JP7740802B2 - 細胞含有液用保存容器及び保存液 - Google Patents

Description

本発明は、細胞含有液を保存するための保存容器に関する。また、本発明は、細胞含有液を保存するために用いられる保存液に関する。

血液、血漿、血清及び尿等の体液には、遊離ＤＮＡ（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ＤＮＡ，ｃｆＤＮＡ）が含まれる。悪性腫瘍を有する人及び感染症に罹患した人などの体液中には、健常者と比べて、ｃｆＤＮＡが高濃度で存在することが知られている（非特許文献１）。

近年、がん及び遺伝子疾患等の領域において、ｃｆＤＮＡを検体とする検査等が行われている。ｃｆＤＮＡを検体とする検査は、患者から病変組織を採取して行う検査と比べて、患者への負担が小さい。

また、母体血中には胎児由来の遊離ＤＮＡ（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ｆｅｔａｌ ＤＮＡ，ｃｆｆＤＮＡ）が含まれる（非特許文献２）。出生前遺伝学的検査では、ｃｆｆＤＮＡを検体とする検査が行われている。

ｃｆＤＮＡを検体とする検査は、ｑＰＣＲ装置や次世代シーケンサー（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ，ＮＧＳ）等の専用の装置を有する専門機関でなければ実施することが困難である。このため、病院等で採取された血液等の細胞含有液は、専門機関に輸送される必要があり、細胞含有液の採取から分析までに、ある程度の日数を要する。この間、上記細胞含有液は、所定の容器で保存されている。

下記の特許文献１，２には、全血中に存在する細胞、特に白血球を安定化させることによって、ｃｆＤＮＡを安定的に回収する方法が記載されている。

また、下記の特許文献３には、血清を含まず、凍結保護物質としてヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロースからなる群より選択された少なくとも一種の水溶性セルロース系凍結保護物質を含有する動物細胞のガラス化凍結保存液が開示されている。特許文献３には、上記ガラス化凍結保存液が、特定の細胞膜透過性凍結保護物質又は特定の細胞膜非透過性凍結保護物質を含むことが好ましいことが記載されている。

ＷＯ２０１３／１２３０３０Ａ１ ＣＮ１０７０８３３８２Ａ 特開２０１１－１１１４０６号公報

Karen-Lise Garm Spindler, Ane L.Appelt, Niels Pallisgaard, et al. Cell-free DNA in healthy individuals, noncancerous disease and strong prognostic value in colorectal cancer. Int. J. Cancer: 135, 2984-2991 (2014) Alberry M, Maddocks D, Jones M, et al. Free fetal DNA in maternal plasma in anembryonic pregnancies: confirmation that the origin is the trophoblast. Prenat Diagn. 2007 May; 27(5): 415-8

血液等の細胞含有液に含まれるｃｆＤＮＡを検体とする検査が行われている。血液等の細胞含有液は、保存液が収容された保存容器に採取された後、ｑＰＣＲ装置や次世代シーケンサーを有する専門機関に輸送される。専門機関までの輸送は、凍結環境下で行われることもあるが、輸送コストを抑える観点及び輸送中のトラブルを抑える観点から、室温の環境下（例えば１５℃～２５℃）で行われることが望ましい。

しかしながら、従来の保存液が収容された保存容器では、細胞含有液が室温環境下で保存された場合に、該細胞含有液に含まれるｃｆＤＮＡの保存安定性が低下しやすい。例えば、従来の保存容器では、室温環境下での保存中に、細胞含有液に含まれるＤＮＡ分解酵素によってｃｆＤＮＡの分解が生じることがある。また、従来の保存容器では、室温環境下での保存中に、細胞含有液に含まれる細胞が破壊されたり、死滅したりして、該細胞中のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）が細胞含有液に漏出することがある。ＥＤＴＡが収容された従来の保存容器では、ＥＤＴＡがＤＮａｓｅの活性化を抑えることによって、ｃｆＤＮＡの分解をある程度抑えることができるものの、細胞の死滅等は抑えることができない。

上記特許文献１に記載の方法では、細胞含有液に含まれるｃｆＤＮＡの保存安定性をある程度高めることができる。しかしながら、本発明者らは、上記特許文献１に記載の方法であっても、ホルムアルデヒドドナー化合物により放出されたホルムアルデヒドによって、核酸同士が架橋したり、核酸とタンパク質とが架橋したりして、ｃｆＤＮＡの断片長が見かけ上、長くなるなど、ｃｆＤＮＡの保存安定性が低下することを見出した。また、出生前遺伝学的検査では、胎児由来のｃｆＤＮＡ（ｃｆｆＤＮＡ）と、母体由来のｃｆＤＮＡとを区別する必要がある。ｃｆｆＤＮＡは、胎盤などの母体組織を通過する際にデグラデーションされることにより、母体由来のｃｆＤＮＡよりも断片長が短くなっている。出生前遺伝学的検査では、ｃｆｆＤＮＡとｃｆＤＮＡとの断片長の違いを利用して、両者を区別しているため、ホルムアルデヒドによってｃｆｆＤＮＡとｃｆＤＮＡとが架橋したりして、ｃｆｆＤＮＡ及びｃｆＤＮＡの断片長が変化した場合には、検査結果に重大な影響を与える。

また、上記特許文献２に記載の方法でも、ｃｆＤＮＡの保存安定性を十分に高めることは困難である。

また、上記特許文献３に記載のような従来のガラス化凍結保存液を用いて、体液等の細胞含有液を保存する場合には、細胞含有液によってガラス化凍結保存液が過度に希釈されるため、ガラス化凍結保存液による効果が十分に発揮されない。そのため、細胞含有液に含まれるｃｆＤＮＡの保存安定性を高めることは困難である。

このように、従来の方法では、細胞含有液が室温環境下で保存された場合に、ｃｆＤＮＡの保存安定性を十分に高めることは困難である。

本発明の目的は、室温環境下で保存した場合でも、細胞含有液に含まれるｃｆＤＮＡの保存安定性を高めることができる細胞含有液用保存容器を提供することである。また、本発明の目的は、室温環境下で保存した場合でも、細胞含有液に含まれるｃｆＤＮＡの保存安定性を高めることができる保存液を提供することである。

本発明の広い局面によれば、所定量の細胞含有液を保存するための容器であって、容器本体と、前記容器本体内に収容された保存液とを備え、前記保存液が、分子量が１００以下であり、０℃で凍結しない細胞膜透過性化合物を含み、かつ、前記所定量の細胞含有液を細胞含有液用保存容器に採取して、該細胞含有液と前記保存液とを混合した混合液Ｘを得たときに、前記混合液Ｘにおいて、前記細胞膜透過性化合物の含有量が、１ｖｏｌ％以上５ｖｏｌ％以下である第１の構成を備えるか、又は、前記保存液が、分子量が３００以上である細胞膜非透過性化合物を含み、かつ、前記所定量の細胞含有液を細胞含有液用保存容器に採取して、該細胞含有液と前記保存液とを混合した混合液Ｘを得たときに、前記混合液Ｘにおいて、前記細胞膜非透過性化合物の含有量が、０．５μｍｏｌ／Ｌ以上５μｍｏｌ／Ｌ以下である第２の構成を備える、細胞含有液用保存容器が提供される。

本発明の細胞含有液用保存容器のある特定の局面では、前記細胞含有液用保存容器は、前記第１の構成を備え、前記細胞膜透過性化合物が、多価アルコールである。

本発明の細胞含有液用保存容器のある特定の局面では、前記細胞含有液用保存容器は、前記第１の構成を備え、前記細胞膜透過性化合物が、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジメチルスルホキシド、アセトアミド、１，３－プロパンジオール、又はブチレングリコールである。

本発明の細胞含有液用保存容器のある特定の局面では、前記細胞含有液用保存容器は、前記第２の構成を備え、前記細胞膜非透過性化合物が、分子量が１０００以上である化合物である。

本発明の細胞含有液用保存容器のある特定の局面では、前記細胞含有液用保存容器は、前記第２の構成を備え、前記細胞膜非透過性化合物が、ポリビニルピロリドン、ポリエチンレングリコール、ポリビニルアルコール、多糖類、多糖類の誘導体、糖アルコール、又はフィコールである。

本発明の細胞含有液用保存容器のある特定の局面では、前記細胞含有液用保存容器は、前記第１の構成を備え、前記保存液が、前記細胞膜透過性化合物及び前記細胞膜非透過性化合物の双方とは異なる化合物として、ホルムアルデヒドドナー化合物を含む。

本発明の細胞含有液用保存容器のある特定の局面では、前記保存液が、前記細胞膜透過性化合物及び前記細胞膜非透過性化合物の双方とは異なる化合物として、ホルムアルデヒドドナー化合物を含み、生理食塩水１Ｌに対して次亜塩素酸ナトリウム７．４ｇが混合された溶液Ｙ’を得て、細胞含有液用保存容器に保存される細胞含有液の所定量と等量の前記溶液Ｙ’を細胞含有液用保存容器に採取して、該溶液Ｙ’と前記保存液とを混合した混合液Ｙを得たときに、前記混合液Ｙにおいて、ホルムアルデヒドの含有量が、１００ｍｇ／Ｌ以上４００ｍｇ／Ｌ以下である。

本発明の細胞含有液用保存容器のある特定の局面では、前記ホルムアルデヒドドナー化合物が、ＤＭＤＭヒダントイン、又は１－ヒドロキシメチル－５，５－ジメチルヒダントインである。

本発明の細胞含有液用保存容器のある特定の局面では、細胞含有液用保存容器に保存される細胞含有液の所定量と等量の生理食塩水を細胞含有液用保存容器に採取して、該生理食塩水と前記保存液とを混合した混合液Ｚを得たときに、前記混合液Ｚの浸透圧が、３００ｍＯｓｍ／Ｌ以上１１００ｍＯｓｍ／Ｌ以下である。

本発明の細胞含有液用保存容器のある特定の局面では、前記保存液が、前記細胞膜透過性化合物及び前記細胞膜非透過性化合物の双方とは異なる化合物として、浸透圧調整剤を含み、前記浸透圧調整剤が、グルコース、又は塩化ナトリウムである。

本発明の細胞含有液用保存容器のある特定の局面では、前記保存液が、前記細胞膜透過性化合物及び前記細胞膜非透過性化合物の双方とは異なる化合物として、キレート作用を有する化合物を含み、前記キレート作用を有する化合物が、ＥＤＴＡを含み、前記混合液Ｘにおいて、前記ＥＤＴＡの含有量が、４ｍｍｏｌ／Ｌ以上７ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。

本発明の細胞含有液用保存容器のある特定の局面では、前記保存液が、前記細胞膜透過性化合物及び前記細胞膜非透過性化合物の双方とは異なる化合物として、緩衝剤を含み、前記緩衝剤が、グリシンを含み、前記混合液Ｘにおいて、前記グリシンの含有量が、０．５ｗ／ｖ％以下である。

本発明の細胞含有液用保存容器のある特定の局面では、前記細胞含有液用保存容器は、前記第１の構成と、前記第２の構成とを備える。

本発明の細胞含有液用保存容器のある特定の局面では、前記細胞含有液が、血液である。

本発明の広い局面によれば、細胞含有液を保存するために用いられる保存液であって、分子量が１００以下であり、０℃で凍結しない細胞膜透過性化合物を含み、かつ、前記細胞膜透過性化合物の含有量が、２ｖｏｌ％以上５０ｖｏｌ％以下である第３の構成を備えるか、又は、分子量が３００以上である細胞膜非透過性化合物を含み、かつ、前記細胞膜非透過性化合物の含有量が、１．０μｍｏｌ／Ｌ以上１００μｍｏｌ／Ｌ以下である第４の構成を備える、保存液が提供される。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記保存液は、前記第３の構成を備え、前記細胞膜透過性化合物が、多価アルコールである。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記保存液は、前記第３の構成を備え、前記細胞膜透過性化合物が、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジメチルスルホキシド、アセトアミド、１，３－プロパンジオール、又はブチレングリコールである。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記保存液は、前記第４の構成を備え、前記細胞膜非透過性化合物が、分子量が１０００以上である化合物である。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記保存液は、前記第４の構成を備え、前記細胞膜非透過性化合物が、ポリビニルピロリドン、ポリエチンレングリコール、ポリビニルアルコール、多糖類、多糖類の誘導体、糖アルコール、又はフィコールである。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記保存液は、前記細胞膜透過性化合物及び前記細胞膜非透過性化合物の双方とは異なる化合物として、ホルムアルデヒドドナー化合物を含む。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記ホルムアルデヒドドナー化合物が、ＤＭＤＭヒダントイン、又は１－ヒドロキシメチル－５，５－ジメチルヒダントインである。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記保存液は、前記細胞膜透過性化合物及び前記細胞膜非透過性化合物の双方とは異なる化合物として、浸透圧調整剤を含み、前記浸透圧調整剤が、グルコース、又は塩化ナトリウムである。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記保存液は、前記細胞膜透過性化合物及び前記細胞膜非透過性化合物の双方とは異なる化合物として、キレート作用を有する化合物を含み、前記キレート作用を有する化合物が、ＥＤＴＡを含む。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記保存液は、前記細胞膜透過性化合物及び前記細胞膜非透過性化合物の双方とは異なる化合物として、緩衝剤を含み、前記緩衝剤が、グリシンを含む。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記保存液は、前記第３の構成と、前記第４の構成とを備える。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記細胞含有液が、血液である。

本発明に係る細胞含有液用保存容器は、所定量の細胞含有液を保存するための容器であって、容器本体と、上記容器本体内に収容された保存液とを備える。本発明に係る細胞含有液用保存容器は、以下の第１の構成又は第２の構成を備える。第１の構成：上記保存液が、分子量が１００以下であり、０℃で凍結しない細胞膜透過性化合物を含み、かつ、上記所定量の細胞含有液を細胞含有液用保存容器に採取して、該細胞含有液と上記保存液とを混合した混合液Ｘを得たときに、上記混合液Ｘにおいて、上記細胞膜透過性化合物の含有量が、１ｖｏｌ％以上５ｖｏｌ％以下である。第２の構成：上記保存液が、分子量が３００以上である細胞膜非透過性化合物を含み、かつ、上記所定量の細胞含有液を細胞含有液用保存容器に採取して、該細胞含有液と上記保存液とを混合した混合液Ｘを得たときに、上記混合液Ｘにおいて、上記細胞膜非透過性化合物の含有量が、０．５μｍｏｌ／Ｌ以上５μｍｏｌ／Ｌ以下である。本発明に係る細胞含有液用保存容器では、上記の構成が備えられているので、室温環境下で保存した場合でも、細胞含有液に含まれるｃｆＤＮＡの保存安定性を高めることができる。

本発明に係る保存液は、細胞含有液を保存するために用いられる保存液である。本発明に係る保存液は、以下の第３の構成又は第４の構成を備える。第３の構成：分子量が１００以下であり、０℃で凍結しない細胞膜透過性化合物を含み、かつ、上記細胞膜透過性化合物の含有量が、２ｖｏｌ％以上５０ｖｏｌ％以下である。第４の構成：分子量が３００以上である細胞膜非透過性化合物を含み、かつ、上記細胞膜非透過性化合物の含有量が、１．０μｍｏｌ／Ｌ以上１００μｍｏｌ／Ｌ以下である。本発明に係る保存液では、上記の構成が備えられているので、室温環境下で保存した場合でも、細胞含有液に含まれるｃｆＤＮＡの保存安定性を高めることができる。

図１（ａ）～（ｃ）は、実施例１におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。 図２（ａ），（ｂ）は、実施例２におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。 図３（ａ）～（ｃ）は、比較例１におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果であり、図３（ｄ）は、比較例４におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。 図４（ａ），（ｂ）は、比較例２におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である 図５（ａ）～（ｃ）は、比較例３におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。 図６（ａ）～（ｃ）は、実施例３～５におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。 図７（ａ）～（ｃ）は、実施例６～８におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。 図８（ａ）～（ｄ）は、実施例９～１２におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。 図９（ａ），（ｂ）は、実施例１３におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。 図１０（ａ），（ｂ）は、実施例１４におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。 図１１（ａ），（ｂ）は、実施例１５におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明に係る細胞含有液用保存容器（以下、「保存容器」と略記することがある）は、所定量の細胞含有液を保存するための容器であって、容器本体と、上記容器本体内に収容された保存液とを備える。本発明に係る細胞含有液用保存容器は、以下の第１の構成又は第２の構成を備える。

第１の構成：上記保存液が、分子量が１００以下であり、０℃で凍結しない細胞膜透過性化合物を含み、かつ、上記所定量の細胞含有液を細胞含有液用保存容器に採取して、該細胞含有液と上記保存液とを混合した混合液Ｘを得たときに、上記混合液Ｘにおいて、上記細胞膜透過性化合物の含有量が、１ｖｏｌ％以上５ｖｏｌ％以下である。

第２の構成：上記保存液が、分子量が３００以上である細胞膜非透過性化合物を含み、かつ、上記所定量の細胞含有液を細胞含有液用保存容器に採取して、該細胞含有液と上記保存液とを混合した混合液Ｘを得たときに、上記混合液Ｘにおいて、上記細胞膜非透過性化合物の含有量が、０．５μｍｏｌ／Ｌ以上５μｍｏｌ／Ｌ以下である。

本発明に係る保存液は、細胞含有液を保存するために用いられる保存液である。本発明に係る保存液は、以下の第３の構成又は第４の構成を備える。

第３の構成：分子量が１００以下であり、０℃で凍結しない細胞膜透過性化合物を含み、かつ、上記細胞膜透過性化合物の含有量が、２ｖｏｌ％以上５０ｖｏｌ％以下である。

第４の構成：分子量が３００以上である細胞膜非透過性化合物を含み、かつ、上記細胞膜非透過性化合物の含有量が、１．０μｍｏｌ／Ｌ以上１００μｍｏｌ／Ｌ以下である。

本発明に係る保存容器及び保存液では、上記細胞含有液と上記保存液とが混合された状態で、該細胞含有液が保存される。本発明に係る保存容器及び保存液では、上記の構成が備えられているので、室温環境下で保存した場合でも、細胞含有液に含まれるｃｆＤＮＡの保存安定性を高めることができる。本発明に係る保存容器及び保存液では、例えば、１５℃以上２５℃以下の環境下で保存した場合でも、細胞含有液に含まれるｃｆＤＮＡの保存安定性を高めることができる。本発明では、室温環境下での保存中に、上記細胞含有液に含まれる細胞が破壊されたり、死滅したりして、該細胞中のｇＤＮＡが細胞含有液に混入することを効果的に抑えることができる。このため、本発明では、ｃｆＤＮＡの保存安定性を高めることができる。本発明では、例えば、細胞含有液に含まれるｃｆＤＮＡを２５℃で１日間以上（例えば７日間）安定的に保存することができる。

上記細胞含有液は、細胞を含む液である。上記細胞含有液としては、体液等が挙げられ、具体的には、血液、尿及び髄液等が挙げられる。血液には、細胞として白血球等が含まれる。

本発明の効果がより一層効果的に発揮されることから、上記細胞含有液は、血液であることが好ましい。

本発明に係る保存容器は、上記第１の構成を備えていてもよく、上記第２の構成を備えていてもよく、上記第１の構成と上記第２の構成との双方を備えていてもよい。本発明に係る保存容器は、上記第１の構成及び上記第２の構成の内のいずれか一方のみを備えていてもよく、双方を備えていてもよい。本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点からは、本発明に係る保存容器は、上記第１の構成と上記第２の構成とを備えることが好ましい。

本発明に係る保存液は、上記第３の構成を備えていてもよく、上記第４の構成を備えていてもよく、上記第３の構成と上記第４の構成との双方を備えていてもよい。本発明に係る保存液は、上記第３の構成及び上記第４の構成の内のいずれか一方のみを備えていてもよく、双方を備えていてもよい。本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点からは、本発明に係る保存液は、上記第３の構成と上記第４の構成とを備えることが好ましい。

（保存液）
上記保存液は、２５℃で液状である。

上記保存液は、分子量が１００以下であり、０℃で凍結しない細胞膜透過性化合物を含むか、又は、分子量が３００以上である細胞膜非透過性化合物を含む。上記保存液は、上記細胞膜透過性化合物を含んでいてもよく、上記細胞膜非透過性化合物を含んでいてもよく、上記細胞膜透過性化合物と、上記細胞膜非透過性化合物との双方を含んでいてもよい。

ある化合物が、細胞膜透過性化合物であるか、又は、細胞膜非透過性化合物であるかは、通常、その化合物の分子量、電荷、極性等によって決まる。電荷を有しない化合物は、受動的な拡散により、細胞膜を透過可能であるため、通常、細胞膜透過性化合物に分類される。また、例えば、電荷を有する化合物は、受動的な拡散により、細胞膜を透過できないため、通常、細胞膜非透過性化合物に分類される。

＜細胞膜透過性化合物＞
上記保存液は、分子量が１００以下であり、０℃で凍結しない細胞膜透過性化合物を含むことが好ましい。上記細胞膜透過性化合物は、細胞膜を透過可能な化合物である。上記保存容器が上記第１の構成を備える場合には、上記保存液は上記細胞膜透過性化合物を含む。上記保存液が上記第３の構成を備える場合には、該保存液は上記細胞膜透過性化合物を含む。上記細胞膜透過性化合物を用いることにより、細胞内を良好に脱水することができ、また、細胞内に上記細胞膜透過性化合物を良好に保持させることができる。そのため、保存中に、細胞が破壊されたり、死滅したりして、該細胞中のｇＤＮＡが細胞含有液に混入することを効果的に抑えることができる。上記細胞膜透過性化合物は、細胞の凍結保護剤としても知られている。上記細胞膜透過性化合物は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されていてもよい。

上記細胞膜透過性化合物としては、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジメチルスルホキシド、アセトアミド、１，３－プロパンジオール、及びブチレングリコール等が挙げられる。

上記細胞膜透過性化合物は、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジメチルスルホキシド、アセトアミド、１，３－プロパンジオール、又はブチレングリコールであることが好ましく、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、又はジメチルスルホキシドであることがより好ましい。また、上記細胞膜透過性化合物は、多価アルコールであることが好ましい。この場合には、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。

上記保存液中の上記細胞膜透過性化合物の含有量は、上記混合液Ｘにおいて、細胞膜透過性化合物の含有量が１ｖｏｌ％以上５ｖｏｌ％以下となる含有量である限り特に限定されない。上記保存液中の上記細胞膜透過性化合物の含有量は、上記細胞含有液と上記保存液との混合比等に応じて適宜変更することができる。

上記保存液中の上記細胞膜透過性化合物の含有量は、好ましくは２ｖｏｌ％以上、より好ましくは１０ｖｏｌ％以上、更に好ましくは２０ｖｏｌ％以上、好ましくは５０ｖｏｌ％以下、より好ましくは４０ｖｏｌ％以下、更に好ましくは３０ｖｏｌ％以下である。上記細胞膜透過性化合物の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、細胞含有液と保存液との混合液（混合液Ｘ）中の細胞膜透過性化合物の含有量を上記の範囲に調整しやすくなり、その結果、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。

＜細胞膜非透過性化合物＞
上記保存液は、分子量が３００以上である細胞膜非透過性化合物を含むことが好ましい。上記保存容器が上記第２の構成を備える場合には、上記保存液は上記細胞膜非透過性化合物を含む。上記保存液が上記第４の構成を備える場合には、該保存液は上記細胞膜非透過性化合物を含む。上記細胞膜非透過性化合物を用いることにより、細胞の凝集を効果的に抑えることができ、また、細胞膜の保護効果を高めることができる。そのため、保存中に、細胞が破壊されたり、死滅したりして、該細胞中のｇＤＮＡが細胞含有液に混入することを効果的に抑えることができる。上記細胞膜非透過性化合物は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されていてもよい。

上記細胞膜非透過性化合物としては、ポリビニルピロリドン、ポリエチンレングリコール、ポリビニルアルコール、多糖類、多糖類の誘導体、糖アルコール、及びフィコール等が挙げられる。上記多糖類としては、セルロース、スクロース、及びデキストラン等が挙げられる。上記多糖類の誘導体としては、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。

本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点からは、上記細胞膜非透過性化合物は、ポリビニルピロリドン、ポリエチンレングリコール、ポリビニルアルコール、多糖類、多糖類の誘導体、糖アルコール、又はフィコールであることが好ましい。本発明の効果を更に一層効果的に発揮する観点からは、上記細胞膜非透過性化合物は、ポリビニルピロリドン、ポリエチンレングリコール、ポリビニルアルコール、デキストラン、又はヒドロキシプロピルセルロースであることがより好ましく、ポリビニルピロリドン、ポリエチンレングリコール、又はポリビニルアルコールであることが更に好ましい。

本発明の効果を発揮する観点から、上記細胞膜非透過性化合物の分子量は３００以上である。上記細胞膜非透過性化合物の分子量は、該細胞膜非透過性化合物の構造式が特定できる場合には、当該構造式から算出できる分子量を意味し、構造式が特定できない場合には、重量平均分子量を意味する。

上記細胞膜非透過性化合物の分子量（重量平均分子量）は、好ましくは１０００以上、より好ましくは１万以上、更に好ましくは１０万以上、好ましくは４００万以下、より好ましくは１００万以下である。上記細胞膜非透過性化合物の分子量（重量平均分子量）が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。

上記重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定されたポリスチレン換算での重量平均分子量を意味する。

上記保存液中の上記細胞膜非透過性化合物の含有量は、上記混合液Ｘにおいて、細胞膜非透過性化合物の含有量が０．５μｍｏｌ／Ｌ以上５μｍｏｌ／Ｌ以下となる限り特に限定されない。上記保存液中の上記細胞膜非透過性化合物の含有量は、上記細胞含有液と上記保存液との混合比等に応じて適宜変更することができる。

上記保存液中の上記細胞膜非透過性化合物の含有量は、好ましくは１．０μｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは５μｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは１００μｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは５０μｍｏｌ／Ｌ以下である。上記細胞膜非透過性化合物の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、細胞含有液と保存液との混合液（混合液Ｘ）中の細胞膜非透過性化合物の含有量を上記の範囲に調整しやすくなり、その結果、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。

＜ホルムアルデヒドドナー化合物＞
上記保存液は、上記細胞膜透過性化合物及び上記細胞膜非透過性化合物の双方とは異なる化合物として、ホルムアルデヒドドナー化合物を含むことが好ましい。上記ホルムアルデヒドドナー化合物は、ホルムアルデヒドを遊離可能な化合物である。上記ホルムアルデヒドドナー化合物を用いることにより、細胞含有液と保存液とを混合したときに、ホルムアルデヒドドナー化合物から遊離したホルムアルデヒドの作用により、細胞の膜タンパク質を架橋し、細胞の安定性を高めることができる。ホルムアルデヒドドナー化合物を含む従来の保存液では、室温環境下での保存中に、細胞含有液に含まれるｃｆＤＮＡの断片長変化が生じやすい。これに対して、本発明では、保存液がホルムアルデヒドドナー化合物を含む場合でも、ｃｆＤＮＡの断片長変化を生じにくくすることができる。上記ホルムアルデヒドドナー化合物は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されていてもよい。

上記ホルムアルデヒドドナー化合物としては、ヒダントイン化合物、イミダゾリジニルウレア、ジアゾリジニルウレア、ヘキサメチレンテトラミン、Ｎ，Ｎ’’－メチレンビス－［Ｎ’－（３－ヒドロキシメチル－２，５－ジアオキソ－４－イミダゾリジニル）ウレア］、３級アミン化合物、２級アミン化合物、及び１級アミン化合物等が挙げられる。

上記ヒダントイン化合物としては、ＤＭＤＭヒダントイン、１－ヒドロキシメチル－５，５－ジメチルヒダントイン、１，３－ジメチロール－５，５－ヒダントイン、及び１，３－ジクロロ－５，５－ジメチルヒダントイン等が挙げられる。

本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点からは、上記ホルムアルデヒドドナー化合物は、ヒダントイン化合物であることが好ましく、ＤＭＤＭヒダントイン、又は１－ヒドロキシメチル－５，５－ジメチルヒダントインであることがより好ましい。

上記保存液中の上記ホルムアルデヒドドナー化合物の含有量は、特に限定されない。上記保存液中の上記ホルムアルデヒドドナー化合物の含有量は、例えば、後述の混合液Ｙにおいて、ホルムアルデヒドの含有量が後述の範囲を満足するように適宜変更することができる。上記保存液中の上記ホルムアルデヒドドナー化合物の含有量は、上記細胞含有液と上記保存液との混合比、及びホルムアルデヒドドナー化合物の種類等に応じて適宜変更することができる。

＜浸透圧調整剤＞
上記保存液は、上記細胞膜透過性化合物及び上記細胞膜非透過性化合物の双方とは異なる化合物として、浸透圧調整剤を含むことが好ましい。上記浸透圧調整剤を用いることにより、上記混合液の浸透圧を効果的に高くすることができる。上記浸透圧調整剤は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されていてもよい。

上記浸透圧調整剤としては、塩化ナトリウム及び塩化カリウム等の無機イオン類、グルコース及びスクロース等の糖類等が挙げられる。

本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点からは、上記浸透圧調整剤は、グルコース、スクロース、又は塩化ナトリウムであることが好ましく、グルコース、又は塩化ナトリウムであることがより好ましい。

上記保存液中の上記浸透圧調整剤の含有量は、特に限定されない。上記保存液中の上記浸透圧調整剤の含有量は、例えば、後述の混合液Ｚの浸透圧が後述の範囲を満足するように適宜変更することができる。

＜緩衝剤＞
上記保存液は、上記細胞膜透過性化合物及び上記細胞膜非透過性化合物の双方とは異なる化合物として、緩衝剤を含むことが好ましい。上記緩衝剤は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されていてもよい。

上記緩衝剤としては、グリシン、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム及びリン酸二水素カリウム等のリン酸塩、炭酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウム等の炭酸塩、ホウ酸ナトリウム等のホウ酸塩、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アニリン、アニリン誘導体、アミノ酸、アミン化合物、イミダゾール化合物、アルコール化合物、エチレンジアミン四酢酸、ピロリン酸、ピリジン、カコジル酸、グリセロールリン酸、２，４，６－コリジン、Ｎ－エチルモルホリン、モルホリン、４－アミノピリジン、アンモニア、エフェドリン、ヒドロキシプロリン、ピペリジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等が挙げられる。

緩衝作用を効果的に発揮する観点からは、上記緩衝剤は、グリシンを含むことが好ましく、グリシンであることが好ましい。

上記保存液中の上記緩衝剤の含有量は、緩衝作用を発揮できる含有量であれば特に限定されない。上記保存液中の上記緩衝剤の含有量は、上記細胞含有液と上記保存液との混合比等に応じて適宜変更することができる。

＜キレート作用を有する化合物＞
上記保存液は、上記細胞膜透過性化合物及び上記細胞膜非透過性化合物の双方とは異なる化合物として、キレート作用を有する化合物を含むことが好ましい。ＤＮａｓｅはマグネシウムイオンによって活性化するため、キレート作用を有する化合物を用いることにより、細胞含有液中でのｃｆＤＮＡの分解を効果的に抑えることができる。上記細胞含有液が血液である場合、上記保存液は、上記キレート作用を有する化合物として、抗凝固剤を含むことが好ましい。この場合には、ｃｆＤＮＡの分解を効果的に抑えることに加えて、保存中の血液の凝固を効果的に抑えることができる。上記キレート作用を有する化合物は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されていてもよい。

上記抗凝固剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、及びグリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）等が挙げられる。

ｃｆＤＮＡの分解をより一層効果的に抑える観点及び上記細胞含有液が血液である場合に、保存中の血液の凝固をより一層効果的に抑える観点からは、上記抗凝固剤は、ＥＤＴＡを含むことが好ましく、ＥＤＴＡであることが好ましい。

上記保存液中の上記キレート作用を有する化合物の含有量は、上記細胞含有液と上記保存液との混合比、及びキレート作用を有する化合物の種類等に応じて適宜変更することができる。

＜他の成分＞
上記保存液は、上記細胞膜透過性化合物、上記細胞膜非透過性化合物、上記ホルムアルデヒドドナー化合物、上記浸透圧調整剤、上記緩衝剤及び上記キレート作用を有する化合物以外の他の成分を含んでいてもよい。上記他の成分としては、水、ｐＨ調整剤等が挙げられる。

上記保存液は、水を含むことが好ましい。上記保存液１００重量％中、水の含有量は、好ましくは３０重量％以上、より好ましくは４０重量％以上、好ましくは６０重量％以下、より好ましくは５０重量％以下である。

上記保存液の浸透圧は、好ましくは３００ｍＯｓｍ／Ｌ以上、より好ましくは６００ｍＯｓｍ／Ｌ以上、好ましくは４０００ｍＯｓｍ／Ｌ以下、より好ましくは３０００ｍＯｓｍ／Ｌ以下である。上記保存液の浸透圧が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。

上記保存液の浸透圧は、浸透圧計（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製「オズモメーター３２５０」）を用いて測定することができる。

上記保存液のｐＨは、好ましくは６．０以上、より好ましくは７．０以上、好ましくは８．０以下、より好ましくは７．５以下である。上記ｐＨが上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。

（細胞含有液用保存容器）
本発明に係る保存容器は、所定量の細胞含有液を保存するための容器である。本発明に係る保存容器が上記第１の構成を備える場合には、上記所定量の細胞含有液を保存容器に採取して、該細胞含有液と上記保存液とを混合した混合液Ｘを得たときに、該混合液Ｘにおいて、上記細胞膜透過性化合物の含有量が特定の範囲である。

本発明に係る保存容器が上記第２の構成を備える場合には、上記所定量の細胞含有液を保存容器に採取して、該細胞含有液と上記保存液とを混合した混合液Ｘを得たときに、該混合液Ｘにおいて、上記細胞膜非透過性化合物の含有量が特定の範囲である。

本発明に係る保存容器では、上記所定量の細胞含有液と、保存容器に収容された上記保存液とが混合されて、上記混合液Ｘが得られる。

上記混合液Ｘは、具体的には、以下のようにして調製される。

上記保存容器に採取される所定量の細胞含有液を、該保存容器に採取する。例えば、５ｍＬの血液が採取される保存容器では、５ｍＬの血液を該保存容器に採取する。採取した上記所定量の細胞含有液と、上記保存液とを転倒混和により混合して、混合液Ｘを得る。

上記第１の構成を備える保存容器では、上記混合液Ｘにおいて、上記細胞膜透過性化合物の含有量が、１ｖｏｌ％以上５ｖｏｌ％以下である。すなわち、上記第１の構成を備える保存容器では、上記混合液１００体積％中、上記細胞膜透過性化合物の含有量が、１体積％以上５体積％以下である。上記第１の構成を備える保存容器では、上記混合液Ｘにおける上記細胞膜透過性化合物の含有量が上記の範囲内であるので、細胞内の水分を良好に脱水することができ、また、細胞内に上記細胞膜透過性化合物を良好に保持させることができる。そのため、保存中に、細胞が破壊されたり、死滅したりして、該細胞中のｇＤＮＡが細胞含有液に混入することを効果的に抑えることができる。

上記混合液Ｘにおいて、上記細胞膜透過性化合物の含有量は、好ましくは２ｖｏｌ％以上、好ましくは４ｖｏｌ％以下である。上記細胞膜透過性化合物の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、細胞内をより一層良好に脱水することができ、また、細胞内に上記細胞膜透過性化合物をより一層良好に保持させることができる。そのため、保存中に、細胞が破壊されたり、死滅したりして、該細胞中のｇＤＮＡが細胞含有液に混入することをより一層効果的に抑えることができる。

上記第２の構成を備える保存容器では、上記混合液Ｘにおいて、上記細胞膜非透過性化合物の含有量が、０．５μｍｏｌ／Ｌ以上５μｍｏｌ／Ｌ以下である。上記第２の構成を備える保存容器では、上記混合液Ｘにおける上記細胞膜非透過性化合物の含有量が上記の範囲内であるので、細胞の凝集を効果的に抑えることができ、また、細胞膜の保護効果を高めることができる。そのため、保存中に、細胞が破壊されたり、死滅したりして、該細胞中のｇＤＮＡが細胞含有液に混入することを効果的に抑えることができる。

上記混合液Ｘにおいて、上記細胞膜非透過性化合物の含有量は、好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは４μｍｏｌ／Ｌ以下である。上記細胞膜非透過性化合物の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、細胞の凝集をより一層効果的に抑えることができ、また、細胞膜の保護効果をより一層高めることができる。そのため、保存中に、細胞が破壊されたり、死滅したりして、該細胞中のｇＤＮＡが細胞含有液に混入することをより一層効果的に抑えることができる。

上記保存液がＥＤＴＡ等のキレート作用を有する化合物を含む場合に、上記混合液Ｘにおいて、キレート作用を有する化合物又はＥＤＴＡの含有量は、好ましくは４ｍｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは４．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは７ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは６．５ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。上記キレート作用を有する化合物又は上記ＥＤＴＡの含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、ｃｆＤＮＡの分解をより一層効果的に抑えることができる。また、上記ＥＤＴＡの含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、上記細胞含有液が血液である場合に、血液の保存中の凝固をより一層効果的に抑えることができる。

上記保存液がグリシン等の緩衝剤を含む場合に、上記混合液Ｘにおいて、緩衝剤又はグリシンの含有量は、好ましくは０．１ｗ／ｖ％以上、より好ましくは０．２ｗ／ｖ％以上、好ましくは０．５ｗ／ｖ％以下、より好ましくは０．４ｗ／ｖ％以下である。上記緩衝剤又は上記グリシンの含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、緩衝作用を効果的に発揮することができる。

本発明に係る保存容器において、上記保存液がホルムアルデヒドドナー化合物を含む場合には、以下の混合液Ｙ中のホルムアルデヒドの含有量が特定の範囲を満足することが好ましい。

生理食塩水１Ｌに対して次亜塩素酸ナトリウム７．４ｇが混合された溶液Ｙ’を得て、保存容器に保存される細胞含有液の所定量と等量の上記溶液Ｙ’を保存容器に採取して、該溶液Ｙ’と上記保存液とを混合した混合液Ｙを得る。本発明に係る保存容器では、上記所定量の溶液Ｙ’と、保存容器に収容された上記保存液とが混合されて、上記混合液Ｙが得られる。なお、上記溶液Ｙ’は、細胞含有液を模擬した溶液である。

上記混合液Ｙは、具体的には、以下のようにして調製される。

上記保存容器に採取される細胞含有液の所定量と等量の上記溶液Ｙ’を、該保存容器に採取する。例えば、５ｍＬの血液が採取される保存容器では、５ｍＬの溶液Ｙ’を該保存容器に採取する。採取した上記所定量の溶液Ｙ’と、上記保存液とを転倒混和により混合して、混合液Ｙを得る。

上記保存液がホルムアルデヒドドナー化合物を含む場合に、本発明に係る保存容器では、上記混合液Ｙにおいて、ホルムアルデヒドの含有量が、好ましくは１００ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは１１０ｍｇ／Ｌ以上である。上記保存液がホルムアルデヒドドナー化合物を含む場合に、本発明に係る保存容器では、上記混合液Ｙにおいて、好ましくは４００ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは３００ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは２００ｍｇ／Ｌ以下、特に好ましくは１９０ｍｇ／Ｌ以下である。上記混合液Ｙは、上記ホルムアルデヒドドナー化合物から上記ホルムアルデヒドが遊離することにより、ホルムアルデヒドを含む。上記混合液Ｙにおける上記ホルムアルデヒドの含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、細胞含有液と保存液との混合液中でのホルムアルデヒドの濃度を適切に制御することができる。そのため、細胞の安定性を高めることができ、かつ、ｃｆＤＮＡの分解を抑えることができる。なお、上記混合液Ｙ中のホルムアルデヒドの含有量が４００ｍｇ／Ｌを超えると、４００ｍｇ／Ｌ以下である場合と比べて、ｃｆＤＮＡ同士又はｃｆＤＮＡと膜タンパク質とが架橋されやすく、ｃｆＤＮＡの保存安定性が低下することがある。

上記混合液Ｙ中の上記ホルムアルデヒドの含有量は、ＭＢＴＨ比色法によって求められる。

本発明に係る保存容器では、保存容器に保存される細胞含有液の所定量と等量の生理食塩水を保存容器に採取して、該生理食塩水と上記保存液とを混合した混合液Ｚを得る。上記混合液Ｚの浸透圧は、好ましくは３００ｍＯｓｍ／Ｌ以上、より好ましくは３５０ｍＯｓｍ／Ｌ以上、好ましくは１１００ｍＯｓｍ／Ｌ以下、より好ましくは１０００ｍＯｓｍ／Ｌ以下である。上記混合液Ｚの浸透圧が上記下限以上及び上記上限以下であると、細胞含有液と保存液との混合液中での浸透圧を良好にすることができる。そのため、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。

上記混合液Ｚは、具体的には、以下のようにして調製される。

上記保存容器に採取される細胞含有液の所定量と等量の上記生理食塩水を、該保存容器に採取する。例えば、５ｍＬの血液が採取される保存容器では、５ｍＬの生理食塩水を該保存容器に採取する。採取した上記所定量の生理食塩水と、上記保存液とを転倒混和により混合して、混合液Ｚを得る。

上記混合液Ｚの浸透圧は、浸透圧計（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製「オズモメーター３２５０」）を用いて測定することができる。

（容器本体）
上記容器本体の形状としては、特に限定されない。上記容器本体の形状は、有底の容器であることが好ましく、有底の管状容器であることがより好ましい。

上記容器本体の素材は特に限定されない。上記容器本体の素材としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル等の熱可塑性樹脂；不飽和ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、エポキシ－アクリレート樹脂等の熱硬化性樹脂；酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、エチルセルロース、エチルキチン等の変性天然樹脂；ソーダ石灰ガラス、リンケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス等のケイ酸塩ガラス、石英ガラス等のガラスが挙げられる。上記容器本体の素材は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。

（栓体）
上記保存容器は、栓体を備えることが好ましい。上記栓体として、従来公知の栓体を用いることができる。上記栓体は、容器本体の開口に、気密的かつ液密的に取付けることが可能な素材、形状からなる栓体であることが好ましい。上記細胞含有液が血液である場合には、上記栓体は、採血針が刺通され得るように構成されていることが好ましい。

上記栓体としては、容器本体の開口に嵌合する形状を有する栓体、シート状のシール栓体等が挙げられる。

また、上記栓体は、ゴム栓等の栓本体と、プラスチック等で構成されたキャップ部材とを備える栓体であってもよい。この場合には、血液の採取後に、容器本体の開口から栓体を引き抜く際に、血液が人体と接触するリスクを抑えることができる。

上記栓体（又は上記栓本体）の材料としては、例えば、合成樹脂、エラストマー、ゴム、金属箔等が挙げられる。上記ゴムとしては、ブチルゴム、及びハロゲン化ブチルゴム等が挙げられる。上記金属箔としては、アルミニウム箔等が挙げられる。密封性を高める観点からは、上記栓体の材料は、ブチルゴムであることが好ましい。上記栓体は、ブチルゴム栓であることが好ましい。

（保存容器及び保存液の他の詳細）
上記保存容器は、所定量の細胞含有液を保存するための容器である。上記保存容器は、所定量の細胞含有液を採取及び保存するための容器である。上記保存容器は、上記細胞含有液と上記保存液とが混合した状態で保存するための容器である。上記細胞含有液の上記所定量は、該保存容器のサイズ等により適宜変更される。上記細胞含有液の上記所定量としては、例えば、１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、又は２０ｍＬである。

上記保存容器は、上記細胞含有液を液状で保存するための容器であることが好ましく、上記細胞含有液を凍結せずに保存するための容器であることが好ましい。上記保存容器は、上記細胞含有液を、０℃以上で保存するための容器であることが好ましく、１℃以上で保存するための容器であることがより好ましく、１５℃以上で保存するための容器であることが更に好ましく、１８℃以上で保存するための容器であることが特に好ましい。上記保存容器は、上記細胞含有液を、１００℃以下で保存するための容器であることが好ましく、５０℃以下で保存するための容器であることがより好ましく、２５℃以下で保存するための容器であることが更に好ましく、２４℃以下で保存するための容器であることが特に好ましい。

上記保存液は、上記細胞含有液を、０℃以上で保存するために用いられることが好ましく、１℃以上で保存するために用いられることがより好ましく、１５℃以上で保存するために用いられることが更に好ましく、１８℃以上で保存するために用いられることが特に好ましい。上記保存液は、上記細胞含有液を、１００℃以下で保存するために用いられることが好ましく、５０℃以下で保存するために用いられることがより好ましく、２５℃以下で保存するために用いられることが更に好ましく、２４℃以下で保存するために用いられることが特に好ましい。

保存される細胞含有液１ｍＬに対して、上記容器本体内に収容される保存液の含有量は、好ましくは０．０５ｍＬ以上、より好ましくは０．１ｍＬ以上、好ましくは１ｍＬ以下、より好ましくは０．５ｍＬ以下である。上記保存液の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、細胞含有液が過度に希釈されることなく、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。

上記保存液は、保存される細胞含有液１ｍＬに対して、０．０５ｍＬ以上で混合して用いられることが好ましく、０．１ｍＬ以上で混合して用いられることがより好ましく、１ｍＬ以下で混合して用いられることが好ましく、０．５ｍＬ以下で混合して用いられることがより好ましい。この場合には、細胞含有液が過度に希釈されることなく、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。

上記保存容器の内圧は特に限定されない。上記保存容器は、内部が排気された上で、上記密閉部材によって密閉された真空採血管として用いることもできる。真空採血管である場合、採血者の技術差によらず一定量の血液採取を簡便に行うことができる。

細菌感染を防止する観点から、保存容器の内部はＩＳＯ、及びＪＩＳの基準に則って滅菌されていることが好ましい。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。本発明は以下の実施例のみに限定されない。なお、以下の実施例３～１５は参考例である。

保存液の材料として、以下を用意した。

（細胞膜透過性化合物）
プロピレングリコール
グリセリン
ジメチルスルホキシド

（細胞膜非透過性化合物）
ポリエチンレングリコール（重量平均分子量５０万）
ポリビニルピロリドン（重量平均分子量３万）
デキストラン（重量平均分子量２０万）

（ホルムアルデヒドドナー化合物）
１－ヒドロキシメチル－５，５－ジメチルヒダントイン

（浸透圧調整剤）
グルコース

（抗凝固剤）
ＥＤＴＡ・２Ｎａ

（緩衝剤）
グリシン

（その他）
水

（実施例１～１５）
保存液の作製：
表１～４に示す配合成分を表１～４に示す配合量で配合し、保存液を得た。

保存容器の作製：
容器本体として、長さ１００ｍｍ、開口部の内径１４ｍｍのポリエチレンテレフタレート有底管（ＰＥＴ有底管）を用意した。ＰＥＴ有底管に、得られた保存液０．５ｍＬを収容した。保存容器内部を５０ｋＰａに減圧し、ブチルゴム栓により密封した。このようにして血液５ｍＬを保存するための保存容器を作製した。

（比較例１，４）
ＥＤＴＡが収容された真空採血管（積水メディカル社製「インセパックＩＩ－Ｄ」）を保存容器として用いた。この真空採血管には、細胞膜透過性化合物、細胞膜非透過性化合物及びホルムアルデヒドドナー化合物は収容されていない。

（比較例２，３）
配合成分の種類及び含有量を表１に示すように変更したこと以外は実施例１と同様にして、保存液及び保存容器を得た。

（評価）
（１）混合液Ｘ中の細胞膜透過性化合物、細胞膜非透過性化合物、ホルムアルデヒドドナー化合物、浸透圧調整剤、抗凝固剤及び緩衝剤の含有量
実施例１～１５及び比較例２，３で得られた保存容器に、血液５ｍＬを添加し、血液と保存液とを転倒混和により混合して混合液Ｘを得た。得られた混合液Ｘに含まれる細胞膜透過性化合物、細胞膜非透過性化合物、ホルムアルデヒドドナー化合物、浸透圧調整剤、抗凝固剤及び緩衝剤の含有量を求めた。

（２）混合液Ｙ中のホルムアルデヒドの含有量
生理食塩水１Ｌに対して次亜塩素酸ナトリウム７．４ｇが混合された溶液Ｙ’を作製した。実施例１，２及び比較例２，３で得られた保存容器に、５ｍＬの溶液Ｙ’を添加し、溶液Ｙ’と保存液とを転倒混和により混合して、混合液Ｙを得た。得られた混合液Ｙ中のホルムアルデヒド含有量をＭＢＴＨ比色法により求めた。

（３）混合液Ｚの浸透圧
実施例１～１５及び比較例２で得られた保存容器に、生理食塩水５ｍＬを添加し、生理食塩水と保存液とを転倒混和により混合して混合液Ｚを得た。得られた混合液Ｚの浸透圧を浸透圧計（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製「オズモメーター３２５０」）を用いて測定した。

（４）ｃｆＤＮＡの保存安定性
（４－１）室温保存７日間のｃｆＤＮＡの保存安定性（実施例１，２及び比較例１～３）
実施例１，２及び比較例１～３で得られた保存容器に、血液５ｍＬを採取し、血液と保存液とを転倒混和により混合した。次いで、保存容器を１５℃～２５℃の環境下で静置した。保存した直後、保存から３日後、保存から７日後に、保存容器から、血液と保存液との混合液を採取した。採取した混合液から遠心分離によって血漿を回収した。ｃｆＤＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製「ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ」）を用いて、回収した血漿に含まれるＤＮＡを精製した。

精製したＤＮＡを蛍光標識した後、電気泳動システム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製「Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザー」及び「Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｖｉｔｙ ＤＮＡキット」）を用いて、精製したＤＮＡの電気泳動を行った。電気泳動写真を画像解析し、１８０ｂｐ付近のｃｆＤＮＡのピーク形状、及び、３００ｂｐ以上のｇＤＮＡのピーク形状を観察した。

（４－２）室温保存１日間のｃｆＤＮＡの保存安定性（実施例３～１２及び比較例４）
実施例３～１２及び比較例４で得られた保存容器を用いたこと、保存容器を１５℃～２５℃の環境下で１日間静置したあとに、血液と保存液との混合液を採取したこと以外は、「（４－１）室温保存７日間のｃｆＤＮＡの保存安定性」と同様にして、試験を行った。

（４－３）室温保存４日間のｃｆＤＮＡの保存安定性（実施例１３～１５）
実施例１３～１５で得られた保存容器を用いたこと、保存容器を１５℃～２５℃の環境下で３日間静置したあと及び４日間静置したあとに、血液と保存液との混合液を採取したこと以外は、「（４－１）室温保存７日間のｃｆＤＮＡの保存安定性」と同様にして、試験を行った。

組成及び結果を下記の表１～４及び図１～１１に示す。

図１～図１１において、横軸はＤＮＡの塩基対数（ｂｐ）であり、縦軸は蛍光強度である。また、図１～図１１において、Ｍ１及びＭ２で示すピークはマーカーのピークであり、Ｓで示すピークは、ｃｆＤＮＡ由来のピークである。

図１（ａ）～（ｃ）は、実施例１におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。図２（ａ），（ｂ）は、実施例２におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。図３（ａ）～（ｃ）は、比較例１におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。図４（ａ），（ｂ）は、比較例２におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。図５（ａ）～（ｃ）は、比較例３におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。図１（ａ）、図２（ａ）、図３（ａ）、図４（ａ）、図５（ａ）は、保存容器に血液を採取した直後の混合液を用いて得られた結果である。図１（ｂ）、図３（ｂ）、図４（ｂ）、図５（ｂ）は、保存容器に血液を保存してから３日後の混合液を用いて得られた結果である。図１（ｃ）、図２（ｂ）、図３（ｃ）、図５（ｃ）は、保存容器に血液を保存してから７日後の混合液を用いて得られた結果である。

図１，２に示すように、実施例１，２で得られた精製ＤＮＡでは、１８０ｂｐ付近のｃｆＤＮＡ由来のピーク以外のピークは保存７日目まで確認されなかった。また、ｃｆＤＮＡ由来のピークの形状は、１５℃～２５℃の環境下で保存してから７日間に亘って、良好に維持されており、ｃｆＤＮＡの保存安定性が高められていることが理解できる。

一方、図３，４に示すように、比較例１，２で得られた精製ＤＮＡでは、３００ｂｐ以上のｃｆＤＮＡ以外に由来するピークが検出された。これらのピークは、白血球等からｇＤＮＡが血液中に混入したことに起因した生じたピークと考えられる。

また、図５に示すように、比較例３で得られた精製ＤＮＡでは、白血球等からのｇＤＮＡの混入はある程度抑えられていたものの、ｃｆＤＮＡのピークがブロード化し、蛍光強度が低下していることが理解できる。これは、ホルムアルデヒドによって、ｃｆＤＮＡ同士が架橋されているものだと推測される。

図６（ａ）～（ｃ）はそれぞれ、実施例３～５におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。図７（ａ）～（ｃ）はそれぞれ、実施例６～８におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。図８（ａ）～（ｄ）はそれぞれ、実施例９～１２におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。図３（ｄ）は、比較例４におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。図６（ａ）～（ｃ）、図７（ａ）～（ｃ）、図８（ａ）～（ｄ）、図３（ｄ）は、保存容器に血液を保存してから１日後の混合液を用いて得られた結果である。

図６に示すように、実施例３～５では、白血球等からｇＤＮＡが血液中に混入したことによるピークが検出されるものの、比較例４と比べると、ｃｆＤＮＡの保存安定性が高められていた。

図７に示すように、実施例６～８では、ｃｆＤＮＡの保存安定性が高められていた。

図８（ａ），（ｂ）に示すように、実施例９，１０では、比較例４と比べると、ｃｆＤＮＡの保存安定性が高められていた。

図８（ｃ），（ｄ）に示すように、実施例１１，１２では、ｃｆＤＮＡの保存安定性が高められていた。

図９（ａ），（ｂ）は、実施例１３におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。図１０（ａ），（ｂ）は、実施例１４におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。図１１（ａ），（ｂ）は、実施例１５におけるｃｆＤＮＡの保存安定性の評価で得られた電気泳動写真の画像解析結果である。図９（ａ）、図１０（ａ）、図１１（ａ）は、保存容器に血液を保存してから３日後の混合液を用いて得られた結果である。図９（ｂ）、図１０（ｂ）、図１１（ｂ）は、保存容器に血液を保存してから４日後の混合液を用いて得られた結果である。

Ｍ１，Ｍ２…マーカー
Ｓ…ｃｆＤＮＡ

Claims (14)

1. 所定量の細胞含有液を保存するための容器であって、
   容器本体と、前記容器本体内に収容された保存液とを備え、
   前記保存液が、分子量が１００以下であり、０℃で凍結しない細胞膜透過性化合物を含み、かつ、前記所定量の細胞含有液を細胞含有液用保存容器に採取して、該細胞含有液と前記保存液とを混合した混合液Ｘを得たときに、前記混合液Ｘにおいて、前記細胞膜透過性化合物の含有量が、１ｖｏｌ％以上５ｖｏｌ％以下である第１の構成と、
   前記保存液が、分子量が３００以上である細胞膜非透過性化合物を含み、かつ、前記所定量の細胞含有液を細胞含有液用保存容器に採取して、該細胞含有液と前記保存液とを混合した混合液Ｘを得たときに、前記混合液Ｘにおいて、前記細胞膜非透過性化合物の含有量が、０．５μｍｏｌ／Ｌ以上５μｍｏｌ／Ｌ以下である第２の構成とを備え、
   前記細胞膜透過性化合物が、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジメチルスルホキシド、アセトアミド、１，３－プロパンジオール、又はブチレングリコールであり、
   前記細胞膜非透過性化合物が、ポリビニルピロリドン、ポリエチンレングリコール、ポリビニルアルコール、多糖類、ヒドロキシプロピルセルロース、糖アルコール、又はフィコールであり、
   前記保存液が、ホルムアルデヒドドナー化合物を含み、前記ホルムアルデヒドドナー化合物が、ＤＭＤＭヒダントイン、又は１－ヒドロキシメチル－５，５－ジメチルヒダントインである、細胞含有液用保存容器。
2. 前記細胞膜非透過性化合物が、分子量が１０００以上である化合物である、請求項１に記載の細胞含有液用保存容器。
3. 生理食塩水１Ｌに対して次亜塩素酸ナトリウム７．４ｇが混合された溶液Ｙ’を得て、細胞含有液用保存容器に保存される細胞含有液の所定量と等量の前記溶液Ｙ’を細胞含有液用保存容器に採取して、該溶液Ｙ’と前記保存液とを混合した混合液Ｙを得たときに、前記混合液Ｙにおいて、ホルムアルデヒドの含有量が、１００ｍｇ／Ｌ以上４００ｍｇ／Ｌ以下である、請求項１又は２に記載の細胞含有液用保存容器。
4. 細胞含有液用保存容器に保存される細胞含有液の所定量と等量の生理食塩水を細胞含有液用保存容器に採取して、該生理食塩水と前記保存液とを混合した混合液Ｚを得たときに、前記混合液Ｚの浸透圧が、３００ｍＯｓｍ／Ｌ以上１１００ｍＯｓｍ／Ｌ以下である、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞含有液用保存容器。
5. 前記保存液が、浸透圧調整剤を含み、
   前記浸透圧調整剤が、グルコース、又は塩化ナトリウムである、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞含有液用保存容器。
6. 前記保存液が、キレート作用を有する化合物を含み、
   前記キレート作用を有する化合物が、ＥＤＴＡを含み、
   前記混合液Ｘにおいて、前記ＥＤＴＡの含有量が、４ｍｍｏｌ／Ｌ以上７ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞含有液用保存容器。
7. 前記保存液が、緩衝剤を含み、
   前記緩衝剤が、グリシンを含み、
   前記混合液Ｘにおいて、前記グリシンの含有量が、０．５ｗ／ｖ％以下である、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞含有液用保存容器。
8. 前記細胞含有液が、血液である、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞含有液用保存容器。
9. 細胞含有液を保存するために用いられる保存液であって、
   分子量が１００以下であり、０℃で凍結しない細胞膜透過性化合物を含み、かつ、前記細胞膜透過性化合物の含有量が、２ｖｏｌ％以上５０ｖｏｌ％以下である第３の構成と、
   分子量が３００以上である細胞膜非透過性化合物を含み、かつ、前記細胞膜非透過性化合物の含有量が、１．０μｍｏｌ／Ｌ以上１００μｍｏｌ／Ｌ以下である第４の構成とを備え、
   前記細胞膜透過性化合物が、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジメチルスルホキシド、アセトアミド、１，３－プロパンジオール、又はブチレングリコールであり、
   前記細胞膜非透過性化合物が、ポリビニルピロリドン、ポリエチンレングリコール、ポリビニルアルコール、多糖類、ヒドロキシプロピルセルロース、糖アルコール、又はフィコールであり、
   前記保存液が、ホルムアルデヒドドナー化合物を含み、前記ホルムアルデヒドドナー化合物が、ＤＭＤＭヒダントイン、又は１－ヒドロキシメチル－５，５－ジメチルヒダントインである、保存液。
10. 前記細胞膜非透過性化合物が、分子量が１０００以上である化合物である、請求項９に記載の保存液。
11. 浸透圧調整剤を含み、
    前記浸透圧調整剤が、グルコース、又は塩化ナトリウムである、請求項９又は１０に記載の保存液。
12. キレート作用を有する化合物を含み、
    前記キレート作用を有する化合物が、ＥＤＴＡを含む、請求項９～１１のいずれか１項に記載の保存液。
13. 緩衝剤を含み、
    前記緩衝剤が、グリシンを含む、請求項９～１２のいずれか１項に記載の保存液。
14. 前記細胞含有液が、血液である、請求項９～１３のいずれか１項に記載の保存液。