヌクレオチドと接触させる工程を含む、方法。
前記細胞が、哺乳動物細胞、植物細胞、または昆虫細胞である、請求項２に記載の方法。
前記細胞が、ＨｅＬａ細胞、ＰｅｒＣ．６細胞、アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞（２９３細胞）、ヒト胎児線維芽細胞（ＭＲＣ－５細胞またはＷＩ－３８細胞）、サル腎細胞（Ｖｅｒｏ細胞）、アカゲザル胎児肺細胞（ＦＲｈＬ－２細胞）、またはＨＥＫ２９３細胞から選択される、請求項２または３に記載の方法。
前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶｒｈ．７４、およびＡＡＶｒｈ．ｌ０カプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
前記ｒＡＡＶ粒子の精製をさらに含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
請求項６の方法によって調製された精製ｒＡＡＶ粒子。
請求項２～５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ粒子または請求項７に記載の精製ｒＡＡＶ粒子と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む細胞。
前記細胞が、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または細菌細胞である、請求項９に記載の細胞。
前記細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項９または１０に記載の細胞。
対象における肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療するための薬剤の調製のための、請求項８に記載の組成物の治療有効量の使用。
前記薬剤による治療が、
（ａ）筋線維径の増加
（ｂ）小分葉筋線維数の減少、
（ｃ）内核を有する線維数の減少、
（ｄ）筋内膜結合組織含有量の減少、
（ｅ）筋萎縮の矯正、および
（ｆ）筋力生成の増加
のうちの１つ以上をもたらす、請求項１２に記載の使用。
前記薬剤による治療が、
（ａ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％、または４０％の１ｍｍ^２当たりの全筋繊維数の減少、
（ｂ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、または２５％の筋線維径の増加、
（ｃ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４２％の１ｍｍ^２当たりのＳＴＯ筋線維数の減少、
（ｄ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、または２５％のＳＴＯ筋線維径の増加、
（ｅ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、または２０％の１ｍｍ^２当たりのＦＴＯ筋線維数の減少、
（ｆ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、または２０％のＦＴＯ筋線維径の増加、
（ｇ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、または３５％の１ｍｍ^２当たりのＦＴＧ筋線維数の減少、並びに
（ｈ）投与後４週までに、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、または２５％のＦＴＧ筋線維径の増加
のうちの１つ以上をもたらす、請求項１２または１３に記載の使用。
前記薬剤による治療後、前記対象の心筋が、前記ｒＡＡＶ粒子から発現される最小または低カルパイン３タンパク質を示す、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の使用。