JP7635131B2 - 脂質ナノ粒子の調製方法 - Google Patents

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Description

関連出願
本出願は、２０１９年１月３１日に出願された米国仮出願第６２／７９９，６２０号の優先権及び権益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を作製する新規の方法、その作製された製剤、並びに１つ以上の治療薬及び／または予防薬、例えば、核酸を哺乳動物細胞もしくは臓器に送達する、及び／または哺乳動物細胞もしくは臓器でポリペプチドを産生するための核酸脂質ナノ粒子を含む方法を提供する。
小分子薬、タンパク質、及び核酸などの生物活性物質の効果的な標的化送達は、継続的な医学的な課題を表している。特に、細胞への核酸の送達は、そのような種の相対的な不安定性及び低い細胞透過性により困難になる。従って、細胞への核酸などの治療薬及び予防薬の送達を促進するための方法及び組成物を開発する必要性が存在する。
脂質含有ナノ粒子または脂質ナノ粒子、リポソーム、及びリポプレックスは、小分子薬、タンパク質、及び核酸などの生物活性物質の細胞及び／または細胞内区画への輸送ビヒクルとして有効であることが証明されている。様々なそのような脂質含有ナノ粒子が実証されているが、安全性、有効性、及び特異性の改善は未だ足りていない。
配列表に関する陳述
本出願に関連する配列表が、紙の複製の代わりにテキスト形式で提供され、これにより参照によって本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＭＲＮＡ＿０６２＿００１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、６１４バイトであり、２０２０年１月３０日に作成され、電子提出されている。
いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を作製する方法を提供し、方法は、ｉ）イオン化可能脂質を含む脂質溶液を、第１の緩衝剤を含む水性緩衝溶液と混合し、それにより脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子溶液を形成すること、及びｉｉ）核酸を含む核酸溶液を脂質ナノ粒子溶液に添加し、それにより核酸と会合した脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を形成することを含む。
いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の患者への投与方法を提供し、方法は、ｉ）治療薬及び／または予防薬を含む、約４．５～約８．０の範囲のｐＨを有する活性剤溶液と、イオン化可能脂質を含む脂質ナノ粒子を含む、約４．５～約６．５の範囲のｐＨを有する脂質ナノ粒子溶液とを提供すること、ｉｉ）脂質ナノ粒子製剤が約４．５～約８．０未満の範囲のｐＨを有するように脂質ナノ粒子溶液と活性剤溶液とを混合することによって、治療薬及び／または予防薬と会合した脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を形成すること、及びｉｉｉ）混合後に、脂質ナノ粒子製剤を患者に投与することを含む。
別の態様によれば、本開示は、本明細書に記載される実施形態のいずれか１つの方法によって調製される、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤に関する。
別の態様によれば、本開示は、疾患または障害の治療または予防方法に関し、方法は、本明細書に記載される実施形態のいずれか１つの方法に従って、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を、それを必要とする対象に投与することを含む。
別の態様によれば、本開示は、疾患または障害の治療または予防方法に関し、方法は、本明細書に記載される実施形態のいずれか１つの方法によって調製される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を、それを必要とする対象に投与することを含む。
別の態様によれば、本開示は、本明細書に記載される実施形態のいずれかによる活性剤溶液、本明細書に記載される実施形態のいずれかによる脂質ナノ粒子溶液、及び、本明細書に記載される実施形態のいずれかによる活性剤溶液、脂質ナノ粒子溶液、及び／または混合及び投与装置を含むキットに関する。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される方法によって調製される、脂質ナノ粒子を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される方法によって調製される、脂質ナノ粒子溶液を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される方法によって調製される、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、疾患または障害の治療または予防方法を提供し、方法は、本明細書に記載される脂質ナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む。
いくつかの態様では、本開示は、疾患または障害の治療または予防方法を提供し、方法は、本明細書に記載される脂質ナノ粒子溶液ナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む。
いくつかの態様では、本開示は、疾患または障害の治療または予防方法を提供し、方法は、本明細書に記載される脂質ナノ粒子製剤ナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む。
いくつかの態様では、本開示は、対象における疾患または障害を治療または予防するための、本明細書に記載される脂質ナノ粒子を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、対象における疾患または障害を治療または予防するための、本明細書に記載される脂質ナノ粒子溶液を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、対象における疾患または障害を治療または予防するための、本明細書に記載される脂質ナノ粒子製剤を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、対象における疾患または障害を治療または予防するための薬物の製造における、本明細書に記載される脂質ナノ粒子の使用を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、対象における疾患または障害を治療または予防するための薬物の製造における、本明細書に記載される脂質ナノ粒子溶液の使用を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、対象における疾患または障害を治療または予防するための薬物の製造における、本明細書に記載される脂質ナノ粒子製剤の使用を提供する。
別途説明されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本開示の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されているものと類似または同等の方法及び材料を本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合、定義を含め、本明細書が優先される。さらに、材料、方法、及び例は、例示にすぎず、限定することを意図しない。
本開示の他の特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態、及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
同程度のｍＲＮＡ封入またはｍＲＮＡ封入の増加が、ＬＮＰ作製後の長い時間スケール（すなわち、滞留時間の増加）でｍＲＮＡを導入する場合に観察されることを示すグラフである。封入は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ蛍光アッセイを介して評価した。 同程度のｍＲＮＡ封入またはｍＲＮＡ封入の増加が、対照（点線）と比べて、ＬＮＰ作製後の長い時間スケール（すなわち、滞留時間の増加）でｍＲＮＡを導入する場合に観察されることを示すグラフである。封入は、イオン交換（ＡＥＸ）アッセイを介して評価した。 事後負荷（「ＰＨＬ）」プロセスモードにおいて、ｍＲＮＡが初期粒子形成中に含まれる標準プロセス（「標準」）と比べて、同程度の粒子形態が観察されることを示す凍結ＥＭ画像である。 標準ロットプロセスと比べて、事後負荷プロセスバッチにおける構造的特徴（ｑ＝約１．３ｎｍ－１、算出された格子面間隔５～６ｎｍ）の増加を示す小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）解析である。 予防ワクチンの状況におけるＰＨＬの最初の用量反応（プライムの３週間後）の増加を示す、標準プロセスに対するＰＨＬプロセスのインビボ性能を示し、かつ、ブーストの２週間後に観察される同程度の総ＩｇＧを示すプロットである。Ａ～Ｄエントリーは、比較として標準プロセスの代替バージョンを反映する。 ＬＮＰ分散の初期直径がｍＲＮＡ封入に与えた影響を示し、かつ、直径の減少したＬＮＰバッチがｍＲＮＡ封入の増加をもたらしたことを示すグラフである。 エタノール含有量及び温度がＬＮＰ多分散指数（ＰＤＩ）に影響を及ぼす決定的なパラメーターであることを、動的光散乱（ＤＬＳ）特徴付けを介して示すモデルフィッティングであり、このモデルフィッティングにより、低ＰＤＩに好適な、有利な範囲のプロセス条件（例えば、３０％エタノール、４０℃）の算出が可能になり、小さく均一な粒子及び好ましい組成物が可能となった。 エタノール含有量及び温度がＬＮＰ直径に影響を及ぼす決定的なパラメーターであることを、ＤＬＳ特徴付けを介して示すモデルフィッティングであり、このモデルフィッティングにより、粒径を本明細書に記載されるプロセスによるｍＲＮＡ封入の好ましい範囲（１００ｎｍ未満）に制御するのに好適な、有利な範囲のプロセス条件の算出が可能になり、小さく均一な粒子及び好ましい組成物が可能になった。 空のＬＮＰ作製プロセスが構造的特徴に影響を及ぼしたことを、小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）解析によって示し、全てのプロセス条件により、ｑ＝１．４ｎｍ－１（算出された格子面間隔：約４ｎｍ）で顕著な特徴を有する粒子が得られたことを示すグラフである。熟成させないプロセスＡにより、ｑ＝０．４５（算出された格子面間隔：約１４ｎｍ）でさらなる特徴が作製された。この特徴は、凍結ＴＥＭ解析を介して、試料中の小さなリポソームまたはミセル構造の集団と関連している。熟成時間を組み込んだプロセスＢ及びＣは、プロセスＡと比較して、改善された多分散性（ＤＬＳ解析を介して）及び構造均一性（凍結ＴＥＭ解析を介して）を示した。 本明細書に記載されるプロセスを介して負荷したｍＲＮＡが、ｑ＝１．３ｎｍ－１（算出された格子面間隔：約５ｎｍ）で顕著な特徴を有する、高い構造度を示す粒子を生成したことを示すグラフである。熟成時間及び低ＰＤＩに好ましい、最適なプロセス条件を利用するプロセスＢ及びＣは、プロセスＡと比較して、多分散性の減少及び構造均一性の改善を示した。 本明細書に記載される手順で生成されたバッチの、プロセスＡ（標準）と比べた、プロセスＢ（成熟の増加）で観察された粒子均一性の改善を示す凍結ＥＭ画像である。 ＬＮＰ形成の連続ナノ沈殿プロセスを示す例示のプロセスフロー図である。 スクロースが、ＬＮＰ分散物の凍結保護効果を呈し、凍結／融解ストレス後に粒子直径を保存することができ、有利なスクロース濃度が、１５重量％未満であると決定されたことを示すグラフである。 凍結防止賦形剤スクロースを含むことで、ｍＲＮＡ添加前に凍結／融解ストレスを経る脂質ナノ粒子の本明細書に記載されるプロセスを介したｍＲＮＡ封入の完了が可能になったことを示すグラフである（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ）。 液体状態（約５０ｎｍ）におけるナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）によって特徴付けられたＬＮＰの標準一次集団を示すグラフである。 製剤（アセテート－スクロース）に凍結乾燥を施し、蒸留脱イオン水中で再構成した後の一次ナノ粒子集団の保存を示すグラフである。 液体製品及び凍結乾燥／再構成製品のＬＮＰ製剤の重なり粒子分布を示すグラフである。 インビトロ発現の増加が、ｐＨ５．７５と比較して、ｐＨ５．０の凍結乾燥製剤で観察されたことを示すグラフである。 現場混合プロセスにおける組み合わせ前に、ｍＲＮＡ及びＬＮＰ溶液のｐＨ値を変化させることによって有利なｐＨが決定されたことを示すグラフである。粒径制御は、ｐＨ６．０未満で有利に達成された。 本明細書に記載されるプロセスにおける組み合わせ前に、ｍＲＮＡ及びＬＮＰ溶液のｐＨ値を変化させることによって有利なｐＨが決定され、封入の増加がｐＨ６．０未満で達成されたことを示すグラフである（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ）。 本明細書に記載されるプロセスにおける組み合わせ前に、ｍＲＮＡ及びＬＮＰ溶液のｐＨ値を変化させることによって有利なｐＨが決定され、封入の増加がｐＨ６．０未満で達成されたことを示すグラフである（ＡＥＸアッセイ）。 本明細書に記載されるプロセスにおいて、ＬＮＰ及びｍＲＮＡ溶液中のＮａＣｌのモル濃度を一緒に変化させることによってイオン強度感度が評価され、ｍＲＮＡ封入に好ましい有利な濃度が、２００ｍＭ未満であったことを示すグラフである。 ｍＲＮＡ封入におけるバッチ間のばらつきの少なさが、本明細書に記載されるプロセスで観察され、ｍＲＮＡ負荷ＬＮＰが、２４時間の熟成後に一貫性のあるｍＲＮＡ封入を示したことを示すグラフである。 粒径に対する注入流量の影響を、ＤＬＳ測定を介して示すグラフであり、ｍＲＮＡの溶液をＬＮＰの緩衝液を含有するバイアルに直接注入し、得られた粒子直径は、注入速度に敏感であった。 ｍＲＮＡ封入に対する注入流量の影響を示すグラフ（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ）であり、ｍＲＮＡの溶液をＬＮＰの緩衝液を含有するバイアルに直接注入した。 本明細書に記載されるプロセスを介して負荷したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子製剤が、ｑ＝１．３ｎｍ－１（算出された格子面間隔：約５ｎｍ）で顕著な特徴を有する、高い構造度を示す粒子を含み、同程度の構造的特徴が、様々な流量で観察された（試料９～１４）ことを示すグラフである。 ＬＮＰ溶液中にＰＥＧ脂質複合体を増加レベルで添加することで、ｍＲＮＡとの混合後に粒径が減少したことを示すグラフである。 ＬＮＰ溶液中にＰＥＧ脂質複合体を増加レベルで添加することが、ｍＲＮＡ封入に影響を与えなかったことを示すグラフである。 本明細書に記載されるプロセスを介して負荷したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子製剤が、ｑ＝１．３ｎｍ－１（算出された格子面間隔：約５ｎｍ）で顕著な特徴を有する、高い構造度を示す粒子を含み、同程度の構造的特徴が、混合ステップに含まれるモル％のＰＥＧ－脂質で観察されたことを示すグラフである。 ＬＮＰ溶液中にＰＥＧ脂質複合体を増加レベルで添加することで、混合本明細書に記載されるプロセスにおける注入流量に対する敏感さが減少したことを示すグラフである。 ＬＮＰ溶液中にＰＥＧ脂質複合体を増加レベルで添加することで、混合本明細書に記載されるプロセスにおける注入流量に対する敏感さが減少したことを示すグラフである。 ＬＮＰ溶液中にＰＥＧ脂質複合体を増加レベルで添加することで、封入が増加したことを示すグラフ（Ｒｉｂｏｓｔａｒアッセイ）である。 混合産物の中和が、ｍＲＮＡ封入の増加（ＡＥＸアッセイ）をもたらし、中和が、濃縮リン酸ナトリウム溶液の添加を介して標的ｐＨ値に達成され得ることを示すグラフである。 Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイが、混合産物のｐＨ中和に対する敏感さを検出することができず、中和が、濃縮リン酸ナトリウム溶液の添加を介して標的ｐＨ値に達成されたことを示すグラフである。 混合産物の中和が、増加したＬＮＰ直径（約１０ｎｍ）をもたらし、中和が、濃縮リン酸ナトリウム溶液の添加を介して標的ｐＨ値に達成されたことを示すグラフである。 本明細書に記載されるプロセスを介して負荷したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子製剤が、ｑ＝１．３ｎｍ－１（算出された格子面間隔：約５ｎｍ）で顕著な特徴を有する、高い構造度を示す粒子を含み、１．３ｎｍ－１の僅かな減少が中和で観察され、さらに、混合産物のさらなる中和が、０．３ｎｍ－１（格子面間隔：約２１ｎｍ）で構造特徴の低下をもたらしたことを示すグラフである。 本明細書に記載される混合製剤プロセス（「ＰＨＬプロセス」）の効力の、対照（「ベンチマークプロセス」）に対する増加を示し、標準プロセスモードと比較して、本明細書に記載される混合プロセスによる抗原特異的Ｔ細胞応答の増加を示すグラフである。
本開示は、一部には、本明細書で開示される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の作製方法が、脂質ナノ粒子内のある特定の成分の分布に影響を及ぼし得、及び／またはそれを決定づけ得、並びにこの分布が、脂質ナノ粒子の物理的（例えば、安定性）及び／または生物学的（例えば、有効性、細胞内送達、免疫原性）特性に影響を及ぼし得、及び／またはそれを決定づけ得るという発見に基づく。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、作製された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤からの望ましくない特性変化を緩和する。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、同等の方法（例えば、本明細書で開示される１つ以上のステップを有さない方法）によって作製されたＬＮＰまたはＬＮＰ製剤と比較して、作製された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤からの望ましくない特性変化を緩和する。
いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、脂質ナノ粒子製剤または脂質ナノ粒子に対するストレスによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、ストレスは、脂質ナノ粒子製剤または脂質ナノ粒子の作製、精製、パッキング、保存、輸送、及び／または使用中に誘発される。いくつかの実施形態では、ストレスは、熱、せん断、過度の攪拌、膜濃度分極（荷電状態の変化）、脱水、凍結ストレス、乾燥ストレス、凍結／融解ストレス、及び／または噴霧ストレスである。いくつかの実施形態では、ストレスは、脂質ナノ粒子製剤または脂質ナノ粒子の保存中に誘発される。
いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、ＬＮＰ製剤の物理的安定性の低下である。いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、不純物及び／または目に見えない粒子の量の増加、あるいはＬＮＰ製剤中のＬＮＰの平均サイズの増加である。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、本明細書で開示される同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤と比較して、作製されたＬＮＰ製剤の物理的安定性の低下（例えば、ＬＮＰの平均サイズの増加）を緩和する。
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって作製されたＬＮＰ製剤は、本明細書で開示される同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径と比較して、約９９％以下、約９８％以下、約９７％以下、約９６％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、または約１０％以下の平均ＬＮＰ直径を有する。
いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、ＬＮＰ製剤の化学的安定性の低下である。いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、ＬＮＰ製剤中の核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ））の完全性の低下である。
いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、ＬＮＰ製剤の生物学的特性の低下である。いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、ＬＮＰ製剤の有効性、細胞内送達、及び／または免疫原性の低下である。
いくつかの実施形態では、本開示の方法により作製されるＬＮＰ製剤は、本明細書で開示される同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤の有効性、細胞内送達、及び／または免疫原性よりも高い有効性、細胞内送達、及び／または免疫原性を有する。
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって作製されたＬＮＰ製剤は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤の有効性、細胞内送達、及び／または免疫原性よりも約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約２００倍以上、約３００倍以上、約４００倍以上、約５００倍以上、約１０００倍以上、約２０００倍以上、約３０００倍以上、約４０００倍以上、約５０００倍以上、または約１００００倍以上高い、有効性、細胞内送達、及び／または免疫原性を有する。
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって作製されたＬＮＰ製剤は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤の核酸発現（例えば、ｍＲＮＡ発現）よりも高い核酸発現（例えば、ｍＲＮＡ発現）を示す。
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって作製されたＬＮＰ製剤は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤の核酸発現（例えば、ｍＲＮＡ発現）よりも約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約２００倍以上、約３００倍以上、約４００倍以上、約５００倍以上、約１０００倍以上、約２０００倍以上、約３０００倍以上、約４０００倍以上、約５０００倍以上、または約１００００倍以上高い、核酸発現（例えば、ｍＲＮＡ発現）を示す。
従来より、メッセンジャーＲＮＡ負荷脂質ナノ粒子（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）は、ｍＲＮＡ水溶液とエタノール中の脂質溶液との高エネルギー混合を介して作製されてきた。水溶液は、プロセスで使用された脂質の貧溶媒であり、ほとんどの場合、カチオン性脂質、リン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ脂質の混合物である。従って、脂質の混合は、例えば、１００ｎｍ未満の直径の、ナノ粒子への脂質の自己集合をもたらす。
さらに、「ベッドサイド」及び／または「ポイントオブケア」製剤化に対する近年の取り組みが促進されており、それによりｍＲＮＡは、早い時点で調製された、予め形成された小胞内に封入され得る。臨床化合物の設定におけるｍＲＮＡとの組換え前に空のＬＮＰ小胞を作製し、別々に保存することができるため、この作製様式は、臨床供給の状況において利点を提供する。具体的に、ｍＲＮＡ及び空の原材料を個別に最適化された状態で保存することができるため、ベッドサイド製剤は、安定性の増加を促進することができる。ＬＮＰ調製は貨物に依存せず、複数のｍＲＮＡまたは活性剤構築物に対するプラットフォームアプローチが可能になるため、プロセスの複雑さ及び商品価格を減少することができる。空のＬＮＰ＋ｍＲＮＡモダリティは、「事後負荷」（ＰＨＬ）、「事後添加」、または「事後」と呼んでもよい。
本開示は、一部には、事後負荷の基本原理を探求し、かつ、空のＬＮＰ作製後の複数の時間スケールでのｍＲＮＡ添加の影響及び状態を調査する取り組みに基づく。脂質沈殿後のｍＲＮＡ添加の時間は、製剤の物理化学的特性（例えば、粒径、封入、形態、及び／または構造完全性）に悪影響を及ぼすことなく、７桁以上（例えば、１ｍｓから１０，０００，０００ｍｓまで）変化させた。ｍＲＮＡは、従来、脂質沈殿反応の入口水流内の必須成分として含まれることを考えると、物理化学的特性における類似性は、驚くべきものであり、直感的なものではなかった。さらに、オリゴヌクレオチドは、初期の粒子集合ステップに関与すると説明されることが多い。ｍＲＮＡ封入は、ＬＮＰの物理化学的特性に悪影響を及ぼすことなく、脂質沈殿／粒子形成よりも著しく長い時間スケールで起こり得ることが、実証実験からの結果より示唆される。これらの実験は、脂質粒子形成及びその後のｍＲＮＡ封入が、２つの反応ステップに分離し得ることを示した。本明細書に記載される事後負荷の概念は、各ステップの別々の制御及び／または最適化を可能にし得る。さらに、事後負荷は、ポイントオブケア製剤化が可能になる時間スケール（例えば、空のＬＮＰ作製の数か月または数年後）でのｍＲＮＡ添加を可能にし得る。
歴史的に、予め形成された空の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を臨床供給に適した規模で作製するためのプロセスは開発されていない。本開示は、一部には、粒子サイズ制御中に考慮する脂質濃度、温度、緩衝液組成（例えば、イオン強度、ｐＨ、対イオン）、及びエタノール含有量を含むが、これらに限定されない、規模を変えた生産に有利な多数のプロセスパラメーターを確認する取り組みに基づく。
本開示は、一部には、本明細書で開示される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の作製方法が、脂質ナノ粒子内のある特定の成分の分布に影響を及ぼし得、及び／またはそれを決定づけ得、並びにこの分布が、脂質ナノ粒子の物理的（例えば、安定性）及び／または生物学的（例えば、有効性、細胞内送達、免疫原性）特性に影響を及ぼし得、及び／またはそれを決定づけ得ることができるという発見に基づく。
いくつかの実施形態では、本開示は、有利な分布の成分を有する脂質ナノ粒子を含む組成物をもたらす。
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって作製されたＬＮＰ製剤は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤の核酸発現（例えば、ｍＲＮＡ発現）より高い核酸発現（例えば、ｍＲＮＡ発現）を呈する。
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって作製されたＬＮＰ製剤は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤のものと比べて、インビトロ／インビボ活性の小角Ｘ線散乱解析によって所望の構造的特徴を示す。
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって作製されたＬＮＰ製剤は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤のものと比べて、インビトロ／インビボ活性の小角Ｘ線散乱解析によって所望の構造的特徴を示す。
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって作製されたＬＮＰ製剤は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤のものと比べて、Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ解析よって、より均質な構造的特徴を示す。
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって作製されたＬＮＰ製剤は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤の核酸発現（例えば、ｍＲＮＡ発現）より約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約２００倍以上、約３００倍以上、約４００倍以上、約５００倍以上、約１０００倍以上、約２０００倍以上、約３０００倍以上、約４０００倍以上、約５０００倍以上、または約１００００倍以上高い核酸発現（例えば、ｍＲＮＡ発現）を呈する。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物の作製方法、及び作製されたＬＮＰ組成物
他の作製技術（例えば、薄膜水分補給／押出し）とは対照的に、エタノール滴沈殿は、安定した核酸脂質ナノ粒子（ＳＮＡＬＰ）を生成するための業界標準になっている。沈殿反応は、継続的な性質、拡張性、及び適用し易さにより好適なものである。これらのプロセスには通常、高エネルギーミキサー（例えば、Ｔ字型の、閉じ込められた衝突噴流、ボルテックスミキサー）を用いて、脂質（エタノール中）を適切な貧溶媒（すなわち、水）に制御可能な方法で導入し、液体過飽和及び脂質粒子への自発沈殿を促進する。
本開示は、脂質ナノ粒子組成物の作製方法を提供し、方法は、ｉ）イオン化可能脂質を含む脂質溶液を、第１の緩衝剤を含む水性緩衝溶液と混合し、それにより空の脂質ナノ粒子を形成すること、及びｉｉ）核酸を含む核酸溶液を脂質ナノ粒子溶液に添加し、それにより核酸を封入する脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を形成することを含む。
脂質溶液
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、脂質溶液を提供する。
いくつかの実施形態では、脂質溶液は、イオン化可能脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質溶液は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、０．０７ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ、０．０９ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．１５ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、または１．０ｍｇ／ｍＬより高い濃度でイオン化可能脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質溶液は、約０．０１～１．０ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．９ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．８ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．７ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．６ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．４ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．３ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．２ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．１ｍｇ／ｍＬ、０．０５～１．０ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．９ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．８ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．７ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．６ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．５ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．４ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．３ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．２ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．１ｍｇ／ｍＬ、０．１～１．０ｍｇ／ｍＬ、０．２～０．９ｍｇ／ｍＬ、０．３～０．８ｍｇ／ｍＬ、０．４～０．７ｍｇ／ｍＬ、または０．５～０．６ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でイオン化可能脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質溶液は、最大で約５．０ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、０．０９ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ、０．０７ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、または０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度でイオン化可能脂質を含み得る。
いくつかの実施形態では、脂質溶液は、イオン化可能脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質溶液は、約０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ／ｍＬ、６．０ｍｇ／ｍＬ、７．０ｍｇ／ｍＬ、８．０ｍｇ／ｍＬ、９．０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬまたは３０ｍｇ／ｍＬより高い濃度でイオン化可能脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質溶液は、約０．１～２０．０ｍｇ／ｍＬ、０．１～１９ｍｇ／ｍＬ、０．１～１８ｍｇ／ｍＬ、０．１～１７ｍｇ／ｍＬ、０．１～１６ｍｇ／ｍＬ、０．１～１５ｍｇ／ｍＬ、０．１～１４ｍｇ／ｍＬ、０１～１３ｍｇ／ｍＬ、０．１～１２ｍｇ／ｍＬ、０．１～１１ｍｇ／ｍＬ、０．５～１０．０ｍｇ／ｍＬ、０．５～９ｍｇ／ｍＬ、０．５～８ｍｇ／ｍＬ、０．５～７ｍｇ／ｍＬ、０．５～６ｍｇ／ｍＬ、０．５～５．０ｍｇ／ｍＬ、０．５～４ｍｇ／ｍＬ、０．５～３ｍｇ／ｍＬ、０．５～２ｍｇ／ｍＬ、０．５～１ｍｇ／ｍＬ、１～２０ｍｇ／ｍＬ、１～１５ｍｇ／ｍＬ、１～１２ｍｇ／ｍＬ、１～１０ｍｇ／ｍＬ、または１～８ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でイオン化可能脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質溶液は、最大で約３０ｍｇ／ｍＬ、２５、ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、０．０９ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ、０．０７ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、または０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度でイオン化可能脂質を含み得る。
いくつかの実施形態では、脂質溶液は、水性緩衝液及び／または有機溶液中にイオン化可能脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子溶液は、緩衝剤及び／または塩をさらに含み得る。適切な緩衝剤の例としては、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、脂質溶液は、０．１～１００ｍＭ、約０．５～９０ｍＭ、約１．０～８０ｍＭ、約２～７０ｍＭ、約３～６０ｍＭ、約４～５０ｍＭ、約５～４０ｍＭ、約６～３０ｍＭ、約７～２０ｍＭ、約８～１５ｍＭ、約９～１２ｍＭの範囲の濃度で緩衝剤約を含む。いくつかの実施形態では、脂質溶液は、約０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、または５０ｍＭの濃度またはそれを超える濃度で緩衝剤を含む。適切な塩の例としては、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、脂質溶液は、約１～５００ｍＭ、約５～４００ｍＭ、約１０～３５０ｍＭ、約１５～３００ｍＭ、約２０～２５０ｍＭ、約３０～２００ｍＭ、約４０～１９０ｍＭ、約５０～１８０ｍＭ、約５０～１７０ｍＭ、約５０～１６０ｍＭ、約５０～１５０ｍＭ、または約５０～１００ｍＭの範囲の濃度で塩を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子溶液は、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または１００ｍＭの濃度またはそれを超える濃度で塩を含む。
いくつかの実施形態では、脂質溶液は、約４．５～約７．０、約４．６～約７．０、約４．８～約７．０、約５．０～約７．０、約５．５～約７．０、約６．０～約７．０、約６．０～約６．９、約６．０～約６．８、約６．０～約６．７、約６．０～約６．６、約６．０～約６．５の範囲のｐＨを有し得る。いくつかの実施形態では、適切な脂質溶液は、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０のｐＨまたはそれ以下のｐＨを有し得る。
水性緩衝溶液
いくつかの実施形態では、水性緩衝溶液は、水性緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、適切な溶液は、１つ以上の緩衝剤及び／または塩をさらに含み得る。適切な緩衝剤の例としては、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、水性緩衝溶液は、約０．１～１００ｍＭ、約０．５～９０ｍＭ、約１．０～８０ｍＭ、約２～７０ｍＭ、約３～６０ｍＭ、約４～５０ｍＭ、約５～４０ｍＭ、約６～３０ｍＭ、約７～２０ｍＭ、約８～１５ｍＭ、約９～１２ｍＭの範囲の濃度で緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、水性緩衝溶液は、約０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、または５０ｍＭの濃度またはそれを超える濃度で緩衝剤を含む。適切な塩の例としては、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、水性緩衝溶液は、約１～５００ｍＭ、約５～４００ｍＭ、約１０～３５０ｍＭ、約１５～３００ｍＭ、約２０～２５０ｍＭ、約３０～２００ｍＭ、約４０～１９０ｍＭ、約５０～１８０ｍＭ、約５０～１７０ｍＭ、約５０～１６０ｍＭ、約５０～１５０ｍＭ、または約５０～１００ｍＭの範囲の濃度で塩を含む。いくつかの実施形態では、核酸溶液は、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または１００ｍＭの濃度またはそれを超える濃度で塩を含む。
いくつかの実施形態では、水性緩衝溶液は、約４．５～約７．０、約４．６～約７．０、約４．８～約７．０、約５．０～約７．０、約５．５～約７．０、約６．０～約７．０、約６．０～約６．９、約６．０～約６．８、約６．０～約６．７、約６．０～約６．６、約６．０～約６．５の範囲のｐＨを有し得る。いくつかの実施形態では、適切な水性緩衝溶液は、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０のｐＨまたはそれ以下のｐＨを有し得る。
核酸または活性剤溶液
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、治療薬及び／または予防薬を含む活性剤溶液を提供する。治療薬及び／または予防薬は、治療薬及び／または予防薬が脂質ナノ粒子中に封入され得るように、脂質ナノ粒子または脂質ナノ粒子溶液に混合または添加される溶液で提供され得る。
いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬は、免疫応答を誘発することがができるワクチンまたは化合物である。
いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬は、核酸である。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、核酸を含む核酸溶液を提供する。核酸は、核酸が脂質ナノ粒子中に封入され得るように、脂質ナノ粒子または脂質ナノ粒子溶液に混合または添加される溶液で提供され得る。
いくつかの実施形態では、核酸溶液は、様々な濃度で封入される核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸溶液は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、０．０７ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ、０．０９ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．１５ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、または１．０ｍｇ／ｍＬより高い濃度で核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸溶液は、約０．０１～１．０ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．９ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．８ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．７ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．６ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．４ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．３ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．２ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．１ｍｇ／ｍＬ、０．０５～１．０ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．９ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．８ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．７ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．６ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．５ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．４ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．３ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．２ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．１ｍｇ／ｍＬ、０．１～１．０ｍｇ／ｍＬ、０．２～０．９ｍｇ／ｍＬ、０．３～０．８ｍｇ／ｍＬ、０．４～０．７ｍｇ／ｍＬ、または０．５～０．６ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸溶液は、最大で約５．０ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、０．０９ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ、０．０７ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、または０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度で核酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、核酸溶液は、水性緩衝液中に核酸を含む。いくつかの実施形態では、適切な核酸溶液は、緩衝剤及び／または塩をさらに含み得る。適切な緩衝剤の例としては、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、核酸溶液は、約０．１～１００ｍＭ、約０．５～９０ｍＭ、約１．０～８０ｍＭ、約２～７０ｍＭ、約３～６０ｍＭ、約４～５０ｍＭ、約５～４０ｍＭ、約６～３０ｍＭ、約７～２０ｍＭ、約８～１５ｍＭ、約９～１２ｍＭの範囲の濃度で緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、核酸溶液は、約０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、または５０ｍＭの濃度またはそれを超える濃度で緩衝剤を含む。適切な塩の例としては、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、核酸溶液は、約１～５００ｍＭ、約５～４００ｍＭ、約１０～３５０ｍＭ、約１５～３００ｍＭ、約２０～２５０ｍＭ、約３０～２００ｍＭ、約４０～１９０ｍＭ、約５０～１８０ｍＭ、約５０～１７０ｍＭ、約５０～１６０ｍＭ、約５０～１５０ｍＭ、または約５０～１００ｍＭの範囲の濃度で塩を含む。いくつかの実施形態では、核酸溶液は、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または１００ｍＭの濃度またはそれを超える濃度で塩を含む。
いくつかの実施形態では、核酸溶液は、約４．５～約７．０、約４．６～約７．０、約４．８～約７．０、約５．０～約７．０、約５．５～約７．０、約６．０～約７．０、約６．０～約６．９、約６．０～約６．８、約６．０～約６．７、約６．０～約６．６、約６．０～約６．５の範囲のｐＨを有し得る。いくつかの実施形態では、適切な核酸溶液は、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０のｐＨまたはそれ以下のｐＨを有し得る。
脂質ナノ粒子溶液
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、治療薬及び／または予防薬を含む脂質ナノ粒子溶液を提供する。治療薬及び／または予防薬は、治療薬及び／または予防薬が脂質ナノ粒子中に封入され得るように、脂質ナノ粒子または脂質ナノ粒子溶液に混合または添加される溶液で提供され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、空の脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子溶液を提供する。脂質ナノ粒子は、核酸が脂質ナノ粒子中に封入され得るように、脂質ナノ粒子または脂質ナノ粒子溶液に混合または添加される溶液で提供され得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子溶液は、空の脂質ナノ粒子を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子溶液は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、０．０７ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ、０．０９ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．１５ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、または１．０ｍｇ／ｍＬより高い濃度で脂質ナノ粒子を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子溶液は、約０．０１～１．０ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．９ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．８ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．７ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．６ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．４ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．３ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．２ｍｇ／ｍＬ、０．０１～０．１ｍｇ／ｍＬ、０．０５～１．０ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．９ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．８ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．７ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．６ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．５ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．４ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．３ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．２ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．１ｍｇ／ｍＬ、０．１～１．０ｍｇ／ｍＬ、０．２～０．９ｍｇ／ｍＬ、０．３～０．８ｍｇ／ｍＬ、０．４～０．７ｍｇ／ｍＬ、または０．５～０．６ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で脂質ナノ粒子を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子溶液は、最大で約５．０ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、０．０９ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ、０．０７ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、または０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度で空の脂質ナノ粒子を含み得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子溶液は、水性緩衝液中に脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子溶液は、緩衝剤及び／または塩をさらに含み得る。適切な緩衝剤の例としては、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子溶液は、約０．１～１００ｍＭ、約０．５～９０ｍＭ、約１．０～８０ｍＭ、約２～７０ｍＭ、約３～６０ｍＭ、約４～５０ｍＭ、約５～４０ｍＭ、約６～３０ｍＭ、約７～２０ｍＭ、約８～１５ｍＭ、約９～１２ｍＭの範囲の濃度で緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子溶液は、約０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、または５０ｍＭの濃度またはそれを超える濃度で緩衝剤を含む。適切な塩の例としては、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子溶液は、約１～５００ｍＭ、約５～４００ｍＭ、約１０～３５０ｍＭ、約１５～３００ｍＭ、約２０～２５０ｍＭ、約３０～２００ｍＭ、約４０～１９０ｍＭ、約５０～１８０ｍＭ、約５０～１７０ｍＭ、約５０～１６０ｍＭ、約５０～１５０ｍＭ、または約５０～１００ｍＭの範囲の濃度で塩を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子溶液は、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または１００ｍＭの濃度またはそれを超える濃度で塩を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子溶液は、約４．５～約７．０、約４．６～約７．０、約４．８～約７．０、約５．０～約７．０、約５．５～約７．０、約６．０～約７．０、約６．０～約６．９、約６．０～約６．８、約６．０～約６．７、約６．０～約６．６、約６．０～約６．５の範囲のｐＨを有し得る。いくつかの実施形態では、適切な脂質ナノ粒子溶液は、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０のｐＨまたはそれ以下のｐＨを有し得る。
ＬＮＰ溶液の提供
いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の作製方法を提供し、方法は、（ｉ）イオン化可能脂質を含む脂質溶液を、第１の緩衝剤を含む水性緩衝溶液と混合し、それにより脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子溶液を形成すること、及び（ｉｉ）核酸を含む核酸溶液を脂質ナノ粒子溶液に添加し、それにより核酸を封入する脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を形成することを含む。
本開示の方法に適切な核酸を本明細書にさらに開示する。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。
本開示の方法に適切なイオン化可能脂質を本明細書にさらに開示する。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、リン脂質、ＰＥＧ脂質、構造脂質、またはそれらに任意の組み合わせをさらに含む。本開示の方法に適切なリン脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を本明細書にさらに開示する。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液を提供するステップは、水性緩衝溶液と脂質溶液を混合することを含み、脂質溶液は、有機溶媒中にイオン化可能脂質を含む。
ＬＮＰ溶液の処理
「処理」という用語は、本明細書で使用する場合、ＬＮＰを精製、ｐＨ調整、緩衝液交換、及び／または濃縮するための１つ以上のステップを含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液の処理ステップは、ｉｉａ）ＬＮＰ溶液を濾過することを含む。
いくつかの実施形態では、濾過は、ＬＮＰ溶液から有機溶媒（例えば、アルコールまたはエタノール）を除去する。いくつかの実施形態では、処理には、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）が含まれる。いくつかの実施形態では、有機溶媒（例えば、アルコールまたはエタノール）を除去すると、ＬＮＰ溶液は、中性ｐＨ、ｐＨ６．５～７．８、ｐＨ６．８～ｐＨ７．５、例えば、ｐＨ７．０～ｐＨ７．２で緩衝化された溶液（例えば、リン酸塩またはＨＥＰＥＳ緩衝液）に変換される。いくつかの実施形態では、得られたＬＮＰ溶液は、保存または使用前に、例えば、濾過（例えば、０．１～０．５μｍフィルターを通して）により滅菌する。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液の処理ステップは、ＬＮＰ溶液をパッキングすることをさらに含む。
本明細書で使用する場合、「パッキング」は、最終製品を最終パッケージに入れる前の、最終状態での製剤の保存またはＬＮＰの製造中の保存を指し得る。保存及び／またはパッキングのモードには、滅菌バッグでの冷蔵、バイアルでの冷蔵または冷凍製剤、バイアル及びシリンジでの凍結乾燥製剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液をパッキングするステップは、以下の１つ以上のステップを含む：
ｉｉｂ）凍結保護剤をＬＮＰ溶液に添加すること、
ｉｉｃ）ＬＮＰ溶液を凍結乾燥し、それにより凍結乾燥ＬＮＰ組成物を形成すること、
ｉｉｄ）凍結乾燥ＬＮＰ組成物のＬＮＰ溶液を保存すること、及び
ｉｉｅ）緩衝液をＬＮＰ溶液または凍結乾燥ＬＮＰ組成物に添加し、それによりＬＮＰ製剤を形成すること。
いくつかの実施形態では、凍結保護剤が凍結乾燥の前にＬＮＰ溶液に添加される。いくつかの実施形態では、凍結保護剤は、１つ以上の凍結防止剤を含み、１つ以上の凍結防止剤のそれぞれは独立して、ポリオール（例えば、プロピレングリコール（すなわち、１，２－プロパンジオール）、１，３－プロパンジオール、グリセロール、（＋／－）－２－メチル－２，４－ペンタンジオール、１，６－ヘキサンジオール、１，２－ブタンジオール、２，３－ブタンジオール、エチレングリコール、もしくはジエチレングリコールなどのジオールもしくはトリオール）、非界面活性剤スルホベタイン（例えば、ＮＤＳＢ－２０１（３－（１－ピリジノ）－１－プロパンスルホネート）、オスモライト（例えば、Ｌ－プロリンもしくはトリメチルアミンＮ－オキシド二水和物）、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール２００（ＰＥＧ２００）、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ２００００、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル５５０（ｍＰＥＧ５５０）、ｍＰＥＧ６００、ｍＰＥＧ２０００、ｍＰＥＧ３３５０、ｍＰＥＧ４０００、ｍＰＥＧ５０００、ポリビニルピロリドン（例えば、ポリビニルピロリドンＫ１５）、ペンタエリスリトールプロポキシレート、もしくはポリプロピレングリコールＰ４００）、有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）もしくはエタノール）、糖（例えば、Ｄ－（＋）－スクロース、Ｄ－ソルビトール、トレハロース、Ｄ－（＋）－マルトース一水和物、メソエリスリトール、キシリトール、ミオイノシトール、Ｄ－（＋）－ラフィノース五水和物、Ｄ－（＋）－トレハロース二水和物、もしくはＤ－（＋）－グルコース一水和物）、または塩（例えば、酢酸リチウム、塩化リチウム、ギ酸リチウム、硝酸リチウム、硫酸リチウム、酢酸マグネシウム、塩化ナトリウム、ギ酸ナトリウム、マロン酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、もしくはそれらの水和物）、あるいはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、凍結保護剤は、スクロースを含む。いくつかの実施形態では、凍結保護剤及び／または賦形剤は、スクロースである。
いくつかの実施形態では、凍結乾燥は、適切なガラス容器（例えば、１０ｍｌの円筒形ガラスバイアル）で実施する。いくつかの実施形態では、ガラス容器は、－４０℃未満の温度と室温より高い温度の間の短時間での極端な変化に耐え、及び／または、均一な形状にカットされる。いくつかの実施形態では、凍結乾燥のステップは、約－４０℃より高い、例えば、約－３０℃より低い温度でＬＮＰ溶液を凍結し、それによって凍結ＬＮＰ溶液を形成し、凍結ＬＮＰ溶液を乾燥させて、凍結乾燥ＬＮＰ組成物を形成することを含む。いくつかの実施形態では、凍結ステップは、約６分にわたって、例えば、１℃／分で２０℃から－４０℃まで、最終温度に、温度が直線的に低下する結果となる。いくつかの実施形態では、１２～１５％のスクロースを使用することができ、乾燥ステップは、約５０ｍＴｏｒｒ～約１５０ｍＴｏｒｒの範囲の真空で、例えば、最初に約－３５℃～約－１５℃の範囲の低い低温で実施され、その後、室温から約２５℃までの範囲のより高い温度で実施され、及び例えば、乾燥ステップは、３～７日で完了する。いくつかの実施形態では、乾燥ステップは、約５０ｍＴｏｒｒ～約１００ｍＴｏｒｒの範囲の真空で、例えば、最初に約－１５℃～約０℃の範囲の低温で、次いでより高い温度で実施される。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液または凍結乾燥ＬＮＰ組成物は、緩衝液を添加する前に、約－８０℃、約－７８℃、約－７６℃、約－７４℃、約－７２℃、約－７０℃、約－６５℃、約－６０℃、約－５５℃、約－５０℃、約－４５℃、約－４０℃、約－３５℃、または約－３０℃の温度で保存される。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液または凍結乾燥ＬＮＰ組成物は、緩衝液を添加する前に、約－４０℃、約－３５℃、約－３０℃、約－２５℃、約－２０℃、約－１５℃、約－１０℃、約－５℃、約０℃、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、または約２５℃の温度で保存される。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液または凍結乾燥ＬＮＰ組成物は、緩衝液を添加する前に、約－４０℃～約０℃、約－３５℃～約－５℃、約－３０℃～約－１０℃、約－２５℃～約－１５℃、約－２２℃～約－１８℃、または約－２１℃～約－１９℃の範囲の温度で保存される。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液または凍結乾燥ＬＮＰ組成物は、緩衝液を添加する前に、約－２０℃の温度で保存される。
ＬＮＰ製剤の投与
いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の患者への投与方法に関し、（ｉ）治療薬及び／または予防薬を含む、約４．５～約８．０の範囲のｐＨを有する活性剤溶液と、イオン化可能脂質を含む脂質ナノ粒子を含む、約４．５～約６．５の範囲のｐＨを有する脂質ナノ粒子溶液とを提供すること、（ｉｉ）治療薬及び／または予防薬と会合する脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を、脂質ナノ粒子製剤が約４．５～約８．０未満の範囲のｐＨを有するように脂質ナノ粒子溶液と活性剤溶液とを混合することによって形成すること、及び（ｉｉｉ）混合後の約７２時間未満に、脂質ナノ粒子製剤を患者に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、第１のｐＨ及び第２のｐＨは、約７．０～約８．１、または約７．１～約７．８、または約７．２～約７．７、または約７．３～約７．６、または約７．４～約７．５の範囲である。
いくつかの実施形態では、第１のｐＨ及び第２のｐＨは、約４．５～約６．５、または約４．６～約６．０、または約４．８～約５．５の範囲である。
いくつかの実施形態では、投与は、混合後の約７２時間未満、例えば、混合後の約６０時間未満、例えば、混合後の約４８時間未満、例えば、混合後の約３６時間未満、例えば、混合後の約２４時間未満、例えば、混合後の約２０時間未満、例えば、混合後の約１６時間未満、例えば、混合後の約１２時間未満、例えば、混合後の約８時間未満に行われる。
いくつかの実施形態では、投与は、混合後の約１２０分未満、例えば、混合後の約１００分未満、例えば、混合後の約９０分未満、例えば、混合後の約８０分未満、例えば、混合後の約７０分未満、例えば、混合後の約６０分未満、例えば、混合後の約５０分未満、例えば、混合後の約４０分未満、例えば、混合後の約３０分未満、例えば、混合後の約２０分未満、例えば、混合後の約１５分未満、例えば、混合後の約１０分未満に行われる。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、混合と投与の間で処理されない。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、混合と投与の間にｐＨ調整を含まない。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、混合と投与の間に濾過されない。
いくつかの実施形態では、方法は、混合及び投与装置の第１の入口で、有機溶液を受けることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、混合及び投与装置の第２の入口で、水性緩衝溶液を受けることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、混合は、混合及び投与装置のミキサー部位で行われる。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、混合及び投与装置の出口を介して投与される。
いくつかの実施形態では、提供、形成、混合、及び投与は、単一の混合及び投与装置、例えば、流体接続された混合及び投与装置を採用して全て行われる。
いくつかの実施形態では、混合及び投与装置は、２つの外筒を備えたシリンジを含む。
いくつかの実施形態では、混合及び投与装置は、Ｋ－シリンジ及びＬ－シリンジからなる群から選択される少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、混合及び投与装置は、ミキサー部位にスタティックミキサーを含む。
いくつかの実施形態では、スタティックミキサーは、ヘリカルスタティックミキサーである。
いくつかの実施形態では、水性緩衝溶液のｐＨ及び脂質ナノ粒子製剤のｐＨは、ほぼ同じである。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、脂質ナノ粒子製剤の総体積に対して、約１体積％～約５０体積％の有機溶媒、例えば、脂質ナノ粒子製剤の総体積に対して、約２体積％～約４５体積％、例えば、約３体積％～約４０体積％、例えば、約４体積％～約３５体積％、例えば、約５体積％～約３３体積％の有機溶媒を含む。
いくつかの実施形態では、有機溶媒は、アルコールである。
いくつかの実施形態では、有機溶媒は、エタノールである。
いくつかの実施形態では、有機溶媒は、第１の有機溶媒及び第２の有機溶媒を含む。
いくつかの実施形態では、第１の有機溶媒は、アルコールであり、第２の有機溶媒は、アルコールである。
いくつかの実施形態では、第１の有機溶媒は、エタノールであり、第２の有機溶媒は、ベンジルアルコールである。
いくつかの実施形態では、第１の有機溶媒対第２の有機溶媒の重量／重量比は、約１００：１～約１：１、または約５０：１～約１：１、または約２０：１～約１：１、または約１０：１～約１：１の範囲である。
いくつかの実施形態では、有機溶液は、湿潤剤をさらに含む。本明細書で使用する場合、湿潤剤は、液体が固体表面及び／または液体表面などの表面との接触を維持する能力を増加させる、減少させる、または改善する薬剤を指し得る。
いくつかの実施形態では、湿潤剤は、有機溶媒である。
いくつかの実施形態では、湿潤剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。
いくつかの実施形態では、湿潤剤対有機溶媒の重量／重量比は、約１０００：１～約１：１、または約５００：１～約５：１、または約１００：１～約１０：１の範囲である。
いくつかの実施形態では、水性緩衝溶液は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、及びトリス緩衝液からなる群から選択される少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、水性緩衝溶液は、生理学的ｐＨを維持するのに適切な任意の緩衝液であり得る。いくつかの実施形態では、水性緩衝溶液は、患者、例えば、哺乳動物患者、例えば、ヒト患者への投与に適切なｐＨを維持するのに適切な任意の緩衝液であり得る。
いくつかの実施形態では、水性緩衝溶液は、等張化剤をさらに含む。本明細書で使用する場合、等張化剤は、２つの溶液の水ポテンシャル、または拡散の方向及び程度に影響を及ぼす溶液中に溶解した溶質の相対濃度によって定義される、実効浸透圧勾配を増加させる、減少させる、または改善する薬剤を指し得る。
いくつかの実施形態では、等張化剤は、糖である。
いくつかの実施形態では、糖は、スクロースである。
安定化塩
「安定化塩」という用語は、本明細書で使用する場合、本開示の方法及び／または本開示のＬＮＰ製剤に適切な塩を指す。いくつかの実施形態では、安定化塩は、本開示の方法に従って使用する場合、同等の方法（例えば、安定化塩の使用を伴わない方法（例えば、ステップｉａ）及び／またはステップｉｉａ）を有さない方法、ステップｉａ）、ステップｉｉａ）、ステップｉｉｃ）及び／またはステップｉｉｄ）を有さない方法）によって作製されたＬＮＰ製剤と比較して、作製された脂質ナノ粒子ＬＮＰ製剤からの望ましくない特性変化を軽減する。
いくつかの実施形態では、安定化塩は、同等のナトリウム塩（例えば、安定化塩と同じアニオンを有するナトリウム塩）の核酸に対する親和性よりも高い、核酸（例えば、ｍＲＮＡのＰＯ４－バックボーン）に対する親和性を有する。
いくつかの実施形態では、安定化塩は、同等のナトリウム塩（例えば、安定化塩と同じアニオンを有するナトリウム塩）の核酸に対する親和性よりも、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約２００倍以上、約３００倍以上、約４００倍以上、約５００倍以上、約１０００倍以上、約２０００倍以上、約３０００倍以上、約４０００倍以上、約５０００倍以上、または約１００００倍以上高い、核酸（例えば、ｍＲＮＡのＰＯ４－バックボーン）に対する親和性を有する。
いくつかの実施形態では、安定化塩は、アルカリ塩またはアルカリ土類塩、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、ベリリウム塩、マグネシウム塩、またはカルシウム塩である。
いくつかの実施形態では、安定化塩は、アルカリ塩、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、またはカリウム塩である。
いくつかの実施形態では、安定化塩は、リチウム塩である。
いくつかの実施形態では、安定化塩は、フッ化物塩、臭化物塩、臭素酸塩、過臭化塩、塩化物塩、亜塩素酸塩、水酸化物塩、次亜塩素酸塩、過塩素酸塩、ヨウ化物塩、ヨウ素酸塩、過ヨウ素酸塩、アジ化塩、炭酸塩、リン酸塩、または硫酸塩である。いくつかの実施形態では、安定化塩は、フッ化物塩、塩化物塩、臭化物塩、またはヨウ化物塩である。
いくつかの実施形態では、安定化塩は、塩化物塩である。
いくつかの実施形態では、安定化塩は、フッ化リチウム、臭化リチウム、臭素酸リチウム、過臭素酸リチウム、塩化リチウム、亜塩素酸リチウム、水酸化リチウム、次亜塩素酸リチウム、過塩素酸リチウム、ヨウ化リチウム、ヨウ素酸リチウム、過ヨウ素酸リチウム、アジ化リチウム、炭酸リチウム、リン酸リチウム、または硫酸リチウムである。いくつかの実施形態では、安定化塩は、フッ化リチウム、塩化リチウム、臭化リチウム、またはヨウ化リチウムである。
いくつかの実施形態では、安定化塩は、塩化リチウムである。
いくつかの実施形態では、安定化塩は、酢酸塩、アジピン酸塩、アントラニル酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、酪酸塩、ケイ皮酸塩、クエン酸塩、デカン酸塩、エチルヘキサン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、イソ酪酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マロン酸塩、オクタン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、フタル酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ソルビン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、または吉草酸塩である。
いくつかの実施形態では、安定化塩は、酢酸塩である。
いくつかの実施形態では、安定化塩は、酢酸リチウム、アジピン酸リチウム、アントラニル酸リチウム、アスコルビン酸リチウム、安息香酸リチウム、酪酸リチウム、ケイ皮酸リチウム、クエン酸リチウム、デカン酸リチウム、エチルヘキサン酸リチウム、ギ酸リチウム、フマル酸リチウム、グルコン酸リチウム、グルタミン酸リチウム、イソ酪酸リチウム、乳酸リチウム、ラウリン酸リチウム、リンゴ酸リチウム、マロン酸リチウム、オクタン酸リチウム、シュウ酸リチウム、パルミチン酸リチウム、フタル酸リチウム、ピバル酸リチウム、プロピオン酸リチウム、サリチル酸リチウム、ソルビン酸リチウム、ステアリン酸リチウム、コハク酸リチウム、酒石酸リチウム、または吉草酸リチウムである。
いくつかの実施形態では、安定化塩は、酢酸リチウムである。
いくつかの実施形態では、安定化塩は、アルカリ土類塩、例えば、ベリリウム塩、マグネシウム塩、またはカルシウム塩である。
いくつかの実施形態では、安定化塩は、カルシウム塩である。
いくつかの実施形態では、安定化塩は、フッ化カルシウム、臭化カルシウム、臭素酸カルシウム、過臭素酸カルシウム、塩化カルシウム、亜塩素酸カルシウム、水酸化カルシウム、次亜塩素酸カルシウム、過塩素酸カルシウム、ヨウ化カルシウム、ヨウ素酸カルシウム、過ヨウ素酸カルシウム、アジ化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、または硫酸カルシウムである。
いくつかの実施形態では、安定化塩は、酢酸カルシウム、アジピン酸カルシウム、アントラニル酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、安息香酸カルシウム、酪酸カルシウム、ケイ皮酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デカン酸カルシウム、エチルヘキサン酸カルシウム、ギ酸カルシウム、フマル酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、グルタミン酸カルシウム、イソ酪酸カルシウム、乳酸カルシウム、ラウリン酸カルシウム、リンゴ酸カルシウム、マロン酸カルシウム、オクタン酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、パルミチン酸カルシウム、フタル酸カルシウム、ピバル酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、サリチル酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、コハク酸カルシウム、酒石酸カルシウム、または吉草酸カルシウムである。
本明細書に具体的に開示される塩に加えて、当該技術分野で公知の種々の塩（例えば、市販のもの）が、安定化塩に適切であり得ることを理解されたい。本開示の方法またはＬＮＰ製剤に関する塩の有効性は、例えば、作製されたＬＮＰ製剤を、同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤と比較することによって、当業者によって判断され得る。
第１及び第２の緩衝液
いくつかの実施形態では、第１の緩衝液のｐＨ値は、第２の緩衝液のｐＨ値より大きい。
いくつかの実施形態では、第１の緩衝液のｐＨ値は、約７．０以上、約７．２５以上、約７．５以上、約７．７５以上、または約８．０以上である。
いくつかの実施形態では、第１の緩衝液のｐＨ値は、約７．０～約１０、約７．５～約９．５、約７．７５～約９．２５、または約８～約９の範囲である。
いくつかの実施形態では、第１の緩衝液は、第１の緩衝剤を含む。
いくつかの実施形態では、第１の緩衝剤は、凍結乾燥によって実質的に除去することができる。
いくつかの実施形態では、第１の緩衝剤は、凍結乾燥によって完全に除去することができる。
いくつかの実施形態では、第１の緩衝剤は、凍結乾燥によって実質的に除去される。
いくつかの実施形態では、第１の緩衝剤の約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９８％以上、約９９％以上、約９９．５％以上、約９９．８％以上、約９９．９％以上、または約９９．９５％以上が、凍結乾燥によって除去される。
いくつかの実施形態では、第１の緩衝剤は、＊＊ｍｍＨｇで、＊＊以下、＊＊以下、または＊＊以下の昇華点を有する。
いくつかの実施形態では、第１の緩衝剤は、トリエチルアンモニウム塩である。
いくつかの実施形態では、第１の緩衝剤は、トリエチルアンモニウム重炭酸塩である。
いくつかの実施形態では、第１の緩衝液中のトリエチルアンモニウム重炭酸塩の濃度は、約１ｍＭ～約２００ｍＭ、約５ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、または約１５ｍＭ～約２５ｍＭの範囲である。
いくつかの実施形態では、第１の緩衝液中のトリエチルアンモニウム重炭酸塩の濃度は、約２０ｍＭである。
いくつかの実施形態では、第２の緩衝液のｐＨ値は、約９．０以下、約８．７５以下、約８．５以下、約８．２５以下または以上、約８．０以下、約７．７５以下、約７．５以下、約７．２５以下、または約７．０以下である。
いくつかの実施形態では、第２の緩衝液のｐＨ値は、約７．０～約９．０、約７．２５～約８．７５、約７．５～約８．５、または約７．７５～約８．２５の範囲である。
いくつかの実施形態では、第２の緩衝液は、水である。いくつかの実施形態では、第２の緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む。
いくつかの実施形態では、第２の緩衝液中のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの濃度は、約１ｍＭ～約２００ｍＭ、約５ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、または約１５ｍＭ～約２５ｍＭの範囲である。
いくつかの実施形態では、第２の緩衝液中のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの濃度は、約２０ｍＭである。
ＬＮＰ製剤及び脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
いくつかの態様では、本開示のＬＮＰ製剤は、本明細書に開示される方法によって調製される。
いくつかの態様では、本開示のＬＮＰ製剤は、複数のＬＮＰを含み、ＬＮＰは、核酸及びイオン化可能脂質を含む。
本開示の方法に適切な核酸が、本明細書にさらに開示される。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。
本開示の方法に適切なイオン化可能脂質が、本明細書にさらに開示される。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、リン脂質、ＰＥＧ脂質、構造脂質、またはそれらに任意の組み合わせをさらに含む。本開示の方法に適切なリン脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質が、本明細書にさらに開示される。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ製剤は、少なくとも１つの脂質ナノ粒子成分を含む。脂質ナノ粒子は、脂質成分及び１つ以上のさらなる成分、例えば、治療薬及び／または予防薬、例えば、核酸を含み得る。ＬＮＰは、１つ以上の特定の用途または標的のために設計され得る。ＬＮＰの要素は、特定の用途または標的に基づいて、及び／または有効性、毒性、費用、使用の容易さ、入手可能性、または１つ以上の要素の他の特徴に基づいて選択され得る。同様に、ＬＮＰの特定の製剤は、例えば、要素の特定の組み合わせの有効性及び毒性に応じて、特定の用途または標的のために選択され得る。ＬＮＰ製剤の有効性及び忍容性は、製剤の安定性によって影響され得る。
ＬＮＰの脂質成分は、例えば、式（ＩＬ－Ｉ）、（ＩＬ－ＩＡ）、（ＩＬ－ＩＢ）、（ＩＬ－ＩＩ）、（ＩＬ－ＩＩａ）、（ＩＬ－ＩＩｂ）、（ＩＬ－ＩＩｃ）、（ＩＬ－ＩＩｄ）、（ＩＬ－ＩＩｅ）、（ＩＬ－ＩＩｆ）、（ＩＬ－ＩＩｇ）、（ＩＬ－ＩＩＩ）、（ＩＬ－ＩＩＩａ１）、（ＩＬ－ＩＩＩａ２）、（ＩＬ－ＩＩＩａ３）、（ＩＬ－ＩＩＩａ４）、（ＩＬ－ＩＩＩａ５）、（ＩＬ－ＩＩＩａ６）、（ＩＬ－ＩＩＩａ７）、または（ＩＬ－ＩＩＩａ８）で表される脂質、リン脂質（不飽和脂質、例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣなど）、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含み得る。ＬＮＰの脂質成分は、例えば、式（ＩＬ－Ｉ）、（ＩＬ－ＩＡ）、（ＩＬ－ＩＢ）、（ＩＬ－ＩＩ）、（ＩＬ－ＩＩａ）、（ＩＬ－ＩＩｂ）、（ＩＬ－ＩＩｃ）、（ＩＬ－ＩＩｄ）、（ＩＬ－ＩＩｅ）、（ＩＬ－ＩＩｆ）、（ＩＬ－ＩＩｇ）、（ＩＬ－ＩＩＩ）、（ＩＬ－ＩＩＩａ１）、（ＩＬ－ＩＩＩａ２）、（ＩＬ－ＩＩＩａ３）、（ＩＬ－ＩＩＩａ４）、（ＩＬ－ＩＩＩａ５）、（ＩＬ－ＩＩＩａ６）、（ＩＬ－ＩＩＩａ７）、または（ＩＬ－ＩＩＩａ８）で表される脂質、リン脂質（不飽和脂質、例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣなど）、及び構造脂質を含み得る。脂質成分の要素は、特定の割合で提供され得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰの脂質成分は、式（ＩＬ－Ｉ）、（ＩＬ－ＩＡ）、（ＩＬ－ＩＢ）、（ＩＬ－ＩＩ）、（ＩＬ－ＩＩａ）、（ＩＬ－ＩＩｂ）、（ＩＬ－ＩＩｃ）、（ＩＬ－ＩＩｄ）、（ＩＬ－ＩＩｅ）、（ＩＬ－ＩＩｆ）、（ＩＬ－ＩＩｇ）、（ＩＬ－ＩＩＩ）、（ＩＬ－ＩＩＩａ１）、（ＩＬ－ＩＩＩａ２）、（ＩＬ－ＩＩＩａ３）、（ＩＬ－ＩＩＩａ４）、（ＩＬ－ＩＩＩａ５）、（ＩＬ－ＩＩＩａ６）、（ＩＬ－ＩＩＩａ７）、または（ＩＬ－ＩＩＩａ８）で表される脂質、リン脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰの脂質成分は、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の式（ＩＬ－Ｉ）、（ＩＬ－ＩＡ）、（ＩＬ－ＩＢ）、（ＩＬ－ＩＩ）、（ＩＬ－ＩＩａ）、（ＩＬ－ＩＩｂ）、（ＩＬ－ＩＩｃ）、（ＩＬ－ＩＩｄ）、（ＩＬ－ＩＩｅ）、（ＩＬ－ＩＩｆ）、（ＩＬ－ＩＩｇ）、（ＩＬ－ＩＩＩ）、（ＩＬ－ＩＩＩａ１）、（ＩＬ－ＩＩＩａ２）、（ＩＬ－ＩＩＩａ３）、（ＩＬ－ＩＩＩａ４）、（ＩＬ－ＩＩＩａ５）、（ＩＬ－ＩＩＩａ６）、（ＩＬ－ＩＩＩａ７）、または（ＩＬ－ＩＩＩａ８）の化合物、約０ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％のリン脂質、約１８．５ｍｏｌ％～約４８．５ｍｏｌ％の構造脂質、及び約０ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含み、ただし、総ｍｏｌ％は、１００％を超えない。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の脂質成分は、約３５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％の式（ＩＬ－Ｉ）、（ＩＬ－ＩＡ）、（ＩＬ－ＩＢ）、（ＩＬ－ＩＩ）、（ＩＬ－ＩＩａ）、（ＩＬ－ＩＩｂ）、（ＩＬ－ＩＩｃ）、（ＩＬ－ＩＩｄ）、（ＩＬ－ＩＩｅ）、（ＩＬ－Ｉｌｆ）、（ＩＬ－ＩＩｇ）、（ＩＬ－ＩＩＩ）、（ＩＬ－ＩＩＩａ１）、（ＩＬ－ＩＩＩａ２）、（ＩＬ－ＩＩＩａ３）、（ＩＬ－ＩＩＩａ４）、（ＩＬ－ＩＩＩａ５）、（ＩＬ－ＩＩＩａ６）、（ＩＬ－ＩＩＩａ７）、または（ＩＬ－ＩＩＩａ８）の化合物、約５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％のリン脂質、約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％の構造脂質、及び約０ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。特定の実施形態では、脂質成分は、約５０ｍｏｌ％の前記化合物、約１０ｍｏｌ％のリン脂質、約３８．５ｍｏｌ％の構造脂質、及び約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。別の特定の実施形態では、脂質成分は、約４０ｍｏｌ％の前記化合物、約２０ｍｏｌ％のリン脂質、約３８．５ｍｏｌ％の構造脂質、及び約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧであり得、及び／または構造脂質は、コレステロールであり得る。
脂質ナノ粒子は、１つ以上の特定の用途または標的のために設計され得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＲＮＡなどの治療薬及び／または予防薬を、哺乳動物の身体における特定の細胞、組織、器官、またはそれらの系もしくは群に送達するように設計され得る。脂質ナノ粒子の生理化学的特性は、特定の身体上の標的に対する選択性を高めるために改変され得る。例えば、粒径が、様々な器官の開窓（ｆｅｎｅｓｔｒａｔｉｏｎ）のサイズに基づいて調節され得る。ＬＮＰに含まれる治療薬及び／または予防薬はまた、１つ以上の所望の送達標的に基づいて選択され得る。いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬は、特定の適応症、病態、疾患、または障害のために、及び／または特定の細胞、組織、器官、またはそれらの系もしくは群への送達（例えば、局所的または特異的送達）のために選択され得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、目的のポリペプチドを作製するように細胞内で翻訳されることができる目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含み得る。このような組成物は、特定の器官に特異的に送達されるように設計され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、哺乳動物の肝臓に特異的に送達されるように設計され得る。
ＬＮＰ中の治療薬及び／または予防薬の量は、脂質ナノ粒子のサイズ、組成、所望の標的及び／または用途、または他の特性並びに治療薬及び／または予防薬の特性に依存し得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰに有用なＲＮＡの量は、ＲＮＡのサイズ、配列、及び他の特性に依存し得る。ＬＮＰ中の治療薬及び／または予防薬及び他の要素（例えば、脂質）の相対量も変化し得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ中の脂質成分の治療薬及び／または予防薬、例えば、核酸に対する重量／重量比は、約５：１～約６０：１、例えば、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、及び６０：１であり得る。いくつかの実施形態では、脂質成分の治療薬及び／または予防薬に対する重量／重量比は、約１０：１～約４０：１であり得る。いくつかの実施形態では、重量／重量比は、約２０：１である。ＬＮＰ中の治療薬及び／または予防薬の量は、例えば、吸収分光法（例えば、紫外－可視分光法）を用いて測定され得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上のＲＮＡを含み、１つ以上のＲＮＡ、脂質、及びそれらの量は、特定のＮ：Ｐ比をもたらすように選択され得る。組成物のＮ：Ｐ比は、１つ以上の脂質中の窒素原子の、ＲＮＡ中のリン酸基の数に対するモル比を指す。一般に、より低いＮ：Ｐ比が好ましい。１つ以上のＲＮＡ、脂質、及びそれらの量は、約２：１～約３０：１、例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１、２０：１、２２：１、２４：１、２６：１、２８：１、または３０：１のＮ：Ｐ比をもたらすように選択され得る。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約２：１～約８：１であり得る。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約５：１～約８：１である。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約５．０：１、約５．５：１、約５．６７：１、約６．０：１、約６．５：１、または約７．０：１であり得る。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約５．６７：１であり得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰを含む製剤は、塩、例えば、塩化物塩をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰを含む製剤は、糖、例えば、二糖をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、製剤は糖をさらに含むが、塩、例えば、塩化物塩は含まない。
物理的特性
本開示のＬＮＰの物理的特性は、様々な方法によって特性決定され得る。いくつかの実施形態では、顕微鏡法（例えば、透過電子顕微鏡法または走査電子顕微鏡法）が、ＬＮＰの形態及びサイズ分布を調べるのに使用され得る。動的光散乱または電位差測定法（例えば、電位差滴定法）が、ゼータ電位を測定するのに使用され得る。動的光散乱はまた、粒径を決定するのに用いられ得る。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）などの機器がまた、ナノ粒子組成物の複数の特性、例えば、粒径、多分散指数、及びゼータ電位を決定するのに使用され得る。
ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定して、数１０ｎｍ～数１００ｎｍであり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、例えば、約４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、または１５０ｎｍであり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約９０ｎｍ、約５０ｎｍ～約８０ｎｍ、約５０ｎｍ～約７０ｎｍ、約５０ｎｍ～約６０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ、約６０ｎｍ～約８０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、または約９０ｎｍ～約１００ｎｍであり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約７０ｎｍ～約１００ｎｍであり得る。特定の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約８０ｎｍであり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約１００ｎｍであり得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約１ｍｍ～約５００ｍｍ、約５ｍｍ～約２００ｍｍ、約１０ｍｍ～約１００ｍｍ、約２０ｍｍ～約８０ｍｍ、約２５ｍｍ～約６０ｍｍ、約３０ｍｍ～約５５ｍｍ、約３５ｍｍ～約５０ｍｍ、または約３８ｍｍ～約４２ｍｍの範囲である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤と比較して、約９９％以下、約９８％以下、約９７％以下、約９６％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、または約１０％以下である。
ＬＮＰは、比較的均一であり得る。多分散指数が、ＬＮＰの均一性、例えば、脂質ナノ粒子の粒径分布を示すのに使用され得る。小さい（例えば、０．３未満の）多分散指数は、一般に、狭い粒径分布を示す。ＬＮＰは、約０～約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、または０．２５の多分散指数を有し得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰの多分散指数は、約０．１０～約０．２０であり得る。
ＬＮＰのゼータ電位は、組成物の運動電位を示すのに使用され得る。いくつかの実施形態では、ゼータ電位は、ＬＮＰの表面電荷を表し得る。比較的低い電荷（正電荷か負電荷かにかかわらず）を有する脂質ナノ粒子が一般に望ましいが、これは、より高度に帯電した種は、細胞、組織、及び体内の他の要素と望まれない相互作用をし得るためである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのゼータ電位は、約－１０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約－５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－５ｍＶ～約０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、または約＋５ｍＶ～約＋１０ｍＶであり得る。
治療薬及び／または予防薬、例えば、核酸の封入の効率は、提供される初期の量と比べた、調製後に封入されるかまたは他の形でＬＮＰと会合する治療薬及び／または予防薬の量を表す。封入効率は、高いのが望ましい（例えば、ほぼ１００％）。封入効率は、例えば、１つ以上の有機溶媒または洗浄剤で脂質ナノ粒子を分解する前及び後の脂質ナノ粒子を含有する溶液中の治療薬及び／または予防薬の量を比較することによって測定され得る。アニオン交換樹脂が、溶液中の遊離治療薬及び／または予防薬（例えば、ＲＮＡ）の量を測定するために使用され得る。蛍光が、溶液中の遊離治療薬及び／または予防薬（例えば、ＲＮＡ）の量を測定するのに使用され得る。本明細書に記載される脂質ナノ粒子では、治療薬及び／または予防薬の封入効率は、少なくとも５０％、例えば５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、封入効率は、少なくとも８０％であり得る。いくつかの実施形態では、封入効率は、少なくとも９０％であり得る。いくつかの実施形態では、封入効率は、少なくとも９５％であり得る。
ＬＮＰは、任意選択により、１つ以上のコーティングを含み得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、コーティングを有するカプセル、フィルム、または錠剤において製剤化され得る。本明細書に記載される組成物を含むカプセル、フィルム、または錠剤は、任意の有用なサイズ、引張り強さ、硬度、または密度を有し得る。
化学的特性
本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の化学的特性は、様々な方法によって特性決定され得る。いくつかの実施形態では、電気泳動（例えば、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、逆相液体クロマトグラフィー）は、ｍＲＮＡ完全性を調べるのに使用され得る。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＬＮＰ完全性は、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上である。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＬＮＰ完全性は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＬＮＰ完全性より約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約２００倍以上、約３００倍以上、約４００倍以上、約５００倍以上、約１０００倍以上、約２０００倍以上、約３０００倍以上、約４０００倍以上、約５０００倍以上、または約１００００倍以上高い。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＴ８０％は、約１２か月以上、約１５か月以上、約１８か月以上、約２１か月以上、約２４か月以上、約２７か月以上、約３０か月以上、約３３か月以上、約３６か月以上、約４８か月以上、約６０か月以上、約７２か月以上、約８４か月以上、約９６か月以上、約１０８か月以上、約１２０か月以上である。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＴ８０％は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＴ８０％より約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上長い。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＴ１／２は、約１２か月以上、約１５か月以上、約１８か月以上、約２１か月以上、約２４か月以上、約２７か月以上、約３０か月以上、約３３か月以上、約３６か月以上、約４８か月以上、約６０か月以上、約７２か月以上、約８４か月以上、約９６か月以上、約１０８か月以上、約１２０か月以上である。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＴ１／２は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＴ１／２より約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上長い。
定義
本明細書で使用する場合、「アルキル」または「アルキル基」という用語は、任意選択により置換された、１個以上の炭素原子（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれ以上の炭素原子）を含む直コンカテマーまたは分枝コンカテマー飽和炭化水素を意味する。「Ｃ１－１４アルキル」という表記は、１～１４個の炭素原子を含む任意選択により置換された直コンカテマーまたは分枝コンカテマー飽和炭化水素を意味する。特に規定されない限り、本明細書に記載されるアルキル基は、非置換及び置換アルキル基の両方を指す。
本明細書で使用する場合、「アルケニル」または「アルケニル基」という用語は、任意選択により置換された、２個以上の炭素原子（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれ以上の炭素原子）及び少なくとも１つの二重結合を含む直コンカテマーまたは分枝コンカテマー炭化水素を意味する。「Ｃ２－１４アルケニル」という表記は、２～１４個の炭素原子及び少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を含む任意選択により置換された直コンカテマーまたは分枝コンカテマー炭化水素を意味する。アルケニル基は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の炭素－炭素二重結合を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃ１８アルケニルは、１つ以上の二重結合を含み得る。２つの二重結合を含むＣ１８アルケニル基は、リノレイル基であり得る。特に規定されない限り、本明細書に記載されるアルケニル基は、非置換及び置換アルケニル基の両方を指す。
本明細書で使用する場合、「炭素環」または「炭素環式基」という用語は、炭素原子の１つ以上の環を含む任意選択により置換された単環または多環系を意味する。環は、３員、４員、５員、６員、７員、８員、９員、１０員、１１員、１２員、１３員、１４員、１５員、１６員、１７員、１８員、１９員、または２０員環であり得る。「Ｃ３－６炭素環」という表記は、３～６個の炭素原子を有する単環を含む炭素環を意味する。炭素環は、１つ以上の炭素－炭素二重または三重結合を含んでもよく、非芳香族または芳香族（例えば、シクロアルキルまたはアリール基）であり得る。炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ナフチル、及び１，２－ジヒドロナフチル基が挙げられる。本明細書で使用する場合の「シクロアルキル」という用語は、非芳香族炭素環を意味し、任意の二重または三重結合を含んでもまたは含まなくてもよい。特に規定されない限り、本明細書に記載される炭素環は、非置換及び置換炭素環基の両方、すなわち、任意選択により置換された炭素環を指す。
本明細書で使用する場合、「複素環」または「複素環式基」という用語は、少なくとも１つの環が少なくとも１個のヘテロ原子を含む、１つ以上の環を含む任意選択により置換された単環または多環系を意味する。ヘテロ原子は、例えば、窒素、酸素、または硫黄原子であり得る。環は、３員、４員、５員、６員、７員、８員、９員、１０員、１１員、１２員、１３員、または１４員環であり得る。複素環は、１つ以上の二重または三重結合を含んでもよく、非芳香族または芳香族（例えば、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリール基）であり得る。複素環の例としては、イミダゾリル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、イソキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、モルホリニル、ピロリル、ピロリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チオフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、キノリル、及びイソキノリル基が挙げられる。本明細書で使用する場合の「ヘテロシクロアルキル」という用語は、非芳香族複素環を意味し、任意の二重または三重結合を含んでもまたは含まなくてもよい。特に規定されない限り、本明細書に記載される複素環は、非置換及び置換複素環基の両方、すなわち、任意選択により置換された複素環を指す。
本明細書で使用する場合、「生分解性基」は、哺乳動物の実体内の脂質のより速い代謝を促進し得る基である。生分解性基は、限定はされないが、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、
－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され得る。本明細書で使用する場合、「アリール基」は、１つ以上の芳香環を含む任意選択により置換された炭素環式基である。アリール基の例としては、フェニル及びナフチル基が挙げられる。本明細書で使用する場合、「ヘテロアリール基」は、１つ以上の芳香環を含む任意選択により置換された複素環式基である。ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、及びチアゾリルが挙げられる。アリール及びヘテロアリール基は両方とも、任意選択により置換され得る。いくつかの実施形態では、Ｍ及びＭ’は、任意選択により置換されたフェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる非限定的な群から選択され得る。本明細書の式中、Ｍ及びＭ’は、独立して、上記の生分解性基の一覧から選択され得る。特に規定されない限り、本明細書に記載されるアリールまたはヘテロアリール基は、非置換及び置換された基の両方、すなわち、任意選択により置換されたアリールまたはヘテロアリール基を指す。
アルキル、アルケニル、及びシクリル（例えば、カルボシクリル及びヘテロシクリル）基は、特に規定されない限り、任意選択により置換され得る。任意選択の置換基は、限定はされないが、ハロゲン原子（例えば、塩化物、臭化物、フッ化物、またはヨウ化物基）、カルボン酸（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、アルコール（例えば、ヒドロキシル、－ＯＨ）、エステル（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＯＲまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アルデヒド（例えば、－Ｃ（Ｏ）Ｈ）、カルボニル（例えば、－Ｃ（Ｏ）Ｒ、あるいはＣ＝Ｏによって表される）、ハロゲン化アシル（例えば、－Ｃ（Ｏ）Ｘ、ここで、Ｘが、臭化物、フッ化物、塩化物、及びヨウ化物から選択されるハロゲン化物である）、カーボネート（例えば、－ＯＣ（Ｏ）ＯＲ）、アルコキシ（例えば、－ＯＲ）、アセタール（例えば、－Ｃ（ＯＲ）２Ｒ””、ここで、各ＯＲが、同じかまたは異なり得るアルコキシ基であり、Ｒ””が、アルキルまたはアルケニル基である）、ホスフェート（例えば、Ｐ（Ｏ）４ ３－）、チオール（例えば、－ＳＨ）、スルホキシド（例えば、－Ｓ（Ｏ）Ｒ）、スルフィン酸（例えば、－Ｓ（Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（例えば、－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、チアール（例えば、－Ｃ（Ｓ）Ｈ）、サルフェート（例えば、Ｓ（Ｏ）４ ２－）、スルホニル（例えば、－Ｓ（Ｏ）２－）、アミド（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、または－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ）、アジド（例えば、－Ｎ３）、ニトロ（例えば、－ＮＯ２）、シアノ（例えば、－ＣＮ）、イソシアノ（例えば、－ＮＣ）、アシルオキシ（例えば、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アミノ（例えば、－ＮＲ２、－ＮＲＨ、または－ＮＨ２）、カルバモイル（例えば、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲＨ、または－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２）、スルホンアミド（例えば、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲＨ、－Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ、または－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ）、アルキル基、アルケニル基、及びシクリル（例えば、カルボシクリルまたはヘテロシクリル）基からなる群から選択され得る。上記のいずれかにおいて、Ｒが、本明細書に定義されるように、アルキルまたはアルケニル基である。いくつかの実施形態では、置換基自体が、例えば、１、２、３、４、５、または６つの本明細書に定義される置換基でさらに置換され得る。いくつかの実施形態では、Ｃ１－６アルキル基は、１、２、３、４、５、または６つの本明細書に定義される置換基でさらに置換され得る。
約、およそ：本明細書で使用する場合、目的の１つ以上の値に適用される際の「およそ」及び「約」という用語は、記載される参照値と類似の値を指す。いくつかの実施形態では、ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特に記載しない限りまたは文脈から別の解釈が明らかでない限り（ただし、このような数値が考えられる値の１００％を超える場合を除く）、記載される参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、それ以下の値の両方向（超または未満）の範囲を指す。いくつかの実施形態では、ＬＮＰの脂質成分における所与の化合物の量に関して使用される場合、「約」は、記載される値の＋／－１０％を意味し得る。例えば、約４０％の所与の化合物を有する脂質成分を含むＬＮＰは、３０～５０％の化合物を含み得る。
本明細書で使用する場合、「化合物」という用語は、示される構造のあらゆる異性体及び同位体を含むことを意味する。「同位体」は、同じ原子番号を有するが、核内の異なる中性子数に起因する異なる質量数を有する原子を指す。いくつかの実施形態では、水素の同位体としては、トリチウム及び重水素が挙げられる。さらに、本開示の化合物、塩、または複合体は、常法によって、溶媒和物及び水和物を形成するために、溶媒または水分子と組み合わせて調製され得る。
本明細書で使用する場合、「接触させる」という用語は、２つ以上の実体間の物理的接続を確立することを意味する。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞を、ＬＮＰと接触させることは、哺乳動物細胞及びナノ粒子に、物理的接続を共有させることを意味する。細胞を外部の実体とインビボ及びエクスビボの両方で接触させる方法は、生物学分野において周知である。いくつかの実施形態では、哺乳動物内に配置されたＬＮＰ及び哺乳動物細胞を接触させることは、様々な投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下）によって行われてもよく、様々な量の脂質ナノ粒子を含み得る。さらに、２つ以上の哺乳動物細胞が、ＬＮＰによって接触され得る。
本明細書で使用する場合、「同等の方法」という用語は、比較される方法（例えば、本開示のＬＮＰ製剤の作製方法）と同等のパラメーターまたはステップを有する方法を指す。いくつかの実施形態では、「同等の方法」は、比較される方法のステップｉ）、ｉａ）、ｉａａ）、ｉｂ）、ｉｉ）、ｉｉａ）、ｉｉｂ）、ｉｉｃ）、ｉｉｄ）、及びｉｉｅ）の１つ以上を有する方法である。いくつかの実施形態では、「同等の方法」は、比較される方法のステップｉ）、ｉａ）、ｉａａ）、ｉｂ）、ｉｉ）、ｉｉａ）、ｉｉｂ）、ｉｉｃ）、ｉｉｄ）、及びｉｉｅ）の１つ以上を有さない方法である。いくつかの実施形態では、「同等の方法」は、比較される方法のステップｉａ）及びｉｂ）の１つ以上を有さない方法である。いくつかの実施形態では、「同等の方法」は、核酸の水溶性塩を採用する方法である。いくつかの実施形態では、「同等の方法」は、有機溶媒可溶性核酸を含まない有機溶液を採用する方法である。いくつかの実施形態では、「同等の方法」は、脂質ナノ粒子製剤の投与前に脂質ナノ粒子を処理することを含む方法である。
本明細書で使用する場合、「送達する」という用語は、実体を目的地に提供することを意味する。いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬を対象に送達することは、治療薬及び／または予防薬を含むＬＮＰを、対象に（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、または皮下経路によって）投与することを含み得る。哺乳動物または哺乳動物細胞へのＬＮＰの投与は、１つ以上の細胞を、脂質ナノ粒子と接触させることを含み得る。
本明細書で使用する場合、「向上した送達」という用語は、目的の標的組織（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）への対照ナノ粒子による治療薬及び／または予防薬の送達のレベルと比較して、目的の標的組織（例えば、哺乳動物の肝臓）へのナノ粒子による治療薬及び／または予防薬の、より多い（例えば、少なくとも１．５倍多い、少なくとも２倍多い、少なくとも３倍多い、少なくとも４倍多い、少なくとも５倍多い、少なくとも６倍多い、少なくとも７倍多い、少なくとも８倍多い、少なくとも９倍多い、少なくとも１０倍多い）送達を意味する。特定の組織へのナノ粒子の送達のレベルは、組織において作製されるタンパク質の量を、前記組織の重量と比較するか、組織内の治療薬及び／または予防薬の量を、前記組織の重量と比較するか、組織において作製されるタンパク質の量を、前記組織内の総タンパク質の量と比較するか、または組織内の治療薬及び／または予防薬の量を、前記組織内の総治療薬及び／または予防薬の量と比較することによって測定され得る。標的組織へのナノ粒子の向上した送達が、治療される対象において決定される必要がなく、それが動物モデル（例えば、ラットモデル）などの代理において決定され得ることが理解されよう。
本明細書で使用する場合、「特異的送達」、「特異的に送達する」、または「特異的に送達すること」という用語は、標的以外の組織（例えば、哺乳動物の脾臓）と比較して、目的の標的組織（例えば、哺乳動物の肝臓）へのナノ粒子による治療薬及び／または予防薬の、より多い（例えば、少なくとも１．５倍多い、少なくとも２倍多い、少なくとも３倍多い、少なくとも４倍多い、少なくとも５倍多い、少なくとも６倍多い、少なくとも７倍多い、少なくとも８倍多い、少なくとも９倍多い、少なくとも１０倍多い）送達を意味する。特定の組織へのナノ粒子の送達のレベルは、組織において作製されるタンパク質の量を、前記組織の重量と比較するか、組織内の治療薬及び／または予防薬の量を、前記組織の重量と比較するか、組織において作製されるタンパク質の量を、前記組織内の総タンパク質の量と比較するか、または組織内の治療薬及び／または予防薬の量を、前記組織内の総治療薬及び／または予防薬と比較することによって測定され得る。いくつかの実施形態では、腎血管標的については、治療薬及び／または予防薬の全身投与後に肝臓または脾臓に送達されるものと比較して、組織１ｇ当たり１．５、２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、または２０倍多い治療薬及び／または予防薬が腎臓に送達される場合、治療薬及び／または予防薬は、肝臓及び脾臓と比較して、哺乳動物の腎臓に特異的に送達される。標的組織に特異的に送達するナノ粒子の能力が、治療される対象において決定される必要はなく、動物モデル（例えば、ラットモデル）などの代理において決定され得ることが理解されよう。
本明細書で使用する場合、「封入効率」は、ＬＮＰの調製に使用される治療薬及び／または予防薬の最初の総量に対する、ＬＮＰの一部になる治療薬及び／または予防薬の量を指す。いくつかの実施形態では、組成物に最初に提供される合計１００ｍｇの治療薬及び／または予防薬のうち９７ｍｇの治療薬及び／または予防薬が、ＬＮＰに封入される場合、封入効率は、９７％として示され得る。
本明細書で使用する場合、「封入」、「封入された」、「負荷された」、及び「会合された」は、完全な、実質的な、または部分的な包接（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）、閉じ込め（ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）、包囲（ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ）、または包み込み（ｅｎｃａｓｅｍｅｎｔ）を指し得る。本明細書で使用する場合、「封入」または「会合」とは、個々の核酸分子をナノ粒子内に閉じ込める、及び／または、個々の核酸分子とナノ粒子の間の物理化学的関係を確立するプロセスを指す。本明細書で使用する場合、「空のナノ粒子」とは、治療薬または予防薬を実質的に含まないナノ粒子を指す。本明細書で使用する場合、「空のナノ粒子」とは、核酸を実質的に含まないナノ粒子を指す。本明細書で使用する場合、「空のナノ粒子」とは、脂質成分のみから実質的になるナノ粒子を指す。
本明細書で使用する場合、核酸配列の「発現」は、ポリペプチドまたはタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳、及び／またはポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾を指す。
本明細書で使用する場合、「インビトロ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、または微生物）内ではなく、人工環境、例えば、試験管または反応容器、細胞培養物、ペトリ皿などで起こる事象を指す。
本明細書で使用する場合、「インビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、または微生物またはそれらの細胞もしくは組織）内で起こる事象を指す。
本明細書で使用する場合、「エクスビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、または微生物またはそれらの細胞もしくは組織）の外部で起こる事象を指す。エクスビボ事象は、天然（例えば、インビボ）環境から最小限に変化された環境内で起こり得る。
本明細書で使用する場合、「異性体」という用語は、化合物の任意の幾何異性体、互変異性体、両性イオン、立体異性体、鏡像異性体、またはジアステレオマーを意味する。化合物は、１つ以上のキラル中心及び／または二重結合を含んでもよく、従って、立体異性体、例えば、二重結合異性体（すなわち、幾何Ｅ／Ｚ異性体）またはジアステレオマー（例えば、鏡像異性体（すなわち、（＋）もしくは（－））またはシス／トランス異性体）として存在し得る。本開示は、立体異性体的に純粋な形態（例えば、幾何的に純粋、鏡像異性的に純粋、またはジアステレオマーとして純粋な）並びに鏡像異性体及び立体異性体混合物、例えば、ラセミ体を含む、本明細書に記載される化合物のあらゆる異性体を包含する。化合物の鏡像異性体及び立体異性体混合物及びそれらをそれらの成分鏡像異性体または立体異性体に分割する手段は周知である。
本明細書で使用する場合、「脂質成分」は、１つ以上の脂質を含む脂質ナノ粒子の成分である。いくつかの実施形態では、脂質成分は、１つ以上のカチオン性／イオン化可能脂質、ＰＥＧ化脂質、構造脂質、または他の脂質、例えば、リン脂質を含み得る。
本明細書で使用する場合、「リンカー」は、２つの部分を連結する部分、例えば、キャップ種の２つのヌクレオシド間の結合である。リンカーは、限定はされないが、リン酸基（例えば、ホスフェート、ボラノリン酸、チオホスフェート、セレノホスフェート、及びホスホネート）、アルキル基、アミデート、またはグリセロールを含む１つ以上の基を含み得る。いくつかの実施形態では、キャップ類似体の２つのヌクレオシドは、三リン酸基または２つのリン酸部分及びボラノリン酸部分を含む鎖によって、それらの５’位において連結され得る。
本明細書で使用する場合、「投与の方法」は、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または組成物を対象に送達する他の方法を含み得る。投与の方法は、身体の特定の領域または系に標的送達する（例えば、特異的に送達する）ように選択され得る。
本明細書で使用する場合、「修飾」は、非天然を意味する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、修飾ＲＮＡであり得る。すなわち、ＲＮＡは、天然でない１つ以上の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーを含み得る。「修飾」種は、本明細書において「改変」種と呼ばれることもある。種は、化学的に、構造的に、または機能的に修飾または改変され得る。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基種は、天然でない１つ以上の置換を含み得る。
本明細書で使用する場合、「Ｎ：Ｐ比」は、例えば、脂質成分及びＲＮＡを含むＬＮＰ中の、ＲＮＡ中のリン酸基に対する脂質中のイオン性（生理学的ｐＨ範囲で）窒素原子のモル比である。
本明細書で使用する場合、「脂質ナノ粒子」は、１つ以上の脂質を含む組成物である。脂質ナノ粒子は、典型的に、マイクロメートル台またはより小さいサイズであり、脂質二重層脂質ナノ粒子を含み得る。脂質ナノ粒子は、本明細書で使用する場合、特に規定されない限り、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質小胞）、及びリポプレックスを包含する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、５００ｎｍ以下の直径を有する脂質二重層を有するリポソームであり得る。
本明細書で使用する場合、「天然に存在する」は、人工的な補助なしに自然界に存在することを意味する。
本明細書で使用する場合、「患者」は、治療を求めるまたは治療が必要となり得る、治療を必要とする、治療を受けている、治療を受ける予定の対象、または特定の疾患または病態について専門家による医療を受けている対象を指す。
本明細書で使用する場合、「ＰＥＧ脂質」または「ＰＥＧ化脂質」は、ポリエチレングリコール成分を含む脂質を指す。
「薬学的に許容される」という語句は、本明細書において、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに好適であり、妥当なリスク・ベネフィット比に見合う、化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指すために用いられる。
本明細書で使用する場合の「薬学的に許容される賦形剤」という語句は、本明細書に記載される化合物以外の任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁、複合体化、または溶解させることができるビヒクル）であって、患者において実質的に非毒性かつ非炎症性である特性を有する成分を指す。賦形剤としては、例えば、：固結防止剤、酸化防止剤、結合剤、コーティング、圧縮アジュバント、崩壊剤、染料（色素）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、膜形成剤またはコーティング、香味料、香料、滑剤（流動促進剤）、潤滑剤、防腐剤、印刷インク、吸着剤、懸濁剤もしくは分散剤、甘味料、及び水和水が挙げられる。例示的な賦形剤としては、限定はされないが：チル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドンヨード、アルファデンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ（α－トコフェロール）、ビタミンＣ、キシリトール、及び本明細書に開示される他の種が挙げられる。
組成物は、１つ以上の化合物の塩も含み得る。塩は、薬学的に許容される塩であり得る。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される塩」は、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換することによって（例えば、遊離塩基基を適切な有機酸と反応させることによって）親化合物が改変された、開示される化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、限定はされないが、アミンなどの塩基性残基の無機または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩が挙げられる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンホラート、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチネート、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、並びに非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、及びアミンカチオン（限定はされないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含む）が挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩は、例えば、非毒性無機または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩を含む。本開示の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成され得る。一般に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、水もしくは有機溶媒中、または両者の混合物中で、化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製され得；一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。適切な塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ及びＣ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８，及びＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１－１９（１９７７）（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に見出される。
本明細書で使用する場合、「リン脂質」は、リン酸部分と、不飽和脂肪酸鎖などの１つ以上の炭素鎖とを含む脂質である。リン脂質は、１つ以上の多重（例えば、二重または三重）結合（例えば、１つ以上の不飽和）を含んでもよい。リン脂質またはその類似体もしくは誘導体は、コリンを含んでもよい。リン脂質またはその類似体もしくは誘導体は、コリンを含まない場合がある。特定のリン脂質は、膜への融合を促進することができる。いくつかの実施形態では、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つ以上の負に荷電したリン脂質と相互作用できる。膜へのリン脂質の融合は、脂質含有組成物の１つ以上の要素が、膜を通過することを可能にでき、例えば、１つ以上の要素の細胞への送達を可能にする。
本明細書で使用する場合、「多分散指数」は、系の粒径分布の均一性を表す比率である。例えば、０．３未満の小さい値は、狭い粒径分布を示す。
本明細書で使用する場合、両親媒性「ポリマー」は、オリゴマーまたはポリマーを含む両親媒性化合物である。いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマーは、２つ以上のＰＥＧモノマー単位などのオリゴマー断片を含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される両親媒性ポリマーは、ＰＳ２０であり得る。
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」または「目的のポリペプチド」という用語は、天然でまたは合成で作製（例えば、単離または精製）され得るペプチド結合によって典型的に結合されるアミノ酸残基のポリマーを指す。
本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ」は、天然に存在するかまたは天然に存在しないリボ核酸を指す。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１つ以上の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーなどの修飾された及び／または天然に存在しない成分を含み得る。ＲＮＡは、キャップ構造、鎖終止ヌクレオシド、ステムループ、ポリＡ配列、及び／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。ＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり得る。特定のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳、例えば、哺乳動物細胞内のｍＲＮＡのインビボ翻訳は、コードされたポリペプチドを作製し得る。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー基質ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）及びそれらの混合物からなる非限定的な群から選択され得る。
本明細書で使用する場合、「単一単位用量」は、１用量／１回／単一経路／単一接触点、すなわち、単回の投与イベントで投与される任意の治療薬の用量である。
本明細書で使用する場合、「分割用量」は、単一単位用量または１日総用量を２つ以上の用量に分割することである。
本明細書で使用する場合、「１日総用量」は、２４時間の期間に投与または処方される量である。それは、単一単位用量として投与され得る。
明細書において使用される際、「対象」という用語は、例えば、実験、診断、予防薬、及び／または治療目的で本開示に係る組成物または製剤が投与され得るいずれかの生物を指す。典型的な対象としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒトなどの哺乳動物）及び／または植物が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「Ｔｘ」とは、ＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の核酸完全性（例えば、ｍＲＮＡ完全性）が、ＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の調製に使用した核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の初期完全性の約Ｘに劣化するまでの時間の量を指す。例えば、「Ｔ８０％」とは、ＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の核酸完全性（例えば、ｍＲＮＡ完全性）が、ＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の調製に使用した核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の初期完全性の約８０％に劣化するまでの時間の量を指す。別の例として、「Ｔ１／２」とは、ＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の核酸完全性（例えば、ｍＲＮＡ完全性）が、ＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥ＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の調製に使用した核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の初期完全性の約１／２に劣化するまでの時間の量を指す。
本明細書で使用する場合、「標的細胞」は、任意の１つ以上の目的の細胞を指す。細胞は、インビトロ、インビボ、インサイチュ、または生物の組織もしくは器官において見出され得る。生物は、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、例えば、患者であり得る。
本明細書で使用する場合、「標的組織」は、治療薬及び／または予防薬の送達が、所望の生物学的及び／または薬理学的効果をもたらし得る任意の１つ以上の目的の組織タイプを指す。目的の標的組織の例としては、特定の組織、器官、及びその系または群が挙げられる。特定の用途において、標的組織は、腎臓、肺、脾臓、血管の血管内皮（例えば、冠動脈内または大腿骨内）、または腫瘍組織（例えば、腫瘍内投与によって）であり得る。「標的以外の組織」は、コードされたタンパク質の発現が、所望の生物学的及び／または薬理学的効果をもたらさない任意の１つ以上の組織タイプを指す。特定の用途において、標的以外の組織は、肝臓及び脾臓を含み得る。
「治療薬」または「予防薬」という用語は、対象に投与されると、治療、診断、及び／または予防効果を有する、及び／または所望の生物学的及び／または薬理学的効果を引き起こす任意の薬剤を指す。治療薬は、「活性物質（ａｃｔｉｖｅ）」または「活性剤」とも呼ばれる。このような薬剤としては、限定はされないが、細胞毒素、放射性イオン、化学療法剤、小分子薬剤、タンパク質、及び核酸が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「治療有効量」という用語は、感染症、疾患、障害、及び／または病態に罹患しているか、または罹患しやすい対象に投与されると、感染症、疾患、障害、及び／または病態を治療する、その症状を改善する、診断する、予防する、及び／またはその開始を遅延させるのに十分な送達される薬剤（例えば、核酸、薬剤、組成物、治療薬、診断剤、予防薬など）の量を意味する。
本明細書で使用する場合、「トランスフェクション」は、種（例えば、ＲＮＡ）を細胞に導入することを指す。トランスフェクションは、例えば、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで行われ得る。
本明細書で使用する場合、「治療する」という用語は、特定の感染症、疾患、障害、及び／または病態の１つ以上の症状または特徴の部分的もしくは完全な緩和、回復、改善、軽減、その開始の遅延、その進行の阻害、その重症度の軽減、及び／またはその発生率の低下を指す。いくつかの実施形態では、がんを「治療する」ことは、腫瘍の生存、成長、及び／または広がりの阻害を指し得る。治療は、疾患、障害、及び／または病態に関連する病変を発症するリスクを低減する目的で、疾患、障害、及び／または病態の兆候を示していない対象及び／または疾患、障害、及び／または病態の初期兆候しか示していない対象に投与され得る。
本明細書で使用する場合、「ゼータ電位」は、例えば、粒子組成物中の脂質の運動電位である。
イオン化可能脂質
本開示は、イオン化可能脂質、例えば、中心のアミン部分及び少なくとも１つの生分解性基を含むイオン化可能脂質を提供する。本明細書に記載される脂質は、哺乳動物細胞もしくは臓器への治療薬及び／または予防薬、例えば、核酸の送達のために、脂質ナノ粒子及び脂質ナノ粒子製剤において有利に使用され得る。
いくつかの態様では、本開示のイオン化可能脂質は、式（ＩＬ－１）：
の化合物の１つ以上、またはそれらのＮオキシド、またはそれらの塩もしくは異性体であり得、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合される原子と一緒に、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４は、水素、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－（ＣＨ２）ｏＣ（Ｒ１０）２（ＣＨ２）ｎ－ｏＱ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｏは、独立して、１、２、３、及び４から選択され、及び各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、ＯＨ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、ＯＨ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、ここで、Ｍ”は、結合、Ｃ１－１３アルキルまたはＣ２－１３アルケニルであり、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１－３アルキル、及びＣ２－３アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、（ＣＨ２）ｑＯＲ＊、及びＨからなる群から選択され、及び各ｑは、独立して、１、２、及び３から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３－１５アルキル及びＣ３－１５アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、及び
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択され、及び式中、Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが、１、２、３、４または５である場合、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２ではなく、または（ｉｉ）ｎが、１または２である場合、Ｑは、５、６、または７員のヘテロシクロアルキルではない。
いくつかの態様では、本開示のイオン化可能脂質は、式（ＩＬ－Ｘ）：
の化合物の１つ以上、またはそのＮオキシド、またはその塩もしくは異性体であり得、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合される原子と一緒に、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４は、水素、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－（ＣＨ２）ｏＣ（Ｒ１０）２（ＣＨ２）ｎ－ｏＱ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｏは、独立して、１、２、３、及び４から選択され、及び各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、、
Ｒｘは、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、－（ＣＨ２）ＶＯＨ、及び－（ＣＨ２）ＶＮ（Ｒ）２からなる群から選択され、
式中、ｖは、１、２、３、４、５、及び６から選択され、
各Ｒ５は、独立して、ＯＨ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、ＯＨ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、ここで、Ｍ”は、結合、Ｃ１－１３アルキルまたはＣ２－１３アルケニルであり、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１－３アルキル、及びＣ２－３アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、（ＣＨ２）ｑＯＲ＊、及びＨからなる群から選択され、
及び各ｑは、独立して、１、２、及び３から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３－１５アルキル及びＣ３－１５アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、及び
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される。
いくつかの実施形態では、式（ＩＬ－Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＬ－ＩＡ）：
の化合物、またはそのＮオキシド、またはその塩もしくは異性体を含み、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、水素、非置換Ｃ１－３アルキル、－（ＣＨ２）ｏＣ（Ｒ１０）２（ＣＨ２）ｎ－ｏＱ、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、及びＲ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。例えば、ｍは、５、７、または９である。例えば、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。例えば、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＬ－ＩＢ）：
の化合物、またはそのＮオキシド、またはその塩もしくは異性体を含み、ここで、全ての可変要素は、本明細書で定義される通りである。いくつかの実施形態では、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｒ４は、水素、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、－ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、及びＲ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｍは、５、７、または９である。いくつかの実施形態では、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。いくつかの実施形態では、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
いくつかの実施形態では、式（ＩＬ－Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＬ－ＩＩ）：
の化合物、またはそのＮオキシド、またはその塩もしくは異性体を含み、式中、ｌは、１、２、３、４及び５から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、水素、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、２、３、または４であり、及びＱは、－ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、及びＲ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの態様では、本開示のイオン化可能脂質の化合物は、式（ＩＬ－ＶＩ）：
の化合物の１つ以上、またはそのＮオキシド、またはその塩もしくは異性体の１つ以上であり得、
式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合される原子と一緒に、複素環または炭素環を形成し、
各Ｒ５は、独立して、ＯＨ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、ＯＨ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、ここで、Ｍ”は、結合、Ｃ１－１３アルキルまたはＣ２－１３アルケニルであり、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｈ、Ｃ１－３アルキル、及びＣ２－３アルケニルからなる群から選択され、
ＲＮは、Ｈ、またはＣ１－３アルキルであり、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３－１５アルキル及びＣ３－１５アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
Ｘａ及びＸｂは各々独立して、ＯまたはＳであり、
Ｒ１０は、Ｈ、ハロ、－ＯＨ、Ｒ、－Ｎ（Ｒ）２、－ＣＮ、－Ｎ３、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＯＲ、－ＳＲ、－Ｓ（Ｏ）Ｒ、－Ｓ（Ｏ）ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２ＯＲ、－ＮＯ２、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－ＮＨ（ＣＨ２）ｔ１Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨ（ＣＨ２）ｐ１Ｏ（ＣＨ２）ｑ１Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨ（ＣＨ２）ｓ１ＯＲ、－Ｎ（（ＣＨ２）ｓ１ＯＲ）２、炭素環、複素環、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択され、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から選択され、
ｒは、０または１であり、
ｔｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、、
ｐｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、、
ｑｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、及び
ｓｌは、１、２、３、４、及び５から選択される。
いくつかの実施形態では、式（ＩＬ－ＶＩ）の化合物のサブセットは、式（ＩＬ－ＶＩ－ａ）：
の化合物、またはそのＮオキシド、またはその塩もしくは異性体を含み、式中、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択され、及び
Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合される原子と一緒に、複素環または炭素環を形成する。
別の実施形態では、式（ＩＬ－ＶＩ）の化合物のサブセットは、式（ＩＬ－ＶＩＩ）：
の化合物、またはそのＮオキシド、またはその塩もしくは異性体を含み、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、及び
Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
別の実施形態では、式（ＩＬ－ＶＩ）の化合物のサブセットは、式（ＩＬ－ＶＩＩＩ）：
の化合物、またはそのＮオキシド、またはその塩もしくは異性体を含み、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、及び
Ｒａ’及びＲｂ’は、独立して、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択され、及び
Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
式（ＩＬ－Ｉ）、（ＩＬ－ＩＡ）、（ＩＬ－ＶＩ）、（ＩＬ－ＶＩ－ａ）、（ＩＬ－ＶＩＩ）または（ＩＬ－ＶＩＩＩ）のいずれの１つの化合物も、該当する場合、以下の特徴の１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、Ｍ１は、Ｍ’である。
いくつかの実施形態では、Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態では、Ｍ及びＭ’の少なくとも１つは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｍ及びＭ’の少なくとも１つは、－ＯＣ（Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｍは、－ＯＣ（Ｏ）－であり、Ｍ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｍは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、Ｍ’は、－ＯＣ（Ｏ）－である。ある特定の実施形態では、Ｍ及びＭ’は各々、－ＯＣ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｍ及びＭ’は各々、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｍ及びＭ’の少なくとも１つは、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。
いくつかの実施形態では、Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｓ－Ｓ－である。
いくつかの実施形態では、Ｍ及びＭ’の少なくとも１つは、－Ｓ－Ｓ－である。
いくつかの実施形態では、Ｍ及びＭ’の一方は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－であり、他方は、－Ｓ－Ｓ－である。例えば、Ｍは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－もしくは－ＯＣ（Ｏ）－であり、Ｍ’は、－Ｓ－Ｓ－であるか、またはＭ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－もしくは－ＯＣ（Ｏ）－であり、Ｍは、－Ｓ－Ｓ－である。
いくつかの実施形態では、Ｍ及びＭ’の一方は、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、ここで、Ｍ”は、結合、Ｃ１－１３アルキルまたはＣ２－１３アルケニルである。他の実施形態では、Ｍ”は、Ｃ１－６アルキルまたはＣ２－６アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｍ”は、Ｃ１－４アルキルまたはＣ２－４アルケニルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｍ”は、Ｃ１アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｍ”は、Ｃ２アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｍ”は、Ｃ３アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｍ”は、Ｃ４アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｍ”は、Ｃ２アルケニルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｍ”は、Ｃ３アルケニルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｍ”は、Ｃ４アルケニルである。
いくつかの実施形態では、ｌは、１、３、または５である。
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、水素である。
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、水素ではない。
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、非置換メチルまたは－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
いくつかの実施形態では、Ｑは、ＯＨである。
いくつかの実施形態では、Ｑは、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２である。
いくつかの実施形態では、Ｑは、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。
いくつかの実施形態では、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒである。
いくつかの実施形態では、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
いくつかの実施形態では、Ｑは、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２である。
いくつかの実施形態では、Ｑは、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲである。
いくつかの実施形態では、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８である。
いくつかの実施形態では、Ｑは、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２である。
いくつかの実施形態では、Ｑは、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２である。
いくつかの実施形態では、Ｑは、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。
いくつかの実施形態では、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲである。
いくつかの実施形態では、ｎは、２である。
いくつかの実施形態では、ｎは、３である。
いくつかの実施形態では、ｎは、４である。
いくつかの実施形態では、Ｍ１は、存在しない。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ５は、ヒドロキシルである。例えば、１つのＲ５は、ヒドロキシルである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ６は、ヒドロキシルである。例えば、１つのＲ６は、ヒドロキシルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ５及びＲ６の１つは、ヒドロキシルである。例えば、１つのＲ５は、ヒドロキシルであり、各Ｒ６は、水素である。例えば、１つのＲ６は、ヒドロキシルであり、各Ｒ５は、水素である。
いくつかの実施形態では、Ｒｘは、Ｃ１－６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒｘは、Ｃ１－３アルキルである。例えば、Ｒｘは、メチルである。例えば、Ｒｘは、エチルである。例えば、Ｒｘは、プロピルである。
いくつかの実施形態では、Ｒｘは、－（ＣＨ２）ｖＯＨであり、ｖは、１、２または３である。例えば、Ｒｘは、メタノイルである。例えば、Ｒｘは、エタノイルである。例えば、Ｒｘは、プロパノイルである。
いくつかの実施形態では、Ｒｘは、－（ＣＨ２）ｖＮ（Ｒ）２であり、ｖは、１、２または３であり、各Ｒは、Ｈまたはメチルである。例えば、Ｒｘは、メタンアミノ、メチルメタンアミノ、またはジメチルメタンアミノである。例えば、Ｒｘは、アミノメタニル、メチルアミノメタニル、またはジメチルアミノメタニルである。例えば、Ｒｘは、アミノエタニル、メチルアミノエタニル、またはジメチルアミノエタニルである。例えば、Ｒｘは、アミノプロパニル、メチルアミノプロパニル、またはジメチルアミノプロパニルである。
いくつかの実施形態では、R’は、Ｃ１－１８アルキル、C２－１８アルケニル、-R*ＹＲ”、または-ＹＲ”である。
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｃ３－１４アルキルまたはＣ３－１４アルケニルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１ｂは、Ｃ１－１４アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１ｂは、Ｃ２－１４アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１ｂは、Ｃ３－１４アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１ｂは、Ｃ１－８アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１ｂは、Ｃ１－５アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１ｂは、Ｃ１－３アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１ｂは、Ｃ１アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、及びＣ５アルキルから選択される。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ１ｂは、Ｃ１アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ１ｂは、Ｃ２アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ１ｂは、Ｃ３アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ１ｂは、Ｃ４アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ１ｂは、Ｃ５アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、－（ＣＨＲ５Ｒ６）ｍ－Ｍ－ＣＲ２Ｒ３Ｒ７とは異なる。
いくつかの実施形態では、－ＣＨＲ１ａＲ１ｂ－は、－（ＣＨＲ５Ｒ６）ｍ－Ｍ－ＣＲ２Ｒ３Ｒ７とは異なる。
いくつかの実施形態では、Ｒ７は、Ｈである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は、Ｃ１－３アルキルから選択される。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ７は、Ｃ１アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ７は、Ｃ２アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ７は、Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は、Ｃ４アルキル、Ｃ４アルケニル、Ｃ５アルキル、Ｃ５アルケニル、Ｃ６アルキル、Ｃ６アルケニル、Ｃ７アルキル、Ｃ７アルケニル、Ｃ９アルキル、Ｃ９アルケニル、Ｃ１１アルキル、Ｃ１１アルケニル、Ｃ１７アルキル、Ｃ１７アルケニル、Ｃ１８アルキル、及びＣ１８アルケニルから選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒｂ’は、Ｃ１－１４アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒｂ’は、Ｃ２－１４アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒｂ’は、Ｃ３－１４アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒｂ’は、Ｃ１－８アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒｂ’は、Ｃ１－５アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒｂ’は、Ｃ１－３アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒｂ’は、Ｃ１アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、及びＣ５アルキルから選択される。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒｂ’は、Ｃ１アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒｂ’は、Ｃ２アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒｂ’は、Ｃ３アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒｂ’は、Ｃ４アルキルである。
いくつかの実施形態では、式（ＩＬ－Ｉ）の化合物は、式（ＩＬ－ＩＩａ）：
の化合物、またはそれらのＮオキシド、またはそれらの塩もしくは異性体であり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載される通りである。
別の実施形態では、式（ＩＬ－Ｉ）の化合物は、式（ＩＬ－ＩＩｂ）：
の化合物、またはそれらのＮオキシド、またはそれらの塩もしくは異性体であり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載される通りである。
別の実施形態では、式（ＩＬ－Ｉ）の化合物は、式（ＩＬ－ＩＩｃ）または（ＩＬ－ＩＩｅ）：
の化合物、またはそれらのＮオキシド、またはそれらの塩もしくは異性体であり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載される通りである。
別の実施形態では、式（ＩＬ－Ｉ）の化合物は、式（ＩＬ－ＩＩｆ）：
の化合物、またはそれらのＮオキシド、またはそれらの塩もしくは異性体であり、式中、Ｍは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－であり、Ｍ”は、Ｃ１－６アルキルまたはＣ２－６アルケニルであり、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択され、ｎは、２、３、及び４から選択される。
さらなる実施形態では、式（ＩＬ－Ｉ）の化合物は、式（ＩＬ－ＩＩｄ）：
の化合物、またはそれらのＮオキシド、またはそれらの塩もしくは異性体であり、式中、ｎは、２、３、または４であり、及びｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ２～Ｒ６は、本明細書に記載される通りである。例えば、Ｒ２及びＲ３の各々は、独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択され得る。
さらなる実施形態では、式（ＩＬ－Ｉ）の化合物は、式（ＩＬ－ｇ）：
の化合物、またはそれらのＮオキシド、またはそれらの塩もしくは異性体であり、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、及びＲ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｍ”は、Ｃ１－６アルキル（例えば、Ｃ１－４アルキル）またはＣ２－６アルケニル（例えば、Ｃ２－４アルケニル）である。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択される。
別の実施形態では、式（ＩＬ－ＶＩ）の化合物のサブセットは、式（ＩＬ－ＶＩＩａ）：
の化合物、またはそのＮオキシド、またはそれらの塩もしくは異性体を含む。
別の実施形態では、式（ＶＩ）の化合物のサブセットは、式（ＩＬ－ＶＩＩＩａ）：
の化合物、またはそのＮオキシド、またはそれらの塩もしくは異性体を含む。
別の実施形態では、式（ＩＬ－ＶＩ）の化合物のサブセットは、式（ＩＬ－ＶＩＩＩｂ）：
の化合物、またはそのＮオキシド、またはそれらの塩もしくは異性体を含む。
別の実施形態では、式（ＩＬ－ＶＩ）の化合物のサブセットは、式（ＩＬ－ＶＩＩｂ－１）：
の化合物、またはそのＮオキシド、またはそれらの塩もしくは異性体を含む。
別の実施形態では、式（ＩＬ－ＶＩ）の化合物のサブセットは、式（ＩＬ－ＶＩＩｂ－２）：
Figure 0007635131000020
の化合物、またはそのＮオキシド、またはそれらの塩もしくは異性体を含む。
別の実施形態では、式（ＩＬ－ＶＩ）の化合物のサブセットは、式（ＩＬ－ＶＩＩｂ－３）：
の化合物、またはそのＮオキシド、またはそれらの塩もしくは異性体を含む。
別の実施形態では、式（ＩＬ－ＶＩ）の化合物のサブセットは、式（ＩＬ－ＶＩＩｃ）：
の化合物、またはそのＮオキシド、またはそれらの塩もしくは異性体を含む。
別の実施形態では、式（ＩＬ－ＶＩ）の化合物のサブセットは、式（ＩＬ－ＶＩＩｄ）：
の化合物、またはそのＮオキシド、またはそれらの塩もしくは異性体を含む。
別の実施形態では、式（ＩＬ－ＶＩ）の化合物のサブセットは、式（ＩＬ－ＶＩＩＩｃ）：
の化合物を含む。
別の実施形態では、式（ＩＬ－ＶＩ）の化合物のサブセットは、式（ＩＬ－ＶＩＩＩｄ）：
の化合物、またはそのＮオキシド、またはそれらの塩もしくは異性体を含む。
式（ＩＬ－Ｉ）、（ＩＬ－ＩＡ）、（ＩＬ－ＩＢ）、（ＩＬ－ＩＩ）、（ＩＬ－ＩＩａ）、（ＩＬ－ＩＩｂ）、（ＩＬ－ＩＩｃ）、（ＩＬ－ＩＩｄ）、（ＩＬ－ＩＩｅ）、（ＩＬ－ＩＩｆ）、（ＩＬ－ＩＩｇ）、（ＩＬ－ＩＩＩ）、（ＩＬ－ＶＩ）、（ＩＬ－ＶＩ－ａ）、（ＩＬ－ＶＩＩ）、（ＩＬ－ＶＩＩＩ）、（ＩＬ－ＶＩＩａ）、（ＩＬ－ＶＩＩＩａ）、（ＩＬ－ＶＩＩＩｂ）、（ＩＬ－ＶＩＩｂ－１）、（ＩＬ－ＶＩＩｂ－２）、（ＩＬ－ＶＩＩｂ－３）、（ＩＬ－ＶＩＩｃ）、（ＩＬ－ＶＩＩｄ）、（ＩＬ－ＶＩＩＩｃ）、または（ＩＬ－ＶＩＩＩｄ）のいずれの１つの化合物も、該当する場合、以下の特徴の１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、米国出願第６２／２２０，０９１号、同６２／２５２，３１６号、同６２／２５３，４３３号、同６２／２６６，４６０号、同６２／３３３，５５７号、同６２／３８２，７４０号、同６２／３９３，９４０号、同６２／４７１，９３７号、同６２／４７１，９４９号、同６２／４７５，１４０号、及び同６２／４７５，１６６号、及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２号に記載されている化合物の１つ以上である。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、米国出願第６２／４７５，１６６号に記載されている化合物１～２８０から選択される。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、
またはその塩である。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、
またはその塩である。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、
またはその塩である。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、
またはその塩である。
いくつかの態様では、本開示のイオン化可能脂質は、式（ＩＬ－ＩＩＩ）：
の化合物の１つ以上、またはその塩もしくは異性体であり得、式中、
Ｗは、
であり、
環Ａは、
であり、
ｔは、１または２であり、
Ａ１及びＡ２は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、式中、ＺがＣＨ２である場合、破線（１）及び（２）は、各々、単結合を表し、及びＺが不在である場合、破線（１）及び（２）は、両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ’ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
Ｒｘ１及びＲｘ２は各々独立して、ＨまたはＣ１－３アルキルであり、
各Ｍは、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
Ｍ＊は、Ｃ１－Ｃ６アルキルであり、
Ｗ１及びＷ２は各々独立して、－Ｏ－及び－Ｎ（Ｒ６）－からなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｈ及びＣ１－５アルキルからなる群から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、独立して、結合、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎ－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３－１２アルキル、Ｃ３－１２アルケニル及び－Ｒ＊ＭＲ’からなる群から選択され、及び
ｎは、１～６の整数であり、
式中、環Ａが、
である場合、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３－ＣＨ２－でなく、及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’である。
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＬ－ＩＩＩａ１）～（ＩＬ－ＩＩＩａ８）：
のいずれかである。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、米国出願第６２／２７１，１４６号、同第６２／３３８，４７４号、同第６２／４１３，３４５号、及び同第６２／５１９，８２６号、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５２００９号、及び国際公開第ＷＯ２０１７／１１２８６５、ＷＯ２０１７／０４９２４５、及びＷＯ２０１８／１７０３０６に記載される化合物の１つ以上である。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、米国出願第６２／５１９，８２６号に記載される化合物１～１５６から選択される。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、米国出願第６２／５１９，８２６号に記載される化合物１～１６、４２～６６、６８～７６、及び７８～１５６から選択される。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、
またはその塩である。
式（ＩＬ－１）、（ＩＬ－ＩＡ）、（ＩＬ－ＩＢ）、（ＩＬ－ＩＩ）、（ＩＬ－ＩＩａ）、（ＩＬ－ＩＩｂ）、（ＩＬ－ＩＩｃ）、（ＩＬ－ＩＩｄ）、（ＩＬ－ＩＩｅ）、（ＩＬ－ＩＩｆ）、（ＩＬ－ＩＩｇ）、（ＩＬ－ＩＩＩ）、（ＩＬ－ＩＩＩａｌ）、（ＩＬ－ＩＩＩａ２）、（ＩＬ－ＩＩＩａ３）、（ＩＬ－ＩＩＩａ４）、（ＩＬ－ＩＩＩａ５）、（ＩＬ－ＩＩＩａ６）、（ＩＬ－ＩＩＩａ７）、または（ＩＬ－ＩＩＩａ８）で表される脂質の中心のアミン部分は、生理学的ｐＨでプロトン化され得る。従って、脂質は、生理学的ｐＨで正電荷または部分正電荷を有し得る。このような脂質は、カチオン性またはイオン性（アミノ）脂質と呼ばれ得る。脂質はまた、両性イオン性、すなわち、正電荷及び負電荷の両方を有する中性分子であり得る。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミンプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミンプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、及び（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる群から選択される。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質
本明細書で使用する場合、「ＰＥＧ脂質」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を指す。ＰＥＧ脂質の非限定例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、及びＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが挙げられる。このような脂質は、ＰＥＧ化脂質とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質には、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルメトレイル、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ－１，２－ジミリスチルオクスルプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質の脂質部分には、約Ｃ１４～約Ｃ２２、好ましくは約Ｃ１４～約Ｃ１６の長さを有するものが含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分、例えば、ｍＰＥＧ－ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００、または２０，０００ダルトンのサイズを有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含むことができる。非拡散性ＰＥＧの非限定例としては、ＰＥＧ－ＤＳＧ及びＰＥＧ－ＤＳＰＥが挙げられる。
ＰＥＧ脂質は、米国特許第８１５８６０１号及び国際公開ＷＯ２０１５／１３０５８４ Ａ２に記載されているものなど、当該技術分野で知られており、これらは、その参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一般に、本明細書に記載される様々な式の他の脂質成分のいくつか（例えば、ＰＥＧ脂質）は、２０１６年１２月１０日に出願された「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ」と題する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９に記載のように合成することができ、当該出願は、その参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
脂質ナノ粒子または脂質ナノ粒子製剤の脂質成分は、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質などのポリエチレングリコールを含む１つ以上の分子を含んでもよい。そのような種は、代替的にＰＥＧ化脂質と呼ばれる場合がある。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む非限定的な群から選択され得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧの修飾形態である。ＰＥＧ－ＤＭＧは、以下の構造を有する。
いくつかの実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、国際公開ＷＯ２０１２０９９７５５に記載されているＰＥＧ化脂質であり得、その内容はその参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるこれらの例示的なＰＥＧ脂質のいずれも、ＰＥＧ鎖上にヒドロキシル基を含むように修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質である。本明細書で一般的に定義されるように、「ＰＥＧ－ＯＨ脂質」（本明細書では「ヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質」とも呼ばれる）は、脂質上に１つ以上のヒドロキシル（－ＯＨ）基を有するＰＥＧ化脂質である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨ脂質には、ＰＥＧ鎖に１つ以上のヒドロキシル基が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨまたはヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ鎖の末端に－ＯＨ基を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、式（ＰＬ－Ｉ）の化合物である。本明細書に提供されるのは、式（ＰＬ－Ｉ）：
の化合物、またはその塩であり、式中、
Ｒ３は、－ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意選択により置換されたアルキル、または酸素保護基であり、
ｒは、１～１００の整数であり、両端を含み、
Ｌ１は、任意選択により置換されたＣ１－１０アルキレンであり、ここで任意選択により置換されたＣ１－１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンは、任意選択により置換されたカルボシクリレン、任意選択により置換されたヘテロシクリレン、任意選択により置換されたアリーレン、任意選択により置換されたヘテロアリーレン、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、－ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）によって独立して置き換えられ、
Ｄは、クリックケミストリーによって得られる部分または生理学的条件下で切断可能な部分であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、式：
であり、
Ｌ２の各々の例は、独立して、結合または任意選択により置換されたＣ１－６アルキレンであり、式中、任意選択により置換されたＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位は、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）によって任意選択により置き換えられ、
Ｒ２の各々の例は、独立して、任意選択により置換されたＣ１－３０アルキル、任意選択により置換されたＣ１－３０アルケニル、または任意選択により置換されたＣ１－３０アルキニルであり、任意選択により、ここでＲ２の１つ以上のメチレン単位は、任意選択により置換されたカルボシクリレン、任意選択により置換されたヘテロシクリレン、任意選択により置換されたアリーレン、任意選択により置換されたヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、－Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏによって独立して置き換えられ、
ＲＮの各々の例は、独立して、水素、任意選択により置換されたアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意選択により置換されたカルボシクリル、任意選択により置換されたヘテロシクリル、任意選択により置換されたアリール、または任意選択により置換されたヘテロアリールであり、
ｐは、１または２である。
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ－Ｉ）の化合物は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質（すなわち、Ｒ３が－ＯＲＯであり、かつＲＯが水素である）。いくつかの実施形態では、式（ＰＬ－Ｉ）の化合物は、式（ＰＬ－Ｉ－ＯＨ）：
またはその塩である。
いくつかの実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ化脂肪酸である。いくつかの実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、式（ＰＬ－ＩＩ）の化合物である。本明細書に提供されるのは、式（ＰＬ－ＩＩ）：
の化合物、またはその塩であり、式中、
Ｒ３は、－ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意選択により置換されたアルキル、または酸素保護基であり、
ｒは、１～１００の整数であり、両端を含み、
Ｒ５は、任意選択により置換されたＣ１０－４０アルキル、任意選択により置換されたＣ１０－４０アルケニル、または任意選択により置換されたＣ１０－４０アルキニルであり、及び任意選択により、Ｒ５の１つ以上のメチレン基は、任意選択により置換されたカルボシクリレン、任意選択により置換されたヘテロシクリレン、任意選択により置換されたアリーレン、任意選択により置換されたヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏによって置き換えられ、及び
ＲＮの各々の例は、独立して、水素、任意選択により置換されたアルキル、または窒素保護基である。
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ－ＩＩ）の化合物は、式（ＰＬ－ＩＩ－ＯＨ）：
またはその塩であり、式中、
ｒは、１～１００の整数であり、
Ｒ５は、任意選択により置換されたＣ１０－４０アルキル、任意選択により置換されたＣ１０－４０アルケニル、または任意選択により置換されたＣ１０－４０アルキニルであり、及び任意選択により、Ｒ５の１つ以上のメチレン基は、任意選択により置換されたカルボシクリレン、任意選択により置換されたヘテロシクリレン、任意選択により置換されたアリーレン、任意選択により置換されたヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏによって置き換えられ、及び
ＲＮの各々の例は、独立して、水素、任意選択により置換されたアルキル、または窒素保護基である。
いくつかの実施形態では、ｒは、１０～８０、２０～７０、３０～６０、または４０～５０の整数である。
いくつかの実施形態では、ｒは、４５である。
いくつかの実施形態では、Ｒ５は、Ｃ１７アルキルである。
さらに他の実施形態では、式（ＰＬ－ＩＩ）の化合物は、
またはその塩である。
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ－ＩＩ）の化合物は、
である。
いくつかの態様では、本明細書に記載される医薬組成物の脂質組成物は、ＰＥＧ脂質を含まない。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、米国特許出願第６２／５２０，５３０号に記載されているＰＥＧ脂質の１つ以上であり得る。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、式（ＰＬ－ＩＩＩ）：
の化合物、またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｓは、１～１００の整数である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、以下の式：
の化合物、またはその塩もしくは異性体である。
構造脂質
本明細書で使用する場合、「構造脂質」という用語は、ステロールを指し、ステロール部分を含む脂質をも指す。
脂質ナノ粒子への構造脂質の組み込みは、粒子内の他の脂質の凝集を緩和するのを助け得る。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイド、及びそれらの混合物を含むがこれらに限定されない群から選択できる。いくつかの実施形態では、構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、及びステロイドから各々独立して選択される２つ以上の成分の混合物である。いくつかの実施形態では、構造脂質は、ステロールである。いくつかの実施形態では、構造脂質は、２つ以上のステロールの混合物である。本明細書で定義される場合、「ステロール」は、ステロイドアルコールからなるステロイドのサブグループである。いくつかの実施形態では、構造脂質は、ステロイドである。いくつかの実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、構造脂質は、コレステロールの類似体である。いくつかの実施形態では、構造脂質は、アルファ－トコフェロールである。
いくつかの実施形態では、構造脂質は、米国特許出願第６２／５２０，５３０号に記載されている１つ以上の構造脂質であり得る。
封入剤
本開示のいくつかの実施形態では、封入剤は、式（ＥＡ－Ｉ）の化合物：
またはその塩もしくは異性体であり、式中、
Ｒ２０１及びＲ２０２は各々独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、及び（Ｃ＝ＮＨ）Ｎ（Ｒ１０１）２からなる群から選択され、式中、各Ｒ１０１は、独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、及びＣ２－Ｃ６アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ２０３は、Ｃ１－Ｃ２０アルキル及びＣ２－Ｃ２０アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ２０４は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ１－Ｃ２０アルキル）、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ２－Ｃ２０アルケニル）、Ｃ（Ｏ）（ＮＨＣ１－Ｃ２０アルキル）、及びＣ（Ｏ）（ＮＨＣ２－Ｃ２０アルケニル）からなる群から選択され、
ｎ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ２０１及びＲ２０２は各々独立して、Ｈ及びＣＨ３からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ２０１及びＲ２０２は各々独立して、（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２及び（Ｃ＝ＮＨ）Ｎ（ＣＨ３）２からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ２０３は、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ８－Ｃ１８アルキル、及びＣ１２－Ｃ１６アルキルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ２０４は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ１－Ｃ２０アルキル）、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ２－Ｃ２０アルケニル）、Ｃ（Ｏ）（ＮＨＣ１－Ｃ２０アルキル）、及びＣ（Ｏ）（ＮＨＣ２－Ｃ２０アルケニル）、Ｃ８－Ｃ１８アルキル、Ｃ８－Ｃ１８アルケニル、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ８－Ｃ１８アルキル）、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ８－Ｃ１８アルケニル）、Ｃ（Ｏ）（ＮＨＣ８－Ｃ１８アルキル）、及びＣ（Ｏ）（ＮＨＣ８－Ｃ１８アルケニル）、及びＣ１２－Ｃ１６アルキル、Ｃ１２－Ｃ１６アルケニル、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ１２－Ｃ１６アルキル）、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ１２－Ｃ１６アルケニル）、Ｃ（Ｏ）（ＮＨＣ１２－Ｃ１６アルキル）、及びＣ（Ｏ）（ＮＨＣ１２－Ｃ１６アルケニル）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ｎ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から選択され、ｎ１は、１、２、３、４、５、及び６から選択され、ｎ１は、２、３、及び４から選択される。
いくつかの実施形態では、ｎ１は、３である。
本開示のいくつかの実施形態では、封入剤は、式（ＥＡ－ＩＩ）の化合物：
またはその塩もしくは異性体であり、式中、
Ｘ１０１は、結合、ＮＨ、またはＯであり、
Ｒ１０１及びＲ１０２は各々独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、及びＣ２－Ｃ６アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ１０３及びＲ１０４は各々独立して、Ｃ１－Ｃ２０アルキル及びＣ２－Ｃ２０アルケニルからなる群から選択され、及び
ｎ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｘ１０１は、結合である。
いくつかの実施形態では、Ｘ１０１は、ＮＨである。
いくつかの実施形態では、Ｘ１０１は、Ｏである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１０１及びＲ１０２は各々独立して、Ｈ及びＣＨ３からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ１０３は、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ８－Ｃ１８アルキル、及びＣ１２－Ｃ１６アルキルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ１０４は、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ８－Ｃ１８アルキル、及びＣ１２－Ｃ１６アルキルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ｎ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から選択され、ｎ１は、１、２、３、４、５、及び６から選択され、ｎ１は、２、３、及び４から選択される。
いくつかの実施形態では、ｎ１は、３である。
例示的な封入剤としては、エチル・ラウロイルアルギン酸、エチル・ミリストイルアルギン酸、エチル・パルミトイルアルギン酸、エチル・コレストロールアルギン酸、オレイン酸エチルアルギン酸塩、カプリン酸エチルアルギン酸塩、及びカプリル酸エチルアルギン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、封入剤は、エチル・ラウロイルアルギン酸
または塩もしくは異性体である。
ある特定の実施形態では、封入剤は、
からなる群から選択される少なくとも１つの化合物、またはそれらの塩及び異性体、例えば、遊離塩基、ＴＦＡ塩、及び／またはＨＣｌ塩である。
リン脂質
リン脂質は、１つ以上の脂質二重層に集合する場合がある。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び１つ以上の脂肪酸部分を含む。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択することができる。
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択することができる。
特定のリン脂質は、膜への融合を促進することができる。いくつかの実施形態では、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つ以上の負に荷電したリン脂質と相互作用できる。膜へのリン脂質の融合は、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つ以上の要素（例えば、治療薬）が膜を通過することを可能にし、例えば、１つ以上の要素の標的組織への送達を可能にする。
分岐、酸化、環化、及びアルキンを含む修飾及び置換を伴う天然種を含む非天然リン脂質種もまた想定される。いくつかの実施形態では、リン脂質は、１つ以上のアルキン（例えば、１つ以上の二重結合が三重結合で置き換えられたアルケニル基）で官能化または架橋することができる。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドへの曝露時に銅触媒による環化付加を起こし得る。そのような反応は、ナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化して膜透過もしくは細胞認識を促進するか、またはナノ粒子組成物をターゲティングまたはイメージング部分（例えば、色素）などの有用な成分に結合するのに有用であり得る。
リン脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジン酸などのグリセロリン脂質が挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質には、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴ糖脂質も含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、ＤＳＰＣの類似体またはバリアントである。いくつかの実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、式（ＰＬ－Ｉ）：
の化合物またはその塩であり、式中、
各々のＲ１は、独立して、任意選択により置換されたアルキルであるか、または任意選択により、２つのＲ１は、介在原子と一緒になって、任意選択により置換された単環式カルボシクリルもしくは任意選択により置換された単環式ヘテロシクリルを形成するか、または、任意選択により３つのＲ１が介在原子と一緒になって、任意選択により置換された二環式カルボシクリルもしくは任意選択により置換された二環式ヘテロシクリルを形成し、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、式：
であり、
Ｌ２の各々の例は、独立して、結合または任意選択により置換されたＣ１－６アルキレンであり、式中、任意選択により置換されたＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位は、－Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、または－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－によって任意選択により置き換えられ、
Ｒ２の各々の例は、独立して、任意選択により置換されたＣ１－３０アルキル、任意選択により置換されたＣ１－３０アルケニル、または任意選択により置換されたＣ１－３０アルキニルであり、任意選択により、式中、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、任意選択により置換されたカルボシクリレン、任意選択により置換されたヘテロシクリレン、任意選択により置換されたアリーレン、任意選択により置換されたヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－によって独立して置き換えられ、
ＲＮの各々の例は、独立して、水素、任意選択により置換されたアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意選択により置換されたカルボシクリル、任意選択により置換されたヘテロシクリル、任意選択により置換されたアリール、または任意選択により置換されたヘテロアリールであり、及び
ｐは、１または２であり、
ただし、この化合物は、式：
（式中、Ｒ２の各例は、独立して、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである）
の化合物ではない。
いくつかの実施形態では、リン脂質は、米国特許出願第６２／５２０，５３０号に記載されているリン脂質のうちの１つ以上であり得る。
いくつかの実施形態では、リン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的群から選択することができる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰには、ＤＳＰＣが含まれる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰには、ＤＯＰＥが含まれる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰには、ＤＳＰＣとＤＯＰＥの両方が含まれる。
ｉ）リン脂質頭部の修飾
いくつかの実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、修飾リン脂質頭部（例えば、修飾コリン基）を含む。いくつかの実施形態では、修飾された頭部を有するリン脂質は、修飾された第４級アミンを有するＤＳＰＣまたはその類似体である。いくつかの実施形態では、式（ＰＬ－Ｉ）の実施形態では、Ｒ１のうちの少なくとも１つはメチルではない。いくつかの実施形態では、Ｒ１の少なくとも１つは、水素でもメチルでもない。いくつかの実施形態では、式（ＰＬ－Ｉ）の化合物は以下の式：
のうちの１つまたはその塩であり、式中、
各ｔは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各ｕは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各ｖは、独立して、１、２、または３である。
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ－Ｉ）の化合物は、式（ＰＬ－Ｉ－ａ）：
の化合物、またはその塩である。
いくつかの実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を含む。いくつかの実施形態では、本発明において有用なリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を有するＤＳＰＣまたはその類似体である。いくつかの実施形態では、式（ＰＬ－Ｉ）の化合物は、式（ＰＬ－Ｉ－ｂ）：
の化合物、またはその塩である。
ｉｉ）リン脂質尾部の修飾
いくつかの実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、修飾された尾部を含む。いくつかの実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、修飾された尾部を有するＤＳＰＣまたはその類似体である。本明細書に記載される場合、「修飾された尾部」は、より短いまたはより長い脂肪族鎖、分岐が導入された脂肪族鎖、置換基が導入された脂肪族鎖、１つ以上のメチレンが環状またはヘテロ原子基で置換された脂肪族鎖、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、（ＰＬ－Ｉ）の化合物は、式（ＰＬ－Ｉ－ａ）の化合物、またはその塩であり、式中、Ｒ２の少なくとも１つの例は、Ｒ２の各々の例は、任意選択により置換されたＣ１－３０アルキルであり、式中、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、任意選択により置換されたカルボシクリレン、任意選択により置換されたヘテロシクリレン、任意選択により置換されたアリーレン、任意選択により置換されたヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－によって独立して置き換えられる。
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ－Ｉ）の化合物は、式（ＰＬ－Ｉ－ｃ）：
の化合物、またはその塩であり、式中、
各ｘは、独立して、０～３０の整数であり、その両端を含み、及び
Ｇの各例は、独立して、任意選択により置換されたカルボシクリレン、任意選択により置換されたヘテロシクリレン、任意選択により置換されたアリーレン、任意選択により置換されたヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－からなる群から独立して選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、修飾ホスホコリン部分を含み、第４級アミンをホスホリル基に連結するアルキル鎖はエチレンではない（例えば、ｎは２ではない）。従って、いくつかの実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、式（ＰＬ－Ｉ）の化合物であり、式中、ｎは１、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。いくつかの実施形態では、式（ＰＬ－Ｉ）の化合物は、以下の式：
のうちの１つの化合物、またはその塩である。
代替の脂質
いくつかの実施形態では、本開示のリン脂質の代わりに代替の脂質が使用される。そのような代替的な脂質の非限定例には、以下が含まれる。
アジュバント
いくつかの実施形態では、１つ以上の本明細書に記載される脂質を含むＬＮＰは、１つ以上のアジュバント、例えば、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（例えば、クラスＡまたはＢ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）、水酸化アルミニウム、及びＰａｍ３ＣＳＫ４をさらに含み得る。
治療薬
脂質ナノ粒子は、１つ以上の治療薬及び／または予防薬、例えば、核酸を含み得る。本開示は、治療薬及び／または予防薬、例えば、核酸を、哺乳動物細胞もしくは臓器に送達し、哺乳動物細胞内で目的のポリペプチドを生成し、必要とする哺乳動物における疾患または障害を治療する方法であって、治療薬及び／または予防薬を含むＬＮＰを哺乳動物に投与するか、及び／または治療薬及び／または予防薬、例えば、核酸を含むＬＮＰと哺乳動物細胞を接触させることを含む方法を特徴とする。
治療薬及び／または予防薬は、生物学的活性物質を含み、あるいは、「活性剤」と呼ばれる。治療薬及び／または予防薬は、細胞もしくは臓器に送達されると、細胞、器官、または他の身体組織もしくは系に望ましい変化をもたらす物質であり得る。このような種は、１つ以上の疾患、障害、または病態の治療に有用であり得る。いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬は、特定の疾患、障害、または病態の治療に有用な小分子薬剤である。脂質ナノ粒子に有用な薬剤の例としては、限定はされないが、抗腫瘍薬（例えば、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、カンプトテシン、シスプラチン、ブレオマイシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、及びストレプトゾトシン）、抗腫瘍薬（例えば、アクチノマイシンＤ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シスチンアラビノシド、アントラサイクリン、アルキル化剤、白金化合物、代謝拮抗剤、及びヌクレオシド類似体、例えば、メトトレキサート及びプリン及びピリミジン類似体）、抗感染症薬、局所麻酔薬（例えば、ジブカイン及びクロルプロマジン）、β－アドレナリン遮断薬（例えば、プロプラノロール、チモロール、及びラベタロール）、降圧薬（例えば、クロニジン及びヒドララジン）、抗鬱薬（例えば、イミプラミン、アミトリプチリン、及びドキセピン）、抗けいれん薬（例えば、フェニトイン）、抗ヒスタミン剤（例えば、ジフェニルヒドラミン、クロルフェニラミン、及びプロメタジン）、抗生物質／抗菌剤（例えば、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン、及びセフォキシチン）、抗真菌薬（例えば、ミコナゾール、テルコナゾール、エコナゾール、イソコナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、イトラコナゾール、ナイスタチン、ナフチフィン、及びアムホテリシンＢ）、抗寄生虫薬、ホルモン、ホルモン拮抗薬、免疫調節剤、神経伝達物質拮抗薬、抗緑内障薬、ビタミン、麻酔薬、及びイメージング剤が挙げられる。
いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬は、細胞毒素、放射性イオン、化学療法剤、ワクチン、免疫応答を引き起こす化合物、及び／または別の治療薬及び／または予防薬である。細胞毒素または細胞毒性剤は、細胞に有害であり得る任意の薬剤を含む。例としては、限定はされないが、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、マイタンシノイド、例えば、マイタンシノール、ラケルマイシン（ＣＣ－１０６５）、及びそれらの類似体または同族体が挙げられる。放射性イオンとしては、限定はされないが、ヨウ素（例えば、ヨウ素１２５またはヨウ素１３１）、ストロンチウム８９、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、スフェート、コバルト、イットリウム９０、サマリウム１５３、及びプラセオジムが挙げられる。ワクチンは、インフルエンザ、麻疹、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、狂犬病、髄膜炎、百日咳、破傷風、ペスト、肝炎、及び結核などの感染症に関連する１つ以上の病態に対して免疫を与えることが可能な化合物及び製剤を含み、感染症に由来する抗原及び／またはエピトープをコードするｍＲＮＡを含み得る。ワクチンは、癌細胞に対して免疫応答を指令し、腫瘍細胞に由来する抗原、エピトープ、及び／またはネオエピトープをコードするｍＲＮＡを含み得る化合物及び製剤も含む。免疫応答を引き起こす化合物は、限定されないが、ワクチン、コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン）、及び他の種を含み得る。
いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬は、タンパク質である。本開示のナノ粒子に有用な治療用タンパク質としては、限定はされないが、ゲンタマイシン、アミカシン、インスリン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、第ＶＩＲ因子、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）類似体、インターフェロン、ヘパリン、Ｂ型肝炎表面抗原、腸チフスワクチン、及びコレラワクチンが挙げられる。いくつかの実施形態では、ワクチン及び／または免疫応答を引き起こすことが可能な化合物は、式（ＩＬ－Ｉ）、（ＩＬ－ＩＡ）、（ＩＬ－ＩＢ）、（ＩＬ－ＩＩ）、（ＩＬ－ＩＩａ）、（ＩＬ－ＩＩｂ）、（ＩＬ－ＩＩｃ）、（ＩＬ－ＩＩｄ）、（ＩＬ－ＩＩｅ）、（ＩＬ－ＩＩｆ）、（ＩＬ－ＩＩｇ）、（ＩＬ－ＩＩＩ）、（ＩＬ－ＩＩＩａｌ）、（ＩＬ－ＩＩＩａ２）、（ＩＬ－ＩＩＩａ３）、（ＩＬ－ＩＩＩａ４）、（ＩＬ－ＩＩＩａ５）、（ＩＬ－ＩＩＩａ６）、（ＩＬ－ＩＩＩａ７）、または（ＩＬ－ＩＩＩａ８）（例えば、化合物３、１８、２０、２６、または２９）で表される化合物を含む組成物を介して、筋肉内投与される。他の治療薬及び／または予防薬としては、限定はされないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシルダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、ラケルマイシン（ＣＣ－１０６５）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール及びマイタンシノイド）が挙げられる。
ポリヌクレオチド及び核酸
いくつかの実施形態では、治療薬は、ポリヌクレオチドまたは核酸（例えば、リボ核酸またはデオキシリボ核酸）である。「ポリヌクレオチド」という用語は、その最も広い意味で、オリゴヌクレオチド鎖であるか、またはそれに組み込むことができる任意の化合物及び／または物質を含む。本開示に従って使用するための例示的なポリヌクレオチドとしては、限定はされないが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、メッセンジャーｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むリボ核酸（ＲＮＡ）、そのハイブリッド、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなどのうちの１つ以上が挙げられる。いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬は、ＲＮＡである。本明細書に記載される組成物及び方法に有用なＲＮＡは、限定はされないが、ショートマ（ｓｈｏｒｔｍｅｒ）、アンタゴマー（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、アンチセンス、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー基質ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、及びそれらの混合物からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬は、ｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは、任意の天然または非天然あるいは修飾ポリペプチドを含む、任意の目的のポリペプチドをコードし得る。ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、任意のサイズのものであってもよく、任意の二次構造または活性を有し得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、細胞において発現されると、治療効果を有し得る。
いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬は、ｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子の発現を選択的にノックダウンするかまたは下方制御することが可能であり得る。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを含むＬＮＰを、必要とする対象に投与すると、特定の疾患、障害、または病態と関連する遺伝子をサイレンシングするように選択され得る。ｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子またはタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列に相補的な配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、免疫調節ｓｉＲＮＡであり得る。
いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬は、ｓｈＲＮＡまたはそれをコードするベクターもしくはプラスミドである。ｓｈＲＮＡは、適切な構築物が核に送達されると、標的細胞の内部で生成され得る。ｓｈＲＮＡに関連する構築物及び機構は、従来分野において周知である。
本開示に有用な核酸及びポリヌクレオチドは、典型的に、目的のポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの第１の領域（例えば、コード領域）、第１の領域の５’末端に位置する第１のフランキング領域（例えば、５’－ＵＴＲ）、第１の領域の３’末端に位置する第２のフランキング領域（例えば、３’－ＵＴＲ）、少なくとも１つの５’－キャップ領域、及び３’－安定化領域を含む。いくつかの実施形態では、核酸またはポリヌクレオチドは、ポリ－Ａ領域またはコザック配列（例えば、５’－ＵＴＲ中に）をさらに含む。ある場合には、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドから切り取られることが可能な１つ以上のイントロンヌクレオチド配列を含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’キャップ構造、鎖終止ヌクレオチド、ステムループ、ポリＡ配列、及び／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。核酸の領域のいずれか１つが、１つ以上の改変成分（例えば、改変ヌクレオシド）を含み得る。いくつかの実施形態では、３’－安定化領域は、改変ヌクレオシド、例えば、Ｌ－ヌクレオシド、逆方向チミジン、または２’－Ｏ－メチルヌクレオシドを含有してもよく、及び／またはコード領域、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、またはキャップ領域は、改変ヌクレオシド、例えば、５－置換ウリジン（例えば、５－メトキシウリジン）、１－置換プソイドウリジン（例えば、１－メチル－プソイドウリジンまたは１－エチル－プソイドウリジン）、及び／または５－置換シチジン（例えば、５－メチル－シチジン）を含み得る。
一般に、ポリヌクレオチドの最も短い長さは、ジペプチドをコードするのに十分なポリヌクレオチド配列の長さであり得る。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列の長さは、トリペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列の長さは、テトラペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列の長さは、ペンタペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列の長さは、ヘキサペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列の長さは、ヘプタペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列の長さは、オクタペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列の長さは、ノナペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列の長さは、デカペプチドをコードするのに十分である。
改変ポリヌクレオチド配列がコードすることができるジペプチドの例としては、限定はされないが、カルノシン及びアンセリンが挙げられる。
ある場合には、ポリヌクレオチドは、３０ヌクレオチドを超える長さである。別の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、３５ヌクレオチドを超える長さである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４５ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも５５ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも９０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１２０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１４０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも３５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも６００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも７００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも８００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも９００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１２００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１４００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１６００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１８００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも３０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも５０００ヌクレオチド、または５０００ヌクレオチド超である。
核酸及びポリヌクレオチドは、標準ヌクレオチドＡ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シトシン）、Ｕ（ウリジン）、またはＴ（チミジン）のいずれかを含む１つ以上の天然成分を含み得る。いくつかの実施形態では、（ａ）５’－ＵＴＲ、（ｂ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、（ｃ）３’－ＵＴＲ、（ｄ）ポリＡ尾部及び（上記のａ、ｂ、ｃ、またはｄ）の任意の組み合わせを含むヌクレオチドの全てまたは実質的に全てが、天然成分の標準ヌクレオチドＡ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シトシン）、Ｕ（ウリジン）、またはＴ（チミジン）を含む。
核酸及びポリヌクレオチドは、向上した安定性及び／またはポリヌクレオチドが導入される細胞の自然免疫応答の実質的な誘導がないことを含む有用な特性を与える、本明細書に記載される１つ以上の代替成分を含み得る。いくつかの実施形態では、代替のポリヌクレオチドまたは核酸は、対応する非改変ポリヌクレオチドまたは核酸と比較して、ポリヌクレオチドまたは核酸が導入される細胞における減少した分解を示す。これらの代替種は、タンパク質産生の効率性、ポリヌクレオチドの細胞内貯留、及び／または接触される細胞の生存率を向上させることができるだけでなく、減少した免疫原性を有する。
ポリヌクレオチド及び核酸は、天然または非天然であり得る。ポリヌクレオチド及び核酸は、１つ以上の修飾（例えば、改変または代替の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含み得る。ＬＮＰに有用な核酸及びポリヌクレオチドは、核酸塩基、糖、またはヌクレオシド間結合（例えば、連結ホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格）に対するものなどの任意の有用な修飾または改変を含み得る。いくつかの実施形態では、改変（例えば、１つ以上の改変）は、核酸塩基、糖、及びヌクレオシド間結合のそれぞれに存在する。本開示に係る改変は、リボ核酸（ＲＮＡ）のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（例えば、リボフラノシル環の２’－ＯＨの２’－Ｈへの置換）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはそのハイブリッドへの改変であり得る。さらなる改変が、本明細書に記載される。
ポリヌクレオチド及び核酸は、分子の全長に沿って均一に改変されても、または均一に改変されなくてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上または全てのタイプのヌクレオチド（例えば、プリンまたはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上または全て）は、ポリヌクレオチドまたは核酸において、またはその所与の所定の配列領域において均一に改変されても、または均一に改変されなくてもよい。ある場合には、ポリヌクレオチド中の全てのヌクレオチドＸ（またはその所与の配列領域において）が改変され、ここで、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ、または組み合わせＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋ＣまたはＡ＋Ｇ＋Ｃのいずれか１つであり得る。
異なる糖改変及び／またはヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）は、ポリヌクレオチドの様々な位置に存在し得る。ポリヌクレオチドの機能が実質的に低下されないように、ヌクレオチド類似体または他の改変（複数可）が、ポリヌクレオチドの任意の位置（複数可）に位置し得ることが、当業者に理解されよう。改変はまた、５’末端または３’末端改変であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、３’末端に改変を含む。ポリヌクレオチドは、約１％～約１００％の代替ヌクレオチド（全ヌクレオチド含量に対して、または１つ以上のタイプのヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｇ、ＵまたはＣのいずれか１つ以上に対して）またはその間の任意のパーセンテージ（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）を含有し得る。標準ヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣ）の存在が任意の残りのパーセンテージを占めることが理解されよう。
ポリヌクレオチドは、最小で０％及び最大で１００％の代替ヌクレオチド、またはその間の任意のパーセンテージ、例えば、少なくとも５％の代替ヌクレオチド、少なくとも１０％の改変ヌクレオチド、少なくとも２５％の代替ヌクレオチド、少なくとも５０％の代替ヌクレオチド、少なくとも８０％の代替ヌクレオチド、または少なくとも９０％の代替ヌクレオチドを含有し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、代替ピリミジン、例えば、代替ウラシルまたはシトシンを含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が、改変ウラシル（例えば、５－置換ウラシル）で置換される。代替ウラシルは、単一の独自の構造を有する化合物で置換され得、または異なる構造（例えば、２、３、４またはそれ以上の独自の構造）を有する複数の化合物で置換され得る。ある場合には、ポリヌクレオチド中のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が、代替シトシン（例えば、５－置換シトシン）で置換される。代替シトシンは、単一の独自の構造を有する化合物で置換され得、または異なる構造（例えば、２、３、４またはそれ以上の独自の構造）を有する複数の化合物で置換され得る。
いくつかの実施形態では、核酸は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）が導入された細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。誘導される自然免疫応答の特徴としては、１）炎症促進性サイトカインの発現の増加、２）細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５などの活性化、及び／または３）タンパク質翻訳の終結または低減が挙げられる。
核酸は、他の薬剤（例えば、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクター）を任意選択により含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の代替ヌクレオシドまたはヌクレオチド（すなわち、代替ｍＲＮＡ分子）を有する１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み得る。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）分子、それに関連する式、組成物または方法は、ＷＯ２００２／０９８４４３、ＷＯ２００３／０５１４０１、ＷＯ２００８／０５２７７０、ＷＯ２００９１２７２３０、ＷＯ２００６１２２８２８、ＷＯ２００８／０８３９４９、ＷＯ２０１００８８９２７、ＷＯ２０１０／０３７５３９、ＷＯ２００４／００４７４３、ＷＯ２００５／０１６３７６、ＷＯ２００６／０２４５１８、ＷＯ２００７／０９５９７６、ＷＯ２００８／０１４９７９、ＷＯ２００８／０７７５９２、ＷＯ２００９／０３０４８１、ＷＯ２００９／０９５２２６、ＷＯ２０１１０６９５８６、ＷＯ２０１１０２６６４１、ＷＯ２０１１／１４４３５８、ＷＯ２０１２０１９７８０、ＷＯ２０１２０１３３２６、ＷＯ２０１２０８９３３８、ＷＯ２０１２１１３５１３、ＷＯ２０１２１１６８１１、ＷＯ２０１２１１６８１０、ＷＯ２０１３１１３５０２、ＷＯ２０１３１１３５０１、ＷＯ２０１３１１３７３６、ＷＯ２０１３１４３６９８、ＷＯ２０１３１４３６９９、ＷＯ２０１３１４３７００、ＷＯ２０１３／１２０６２６、ＷＯ２０１３１２０６２７、ＷＯ２０１３１２０６２８、ＷＯ２０１３１２０６２９、ＷＯ２０１３１７４４０９、ＷＯ２０１４１２７９１７、ＷＯ２０１５／０２４６６９、ＷＯ２０１５／０２４６６８、ＷＯ２０１５／０２４６６７、ＷＯ２０１５／０２４６６５、ＷＯ２０１５／０２４６６６、ＷＯ２０１５／０２４６６４、ＷＯ２０１５１０１４１５、ＷＯ２０１５１０１４１４、ＷＯ２０１５０２４６６７、ＷＯ２０１５０６２７３８、ＷＯ２０１５１０１４１６（これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される特徴を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
核酸塩基代替物
代替ヌクレオシド及びヌクレオチドは、代替核酸塩基を含み得る。核酸の核酸塩基は、有機塩基、例えば、プリンまたはピリミジンまたはその誘導体である。核酸塩基は、標準塩基（例えば、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、及びシトシン）であり得る。これらの核酸塩基は、向上した特性、例えば、ヌクレアーゼに対する耐性などの向上した安定性を有するポリヌクレオチド分子を提供するように、改変または完全に置換され得る。非標準または修飾塩基は、例えば、限定はされないが、アルキル、アリール、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルキルオキシ、及び／またはチオ置換；１つ以上の縮合環または開環；酸化；及び／または還元を含む１つ以上の置換または修飾を含み得る。
代替ヌクレオチド塩基対形成は、標準アデニン－チミン、アデニン－ウラシル、またはグアニン－シトシン塩基対だけでなく、ヌクレオチド及び／または非標準または代替塩基を含む代替ヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、水素結合供与体及び水素結合受容体の構成が、非標準塩基と標準塩基との間または２つの相補的非標準塩基構造間の水素結合を可能にする。このような非標準塩基対形成の一例は、代替ヌクレオチドイノシン及びアデニン、シトシン、またはウラシル間の塩基対形成である。
いくつかの実施形態では、核酸塩基は、代替ウラシルである。代替ウラシルを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとしては、プソイドウリジン（ψ）、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウラシル、６－アザ－ウラシル、２－チオ－５－アザ－ウラシル、２－チオ－ウラシル（ｓ２Ｕ）、４－チオ－ウラシル（ｓ４Ｕ）、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシ－ウラシル（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリル－ウラシル、５－ハロ－ウラシル（例えば、５－ヨード－ウラシルまたは５－ブロモ－ウラシル）、３－メチル－ウラシル（ｍ３Ｕ）、５－メトキシ－ウラシル（ｍｏ５Ｕ）、ウラシル５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウラシル５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウラシル（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウラシル（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウラシルメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウラシル（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウラシル（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオ－ウラシル（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－ウラシル（ｍｎｍ５Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウラシル（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウラシル（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウラシル（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピニル－ウラシル、１－プロピニル－プソイドウラシル、５－タウリノメチル－ウラシル（τｍ５Ｕ）、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウラシル（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－プソイドウリジン、５－メチル－ウラシル（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有する）、１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－プソイドウリジン（Ｅｔ１ψ）、５－メチル－２－チオ－ウラシル（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオ－プソイドウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、３－メチル－プソイドウリジン（ｍ３ψ）、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウラシル（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６－ジヒドロウラシル、５－メチル－ジヒドロウラシル（ｍ５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウラシル、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシ－ウラシル、２－メトキシ－４－チオ－ウラシル、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウラシル（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウラシル（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウラシル（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２－チオ－２’－Ｏ＿メチル－ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、及び５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオ－ウラシル、デオキシチミジン、５－（２－カルボメトキシビニル）－ウラシル、５－（カルバモイルヒドロキシメチル）－ウラシル、５－カルバモイルメチル－２－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチル－２－チオ－ウラシル、５－シアノメチル－ウラシル、５－メトキシ－２－チオ－ウラシル、及び５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）］ウラシルが挙げられる。
いくつかの実施形態では、核酸塩基は、代替シトシンである。代替シトシンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとしては、限定されないが、５－アザ－シトシン、６－アザ－シトシン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シトシン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４－アセチル－シトシン（ａｃ４Ｃ）、５－ホルミル－シトシン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４－メチル－シトシン（ｍ４Ｃ）、５－メチル－シトシン（ｍ５Ｃ）、５－ハロ－シトシン（例えば、５－ヨード－シトシン）、５－ヒドロキシメチル－シトシン（ｈｍ５Ｃ）、１－メチル－プソイドイソシチジン、ピロロ－シトシン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シトシン（ｓ２Ｃ）、２－チオ－５－メチル－シトシン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シトシン、２－メトキシ－５－メチル－シトシン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチル－シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチル－シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５－ホルミル－２’－Ｏ－メチル－シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチル－シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１－チオ－シトシン、５－ヒドロキシ－シトシン、５－（３－アジドプロピル）－シトシン、及び５－（２－アジドエチル）－シトシンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、核酸塩基は、代替アデニンである。代替アデニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとしては、限定されないが、２－アミノ－プリン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノ－６－ハロ－プリン（例えば、２－アミノ－６－クロロ－プリン）、６－ハロ－プリン（例えば、６－クロロ－プリン）、２－アミノ－６－メチル－プリン、８－アジド－アデニン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチル－アデニン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデニン（ｍ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチル－アデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－イソペンテニル－アデニン（ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニル－アデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイル－アデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－トレオニルカルバモイル－アデニン（ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイル－アデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイル－アデニン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチル－アデニン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデニン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６－アセチル－アデニン（ａｃ６Ａ）、７－メチル－アデニン、２－メチルチオ－アデニン、２－メトキシ－アデニン、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチル－アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２－アミノ－Ｎ６－メチル－プリン、１－チオ－アデニン、８－アジド－アデニン、Ｎ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノナデシル）－アデニン、２，８－ジメチル－アデニン、Ｎ６－ホルミル－アデニン、及びＮ６－ヒドロキシメチル－アデニンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、核酸塩基は、代替グアニンである。代替グアニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとしては、限定されないが、イノシン（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４－デメチル－ワイオシン（ｉｍＧ－１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ）、不完全修飾型ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７－デアザ－グアニン、キューオシン（Ｑ）、エポキシキューオシン（ｏＱ）、ガラクトシル－キューオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル－キューオシン（ｍａｎＱ）、７－シアノ－７－デアザ－グアニン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアニン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７－デアザ－８－アザ－グアニン、６－チオ－グアニン、６－チオ－７－デアザ－グアニン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアニン、７－メチル－グアニン（ｍ７Ｇ）、６－チオ－７－メチル－グアニン、７－メチル－イノシン、６－メトキシ－グアニン、１－メチル－グアニン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２－メチル－グアニン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－グアニン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７－ジメチル－グアニン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２、Ｎ２，７－ジメチル－グアニン（ｍ２，２，７Ｇ）、８－オキソ－グアニン、７－メチル－８－オキソ－グアニン、１－メチル－６－チオ－グアニン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアニン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアニン、Ｎ２－メチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１－メチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’－Ｏ－メチル－イノシン（Ｉｍ）、１，２’－Ｏ－ジメチル－イノシン（ｍ１Ｉｍ）、１－チオ－グアニン、及びＯ－６－メチル－グアニンが挙げられる。
ヌクレオチドの代替核酸塩基は、独立して、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジン類似体であり得る。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、またはヒポキサンチンの代替物であり得る。別の実施形態では、核酸塩基は、例えば、塩基の天然及び合成誘導体も含むことができ、このような誘導体は、限定されないが、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６－メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ（例えば、８－ブロモ）、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシ及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、デアザグアニン、７－デアザグアニン、３－デアザグアニン、デアザアデニン、７－デアザアデニン、３－デアザアデニン、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、イミダゾ［１，５－ａ］１，３，５トリアジノン、９－デアザプリン、イミダゾ［４，５－ｄ］ピラジン、チアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン、ピラジン－２－オン、１，２，４－トリアジン、ピリダジン；または１，３，５トリアジンを含む。ヌクレオチドが、略語Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵを用いて示される場合、各文字は、代表的な塩基及び／またはその誘導体を指し、例えば、Ａは、アデニンまたはアデニン類似体、例えば、７－デアザアデニン）を含む。
糖における改変
ヌクレオシドは、核酸塩基と組み合わせて、糖分子（例えば、５－炭素または６－炭素糖、例えば、ペントース、リボース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、またはそれらのデオキシ誘導体）を含む一方、ヌクレオチドは、ヌクレオシド及びリン酸基または代替基（例えば、ボラノリン酸、チオホスフェート、セレノホスフェート、ホスホネート、アルキル基、アミデート、及びグリセロール）を含有するヌクレオシドである。ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、標準種、例えば、標準核酸塩基、糖、及び、ヌクレオチドの場合、リン酸基を含むヌクレオシドまたはヌクレオチドであり得、または１つ以上の代替成分を含む代替ヌクレオシドまたはヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、代替ヌクレオシド及びヌクレオチドは、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの糖において改変され得る。いくつかの実施形態では、代替ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、構造：
を含む。式ＩＶ、Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩのそれぞれにおいて、
ｍ及びｎの各々が、独立して、０～５の整数であり、
Ｕ及びＵ’の各々が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ここで、ｎｕが、０～２の整数であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意選択により置換されたアルキルであり；
Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ１”、Ｒ２”、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の各々が、独立して、存在する場合、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択により置換されたアルキル、任意選択により置換されたアルコキシ、任意選択により置換されたアルケニルオキシ、任意選択により置換されたアルキニルオキシ、任意選択により置換されたアミノアルコキシ、任意選択により置換されたアルコキシアルコキシ、任意選択により置換されたヒドロキシアルコキシ、任意選択により置換されたアミノ、アジド、任意選択により置換されたアリール、任意選択により置換されたアミノアルキル、任意選択により置換されたアミノアルケニル、任意選択により置換されたアミノアルキニルであるか、または存在せず；ここで、Ｒ３ｘと、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、Ｒ２”、またはＲ５の１つ以上との組み合わせ（例えば、Ｒ１”及びＲ３ｘの組み合わせ、Ｒ１”及びＲ３ｘの組み合わせ、Ｒ２’及びＲ３ｘの組み合わせ、Ｒ２”及びＲ３ｘの組み合わせ、またはＲ５ｘ及びＲ３ｘの組み合わせ）が、一緒に結合して、任意選択により置換されたアルキレンまたは任意選択により置換されたヘテロアルキレンを形成することができ、それらが結合される炭素と一緒になって、任意選択により置換されたヘテロシクリル（例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル）を提供し、ここで、Ｒ５と、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、またはＲ２”の１つ以上との組み合わせ（例えば、Ｒ１’及びＲ５の組み合わせ、Ｒ１”及びＲ５の組み合わせ、Ｒ２’及びＲ５の組み合わせ、またはＲ２”及びＲ５の組み合わせ）が、一緒に結合して、任意選択により置換されたアルキレンまたは任意選択により置換されたヘテロアルキレンを形成することができ、それらが結合される炭素と一緒になって、任意選択により置換されたヘテロシクリル（例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル）を提供し、ここで、Ｒ４ｘと、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、Ｒ２”、Ｒ３、またはＲ５の１つ以上との組み合わせが、一緒に結合して、任意選択により置換されたアルキレンまたは任意選択により置換されたヘテロアルキレンを形成することができ、それらが結合される炭素と一緒になって、任意選択により置換されたヘテロシクリル（例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル）を提供し、ｍ’及びｍ”の各々が、独立して、０～３（例えば、０～２、０～１、１～３、または１～２）の整数であり、
Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３の各々が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、－ＮＲＮ１－、任意選択により置換されたアルキレン、または任意選択により置換されたヘテロアルキレンであり、ここで、ＲＮ１が、Ｈ、任意選択により置換されたアルキル、任意選択により置換されたアルケニル、任意選択により置換されたアルキニル、任意選択により置換されたアリールであるか、または存在せず、
各Ｙ４が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、任意選択により置換されたアルキル、任意選択により置換されたアルケニル、任意選択により置換されたアルキニル、任意選択により置換されたアルコキシ、任意選択により置換されたアルケニルオキシ、任意選択により置換されたアルキニルオキシ、任意選択により置換されたチオアルコキシ、任意選択により置換されたアルコキシアルコキシ、または任意選択により置換されたアミノであり、
各Ｙ５が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、任意選択により置換されたアルキレン（例えば、メチレン）、または任意選択により置換されたヘテロアルキレンであり；
Ｂが、修飾または非修飾のいずれかの核酸塩基である。
いくつかの実施形態では、２’－ヒドロキシ基（ＯＨ）は、いくつかの異なる置換基で修飾または置換され得る。２’－位における例示的な置換としては、限定はされないが、Ｈ、アジド、ハロ（例えば、フルオロ）、任意選択により置換されたＣ１－６アルキル（例えば、メチル）、任意選択により置換されたＣ１－６アルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）、任意選択により置換されたＣ６－１０アリールオキシ；任意選択により置換されたＣ３－８シクロアルキル；任意選択により置換されたＣ６－１０アリール－Ｃ１－６アルコキシ、任意選択により置換されたＣ１－１２（ヘテロシクリル）オキシ；糖（例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載されるいずれか）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（ここで、Ｒが、Ｈまたは任意選択により置換されたアルキルであり、ｎが、０～２０（例えば、０～４、０～８、０～１０、０～１６、１～４、１～８、１～１０、１～１６、１～２０、２～４、２～８、２～１０、２～１６、２～２０、４～８、４～１０、４～１６、及び４～２０）の整数である）、「ロックド」核酸（ＬＮＡ）（ここで、２’－ヒドロキシが、Ｃ１－６アルキレンまたはＣ１－６ヘテロアルキレン架橋によって、同じリボース糖の４’－炭素に連結され、例示的な架橋は、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋を含んでいた）、本明細書に定義されるアミノアルキル、本明細書に定義されるアミノアルコキシ、本明細書に定義されるアミノ；及び本明細書に定義されるアミノ酸が挙げられる。
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖基リボースを含む。例示的な非限定的な代替ヌクレオチドとしては、リボース中の酸素の置換（例えば、Ｓ、Ｓｅ、またはメチレンもしくはエチレンなどのアルキレンによる）、二重結合の付加（例えば、リボースを、シクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換するために）；リボースの環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成するために）；リボースの環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、及びモルホリノ（ホスホロアミデート骨格も有する）などの、さらなる炭素またはヘテロ原子を有する６員または７員環を形成するために）、多環式形態（例えば、トリシクロ及び「ロックされていない」形態、例えば、グリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、Ｒ－ＧＮＡまたはＳ－ＧＮＡ、ここで、リボースは、ホスホジエステル結合に結合されたグリコール単位で置換される）、トレオース核酸（ＴＮＡ、ここで、リボースは、α－Ｌ－トレオフラノシル－（３’→２’）で置換される）、及びペプチド核酸（ＰＮＡ、ここで、２－アミノ－エチル－グリシン結合が、リボース及びホスホジエステル骨格を置換する）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、糖基は、リボース中に対応する炭素と反対の立体化学配置を有する１つ以上の炭素を含有する。従って、ポリヌクレオチド分子は、糖として、例えば、アラビノースまたはＬ－リボースを含有するヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオシドを含み、ここで、糖は、Ｌ－リボース、２’－Ｏ－メチル－リボース、２’－フルオロ－リボース、アラビノース、ヘキシトール、ＬＮＡ、またはＰＮＡである。
ヌクレオシド間結合における改変
代替ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、ホスフェート骨格）において改変され得る。本明細書において、ポリヌクレオチド骨格に関して、「ホスフェート」及び「ホスホジエステル」という語句は、同義的に使用される。骨格リン酸基は、酸素原子の１つ以上を、異なる置換基で置換することによって改変され得る。
代替ヌクレオチドは、本明細書に記載されるような別のヌクレオシド間結合による非改変リン酸部分の大規模な置換を含み得る。代替リン酸基の例としては、限定はされないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホン酸アルキルまたはアリール、及びホスホトリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは、硫黄によって置換される両方の非結合酸素を有する。ホスフェートリンカーはまた、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレン－ホスホネート）による結合酸素の置換によって改変され得る。
代替ヌクレオシド及びヌクレオチドは、ボラン部分（ＢＨ３）、硫黄（チオ）、メチル、エチル、及び／またはメトキシによる非架橋酸素の１つ以上の置換を含み得る。非限定例として、同じ位置（例えば、アルファ（α）、ベータ（β）またはガンマ（γ）位置）における２つの非架橋酸素が、硫黄（チオ）及びメトキシで置換され得る。
リン酸部分（例えば、α－チオリン酸）のα位置における酸素原子の１つ以上の置換は、非天然ホスホロチオエート骨格結合によってＲＮＡ及びＤＮＡに安定性（例えば、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼに対して）を与えるために提供される。ホスホロチオエートＤＮＡ及びＲＮＡは、増加したヌクレアーゼ耐性を有するため、細胞環境においてより長い半減期を有する。
リン原子を含有しないヌクレオシド間結合を含む、本開示に従って用いられ得る他のヌクレオシド間結合が、本明細書に記載される。
内部リボソーム侵入部位
ポリヌクレオチドは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含有し得る。ＩＲＥＳは、単独のリボソーム結合部位として作用し得るか、またはｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位の１つとして作用し得る。２つ以上の機能性リボソーム結合部位を含有するポリヌクレオチドは、リボソームによって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る（例えば、多シストロン性ｍＲＮＡ）。ポリヌクレオチドがＩＲＥＳを備えている場合、第２の翻訳可能領域がさらに任意選択により提供される。本開示に従って使用され得るＩＲＥＳ配列の例としては、限定はされないが、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）に由来するものが挙げられる。
５’－キャップ構造
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’－キャップ構造を含み得る。ポリヌクレオチドの５’－キャップ構造は、核外輸送に関与し、ポリヌクレオチド安定性を高め、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、これは、ＣＢＰとポリ－Ａ結合タンパク質との結合を介して、細胞内のポリヌクレオチド安定性及び翻訳能力に関与して、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成する。キャップはさらに、ｍＲＮＡスプライシング中の５’－近位イントロン除去の除去を補助する。
内因性ポリヌクレオチド分子は、５’末端にキャッピングされて、ポリヌクレオチドの末端グアノシンキャップ残基と５’末端転写センスヌクレオチドとの間に５’－ｐｐｐ－５’－三リン酸結合を形成し得る。次に、この５’－グアニル酸キャップは、メチル化されて、Ｎ７－メチル－グアニル酸残基を生成し得る。ポリヌクレオチドの５’末端の末端及び／または末端前の転写ヌクレオチドのリボース糖はまた、任意選択により２’－Ｏ－メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解及び切断による５’－キャップ除去は、ｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチド分子の分解にターゲティングすることができる。
ポリヌクレオチドに対する改変は、非加水分解性キャップ構造を生成して、キャップ除去を防止し、それによってポリヌクレオチド半減期を増加させ得る。キャップ構造加水分解は、５’－ｐｐｐ－５’ホスホロジエステル結合の切断を必要とするため、代替ヌクレオチドが、キャッピング反応中に使用され得る。いくつかの実施形態では、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）製のワクシニアキャッピング酵素が、製造業者の指示に従って、α－チオ－グアノシンヌクレオチドとともに使用されて、５’－ｐｐｐ－５’キャップ内にホスホロチオエート結合を形成し得る。α－メチル－ホスホネート及びセレノ－リン酸ヌクレオチドなどのさらなる代替グアノシンヌクレオチドが使用され得る。
さらなる改変としては、限定はされないが、糖の２’－ヒドロキシ基におけるポリヌクレオチドの５’末端及び／または５’末端前ヌクレオチドのリボース糖の２’－Ｏ－メチル化（上述される）が挙げられる。複数の異なる５’－キャップ構造を用いて、ｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドの５’－キャップを作製することができる。
５’－キャップ構造としては、国際特許公開番号ＷＯ２００８１２７６８８、ＷＯ２００８０１６４７３、及びＷＯ２０１１０１５３４７に記載されるものが挙げられ、これらのそれぞれのキャップ構造は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において合成キャップ類似体、化学キャップ、化学キャップ類似体、または構造的もしくは機能性キャップ類似体とも呼ばれるキャップ類似体は、キャップ機能を保持しながら、その化学構造が天然の（すなわち、内因性、野生型、または生理学的）５’－キャップとは異なる。キャップ類似体は、化学的に（すなわち、非酵素的に）または酵素的に合成され／ポリヌクレオチドに連結され得る。
例えば、アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップは、５’－５’－三リン酸基によって連結された２つのグアノシンを含有し、ここで、１つのグアノシンは、Ｎ７－メチル基並びに３’－Ｏ－メチル基（すなわち、Ｎ７，３’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ７Ｇ－３’ｍｐｐｐ－Ｇ、同様に３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと呼ばれ得る）を含有する。他方の非改変グアノシンの３’－Ｏ原子が、キャッピングされたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’末端ヌクレオチドに連結される。Ｎ７－及び３’－Ｏ－メチル化グアノシンは、キャッピングされたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の末端部分を提供する。
別の例示的なキャップは、ｍＣＡＰであり、これは、ＡＲＣＡと類似しているが、グアノシン上に２’－Ｏ－メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ）。
キャップは、ジヌクレオチドキャップ類似体であり得る。非限定例として、米国特許第８，５１９，１１０号（そのキャップ構造は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるジヌクレオチドキャップ類似体などのジヌクレオチドキャップ類似体は、様々なリン酸位置で、ボラノリン酸基またはホスホロセレノエート基で修飾され得る。
あるいは、キャップ類似体は、当該技術分野において公知の、及び／または本明細書に記載されるＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチドキャップ類似体であり得る。Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチドキャップ類似体の非限定例としては、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ及びＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ３’－ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体が挙げられる（例えば、Ｋｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３ ２１：４５７０－４５７４（そのキャップ構造は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される様々なキャップ類似体及びキャップ類似体の合成方法を参照されたい）。他の場合には、本開示のポリヌクレオチドに有用なキャップ類似体は、４－クロロ／ブロモフェノキシエチル類似体である。
キャップ類似体は、インビトロ転写反応においてポリヌクレオチドの同時キャッピングを可能にするが、転写物の最大２０％がキャッピングされないままである。これは、内因性の細胞転写機構によって産生されたポリヌクレオチドの内因性５’－キャップ構造とのキャップ類似体の構造差とともに、翻訳能力の低下及び細胞安定性の低下をもたらし得る。
代替ポリヌクレオチドはまた、より真正な５’－キャップ構造を作製するために、酵素を用いて転写後にキャッピングされ得る。本明細書で使用する場合、「より真正な」という語句は、内因性または野生型の特徴と構造的または機能的に酷似しているか、またはそれを模倣する特徴を指す。すなわち、「より真正な」特徴は、先行技術の合成の特徴または類似体と比較して、内因性、野生型、天然または生理学的な細胞機能、及び／または構造をより良好に示し、または１つ以上の点で対応する内因性、野生型、天然、または生理学的な特徴より性能が優れている。本開示のポリヌクレオチドに有用なより真正な５’－キャップ構造の非限定例は、中でも特に、当該技術分野において公知の合成５’－キャップ構造（または野生型、天然または生理学的５’－キャップ構造）と比較して、キャップ結合タンパク質の増大した結合、増加した半減期、５’－エンドヌクレアーゼに対する低下した感受性、及び／または減少した５’－キャップ除去を有するものである。いくつかの実施形態では、組み換えワクシニアウイルスキャッピング酵素及び組み換え２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素が、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアノシンキャップヌクレオチドとの間に標準５’－５’－三リン酸結合を形成することができ、ここで、キャップグアノシンは、Ｎ７－メチル化を含み、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルを含む。このような構造は、キャップ１構造と呼ばれる。このキャップは、例えば、当該技術分野において公知の他の５’キャップ類似体構造と比較して、より高い翻訳能力、細胞安定性、及び細胞の炎症促進性サイトカインの活性化の低下をもたらす。他の例示的なキャップ構造としては、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）、及びｍ（７）Ｇｐｐｐｍ（３）（６，６，２’）Ａｐｍ（２’）Ａｐｍ（２’）Ｃｐｍ（２）（３，２’）Ｕｐ（キャップ４）が挙げられる。
代替ポリヌクレオチドは、転写後にキャッピングされ得るため、また、このプロセスはより効率的であるため、ほぼ１００％の代替ポリヌクレオチドがキャッピングされ得る。これは、キャップ類似体がインビトロ転写反応の過程でポリヌクレオチドに連結される場合の約８０％と対照的である。
５’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。５’末端は、グアノシン類似体を含み得る。有用なグアノシン類似体としては、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、及び２－アジド－グアノシンが挙げられる。
ある場合には、ポリヌクレオチドは、修飾５’－キャップを含有する。５’－キャップにおける修飾は、ポリヌクレオチドの安定性を高め、ポリヌクレオチドの半減期を増加させることができ、ポリヌクレオチド翻訳効率を高め得る。修飾５’－キャップとしては、限定はされないが、以下の修飾の１つ以上が挙げられる：キャッピングされたグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）の２’位及び／または３’位における修飾、メチレン部分（ＣＨ２）による糖環酸素置換（これにより炭素環が生成された）、キャップ構造の三リン酸架橋部分における修飾、または核酸塩基（Ｇ）部分における修飾。
５’－ＵＴＲ
５’－ＵＴＲは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）とのフランキング領域として提供され得る。５’－ＵＴＲは、ポリヌクレオチドに見られるコード領域に対して相同的または異種であり得る。複数の５’－ＵＴＲが、フランキング領域に含まれてもよく、同じかまたは異なる配列のものであり得る。フランキング領域の任意の部分（皆無を含む）は、コドン最適化されてもよく、独立して、コドン最適化の前及び／または後に、１つ以上の異なる構造的または化学的改変を含有し得る。
米国仮特許出願第６１／７７５，５０９号の表２１、並びに米国仮特許出願第６１／８２９，３７２号の表２１及び表２２（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）に示されるのは、代替ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の開始及び終止部位の一覧である。表２１において、各５’－ＵＴＲ（５’－ＵＴＲ－００５～５’－ＵＴＲ ６８５１１）は、その天然または野生型（相同性）転写物に対するその開始及び終止部位によって同定される（ＥＮＳＴ；ＥＮＳＥＭＢＬデータベースに使用される識別番号）。
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の１つ以上の特性を改変するために、改変ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のコード領域と異種の５’－ＵＴＲが操作され得る。次に、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、細胞、組織または生物に投与され得、タンパク質レベル、局在化、及び／または半減期などの結果が、測定されて、異種５’－ＵＴＲが代替ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）に対して与え得る有益な効果を評価し得る。Ａ、Ｔ、ＣまたはＧを含む１つ以上のヌクレオチドが末端に付加されるかまたは除去された５’－ＵＴＲの変異体が用いられ得る。５’－ＵＴＲはまた、コドン最適化されてもよく、または本明細書に記載される任意の方法で改変され得る。
５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、及び翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’－ＵＴＲは、少なくとも１つの翻訳エンハンサーエレメントを含み得る。「翻訳エンハンサーエレメント」という用語は、ポリヌクレオチドから産生されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる配列を指す。非限定例として、ＴＥＥは、転写プロモータと開始コドンとの間に位置し得る。５’－ＵＴＲにおける少なくとも１つのＴＥＥを有するポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’－ＵＴＲにおけるキャップを含み得る。さらに、少なくとも１つのＴＥＥは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’－ＵＴＲに位置して、キャップ依存性またはキャップ非依存性の翻訳を行い得る。
いくつかの態様では、ＴＥＥは、限定はされないが、キャップ依存性またはキャップ非依存性の翻訳などのポリヌクレオチドの翻訳活性を促進し得るＵＴＲにおける保存エレメントである。これらの配列の保存は、ヒトを含む１４種についてＰａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３，１－１０）によって既に示されている。
１つの非限定例では、公知のＴＥＥは、Ｇｔｘホメオドメインタンパク質の５’－リーダにあり得る（Ｃｈａｐｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：９５９０－９５９４，２００４（そのＴＥＥは、参照により本明細書に組み込まれる））。
別の非限定例では、ＴＥＥは、米国特許公開第２００９／０２２６４７０号及び同第２０１３／０１７７５８１号、国際特許公開番号ＷＯ２００９／０７５８８６、ＷＯ２０１２／００９６４４、及びＷＯ１９９９／０２４５９５、米国特許第６，３１０，１９７号及び同第６，８４９，４０５号において開示されており、これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
さらに別の非限定例では、ＴＥＥは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ＨＣＶ－ＩＲＥＳまたはＩＲＥＳエレメント、例えば、限定はされないが、米国特許第７，４６８，２７５号、米国特許出願公開第２００７／００４８７７６号及び同第２０１１／０１２４１００号及び国際特許公開番号ＷＯ２００７／０２５００８及びＷＯ２００１／０５５３６９（これらのそれぞれのＩＲＥＳ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものであり得る。ＩＲＥＳエレメントとしては、限定はされないが、Ｃｈａｐｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：９５９０－９５９４，２００４）及びＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ １０２：６２７３－６２７８，２００５）によって、並びに米国特許公開第２００７／００４８７７６号及び同第２０１１／０１２４１００号及び国際特許公開番号ＷＯ２００７／０２５００８（これらのそれぞれのＩＲＥＳ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＧｔｘ配列（例えば、Ｇｔｘ９－ｎｔ、Ｇｔｘ８－ｎｔ、Ｇｔｘ７－ｎｔ）が挙げられる。
「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド」は、本明細書に例示されるか、及び／または当該技術分野において開示される（例えば、米国特許第６，３１０，１９７号、同第６，８４９，４０５号、同第７，４５６，２７３号、同第７，１８３，３９５号、米国特許出願公開第２００９０／２２６４７０号、同第２００７／００４８７７６号、同第２０１１／０１２４１００号、同第２００９／００９３０４９号、同第２０１３／０１７７５８１号、国際特許公開番号ＷＯ２００９／０７５８８６、ＷＯ２００７／０２５００８、ＷＯ２０１２／００９６４４、ＷＯ２００１／０５５３７１、ＷＯ１９９９／０２４５９５、並びに欧州特許第２６１０３４１号及び同第２６１０３４０号を参照（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）特定のＴＥＥの１つ以上またはそれらの変異体、相同体または機能的誘導体を含むポリヌクレオチドである。特定のＴＥＥの１つ以上のコピーが、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）に存在し得る。翻訳エンハンサーポリヌクレオチドにおけるＴＥＥは、１つ以上の配列セグメントにおいて構成され得る。配列セグメントは、本明細書に例示される特定のＴＥＥの１つ以上を保有することができ、各ＴＥＥは、１つ以上のコピーに存在する。複数の配列セグメントが、翻訳エンハンサーポリヌクレオチドに存在する場合、それらは、相同的または異種であり得る。従って、翻訳エンハンサーポリヌクレオチドにおける複数の配列セグメントは、本明細書に例示される特定のＴＥＥの同一または異なるタイプ、特定のＴＥＥのそれぞれの同一または異なる数のコピー、及び／または各配列セグメント内のＴＥＥの同一または異なる構成を保有し得る。
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、国際特許公開番号ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＷＯ２０１２／００９６４４、ＷＯ２００９／０７５８８６、ＷＯ２００７／０２５００８、ＷＯ１９９９／０２４５９５、欧州特許公開第２６１０３４１号及び同第２６１０３４０号、米国特許第６，３１０，１９７号、同第６，８４９，４０５号、同第７，４５６，２７３号、同第７，１８３，３９５号、並びに米国特許出願公開第２００９／０２２６４７０号、同第２０１１／０１２４１００号、同第２００７／００４８７７６号、同第２００９／００９３０４９号、及び同第２０１３／０１７７５８１号（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される少なくとも１つのＴＥＥを含み得る。ＴＥＥは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’－ＵＴＲに位置し得る。
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、米国特許出願公開第２００９／０２２６４７０号、同第２００７／００４８７７６号、同第２０１３／０１７７５８１号及び同第２０１１／０１２４１００号、国際特許公開番号ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＷＯ２０１２／００９６４４、ＷＯ２００９／０７５８８６及びＷＯ２００７／０２５００８、欧州特許公開第２６１０３４１号及び同第２６１０３４０号、米国特許第６，３１０，１９７号、同第６，８４９，４０５号、同第７，４５６，２７３号、同第７，１８３，３９５号（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＴＥＥと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つのＴＥＥを含み得る。
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’－ＵＴＲは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５または６０超のＴＥＥ配列を含み得る。ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’－ＵＴＲにおけるＴＥＥ配列は、同じかまたは異なるＴＥＥ配列であり得る。ＴＥＥ配列は、１回、２回、または３回超反復される、ＡＢＡＢＡＢ、ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ、またはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、またはその変形などのパターンであり得る。これらのパターンにおいて、各文字、Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＴＥＥ配列を表す。
ある場合には、５’－ＵＴＲは、２つのＴＥＥ配列を隔てるスペーサーを含み得る。非限定例として、スペーサーは、１５ヌクレオチドスペーサー及び／または当該技術分野において公知の他のスペーサーであり得る。別の非限定例として、５’－ＵＴＲは、５’－ＵＴＲにおいて少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または１０回以上反復されるＴＥＥ配列－スペーサーモジュールを含み得る。
他の場合には、２つのＴＥＥ配列を隔てるスペーサーは、限定はされないが、ｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ結合部位及びｍｉＲシード）などの、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳を調節し得る、当該技術分野において公知の他の配列を含み得る。非限定例として、２つのＴＥＥ配列を隔てるのに使用される各スペーサーは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の成分（例えば、ｍｉＲシード配列）を含み得る。
ある場合には、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’－ＵＴＲにおけるＴＥＥは、米国特許出願公開第２００９／０２２６４７０号、同第２００７／００４８７７６号、同第２０１３／０１７７５８１号及び同第２０１１／０１２４１００号、国際特許公開番号ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＷＯ２０１２／００９６４４、ＷＯ２００９／０７５８８６及びＷＯ２００７／０２５００８、欧州特許公開第２６１０３４１号及び同第２６１０３４０号、並びに米国特許第６，３１０，１９７号、同第６，８４９，４０５号、同第７，４５６，２７３号、及び同第７，１８３，３９５号（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるＴＥＥ配列を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または９９％超含み得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’－ＵＴＲにおけるＴＥＥは、米国特許公開第２００９／０２２６４７０号、同第２００７／００４８７７６号、同第２０１３／０１７７５８１号及び同第２０１１／０１２４１００号、国際特許公開番号ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＷＯ２０１２／００９６４４、ＷＯ２００９／０７５８８６及びＷＯ２００７／０２５００８、欧州特許公開第２６１０３４１号及び２６１０３４０号、並びに米国特許第６，３１０，１９７号、同第６，８４９，４０５号、同第７，４５６，２７３号、及び同第７，１８３，３９５号（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるＴＥＥ配列の５～３０ヌクレオチド断片、５～２５ヌクレオチド断片、５～２０ヌクレオチド断片、５～１５ヌクレオチド断片、５～１０ヌクレオチド断片を含み得る。
ある場合には、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’－ＵＴＲにおけるＴＥＥは、Ｃｈａｐｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：９５９０－９５９４，２００４）及びＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ １０２：６２７３－６２７８，２００５）、及びＷｅｌｌｅｎｓｉｅｋ ｅｔ ａｌ（Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｐ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ－ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１３；ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２）によって開示される補足表１及び補足表２（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるＴＥＥ配列を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または９９％超含み得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’－ＵＴＲにおけるＴＥＥは、Ｃｈａｐｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：９５９０－９５９４，２００４）及びＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ １０２：６２７３－６２７８，２００５）、及びＷｅｌｌｅｎｓｉｅｋ ｅｔ ａｌ（Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｐ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ－ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１３；ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２）によって開示される補足表１及び補足表２（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるＴＥＥ配列の５～３０ヌクレオチド断片、５～２５ヌクレオチド断片、５～２０ヌクレオチド断片、５～１５ヌクレオチド断片、５～１０ヌクレオチド断片を含み得る。
いくつかの場合には、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’－ＵＴＲに使用されるＴＥＥは、限定はされないが、米国特許第７，４６８，２７５号及び国際特許公開番号ＷＯ２００１／０５５３６９（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどのＩＲＥＳ配列である。
いくつかの場合には、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’－ＵＴＲに使用されるＴＥＥは、米国特許出願公開第２００７／００４８７７６号及び同第２０１１／０１２４１００号及び国際特許公開番号ＷＯ２００７／０２５００８及びＷＯ２０１２／００９６４４（これらのそれぞれの方法は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法によって同定され得る。
いくつかの場合には、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’－ＵＴＲに使用されるＴＥＥは、米国特許第７，４５６，２７３号及び同第７，１８３，３９５号、米国特許出願公開第２００９／００９３０４９号、及び国際公開番号ＷＯ２００１／０５５３７１（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される転写調節エレメントであり得る。転写調節エレメントは、限定はされないが、米国特許第７，４５６，２７３号及び同第７，１８３，３９５号、米国特許出願公開第２００９／００９３０４９号、及び国際公開番号ＷＯ２００１／０５５３７１（これらのそれぞれの方法は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法などの、当該技術分野において公知の方法によって同定され得る。
さらに他の場合には、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’－ＵＴＲに使用されるＴＥＥは、米国特許第７，４５６，２７３号及び同第７，１８３，３９５号、米国特許出願公開第２００９／００９３０４９号、及び国際公開番号ＷＯ２００１／０５５３７１（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるポリヌクレオチドまたはその部分である。
本明細書に記載される少なくとも１つのＴＥＥを含む５’－ＵＴＲは、限定はされないが、ベクター系またはポリヌクレオチドベクターなどの単シストロン性配列に組み込まれ得る。非限定例として、ベクター系及びポリヌクレオチドベクターは、米国特許第７，４５６，２７３号及び同第７，１８３，３９５号、米国特許出願公開第２００７／００４８７７６号、同第２００９／００９３０４９号及び同第２０１１／０１２４１００号、並びに国際特許公開番号ＷＯ２００７／０２５００８及びＷＯ２００１／０５５３７１（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものを含み得る。
本明細書に記載されるＴＥＥは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’－ＵＴＲ及び／または３’－ＵＴＲに位置し得る。３’－ＵＴＲに位置するＴＥＥは、５’－ＵＴＲに位置するか、及び／または５’－ＵＴＲへの組み込みについて記載されるＴＥＥと同じか及び／または異なり得る。
いくつかの場合には、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’－ＵＴＲは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５または６０超のＴＥＥ配列を含み得る。本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’－ＵＴＲにおけるＴＥＥ配列は、同じかまたは異なるＴＥＥ配列であり得る。ＴＥＥ配列は、１回、２回、または３回超反復される、ＡＢＡＢＡＢ、ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ、またはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、またはその変形などのパターンであり得る。これらのパターンにおいて、各文字、Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＴＥＥ配列を表す。
１つの例では、３’－ＵＴＲは、２つのＴＥＥ配列を隔てるスペーサーを含み得る。非限定例として、スペーサーは、１５ヌクレオチドスペーサー及び／または当該技術分野において公知の他のスペーサーであり得る。別の非限定例として、３’－ＵＴＲは、３’－ＵＴＲにおいて少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または１０回以上反復されるＴＥＥ配列－スペーサーモジュールを含み得る。
他の場合には、２つのＴＥＥ配列を隔てるスペーサーは、限定はされないが、本明細書に記載されるｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ結合部位及びｍｉＲシード）などの、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳を調節し得る、当該技術分野において公知の他の配列を含み得る。非限定例として、２つのＴＥＥ配列を隔てるのに使用される各スペーサーは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の成分（例えば、ｍｉＲシード配列）を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のポリリボヌクレオチドは、ｍｉＲ及び／またはＴＥＥ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ配列及び／またはＴＥＥ配列の本開示のポリリボヌクレオチドへの組み込みは、ステムループ領域の形状を変化させ、これは、翻訳を増加及び／または減少させ得る（例えば、Ｋｅｄｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０ １２（１０）：１０１４－２０を参照されたい、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
センサー配列及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位
センサー配列には、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列及び／またはモチーフ、内因性核酸結合分子の疑似受容体として作用するように改変された人工結合部位、並びにそれらの組み合わせが含まれる。センサー配列の非限定例は、米国公開第２０１４／０２００２６１号に記載されており、その内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む本開示のポリリボヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、センサー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、センサー配列は、ｍｉＲＮＡ結合部位である。
ｍｉＲＮＡは、ポリリボヌクレオチドに結合し、ポリリボヌクレオチドの安定性を低下させるか、ポリリボヌクレオチドの翻訳を阻害することにより、遺伝子発現を下方制御する１９～２５ヌクレオチドの長さの非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの位置２～８の領域内の配列を含む。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの位置２～８または２～７を含むことができる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含むことができ、対応するｍｉＲＮＡ結合部位のシード相補部位は、ｍｉＲＮＡの位置１とは反対のアデノシン（Ａ）が隣接している。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含むことができ、対応するｍｉＲＮＡ結合部位のシード相補部位は、ｍｉＲＮＡの位置１とは反対のアデノシン（Ａ）が隣接している。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ Ａ，Ｆａｒｈ ＫＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ－Ｅｎｇｅｌｅ Ｐ，Ｌｉｍ ＬＰ，Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００７ Ｊｕｌ ６；２７（ｌ）：９１－１０５を参照されたい。標的細胞または組織のｍｉＲＮＡプロファイリングを行って、細胞または組織内のｍｉＲＮＡの有無を判断することができる。いくつかの実施形態では、本開示のポリリボヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、またはマイクロＲＮＡシードを含む。そのような配列は、米国特許公開第２００５／０２６１２１８号及び米国特許公開第２００５／００５９００５号に教示されているものなどの任意の公知のマイクロＲＮＡに対応することができ、そのそれぞれの内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用する場合、「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）結合部位」という用語は、ｍｉＲＮＡと相互作用、結合、または結合するためのｍｉＲＮＡの全てまたは領域に対する十分な相補性を有する、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含む、ポリリボヌクレオチド内、例えば、ＤＮＡ内またはＲＮＡ転写物内の配列を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む本開示のポリリボヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。例示的な実施形態では、ポリリボヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリリボヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介調節、例えば、ポリリボヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介翻訳抑制または分解を促進するのに十分な程度の相補性を指す。本開示の例示的な態様では、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリリボヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介分解、例えば、ｍＲＮＡの、ｍｉＲＮＡ誘導ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲｌＳＣ）媒介切断を促進するのに十分な程度の相補性を指す。ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、１９～２５ヌクレオチドｍｉＲＮＡ配列、１９～２３ヌクレオチドｍｉＲＮＡ配列、または２２ヌクレオチドｍｉＲＮＡ配列に対して相補性を有し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡの一部のみ、例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡ配列の全長の１、２、３、または４ヌクレオチド未満の部分のみに相補的であり得る。所望の調節がｍＲＮＡ分解である場合、全部または完全な相補性（例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡの長さの全てまたはかなりの部分にわたる全部の相補性または完全な相補性）が好ましい。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位には、ｍｉＲＮＡシード配列との相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位には、ｍｉＲＮＡシード配列と完全な相補性を有する配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位には、ｍｉＲＮＡ配列と相補性（部分的または完全な相補性など）を有する配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位には、ｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有する配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位はｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有するが、１、２、または３ヌクレオチドの置換、末端付加、及び／または短縮化がある。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡと同一の長さである。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、またはその両方で、対応するｍｉＲＮＡよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヌクレオチド（複数可）短い。さらに他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、またはその両方で、対応するマイクロＲＮＡよりも２ヌクレオチド短い。対応するｍｉＲＮＡよりも短いｍｉＲＮＡ結合部位は、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を取り込んだｍＲＮＡを分解したり、ｍＲＮＡの翻訳を妨げたりすることがなおも可能である。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ダイサーを含む活性ＲＩＳＣの一部である対応する成熟ｍｉＲＮＡに結合する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位のＲＩＳＣ内の対応するｍｉＲＮＡへの結合は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡを分解するか、またはｍＲＮＡが翻訳されるのを防ぐ。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡと十分な相補性を持っているため、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体はｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリリボヌクレオチドを切断する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、不完全な相補性を有するため、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリリボヌクレオチドの不安定性を誘発する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、不完全な相補性を持っているため、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリリボヌクレオチドの転写を抑制する。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のミスマッチを有する。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の連続したヌクレオチドのそれぞれに相補的な、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の連続したヌクレオチドを有する。
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチド内に入れるように操作することにより、問題のｍｉＲＮＡが利用可能であれば、ポリリボヌクレオチドを分解または翻訳の減少の標的とすることができる。これにより、ポリリボヌクレオチドの送達時のオフターゲット効果を減らすことができる。いくつかの実施形態では、本開示のポリリボヌクレオチドが組織または細胞に送達されることを意図していないが、そこで終わる場合、その組織または細胞内の豊富なｍｉＲＮＡは、１つ以上のｍｉＲＮＡの結合部位がポリリボヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに入れるよう操作されている場合、目的の遺伝子の発現を阻害し得る。
逆に、ｍｉＲＮＡ結合部位は、特定の組織でのタンパク質発現を増加させるために、天然に存在するポリリボヌクレオチド配列から除去できる。いくつかの実施形態では、特定のｍｉＲＮＡの結合部位をポリリボヌクレオチドから除去して、ｍｉＲＮＡを含む組織または細胞のタンパク質発現を改善することができる。
いくつかの実施形態では、本開示のポリリボヌクレオチドは、正常及び／または癌性細胞などであるが、これらに限定されない特定の細胞に細胞傷害性または細胞保護性ｍＲＮＡ治療薬を誘導するために、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含むことができる。別の実施形態では、本開示のポリリボヌクレオチドは、正常及び／または癌性細胞などであるが、これらに限定されない特定の細胞に細胞傷害性または細胞保護性ｍＲＮＡ治療薬を誘導するために、５’－ＵＴＲ及び／または３’－ＵＴＲに２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含むことができる。
複数の組織での発現の調節は、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の導入または除去によって実現できる。ｍｉＲＮＡ結合部位を除去または挿入するかどうかの決定は、ｍｉＲＮＡ発現パターン及び／または疾患におけるプロファイリングに基づいて行うことができる。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、並びにそれらの発現パターン及び生物学における役割の同定が報告されている（例えば、Ｂｏｎａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２０１０ １１：９４３－９４９、Ａｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ａｎｄ Ｒａｏ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１２ ２６：４０４－４１３（２０１１ Ｄｅｃ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）、Ｂａｒｔｅｌ Ｃｅｌｌ ２００９ １３６：２１５－２３３、Ｌａｎｄｇｒａｆ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００７ １２９：１４０１－１４１４、Ｇｅｎｔｎｅｒ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２ ８０：３９３－４０３、及びそれらの中の引用。それぞれは、その参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ結合部位は、米国公開第２０１４／０２００２６１号、同第２００５／０２６１２１８号、及び同第２００５／００５９００５号に記載された非限定的な例を含む、任意の公知の配列に対応することができ、これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡを制御し、それによりタンパク質発現を行うことが知られている組織の例としては、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－ｌｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）が挙げられるが、これらに限定されない。
具体的には、ｍｉＲＮＡは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞及びマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラーなどの免疫細胞（造血細胞とも呼ばれる）で差次的に発現することが知られている。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫反応、炎症、並びに遺伝子治療及び組織／臓器移植後の望ましくない免疫応答に関与している。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡは、造血細胞（免疫細胞）の発生、増殖、分化、及びアポトーシスの多くの側面も制御する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２及びｍｉＲ－１４６は、免疫細胞でのみ発現し、特に、骨髄樹状細胞で豊富である。ｍｉＲ－１４２結合部位をポリリボヌクレオチドの３’－ＵＴＲに付加することにより、ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答を遮断できることが実証されており、組織及び細胞内でのより安定した遺伝子導入が可能になる。ｍｉＲ－１４２は、抗原提示細胞の外因性ポリリボヌクレオチドを効率的に分解し、形質導入細胞の細胞傷害性除去を抑制する（例えば、Ａｎｎｏｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，５１５２－５１６１、Ｂｒｏｗｎ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ ｍｅｄ．２００６，１２（５），５８５－５９１、Ｂｒｏｗｎ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００７，１１０（１３）：４１４４－４１５２。これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
抗原媒介性免疫応答とは、外来抗原によって誘発される免疫応答を指し得、外来抗原は、生物に侵入すると、抗原提示細胞によって処理され、抗原提示細胞の表面に表示される。Ｔ細胞は、提示された抗原を認識し、抗原を発現する細胞の細胞傷害性排除を誘導できる。
本開示のポリリボヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲにｍｉＲ－１４２結合部位を導入すると、ｍｉＲ－１４２を介した分解により抗原提示細胞の遺伝子発現を選択的に抑制し、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）の抗原提示を制限でき、それによりポリリボヌクレオチドの送達後の抗原媒介性免疫応答を防ぐことができる。ポリリボヌクレオチドは、細胞傷害性除去を誘発することなく、標的組織または細胞で安定して発現する。
いくつかの実施形態では、免疫細胞、特に、抗原提示細胞で発現することが知られているｍｉＲＮＡの結合部位は、本開示のポリリボヌクレオチドに入れるよう操作され、ｍｉＲＮＡ媒介ＲＮＡ分解により抗原提示細胞のポリリボヌクレオチドの発現を抑制し、抗原媒介性免疫応答を抑制することができる。ポリリボヌクレオチドの発現は、免疫細胞特異的なｍｉＲＮＡが発現しない非免疫細胞で維持される。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、肝臓特異的タンパク質に対する免疫原性反応を防ぐために、ｍｉＲ－１２２結合部位を除去し、ｍｉＲ－１４２（及び／またはｍｉｒＲ－１４６）結合部位を、本開示のポリリボヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲへと入れるよう操作することができる。
ＡＰＣ及びマクロファージの選択的分解及び抑制をさらに促進するために、本開示のポリリボヌクレオチドは、単独であるいはｍｉＲ－１４２及び／またはｍｉＲ－１４６結合部位と組み合わせて、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲにさらなる負の調節エレメントを含むことができる。非限定例として、さらなる負の調節エレメントは、構成的減衰エレメント（ＣＤＥ）である。
免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡには、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｈｓａ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１１８４、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－ｌ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２７９、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４７ａ、ｍｉＲ－１４７ｂ、ｍｉＲ－１４８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１５１ｂ、ｍｉＲ－１５５－３ｐ、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１６－１－３ｐ、ｍｉＲ－１６－２－３ｐ、ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ｍｉＲ－１９７－３ｐ、ｍｉＲ－１９７－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｍｉＲ－２２３－５ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２４－１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－１－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｍｉＲ－２８－５ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－１－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３３１－５ｐ、ｍｉＲ－３３９－３ｐ、ｍｉＲ－３３９－５ｐ、ｍｉＲ－３４５－３ｐ、ｍｉＲ－３４５－５ｐ、ｍｉＲ－３４６、ｍｉＲ－３４ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７２、ｍｉＲ－３７７－３ｐ、ｍｉＲ－３７７－５ｐ、ｍｉＲ－４９３－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－５ｐ、ｍｉＲ－５４２、ｍｉＲ－５４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｉ、ｍｉＲ－５４８ｊ、ｍｉＲ－５４８ｎ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－５９８、ｍｉＲ－７１８、ｍｉＲ－９３５、ｍｉＲ－９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９９ｂ－５ｐが含まれるが、これらに限定されない。さらに、マイクロアレイハイブリダイゼーション及びミクロトーム解析により免疫細胞で新規ｍｉＲＮＡを同定することができる（例えば、Ｊｉｍａ ＤＤ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：ｅｌ １８－ｅｌ２７、Ｖａｚ Ｃ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，１１，２８８。それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
肝臓で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ－１０７、ｍｉＲ－１２２－３ｐ、ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｍｉＲ－１２２８－３ｐ、ｍｉＲ－１２２８－５ｐ、ｍｉＲ－１２４９、ｍｉＲ－１２９－５ｐ、ｍｉＲ－１３０３、ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５２、ｍｉＲ－１９４－３ｐ、ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－５５７、ｍｉＲ－５８１、ｍｉＲ－９３９－３ｐ、及びｍｉＲ－９３９－５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。任意の肝臓特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入またはそこから除去して、肝臓におけるポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。肝臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、または本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
肺で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１２７－３ｐ、ｍｉＲ－１２７－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１３４、ｍｉＲ－１８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２４－１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－３２－３ｐ、ｍｉＲ－３３７－３ｐ、ｍｉＲ－３３７－５ｐ、ｍｉＲ－３８１－３ｐ、及びｍｉＲ－３８１－５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。任意の肺特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入またはそこから除去して、肺におけるポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。肺特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、または本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて改変することができる。
心臓で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－５ｐ、ｍｉＲ－１８６－３ｐ、ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－３２０、ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｉＲ－４５１ｂ、ｍｉＲ－４９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－４９９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－７４４－３ｐ、ｍｉＲ－７４４－５ｐ、ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９２ｂ－５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。任意の心臓特異的マイクロＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入またはそこから除去して、心臓におけるポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。心臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、または本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
神経系で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ－１２４－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２７１－３ｐ、ｍｉＲ－１２７１－５ｐ、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１３７、ｍｉＲ－１３９－５ｐ、ｍｉＲ－１３９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－５ｐ、ｍｉＲ－１５３、ｍｉＲ－１８１ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－１８３－３ｐ、ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１９０ａ、ｍｉＲ－１９０ｂ、ｍｉＲ－２１２－３ｐ、ｍｉＲ－２１２－５ｐ、ｍｉＲ－２１９－１－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－２－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－１－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－２－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｄ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－３２９、ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｍｉＲ－３６６５、ｍｉＲ－３６６６、ｍｉＲ－３８０－３ｐ、ｍｉＲ－３８０－５ｐ、ｍｉＲ－３８３、ｍｉＲ－４１０、ｍｉＲ－４２５－３ｐ、ｍｉＲ－４２５－５ｐ、ｍｉＲ－４５４－３ｐ、ｍｉＲ－４５４－５ｐ、ｍｉＲ－４８３、ｍｉＲ－５１０、ｍｉＲ－５１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－５７１、ｍｉＲ－７－１－３ｐ、ｍｉＲ－７－２－３ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－８０２、ｍｉＲ－９２２、ｍｉＲ－９－３ｐ、及びｍｉＲ－９－５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。神経系において豊富なｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１４８ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１２－３ｐ、ｍｉＲ－２１２－５ｐ、ｍｉＲ－３２０ｂ、ｍｉＲ－３２０ｅ、ｍｉＲ－３２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｍｉＲ－３２５、ｍｉＲ－３２６、ｍｉＲ－３２８、ｍｉＲ－９２２を含むがこれらに限定されないニューロンに特異的に発現するもの、並びにｍｉＲ－１２５０、ｍｉＲ－２１９－１－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－２－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０６５－３ｐ、ｍｉＲ－３０６５－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－３３８－５ｐ、及びｍｉＲ－６５７を含むがこれらに限定されないグリア細胞で特異的に発現するものがさらに含まれる。任意のＣＮＳ特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入またはそこから除去して、神経系におけるポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。神経系特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、または本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
膵臓で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ－１０５－３ｐ、ｍｉＲ－１０５－５ｐ、ｍｉＲ－１８４、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３７５、ｍｉＲ－７－１－３ｐ、ｍｉＲ－７－２－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－５ｐ、及びｍｉＲ－９４４が挙げられるが、これらに限定されない。任意の膵臓特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入またはそこから除去して、膵臓におけるポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。膵臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、または本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて改変することができる。
腎臓で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ－１２２－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１９２－３ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－１９４－３ｐ、ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ、ｍｉＲ－２０４－５ｐ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－１－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－２－３ｐ、ｍｉＲ３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－３ｐ、ｍｉＲ－３３５－３ｐ、ｍｉＲ－３３５－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、及びｍｉＲ－５６２が挙げられるが、これらに限定されない。任意の腎臓特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入またはそこから除去して、腎臓におけるポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。腎臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、または本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
筋肉で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ－７ｇ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１２８６、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４０－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－５ｐ、ｍｉＲ－１４５－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１８８－３ｐ、ｍｉＲ－１８８－５ｐ、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ、ｍｉＲ－２５－３ｐ、及びｍｉＲ－２５－５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。任意の筋肉特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入またはそこから除去して、筋肉におけるポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。筋肉特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、または本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて改変することができる。
ｍｉＲＮＡは、内皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞を含むがこれらに限定されない様々なタイプの細胞でも差次的に発現する。
内皮細胞で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ－７ｂ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１００－３ｐ、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｍｉＲ－１０１－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１２３６－３ｐ、ｍｉＲ－１２３６－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１７－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－１－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｍｉＲ－２２２－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｍｉＲ－３６１－５ｐ、ｍｉＲ－４２１、ｍｉＲ－４２４－３ｐ、ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９２ｂ－５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。多くの新規ｍｉＲＮＡが、ディープシークエンシング解析から内皮細胞において発見されている（例えば、Ｖｏｅｌｌｅｎｋｌｅ Ｃ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，２０１２，１８，４７２－４８４。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。任意の内皮細胞特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入またはそこから除去して、内皮細胞におけるポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。
上皮細胞で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ－７ｂ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－４２９、ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｉＲ－４５１ｂ、ｍｉＲ－４９４、ｍｉＲ－８０２及びｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－３４ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３４ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－４４９ａ、ｍｉＲ－４４９ｂ－３ｐ、呼吸器繊毛上皮細胞に特異的なｍｉＲ－４４９ｂ－５ｐ、ｌｅｔ－７ファミリー、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、肺上皮細胞に特異的なｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－３８２－３ｐ、腎上皮細胞に特異的なｍｉＲ－３８２－５ｐ、角膜上皮細胞に特異的なｍｉＲ－７６２が含まれるが、これらに限定されない。任意の上皮細胞特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入またはそこから除去して、上皮細胞におけるポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。
さらに、ｍｉＲＮＡの大規模な群が胚性幹細胞に富んでおり、幹細胞の自己再生、並びに神経細胞、心臓、造血細胞、皮膚細胞、骨形成細胞、及び筋肉細胞などの様々な細胞系統の発生及び／または分化を制御する（例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ ＫＴ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２０１３，１３（５），７５７－７６４、Ｖｉｄｉｇａｌ ＪＡ ａｎｄ Ｖｅｎｔｕｒａ Ａ，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．２０１２，２２（５－６），４２８－４３６；Ｇｏｆｆ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２、Ｍｏｒｉｎ ＲＤ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０－６２１、Ｙｏｏ ＪＫ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２０１２，２１（１１），２０４９－２０５７。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。胚性幹細胞に豊富なｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｌｅｔ－ａ－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｌｅｔ７ｄ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１０６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－１２７５、ｍｉＲ－１３８－１－３ｐ、ｍｉＲ－１３８－２－３ｐ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－１５４－３ｐ、ｍｉＲ－１５４－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－２９０、ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｄ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｅ、ｍｉＲ－３６７－３ｐ、ｍｉＲ－３６７－５ｐ、ｍｉＲ－３６９－３ｐ、ｍｉＲ－３６９－５ｐ、ｍｉＲ－３７０、ｍｉＲ－３７１、ｍｉＲ－３７３、ｍｉＲ－３８０－５ｐ、ｍｉＲ－４２３－３ｐ、ｍｉＲ－４２３－５ｐ、ｍｉＲ－４８６－５ｐ、ｍｉＲ－５２０ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｅ、ｍｉＲ－５４８ｆ、ｍｉＲ－５４８ｇ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｇ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｉ、ｍｉＲ－５４８ｋ、ｍｉＲ－５４８ｌ、ｍｉＲ－５４８ｍ、ｍｉＲ－５４８ｎ、ｍｉＲ－５４８ｏ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｏ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｐ、ｍｉＲ－６６４ａ－３ｐ、ｍｉＲ－６６４ａ－５ｐ、ｍｉＲ－６６４ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－６６４ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－７６６－３ｐ、ｍｉＲ－７６６－５ｐ、ｍｉＲ－８８５－３ｐ、ｍｉＲ－８８５－５ｐ、ｍｉＲ－９３－３ｐ、ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｍｉＲ－９４１、ｍｉＲ－９６－３ｐ、ｍｉＲ－９６－５ｐ、ｍｉＲ－９９ｂ－３ｐ及びｍｉＲ－９９ｂ－５ｐが含まれるが、これらに限定されない。予測される多くの新規ｍｉＲＮＡは、ヒト胚性幹細胞のディープシークエンシングによって発見される（例えば、Ｍｏｒｉｎ ＲＤ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０－６２１、Ｇｏｆｆ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２、Ｂａｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，２００８，２６，２４９６－２５０５。これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、胚性幹細胞特異的ｍｉＲＮＡの結合部位は、本開示のポリリボヌクレオチドの３’ＵＴＲに含まれるか、またはそこから除去されて、胚性幹細胞の発生及び／または分化を調節し、変性状態（例えば、変性疾患）での幹細胞の老化を阻害し、あるいは疾患状態の幹細胞（例えば、癌幹細胞）の老化及びアポトーシスを刺激することができる。
多くのｍｉＲＮＡ発現研究が、様々な癌細胞／組織及び他の疾患でのｍｉＲＮＡの差次的発現をプロファイルするために実施される。いくつかのｍｉＲＮＡは、ある特定の癌細胞で異常に過剰発現し、他のｍｉＲＮＡは、過少発現している。例えば、ｍｉＲＮＡは、癌細胞において（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＵＳ２０１３／００５９０１５、ＵＳ２０１３／００４２３３３、ＷＯ２０１１／１５７２９４）、癌幹細胞において（ＵＳ２０１２／００５３２２４）、膵臓癌及び疾患において（ＵＳ２００９／０１３１３４８、ＵＳ２０１１／０１７１６４６、ＵＳ２０１０／０２８６２３２、ＵＳ８３８９２１０）、喘息及び炎症において（ＵＳ８４１５０９６）、前立腺癌において（ＵＳ２０１３／００５３２６４）、肝細胞癌において（ＷＯ２０１２／１５１２１２、ＵＳ２０１２／０３２９６７２、ＷＯ２００８／０５４８２８、ＵＳ８２５２５３８）、胚細胞癌において（ＷＯ２０１１／０７６１４３、ＷＯ２０１３／０３３６４０、ＷＯ２００９／０７０６５３、ＵＳ２０１０／０３２３３５７）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫において（ＷＯ２０１３／０１１３７８）、大腸癌細胞において（ＷＯ２０１１／０２８１７５６、ＷＯ２０１１／０７６１４２）、がん陽性リンパ節において（ＷＯ２００９／１００４３０、ＵＳ２００９／０２６３８０３）、上咽頭癌において（ＥＰ２１１２２３５）、慢性閉塞性肺疾患において（ＵＳ２０１２／０２６４６２６、ＵＳ２０１３／００５３２６３）、甲状腺癌において（ＷＯ２０１３／０６６６７８）、卵巣癌細胞において（ＵＳ２０１２／０３０９６４５、ＷＯ２０１１／０９５６２３）、乳癌細胞において（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＷＯ２００７／０８１７４０、ＵＳ２０１２／０２１４６９９）、白血病及びリンパ腫において（ＷＯ２００８／０７３９１５、ＵＳ２００９／００９２９７４、ＵＳ２０１２／０３１６０８１、ＵＳ２０１２／０２８３３１０、ＷＯ２０１０／０１８５６３）差次的に発現しており、それらのそれぞれの内容は、その参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
非限定例として、ある特定の癌及び／または腫瘍細胞で過剰発現するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリリボヌクレオチドの３’ＵＴＲから除去され、癌細胞において過剰発現したｍｉＲＮＡにより抑制された発現を回復することができ、従って、例えば、転写刺激及び／または抑制、細胞周期停止、アポトーシス及び細胞死などの対応する生物学的機能を改善する。ｍｉＲＮＡの発現が上方制御されていない正常な細胞及び組織は、影響を受けない。
ｍｉＲＮＡは、血管新生などの複雑な生物学的プロセスも調節できる（例えば、ｍｉＲ－１３２）（Ａｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６）。本開示のポリリボヌクレオチドにおいて、ポリリボヌクレオチドの発現を生物学的に関連する細胞タイプまたは関連する生物学的プロセスに合わせるために、そのようなプロセスに関与するｍｉＲＮＡ結合部位を除去または導入することができる。これに関連して、本開示のポリリボヌクレオチドは、栄養要求性ポリリボヌクレオチドとして定義される。
ステムループ
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、限定はされないが、ヒストンステムループなどのステムループを含み得る。ステムループは、約２５または約２６ヌクレオチド長のヌクレオチド配列、例えば、限定はされないが、国際特許公開番号ＷＯ２０１３／１０３６５９（その配列番号７～１７は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される配列番号７～１７であり得る。ヒストンステムループは、コード領域に対して３’側に（例えば、コード領域の３’末端に）位置し得る。非限定例として、ステムループは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの３’末端に位置し得る。ある場合には、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、２つ以上のステムループ（例えば、２つのステムループ）を含む。ステムループ配列の例は、国際特許公開番号ＷＯ２０１２／０１９７８０及びＷＯ２０１５０２６６７（これらのステムループ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ある場合には、ポリヌクレオチドは、ステムループ配列ＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ（配列番号１）を含む。他の場合には、ポリヌクレオチドは、ステムループ配列ＣＡＡＡＧＧＣＵＣＵＵＵＵＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ（配列番号２）を含む。
ステムループは、ポリヌクレオチドの第２の末端領域に位置し得る。非限定例として、ステムループは、第２の末端領域の非翻訳領域（例えば、３’－ＵＴＲ）に位置し得る。
ある場合には、限定はされないが、ヒストンステムループを含むｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、３’－安定化領域（例えば、少なくとも１つの鎖終止ヌクレオシドを含む３’－安定化領域）の付加によって安定化され得る。理論に制約されることは意図しないが、少なくとも１つの鎖終止ヌクレオシドの付加は、ポリヌクレオチドの分解を減速させ得るため、ポリヌクレオチドの半減期を増加させることができる。
他の場合には、限定はされないが、ヒストンステムループを含むｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、オリゴ（Ｕ）の付加を防止及び／または阻害することができるポリヌクレオチドの３’－領域に対する改変によって安定化され得る（例えば、国際特許公開番号ＷＯ２０１３／１０３６５９を参照されたい）。
さらに他の場合には、限定はされないが、ヒストンステムループを含むｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、３’－デオキシヌクレオシド、２’，３’－ジデオキシヌクレオシド３’－Ｏ－メチルヌクレオシド、３’－Ｏ－エチルヌクレオシド、３’－アラビノシド、及び当該技術分野において公知であるか、及び／または本明細書に記載される他の改変ヌクレオシドにおいて終端するオリゴヌクレオチドの付加によって安定化され得る。
ある場合には、本開示のポリヌクレオチドは、ヒストンステムループ、ポリ－Ａ領域、及び／または５’－キャップ構造を含み得る。ヒストンステムループは、ポリ－Ａ領域の前及び／または後にあり得る。ヒストンステムループ及びポリ－Ａ領域配列を含むポリヌクレオチドは、本明細書に記載される鎖終止ヌクレオシドを含み得る。
他の場合には、本開示のポリヌクレオチドは、ヒストンステムループ及び５’－キャップ構造を含み得る。５’－キャップ構造は、限定はされないが、本明細書に記載されるか、及び／または当該技術分野において公知のものを含み得る。
ある場合には、保存ステムループ領域は、本明細書に記載されるｍｉＲ配列を含み得る。非限定例として、ステムループ領域は、本明細書に記載されるｍｉＲ配列のシード配列を含み得る。別の非限定例では、ステムループ領域は、ｍｉＲ－１２２シード配列を含み得る。
場合によっては、保存ステムループ領域は、本明細書に記載されるｍｉＲ配列を含んでもよく、ＴＥＥ配列も含み得る。
ある場合には、ｍｉＲ配列及び／またはＴＥＥ配列の組み込みは、ステムループ領域の形状を変化させ、これは、翻訳を増加及び／または減少させ得る（例えば、Ｋｅｄｄｅ ｅｔ ａｌ．Ａ Ｐｕｍｉｌｉｏ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ ｐ２７－３’ＵＴＲ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｍｉＲ－２２１ ａｎｄ ｍｉＲ－２２ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．２０１０（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのヒストンステムループ及びポリ－Ａ領域またはポリアデニル化シグナルを含み得る。少なくとも１つのヒストンステムループ及びポリ－Ａ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチド配列の非限定例は、国際特許公開番号ＷＯ２０１３／１２０４９７、ＷＯ２０１３／１２０６２９、ＷＯ２０１３／１２０５００、ＷＯ２０１３／１２０６２７、ＷＯ２０１３／１２０４９８、ＷＯ２０１３／１２０６２６、ＷＯ２０１３／１２０４９９及びＷＯ２０１３／１２０６２８（これらのそれぞれの配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ある場合には、ヒストンステムループ及びポリ－Ａ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、国際特許公開番号ＷＯ２０１３／１２０４９９及びＷＯ２０１３／１２０６２８（これらの両方の配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるポリヌクレオチド配列などの病原体抗原またはその断片をコードし得る。他の場合には、ヒストンステムループ及びポリ－Ａ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、国際特許公開番号ＷＯ２０１３／１２０４９７及びＷＯ２０１３／１２０６２９（これらの両方の配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるポリヌクレオチド配列などの治療用タンパク質をコードし得る。ある場合には、ヒストンステムループ及びポリ－Ａ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、国際特許公開番号ＷＯ２０１３／１２０５００及びＷＯ２０１３／１２０６２７（これらの両方の配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるポリヌクレオチド配列などの腫瘍抗原またはその断片をコードし得る。他の場合には、ヒストンステムループ及びポリ－Ａ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、国際特許公開番号ＷＯ２０１３／１２０４９８及びＷＯ２０１３／１２０６２６（これらの両方の配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるポリヌクレオチド配列などのアレルゲン性抗原または自己免疫自己抗原をコードし得る。
ポリ－Ａ領域
ポリヌクレオチドまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリＡ配列及び／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。ポリＡ配列は、全体的にまたは大部分が、アデニンヌクレオチドまたはその類似体もしくは誘導体から構成され得る。ポリＡ配列は、核酸の３’非翻訳領域に隣接して位置する尾部であり得る。
ＲＮＡプロセシングの間、アデノシンヌクレオチド（ポリ－Ａ領域）の長鎖は、通常、分子の安定性を高めるために、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に加えられる。転写の直後、転写物の３’末端が切断されて、３’－ヒドロキシを解放する。次に、ポリ－Ａポリメラーゼが、アデノシンヌクレオチドの鎖をＲＮＡに加える。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは、長さが１００～２５０残基であるポリ－Ａ領域を加える。
独自のポリ－Ａ領域の長さは、本開示の改変ポリヌクレオチドにいくつかの利点を与え得る。
一般に、本開示のポリ－Ａ領域の長さは、少なくとも３０ヌクレオチド長である。別の実施形態では、ポリ－Ａ領域は、少なくとも３５ヌクレオチド長である。別の実施形態では、長さは、少なくとも４０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４５ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも５５ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも７０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも９０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１２０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１４０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも３５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも６００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも７００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも８００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも９００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１２００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１４００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１６００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１７００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１８００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１９００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも３０００ヌクレオチドである。
いくつかの場合には、ポリ－Ａ領域は、本明細書に記載される改変ポリヌクレオチド分子において、８０ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１６０ヌクレオチド長であり得る。
他の場合には、ポリ－Ａ領域は、本明細書に記載される改変ポリヌクレオチド分子において、２０、４０、８０、１００、１２０、１４０または１６０ヌクレオチド長であり得る。
いくつかの場合には、ポリ－Ａ領域は、改変ポリヌクレオチド全体の長さに対して設計される。この設計は、改変ポリヌクレオチドのコード領域の長さ、改変ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡなど）の特定の特徴もしくは領域の長さに基づいて、または改変ポリヌクレオチドから発現される最終産物の長さに基づいて行われ得る。改変ポリヌクレオチドの任意の特徴（例えば、ポリ－Ａ領域を含むｍＲＮＡ部分以外）と比較して、ポリ－Ａ領域は、さらなる特徴より長さが１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％長くなり得る。ポリ－Ａ領域はまた、それが属する改変ポリヌクレオチドの一部として設計され得る。これに関して、ポリ－Ａ領域は、構築物の全長または構築物の全長からポリ－Ａ領域を引いたものの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％以上であり得る。
ある場合には、ポリ－Ａ結合タンパク質のためのポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の操作結合部位及び／または共役が、発現を促進するのに使用され得る。操作結合部位は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の局所微小環境のリガンドの結合部位として動作し得るセンサー配列であり得る。非限定例として、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリ－Ａ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）及びその類似体の結合親和性を改変するために、少なくとも１つの操作結合部位を含み得る。少なくとも１つの操作結合部位の組み込みは、ＰＡＢＰ及びその類似体の結合親和性を増加させ得る。
さらに、複数の異なるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリ－Ａ領域の３’末端における改変ヌクレオチドを用いて、３’末端を介してＰＡＢＰ（ポリ－Ａ結合タンパク質）に一緒に連結され得る。トランスフェクション実験は、関連する細胞株において行うことができ、タンパク質産生は、トランスフェクションから１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、及び７日後にＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。非限定例として、トランスフェクション実験は、少なくとも１つの操作結合部位の付加の結果としてのＰＡＢＰまたはその類似体の結合親和性に対する影響を評価するのに使用され得る。
ある場合には、ポリ－Ａ領域は、翻訳開始を調節するのに使用され得る。理論に制約されることは意図しないが、ポリ－Ａ領域は、ＰＡＢＰを動員し、これは、次に、翻訳開始複合体と相互作用することができるため、タンパク質合成に不可欠であり得る。
いくつかの場合には、ポリ－Ａ領域はまた、３’－５’－エキソヌクレアーゼ消化から保護するために、本開示において使用され得る。
いくつかの場合には、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリＡ－Ｇカルテット（Ｑｕａｒｔｅｔ）を含み得る。Ｇ－カルテットは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方においてＧリッチ配列によって形成され得る４つのグアノシンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。この実施形態では、Ｇ－カルテットは、ポリ－Ａ領域の末端に組み込まれている。得られたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、様々な時点で、安定性、タンパク質産生及び半減期を含む他のパラメーターについてアッセイされ得る。ポリＡ－Ｇカルテットが、１２０ヌクレオチドのポリ－Ａ領域のみを用いて見られるタンパク質産生の少なくとも７５％に相当するタンパク質産生をもたらすことが発見されている。
いくつかの場合には、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリ－Ａ領域を含んでもよく、３’－安定化領域の付加によって安定化され得る。ポリ－Ａ領域を含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’－キャップ構造をさらに含み得る。
他の場合には、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリ－Ａ－Ｇカルテットを含み得る。ポリ－Ａ－Ｇカルテットを含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’－キャップ構造をさらに含み得る。
いくつかの場合には、ポリ－Ａ領域またはポリ－Ａ－Ｇカルテットを含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を安定させるのに使用され得る３’－安定化領域は、限定はされないが、国際特許公開番号ＷＯ２０１３／１０３６５９（そのポリ－Ａ領域及びポリ－Ａ－Ｇカルテットは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものであり得る。他の場合には、本開示に使用され得る３’－安定化領域としては、３’－デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’－デオキシウリジン、３’－デオキシシトシン、３’－デオキシグアノシン、３’－デオキシチミン、２’，３’－ジデオキシヌクレオシド、例えば、２’，３’－ジデオキシアデノシン、２’，３’－ジデオキシウリジン、２’，３’－ジデオキシシトシン、２’，３’－ジデオキシグアノシン、２’，３’－ジデオキシチミン、２’－デオキシヌクレオシド、またはＯ－メチルヌクレオシドなどの鎖終止ヌクレオシドが挙げられる。
他の場合には、限定はされないが、ポリＡ領域またはポリ－Ａ－Ｇカルテットを含むｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、オリゴ（Ｕ）の付加を防止及び／または阻害することができるポリヌクレオチドの３’－領域に対する改変によって安定化され得る（例えば、国際特許公開番号ＷＯ２０１３／１０３６５９を参照されたい）。
さらに他の場合には、限定はされないが、ポリ－Ａ領域またはポリ－Ａ－Ｇカルテットを含むｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、３’－デオキシヌクレオシド、２’，３’－ジデオキシヌクレオシド３’－Ｏ－メチルヌクレオシド、３’－Ｏ－エチルヌクレオシド、３’－アラビノシド、及び当該技術分野において公知であるか、及び／または本明細書に記載される他の改変ヌクレオシドにおいて終端するオリゴヌクレオチドの付加によって安定化され得る。
鎖終止ヌクレオシド
核酸は、鎖終止ヌクレオシドを含み得る。いくつかの実施形態では、鎖終止ヌクレオシドは、それらの糖基の２’及び／または３’位において脱酸素化されたヌクレオシドを含み得る。このような種としては、３’－デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’－デオキシウリジン、３’－デオキシシトシン、３’－デオキシグアノシン、３’－デオキシチミン、及び２’，３’－ジデオキシヌクレオシド、例えば、２’，３’－ジデオキシアデノシン、２’，３’－ジデオキシウリジン、２’，３’－ジデオキシシトシン、２’，３’－ジデオキシグアノシン、及び２’，３’－ジデオキシチミンが挙げられる。
ゲノム編集技術
いくつかの実施形態では、核酸は、ゲノム編集技術に適している。
いくつかの実施形態では、ゲノム編集技術は、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。
いくつかの実施形態では、核酸は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、及びＤＮＡ修復テンプレートからなる群から選択されるゲノム編集技術に適した少なくとも１つの核酸である。
ワクチン
いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬は、身体の細胞機構を、目的とするほぼあらゆる癌タンパク質またはその断片を生成するように安全に誘導することができる、リボ核酸（ＲＮＡ）癌ワクチンＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、修飾ＲＮＡである。本開示のＲＮＡワクチンは、例えば、挿入突然変異の可能性のリスクを伴うことなく、癌細胞性免疫と体液性免疫の両方を含むバランスの取れた免疫応答を誘導するために使用することができる。
ＲＮＡワクチンは、癌の罹患率またはアンメットメディカルニーズの程度もしくはレベルに応じて、様々な環境で利用することができる。ＲＮＡワクチンは、様々なステージまたは転移の程度の癌を治療及び／または予防するために利用することができる。ＲＮＡワクチンは、癌ワクチンを含む代替の抗癌療法と比べて、抗体力価がより大きく、より早い応答をもたらす点で、優れた特性を有する。理論に束縛されることを望むものではないが、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡワクチンは、ＲＮＡワクチンが天然の細胞機構を利用することから、翻訳の際に適切なタンパク質コンフォメーションを生じるように良好に設計されると考えられる。エクスビボで製造され、望ましくない細胞性応答を惹起し得る従来型ワクチンとは異なり、ＲＮＡワクチンは、より自然な方法で、細胞系にもたらされる。
本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも１つの癌抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、がんに対する免疫応答を誘発することができる免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、癌ワクチンを提供する。他の実施形態は、がんに対する免疫応答を誘発することができる２つ以上の抗原またはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
本発明は、いくつかの態様では、癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ、及び免疫チェックポイントモジュレーターをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡのワクチンである。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントモジュレーターは、阻害性チェックポイントポリペプチドである。いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ及びＬＡＧ３からなる群から選択される分子に特異的に結合する抗体またはその断片である。阻害性チェックポイントポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ４または抗ＰＤｌ抗体である。いくつかの実施形態では、任意に、ワクチンは、脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡのワクチンが対象に投与される。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤が、３～１０週後に投与される。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、４週後に投与される。
他の態様では、本発明は、少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡの個別化された癌ワクチンであり、少なくとも２つの癌抗原は、患者特異的癌抗原、及び脂質ナノ粒子担体である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５０～２００ｎｍの平均直径を有する。
さらに他の態様では、本発明は、少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡの個別化された癌ワクチンであり、少なくとも２つの癌抗原は、患者の抗原を表すものである。いくつかの実施形態では、患者の抗原は、患者のエクソソーム同定抗原である。いくつかの実施形態では、単一のｍＲＮＡは、癌抗原をコードする。他の実施形態では、複数のｍＲＮＡは、癌抗原をコードする。
各ｍＲＮＡは、他の実施形態では、５～１０の癌抗原または単一の癌抗原をコードし得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、２～１００の癌抗原をコードする。他の実施形態では、ｍＲＮＡは、１０～１００、２０～１００、５０～１００、１００～２００、３００～４００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、９００～１，０００、または１，０００～１０，０００の癌抗原をコードする。
いくつかの実施形態では、
ａ）各癌抗原をコードするｍＲＮＡは切断感受性部位に点在している、
ｂ）各癌抗原をコードするｍＲＮＡが、リンカーなしで互いに直接連結されている、
ｃ）各癌抗原をコードするｍＲＮＡが、単一のヌクレオチドリンカーを用いて互いに連結されている、
ｄ）各癌抗原が２５～３５個のアミノ酸を含み、中央に位置するＳＮＰ変異を含む、
ｅ）癌抗原の少なくとも３０％が、対象由来のクラスＩ ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有する、
ｆ）癌抗原の少なくとも３０％が、対象由来のクラスＩＩ ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有する、
ｇ）癌抗原の少なくとも５０％が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／またはＤＲＢ１に対してＩＣが５００ｎＭ未満という推定結合親和性を有する、
ｈ）ｍＲＮＡは２０個の癌抗原をコードする、
ｉ）５０％の癌抗原がクラスＩ ＭＨＣに対する結合親和性を有し、５０％の癌抗原がクラスＩＩ ＭＨＣに対する結合親和性を有する、及び／または
ｊ）癌抗原をコードするｍＲＮＡが、癌抗原が疑似エピトープを最小にするように順序付けられるように配置される。
いくつかの実施形態では、各癌抗原は、３１個のアミノ酸を含み、ＳＮＰ変異の両側に１５個の隣接アミノ酸を有する中央に位置するＳＮＰ変異を含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、個別化された癌ワクチンであり、癌抗原は、対象特異的癌抗原である。いくつかの実施形態では、対象特異的癌抗原は、対象の腫瘍試料のエクソームまたは対象の腫瘍試料のトランスクリプトームを表し得る。いくつかの実施形態では、対象特異的癌抗原は、対象のエクソソームを表し得る。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、１つ以上の従来の癌抗原をさらにコードする。いくつかの実施形態では、従来の癌抗原は、非変異抗原である。いくつかの実施形態では、従来の癌抗原は、変異抗原である。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、１つ以上の従来の癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡをさらに含む。
いくつかの実施形態では、単一のｍＲＮＡが癌抗原をコードする。他の実施形態では、複数のｍＲＮＡが癌抗原をコードする。各癌抗原は、いくつかの実施形態では、１０～５０個のアミノ酸の長さである。他の実施形態では、各癌抗原は、１５～２０個のアミノ酸の長さである。他の実施形態では、癌抗原は、２０～５０、２５～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～１，０００、または１，０００～１０，０００個のアミノ酸の長さである。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、アジュバントをさらに含む。
本開示のいくつかの実施形態は、脂質ナノ粒子内に製剤化される、少なくとも１つの癌ポリペプチド、少なくとも１つの５’末端キャップ、及び少なくとも１つの化学修飾をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、癌ワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、５’末端キャップは、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、Ｎ１－エチルプソイドウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン及び２’－Ｏ－メチルウリジンから選択される。いくつかの実施形態では、化学的に修飾されたヌクレオチドの組み込みの程度は、ワクチン製剤に対する免疫応答の改善のために最適化されている。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール、及び非カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、イオン化可能なカチオン性脂質であり、非カチオン性脂質は、中性脂質であり、ステロールは、コレステロールである。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカン二酸（Ｌ３１９）から選択される。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、ワクチン（製剤）の免疫原性を増強するための免疫増強剤（例えば、ＴＬＲアゴニスト）を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレーム中のウラシルの１００％が化学修飾を有する。いくつかの実施形態では、化学修飾がウラシルの５位にある。いくつかの実施形態では、化学修飾は、Ｎ１－メチルプソイドウリジンである。
他の実施形態では、ＡＰＣ再プログラミング分子をコードするｍＲＮＡが、ワクチンに含まれるか、またはワクチンと同時投与される。ＡＰＣ再プログラミング分子は、ＣＩＩＴＡ、シャペロンタンパク質、例えば、ＣＬＩＰ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＭなど、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６などのような共刺激分子、ＣＩＩＴＡのアミノ酸２６～１３７などのようなＣＩＩＴＡ断片、またはＣＩＩＴＡに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質であり得る。
他の態様では、対象の試料から少なくとも２つの癌抗原（少なくとも２つの癌抗原が、フレームシフト変異及び組み換えからなる群から選択される変異を含む）を同定すること、及び少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンを対象に投与することによって、対象における免疫応答を誘発する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、癌抗原は、対象のエクソソームから同定される。いくつかの実施形態では、２～１００個の抗原がエクソソームから同定される。他の実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、２～１００個の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する。単一のｍＲＮＡまたは複数のｍＲＮＡが抗原をコードし得る。
いくつかの実施形態では、抗原は、癌抗原である。癌抗原は、点変異、フレームシフト変異及び組み換えから選択される変異を有し得る。方法は、エクソーム解析によって癌抗原が対象に特異的であることを確認することをさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、方法は、トランスクリプトーム解析によって癌抗原が対象に特異的であることを確認することをさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、方法は、ｍＲＮＡワクチンの投与の少なくとも１か月後に、対象の試料から少なくとも２つの癌抗原を同定して、第２セットの癌抗原を生成すること、及び対象に対する第２セットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンを対象に投与することも含む。
他の実施形態では、対象の試料は、腫瘍試料である。
他の態様では、本発明は、対象の試料から少なくとも２つの癌抗原を同定して、第１セットの癌抗原を生成すること、ｍＲＮＡワクチンの投与の少なくとも１か月後に、対象に対する第１セットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンを対象に投与すること、対象の試料から少なくとも２つの癌抗原を同定して、第２セットの癌抗原を生成すること、及び対象に対する第２セットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンを対象に投与することによって、対象における免疫応答を誘発する方法を含む。
第２セットの抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンは、いくつかの実施形態では、第１セットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの投与の６か月～１年後に対象に投与される。他の実施形態では、第２セットの抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンは、第１セットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの投与の１～２年後に対象に投与される。
いくつかの実施形態では、単一のｍＲＮＡが癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する。他の実施形態では、複数のｍＲＮＡが抗原をコードする。いくつかの実施形態では、第２セットの癌抗原は、２～１００個の抗原を含む。他の実施形態では、癌抗原は、点変異、フレームシフト変異及び組み換えから選択される変異を有し得る。
他の態様では、本発明は、対象の試料から少なくとも２つの癌抗原を同定すること、少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを対象に投与すること、及び癌治療薬を対象に投与することによって、対象における免疫応答を誘発する方法を含む。いくつかの実施形態では、癌治療薬は、標的療法である。標的療法は、ＢＲＡＦ阻害剤、例えば、ベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２）またはダブラフェニブであり得る。
他の実施形態では、癌治療薬は、Ｔ細胞治療薬である。Ｔ細胞治療薬は、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ－１抗体または抗ＣＴＬＡ－４抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＢＭＳ－９３６５５８（ニボルマブ）である。他の実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブである。Ｔ細胞治療薬は、他の実施形態では、ＯＸ４０Ｌである。さらに他の実施形態では、癌治療薬は、集団ベースの腫瘍特異的抗原を含むワクチンである。
他の実施形態では、癌治療薬は、１つ以上の従来の癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含むワクチンである。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡは、癌治療薬と同時に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡは、癌治療薬の投与前に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡは、癌治療薬の投与後に対象に投与される。
癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを脂質ナノ粒子製剤と混合して、ｍＲＮＡ癌ワクチンを生成すること、及び混合してから２４時間以内に、ｍＲＮＡ癌ワクチンを対象に投与することを含む方法が、本発明の他の態様では提供される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、混合してから１２時間以内に対象に投与される。他の実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、混合してから１時間以内に対象に投与される。ｍＲＮＡ癌ワクチンは、いくつかの実施形態では、２～１００個の癌抗原または１０～１００個の癌抗原をコードする。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、個別化された癌ワクチンであり、癌抗原は、対象特異的癌抗原である。
いくつかの実施形態では、単一のｍＲＮＡが癌抗原をコードする。他の実施形態では、複数のｍＲＮＡが癌抗原をコードする。各ｍＲＮＡは、他の実施形態では、５～１０個の癌抗原または単一の癌抗原をコードする。さらに他の実施形態では、各癌抗原は、１０～５０個のアミノ酸の長さまたは１５～２０個のアミノ酸の長さである。
本明細書でさらに提供されるのは、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量で癌ワクチンを対象に投与することを含む、対象における抗原特異的免疫応答を誘発する方法で使用される薬物の製造における癌ワクチンの使用である。
対象から単離されたエクソソームから少なくとも２つの癌抗原を同定すること、同定抗原に基づいて、抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンを作製すること、及びｍＲＮＡワクチンを対象に投与することによって、癌の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、ｍＲＮＡワクチンが、対象における腫瘍特異的免疫応答を誘発することによって、対象における癌を治療する、方法が、他の態様で提供される。本発明は、他の態様では、対象から単離されたエクソソームから少なくとも２つの癌抗原を同定すること、同定抗原に基づいて、抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンを作製することを含む方法に従って調製可能な、ＲＮＡワクチンである。
癌抗原に対する対象における免疫応答を誘発する方法が、本発明の態様では提供される。方法は、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＲＮＡワクチンを対象に投与することによって、抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を対象に誘発させることを含み、対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、癌に対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して、ワクチン接種後に増加する。「抗抗原性ポリペプチド抗体」は、抗原性ポリペプチドに特異的に結合する血清抗体である。
予防上有効な用量は、予防上有効な用量は、臨床的に許容されるレベルで癌の進行を防ぐ治療上有効な用量である。いくつかの実施形態では、治療上有効な用量は、ワクチンの添付文書に列挙される用量である。従来型ワクチンとは、本明細書で使用する場合、本発明のｍＲＮＡワクチン以外のワクチンを指す。例えば、従来型ワクチンには、生きた微生物のワクチン、死滅した微生物のワクチン、サブユニットワクチン、タンパク質抗原ワクチン、ＤＮＡワクチンなどが含まれるが、これらに限定されない。例示的な実施形態では、従来型ワクチンは、規制当局の承認を得ている、及び／または国立の薬物規制団体、例えば、米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）または欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって登録されているワクチンである。
いくつかの実施形態では、対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、癌に対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して、１ｌｏｇ～１０ｌｏｇ増加する。
いくつかの実施形態では、対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、癌に対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して、１ｌｏｇ増加する。
いくつかの実施形態では、対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、癌に対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して、２ｌｏｇ増加する。
いくつかの実施形態では、対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、癌に対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して、３ｌｏｇ増加する。
いくつかの実施形態では、対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、癌に対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して、５ｌｏｇ増加する。
いくつかの実施形態では、対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、癌に対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して、１０ｌｏｇ増加する。
癌抗原に対する対象における免疫応答を誘発する方法が、本発明の他の態様では提供される。方法は、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＲＮＡワクチンを対象に投与することを伴い、これにより、対象において、抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を誘導するものであり、対象における免疫応答は、癌抗原に対する従来型ワクチンをＲＮＡワクチンに対して２倍～１００倍の用量レベルで接種した対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、従来型ワクチンをＲＮＡワクチンに対して２倍の用量レベルで接種した対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、従来型ワクチンをＲＮＡワクチンに対して３倍の用量レベルで接種した対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、従来型ワクチンをＲＮＡワクチンに対して４倍の用量レベルで接種した対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、従来型ワクチンをＲＮＡワクチンに対して５倍の用量レベルで接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、従来型ワクチンをＲＮＡワクチンに対して１０倍の用量レベルで接種した対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、従来型ワクチンをＲＮＡワクチンに対して５０倍の用量レベルで接種した対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、従来型ワクチンをＲＮＡワクチンに対して１００倍の用量レベルで接種した対象における免疫応答と同等である。。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、癌抗原に対する従来型ワクチンをＲＮＡワクチンに対して１０倍～１０００倍の用量レベルで接種した対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、癌抗原に対する従来型ワクチンをＲＮＡワクチンに対して１００倍～１０００倍の用量レベルで接種した対象における免疫応答と同等である。
他の実施形態では、免疫応答は、対象における抗体力価を決定することによって評価される。
他の態様では、本発明は、少なくとも１つの癌抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＲＮＡワクチンを対象に投与することによって、対象において、ＲＮＡワクチンに対する免疫応答を誘発する方法であり、これにより、対象において、抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を誘導するものであり、対象における免疫応答は、癌抗原に対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象において誘発される免疫応答と比較して２日～１０週間早く誘導される。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＲＮＡワクチンに対して２倍～１００倍の用量である予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘導される。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、２日早く誘導される。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、３日早く誘導される。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、１週間早く誘導される。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、２週間早く誘導される。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、３週間早く誘導される。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、５週間早く誘導される。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、１０週間早く誘導される。
第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する癌ＲＮＡワクチンを対象に投与することによって、癌に対する対象の免疫応答を誘発する方法であって、ＲＮＡポリヌクレオチドは、安定化要素を含まず、アジュバントは、ワクチンと同時製剤化または同時投与されない。
さらに他の態様では、本発明は、１０００～３０００個のヌクレオチドを含むコンカテマー癌抗原をコードするｍＲＮＡの作製方法であって、
（ａ）コンカテマー癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを含む第１のポリヌクレオチド及び５’－ＵＴＲを含む第２のポリヌクレオチドの、固形担体に複合化したポリヌクレオチドへの結合、
（ｂ）第２のポリヌクレオチドの３’末端の、第１のポリヌクレオチドの５’末端への適切な条件下でのライゲーションであって、適切な条件はＤＮＡリガーゼを含み、それによって、第１のライゲーション産物が作製するライゲーション、
（ｃ）３’－ＵＴＲを含む第３のポリヌクレオチドの５’末端の、第１のライゲーション産物の３’末端への、適切な条件下でのライゲーションであって、適切な条件はＲＮＡリガーゼを含み、それによって、第２のライゲーション産物が作製するライゲーション、及び
（ｄ）固形担体からの第２のライゲーション産物の遊離させ、それによって、１０００～３０００ヌクレオチドを含むコンカテマー癌抗原をコードするｍＲＮＡを作製する
方法を含む。提供された組成物または方法のいずれの１つのいくつかの実施形態でも、ｍＲＮＡは、１つ以上の再発性多形をコードする。いくつかの実施形態では、１つ以上の再発性多形は、ｐ５３の再発性体細胞癌変異を含む。いくつかのかかる実施形態では、ｐ５３の１つ以上の再発性体細胞癌変異は、
（１）カノニカル５’スプライス部位隣接コドンｐ．Ｔ１２５での変異、
（２）カノニカル５’スプライス部位隣接コドンｐ．３３１での変異、
（３）カノニカル３’スプライス部位隣接コドンｐ．１２６での変異、
（４）カノニカル５’スプライス部位隣接コドンｐ．２２４での変異
からなる群から選択され、不可解な代替イントロン５’スプライス部位を誘発する。
いくつかの実施形態では、本発明は、ネオ抗原ペプチド（１）～（４）の１つまたは複数をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするｍＲＮＡを含む癌治療ワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、患者の腫瘍が上記の変異のいずれを含むかということに基づく、ペプチド（１）～（４）の１つまたは複数を含むか、またはコードするワクチンの選択投与を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、対象の腫瘍が上記の変異のいずれを含むか、及び対象の正常なＨＬＡ型が、得られるネオ抗原に結合すると予測される対応ＨＬＡ対立遺伝子を含むかという二重の判断基準に基づいて、ワクチンの選択投与を提供する。
対象から試料を単離すること、患者特異的なミュータノームを生成するための、試料に由来する患者のトランスクリプトーム及び／または患者のエクソームの解析によるネオエピトープのセットを同定すること、ＭＨＣとの結合強度、ＭＨＣとの結合多様性、免疫原性の予測度合い、自己反応性の低さ、及び／またはＴ細胞反応性に基づいて、ワクチン向けネオエピトープのセットのミュータノームから選択すること、ネオエピトープのセットをコードするｍＲＮＡワクチンを調製すること、及び対象からの試料の単離の２ヶ月以内にｍＲＮＡワクチンを対象に投与することによる、個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンによる対象の治療法が、本発明の他の態様で提供される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、対象からの試料の単離の１ヶ月以内に対象に投与される。
他の態様では、本発明は、ａ．患者のトランスクリプトーム及び患者のエクソームの解析による患者特異的なミュータノームの同定、ｂ．患者のＲＮＡシークエンシングにおける遺伝子もしくは転写物レベルの発現評価、バリアントコ－ル信頼スコア、ＲＮＡシークエンシングに基づく対立遺伝子特異的発現、保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換との比較、点変異の位置（ＴＣＲの関与増加についての中心スコア）、点変異の位置（ＨＬＡとの結合の差異についての固定スコア）、独自性：患者のＷＥＳデータとのコアエピトープ相同性（＜１００％）；８マー～１１マーについてはＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂに対するＩＣ５０、１５マー～２０マーについてはＨＬＡ－ＤＲＢ１に対するＩＣ５０、広範結合スコア（すなわち、結合すると予測される患者ＨＬＡの数）、８マー～１１マーについてはＨＬＡ－Ｃに対するＩＣ５０、１５マー～２０マーについてはＨＬＡ－ＤＲＢ３～５に対するＩＣ５０、１５マー～２０マーについてはＨＬＡ－ＤＱＢ１／Ａ１に対するＩＣ５０、１５マー～２０マーについてはＨＬＡ－ＤＰＢ１／Ａ１に対するＩＣ５０、クラスＩとクラスＩＩとの比率比較、患者においてカバーされるＨＬＡ－Ａアロタイプ、ＨＬＡ－Ｂアロタイプ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１アロタイプの多様性、点変異と複合エピトープ（例えば、フレームシフト）との比率比較、及び偽エピトープＨＬＡ結合スコアのうちの少なくとも３つに基づく、ネオエピトープに対する加重値を使用する、ミュータノームからの１５～５００のネオエピトープのサブセットの選択、ならびにｃ．最高加重値に基づく、サブセットからの、個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンにおける使用を目的とするネオエピトープのセットの選択であって、ネオエピトープのセットが１５～４０のネオエピトープを含む選択によって、ネオエピトープのセットをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを有する個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンにおける使用を目的とする、ネオエピトープのセットの同定方法を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸ワクチンは、化学的に修飾される。他の実施形態では、核酸ワクチンは、修飾されない。
さらに他の態様では、第１の抗原性ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する癌ＲＮＡワクチンを対象に投与することを含む、対象に接種する組成物及び方法を提供し、ＲＮＡポリヌクレオチドは、安定化要素を含まず、アジュバントは、ワクチンと同時製剤化または同時投与されない。
他の態様では、本発明は、対象にワクチン接種する組成物または方法を提供し、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与することを含み、核酸ワクチンの１０μｇ／ｋｇ～４００μｇ／ｋｇの投与量が、対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの投与量は、用量当たり１～５μｇ、５～１０μｇ、１０～１５μｇ、１５～２０μｇ、１０～２５μｇ、２０～２５μｇ、２０～５０μｇ、３０～５０μｇ、４０～５０μｇ、４０～６０μｇ、６０～８０μｇ、６０～１００μｇ、５０～１００μｇ、８０～１２０μｇ、４０～１２０μｇ、４０～１５０μｇ、５０～１５０μｇ、５０～２００μｇ、８０～２００μｇ、１００～２００μｇ、１２０～２５０μｇ、１５０～２５０μｇ、１８０～２８０μｇ、２００～３００μｇ、５０～３００μｇ、８０～３００μｇ、１００～３００μｇ、４０～３００μｇ、５０～３５０μｇ、１００～３５０μｇ、２００～３５０μｇ、３００～３５０μｇ、３２０～４００μｇ、４０～３８０μｇ、４０～１００μｇ、１００～４００μｇ、２００～４００μｇ、または３００～４００μｇである。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、皮内または筋肉内注射によって、対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、０日目に対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンの第２の用量は、２１日目に対象に投与される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの２５マイクログラムの投与量が、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの１００マイクログラムの投与量が、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの５０マイクログラムの投与量が、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの７５マイクログラムの投与量が、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの１５０マイクログラムの投与量が、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの４００マイクログラムの投与量が、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの２００マイクログラムの投与量が、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、遠位リンパ節と比較して、局所リンパ節において１００倍高いレベルで蓄積する。他の実施形態では、核酸ワクチンは、化学的に修飾され、他の実施形態では、核酸ワクチンは、化学的に修飾されない。
本発明の態様は、第１の抗原性ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む、核酸ワクチンを提供し、ＲＮＡポリヌクレオチドは、安定化要素、及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含まず、アジュバントは、ワクチンに含まれない。いくつかの実施形態では、安定化要素は、ヒストンステムループである。いくつかの実施形態では、安定化要素は、野生型配列に比べてＧＣ含有量が増加している核酸配列である。
本発明の態様は、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを提供し、ＲＮＡポリヌクレオチドは、宿主へのインビボ投与用の製剤中に存在し、ヒト対象に許容されるパーセンテージで第１の抗原に対する抗体保有基準を上回る抗体力価を付与する。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンによって産生される抗体の力価は、中和抗体の力価である。いくつかの実施形態では、中和抗体の力価は、タンパク質ワクチンよりも大きい。他の実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンによって産生される中和抗体の力価は、アジュバント添加タンパク質ワクチンよりも大きい。さらに他の実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンによって産生される中和抗体の力価は、１，０００～１０，０００、１，２００～１０，０００、１，４００～１０，０００、１，５００～１０，０００、１，０００～５，０００、１，０００～４，０００、１，８００～１０，０００、２０００～１０，０００、２，０００～５，０００、２，０００～３，０００、２，０００～４，０００、３，０００～５，０００、３，０００～４，０００または２，０００～２，５００である。中和力価は、典型的に、プラーク数の５０％減少を達成するのに必要な最大血清希釈として表される。
好ましい態様では、本発明のワクチン（例えば、ＬＮＰ封入化ｍＲＮＡワクチン）は、ワクチン接種された対象の血中または血清中の抗原特異的抗体の予防上及び／または治療上有効なレベル、濃度及び／または力価をもたらす。本明細書で定義されるように、抗体力価という用語は、対象、例えば、ヒト対象において産生される抗原特異的抗体の量を指す。例示的な実施形態では、抗体力価は、陽性結果をなおももたらす最大希釈（連続希釈）の逆数で表される。例示的な実施形態では、抗体力価は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって決定または測定される。例示的な実施形態では、抗体力価は、中和アッセイ、例えば、マイクロ中和アッセイによって決定または測定される。ある特定の態様では、抗体力価の測定値は、１：４０、１：１００などの比で表される。
本発明の例示的な実施形態では、有効なワクチンは、１：４０超、１：１００超、１：４００超、１：１０００超、１：２０００超、１：３０００超、１：４０００超、１：５００超、１：６０００超、１：７５００超、１：１００００超の抗体力価をもたらす。例示的な実施形態では、抗体力価は、ワクチン接種から１０日後、ワクチン接種から２０日後、ワクチン接種から３０日後、ワクチン接種から４０日後、またはワクチン接種から５０日後以降までに、もたらされるか、達成される。例示的な実施形態では、力価は、単回用量のワクチンを対象に投与した後にもたらされるか、達成される。他の実施形態では、力価は、複数回投与後、例えば、第１の用量及び第２の用量（例えば、ブースター用量）後にもたらされるか、達成される。
本発明の例示的な態様では、抗原特異的抗体は、μｇ／ｍｌ単位で測定されるか、ＩＵ／Ｌ（国際単位／リットル）またはｍＩＵ／ｍｌ（ミリ国際単位／ｍｌ）単位で測定される。本発明の例示的な実施形態では、有効なワクチンは、０．５μｇ／ｍｌ超、０．１μｇ／ｍｌ超、０．２μｇ／ｍｌ超、０．３５μｇ／ｍｌ超、０．５μｇ／ｍｌ超、１μｇ／ｍｌ超、２μｇ／ｍｌ超、５μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌ超をもたらす。本発明の例示的な実施形態では、有効なワクチンは、１０ｍＩＵ／ｍｌ超、２０ｍＩＵ／ｍｌ超、５０ｍＩＵ／ｍｌ超、１００ｍＩＵ／ｍｌ超、２００ｍＩＵ／ｍｌ超、５００ｍＩＵ／ｍｌ超または１０００ｍＩＵ／ｍｌ超をもたらす。例示的な実施形態では、この抗体のレベルまたは濃度は、ワクチン接種から１０日後、ワクチン接種から２０日後、ワクチン接種から３０日後、ワクチン接種から４０日後、またはワクチン接種から５０日後以上までに、もたらされるか、達成される。例示的な実施形態では、レベルまたは濃度は、単回用量のワクチンを対象に投与した後にもたらされるか、達成される。他の実施形態では、レベルまたは濃度は、複数回投与後、例えば、第１の用量及び第２の用量（例えば、ブースター用量）後にもたらされるか、達成される。例示的な実施形態では、抗体のレベルまたは濃度は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって決定または測定される。例示的な実施形態では、抗体のレベルまたは濃度は、中和アッセイ、例えば、マイクロ中和アッセイによって決定または測定される。また、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンが提供され、ＲＮＡポリヌクレオチドは、安定化要素を有するか、アジュバントとともに製剤化された第１の抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡワクチンによって誘発される抗体力価よりも長く持続する高い抗体力価を誘発する、宿主へのインビボ投与用の製剤中に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、単回投与後１週間以内に中和抗体を産生するように製剤化される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、カチオン性ペプチド及び免疫活性化核酸から選択される。いくつかの実施形態では、カチオン性ペプチドは、プロタミンである。
態様は、少なくとも１つの化学修飾を含むか、任意選択により化学修飾を含まないオープンリーディングフレームを有し、オープンリーディングフレームは、第１の抗原性ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードする、１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む、核酸ワクチンを提供し、ＲＮＡポリヌクレオチドは、宿主の抗原発現レベルが、安定化要素を有するか、アジュバントとともに製剤化された第１の抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡワクチンによってもたらされる抗原発現レベルを著しく超えるように、宿主へのインビボ投与用の製剤中に存在する。
他の態様は、少なくとも１つの化学修飾を含むか、任意選択により化学修飾を含まないオープンリーディングフレームを有し、オープンリーディングフレームは、第１の抗原性ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードする、１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む、核酸ワクチンを提供し、ワクチンは、非修飾型ｍＲＮＡワクチンが同等の抗体力価をもたらすのに必要なＲＮＡポリヌクレオチドよりも、少なくとも１／１０少ないＲＮＡポリヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、２５～１００マイクログラムの用量で存在する。
本発明の態様では、使用ワクチン単位も提供され、単位は、少なくとも１つの化学修飾を含むか、または化学修飾を任意選択で含まないオープンリーディングフレームを有し、オープンリーディングフレームが第１の抗原性ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードする１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを１０μｇ～４００μｇと、ヒト対象への送達を目的として製剤化された薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、カチオン性脂質ナノ粒子をさらに含む。
本発明の態様は、個体または個体集団において腫瘍に対する抗原記憶を形成、維持または修復する方法を提供し、方法は、前記個体または集団に抗原記憶ブースター核酸ワクチンを投与することを含み、当該核酸ワクチンは、（ａ）少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドであって、少なくとも１つの化学修飾を含むか、任意選択により化学修飾を含まず、かつ２つ以上のコドン最適化オープンリーディングフレームを含み、オープンリーディングフレームは、一連の参照抗原性ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドと、（ｂ）任意選択により薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、筋肉内投与、皮内投与及び皮下投与からなる群から選択される経路を介して個体に投与される。いくつかの実施形態では、投与ステップは、組成物の注射に適した装置と対象の筋肉組織とを触させることを含む。いくつかの実施形態では、投与ステップは、エレクトロポレーションと組み合わせて、組成物の注射に適した装置と対象の筋肉組織とを接触させることを含む。
本発明の態様は、対象にワクチン接種を行う方法を提供し、方法は、有効量で第１の抗原性ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンの２５μｇ／ｋｇ～４００μｇ／ｋｇの単回用量を対象に投与して、対象にワクチン接種を行うことを含む。
他の態様は、少なくとも１つの化学修飾を含むオープンリーディングフレームを有する、１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを提供し、オープンリーディングフレームは、第１の抗原性ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードし、当該ワクチンは、非修飾型ｍＲＮＡワクチンが同等の抗体力価をもたらすのに必要なＲＮＡポリヌクレオチドよりも少なくとも１／１０少ない、ＲＮＡポリヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、２５～１００マイクログラムの用量で存在する。
他の態様は、修飾ヌクレオチドを含まない（非修飾）オープンリーディングフレームを有し、オープンリーディングフレームは、第１の抗原性ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードする、ＬＮＰ製剤化ＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを提供し、当該ワクチンは、ＬＮＰで製剤化されていない非修飾型ｍＲＮＡワクチンが同等の抗体力価をもたらすのに必要なＲＮＡポリヌクレオチドよりも少なくとも１／１０少ないＲＮＡポリヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、２５～１００μｇの用量で存在する。
他の態様では、本発明は、抗原性ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを有効量で対象に投与して、対象にワクチン接種を行うことを含む、年齢が６０歳以上の高齢者対象を治療する方法を包含する。
他の態様では、本発明は、抗原性ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを有効量で対象に投与して、対象にワクチン接種を行うことを含む、年齢が１７歳以下の若年者対象を治療する方法を包含する。
他の態様では、本発明は、抗原性ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを有効量で対象に投与して、対象にワクチン接種を行うことを含む、成年対象を治療する方法を包含する。
いくつかの態様では、本発明は、抗原をコードする少なくとも２つの核酸配列を含むワクチンと組み合わせて、対象にワクチン接種する方法を含み、ワクチンの投与量は、併用治療用投与量であり、抗原をコードする各個々の核酸の投与量が、治療用未満投与量である。いくつかの実施形態では、併用投与量は、対象に投与された核酸ワクチン中の２５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、併用投与量は、対象に投与された核酸ワクチン中の１００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、併用投与量対象に投与された核酸ワクチン中の５０マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、併用投与量は、対象に投与された核酸ワクチン中の７５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、併用投与量は、対象に投与された核酸ワクチン中の１５０マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、併用投与量は、対象に投与された核酸ワクチン中の４００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、抗原をコードする各個々の核酸のサブ治療用未満投与量は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０マイクログラムである。他の実施形態では、核酸ワクチンは、化学的に修飾され、及び他の実施形態では、核酸ワクチンは、化学的に修飾されない。
他の成分
ＬＮＰは、前の部分に記載されるものに加えて、１つ以上の成分を含み得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ビタミン（例えば、ビタミンＡもしくはビタミンＥ）またはステロールなどの１つ以上の疎水性小分子を含み得る。
脂質ナノ粒子は、１つ以上の透過性促進剤分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤、または他の成分も含み得る。透過性促進剤分子は、例えば、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号に記載される分子であり得る。炭水化物は、単糖類（例えば、グルコース）及び多糖類（例えば、グリコーゲン及びその誘導体及び類似体）を含み得る。
ポリマーが、ＬＮＰに含まれてもよく、及び／またはＬＮＰを封入または部分的に封入するのに使用され得る。ポリマーは、生分解性及び／または生体適合性であり得る。ポリマーは、限定はされないが、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートから選択され得る。いくつかの実施形態では、ポリマーとしては、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ－ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－カプロラクトン－コ－グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－ＰＥＯ－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－ＰＰＯ－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ－Ｌ－グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリアルキレン、例えば、ポリエチレン及びポリプロピレン、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリアルキレンテレフタレート、例えば、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、例えば、ポリ（酢酸ビニル）、ポリハロゲン化ビニル、例えば、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、誘導体化セルロース、例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸のポリマー、例えば、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）並びにそれらのコポリマー及び混合物、ポリジオキサノン及びそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリオキサミン、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）、炭酸トリメチレン、ポリ（Ｎ－アクリロイルモルホリン）（ＰＡｃＭ）、ポリ（２－メチル－２－オキサゾリン）（ＰＭＯＸ）、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）、及びポリグリセロールが挙げられる。
表面改質剤としては、限定はされないが、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、ジメチルジオクタデシル－アンモニウムブロミドなどのカチオン性界面活性剤）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、及びポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、アセチルシステイン、オオヨモギ、ブロメライン、パパイン、クサギ属の木（ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ）、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシンβ４、ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、及びエルドステイン）、及びＤＮａｓｅｓ（例えば、ｒｈＤＮａｓｅ）が挙げられる。表面改質剤は、ナノ粒子内に、及び／またはＬＮＰの表面に（例えば、コーティング、吸着、共有結合、または他のプロセスによって）配置され得る。
ＬＮＰは、１つ以上の官能化脂質も含み得る。いくつかの実施形態では、脂質は、適切な反応条件下でアジドに曝露されると、環状付加反応を起こし得るアルキン基で官能化され得る。特に、脂質二重層は、膜透過、細胞認識、またはイメージングを促進するのに有用な１つ以上の基で、このように官能化され得る。ＬＮＰの表面はまた、１つ以上の有用な抗体と結合され得る。標的細胞送達、イメージング、及び膜透過に有用な官能基及びコンジュゲートは、当該技術分野において周知である。
これらの成分に加えて、脂質ナノ粒子は、医薬組成物に有用な任意の物質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤または補助成分、例えば、限定はされないが、１つ以上の溶媒、分散媒、希釈剤、分散助剤、懸濁助剤、造粒助剤、崩壊剤、充填剤、滑剤、液体ビヒクル、結合剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、緩衝剤、滑沢剤、油、防腐剤、及び他の種を含み得る。ワックス、バター、着色剤、コーティング剤、香味料、及び芳香剤などの賦形剤も含まれ得る。薬学的に許容される賦形剤は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照されたい）。
希釈剤の例としては、限定はされないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、粉砂糖、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられる。造粒剤及び分散剤は、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、シトラスパルプ、寒天、ベントナイト、セルロース及び木製品、天然海綿、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル－ピロリドン）（クロスポビドン）、ナトリウムカルボキシメチルデンプン（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファデンプン（スターチ１５００）、微結晶性デンプン、水不溶性デンプン、カルシウムカルボキシメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ビーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物、及び／またはそれらの組み合わせからなる非限定的な一覧から選択され得る。
表面活性剤及び／または乳化剤としては、限定はされないが、天然の乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、及びレシチン）、コロイド性粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］及びビーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標）［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、トリアセチンモノステアレート、エチレングリコールジステアレート、モノステアリン酸グリセリル、及びプロピレングリコールモノステアレート、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、及びカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［トゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［トゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［トゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）４０］、ソルビタンモノステアレート［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）６０］、ソルビタントリステアレート［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）６５］、モノオレイン酸グリセリル、ソルビタンモノオレエート［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、ポリオキシエチレンモノステアレート［ミルジ（ＭＹＲＪ）（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート、及びソルトール（ＳＯＬＵＴＯＬ）（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、クレモフォール（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ）（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル、（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ブリジ（ＢＲＩＪ）（登録商標）３０］）、ポリ（ビニル－ピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、プルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）（登録商標）Ｆ ６８、ポロキサマー（ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ）（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドキュセートナトリウム、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられる。
結合剤は、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン及びデンプンペースト）；ゼラチン；糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；天然及び合成ゴム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンワルガム、ガティガム、イサポール皮の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル－ピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ビーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標））、及びカラマツアラビノガラクタン）；アルギン酸塩；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート；ワックス；水；アルコール；及びそれらの組み合わせ、または任意の他の適切な結合剤であり得る。
防腐剤の例としては、限定はされないが、酸化防止剤、キレート剤、抗菌防腐剤、抗真菌防腐剤、アルコール防腐剤、酸性防腐剤、及び／または他の防腐剤が挙げられる。酸化防止剤の例としては、限定はされないが、αトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、及び／または亜硫酸ナトリウムが挙げられる。キレート剤の例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、及び／またはエデト酸三ナトリウムが挙げられる。抗菌防腐剤の例としては、限定はされないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、及び／またはチメロサールが挙げられる。抗真菌防腐剤の例としては、限定はされないが、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、及び／またはソルビン酸が挙げられる。アルコール防腐剤の例としては、限定はされないが、エタノール、ポリエチレングリコール、ベンジルアルコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸塩、及び／またはフェニルエチルアルコールが挙げられる。酸性防腐剤の例としては、限定はされないが、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、β－カロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロアスコルビン酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、及び／またはフィチン酸が挙げられる。他の防腐剤としては、限定はされないが、トコフェロール、酢酸トコフェロール、デテロキシムメシレート、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、グリダント・プラス（登録商標）、フェノニップ（ＰＨＥＮＯＮＩＰ）（登録商標）、メチルパラベン、ジャーマル（ＧＥＲＭＡＬＬ）（登録商標）１１５、ジャーマベン（ＧＥＲＭＡＢＥＮ）（登録商標）ＩＩ、ネオロン（ＮＥＯＬＯＮＥ）（商標）、カトン（ＫＡＴＨＯＮ）（商標）、及び／またはユーキシル（ＥＵＸＹＬ）（登録商標）が挙げられる。
緩衝剤の例としては、限定はされないが、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、ｄ－グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、リン酸水酸化カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、アミノ－スルホン酸緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱性物質除去蒸留水、等張食生理食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられる。滑沢剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせからなる非限定的な群から選択され得る。
油の例としては、限定はされないが、アーモンド、杏仁、アボカド、ババス、ベルガモット、クロスグリの種子、ルリヂサ、ケード、カモミール、キャノーラ、キャラウェイ、カルナウバ、ヒマシ、シナモン、カカオ脂、ココナッツ、タラの肝臓、コーヒー、トウモロコシ、綿実、エミュー、ユーカリ、月見草、魚、亜麻仁、ゲラニオール、ヒョウタン、ブドウの種子、ハシバミの実、ヒソップ、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ、ククイの実、ラバンジン、ラベンダー、レモン、リツェアクベバ、マカデミアナッツ、マロー、マンゴーの種子、メドウフォームの種子、ミンク、ナツメグ、オリーブ、オレンジ、オレンジラフィー、パーム、パーム核、桃仁、ピーナッツ、ケシの実、カボチャの種子、ナタネ、米ぬか、ローズマリー、ベニバナ、サンダルウッド、サスクアナ（ｓａｓｑｕａｎａ）、セイボリー、サジー、ゴマ、シアバター、シリコーン、ダイズ、ヒマワリ、ティーツリー、アザミ、ツバキ、ベチバー、クルミ、及び小麦胚芽油並びにステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、シメチコン、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられる。
医薬組成物
脂質ナノ粒子を含む製剤は、医薬組成物として全体的にまたは部分的に製剤化され得る。医薬組成物は、１つ以上の脂質ナノ粒子を含み得る。例えば、医薬組成物は、１つ以上の異なる治療薬及び／または予防薬を含む１つ以上の脂質ナノ粒子を含み得る。医薬組成物は、本明細書に記載されるものなどの１つ以上の薬学的に許容される賦形剤または補助成分をさらに含み得る。医薬組成物及び薬剤の製剤化及び製造についての一般的な指針は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６において入手可能である。任意の従来の賦形剤または補助成分が、本開示の製剤中のＬＮＰの１つ以上の成分と不適合である場合を除いて、従来の賦形剤及び補助成分が、任意の医薬組成物において使用され得る。賦形剤または補助成分は、成分またはＬＮＰとのその組み合わせが、何らかの望ましくない生物学的作用、または他の形の有害な作用をもたらし得る場合、製剤のＬＮＰの成分と不適合であり得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上の賦形剤または補助成分は、ＬＮＰを含む医薬組成物の総質量または体積の５０％超を構成し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の賦形剤または補助成分は、医薬品の慣例の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上を構成し得る。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋である。いくつかの実施形態では、賦形剤は、ヒトへの使用及び獣医学用途のために承認されている。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認されている。いくつかの実施形態では、賦形剤は、医薬品グレードである。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、及び／または国際薬局方の基準を満たしている。
本開示に係る医薬組成物中の１つ以上の脂質ナノ粒子、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意のさらなる成分の相対量は、治療対象の属性、サイズ、及び／または状態に応じて、さらには、組成物が投与される経路に応じて変化する。例として、医薬組成物は、０．１％～１００％（ｗｔ／ｗｔ）の１つ以上の脂質ナノ粒子を含み得る。別の例として、医薬組成物は、０．１％～１５％（重量／体積）の１つ以上の両親媒性ポリマー（例えば、０．５％、１％、２．５％、５％、１０％、または１２．５％重量／体積）を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子及び／または医薬組成物は、貯蔵及び／または輸送のために冷蔵または冷凍される（例えば、約－１５０℃～約０℃または約－８０℃～約－２０℃の温度（例えば、約－５℃、－１０℃、－１５℃、－２０℃、－２５℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃、－９０℃、－１３０℃または－１５０℃）などの４℃以下の温度で貯蔵される。例えば、１つ以上の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物は、例えば、約－２０℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、または－８０℃で、貯蔵及び／または輸送のために冷蔵される溶液または固体（例えば、凍結乾燥を介して）である。ある特定の実施形態では、本開示はまた、脂質ナノ粒子及び／または医薬組成物を、４℃以下の温度、例えば、約－１５０℃～約０℃または約－８０℃～約－２０℃の温度、例えば、約－５℃、－１０℃、－１５℃、－２０℃、－２５℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃、－９０℃、－１３０℃または－１５０℃）で貯蔵することによって、脂質ナノ粒子及び／または医薬組成物の安定性を高める方法にも関する。
脂質ナノ粒子及び／または１つ以上の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物は、１つ以上の特定の細胞、組織、器官、またはそれらの系もしくは群（腎臓系など）への治療薬及び／または予防薬の送達によって提供される治療効果から利益を受け得る患者または対象を含む任意の患者または対象に投与され得る。脂質ナノ粒子及び脂質ナノ粒子を含む医薬組成物の本明細書において提供される説明は、主に、ヒトへの投与に適切な組成物に関するが、このような組成物は、一般に、任意の他の哺乳動物への投与に好適であることが当業者によって理解されよう。組成物を様々な動物への投与に好適にするための、ヒトへの投与に適切な組成物の修飾は、十分に理解されており、通常の獣医学薬理学者は、もしあれば単なる通常の実験を用いて、このような修飾を設計及び／または実施することができる。組成物の投与が想定される対象としては、限定はされないが、ヒト、他の霊長類、及びウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、及び／またはラットなどの商業的に価値のある哺乳動物を含む他の哺乳動物が挙げられる。
１つ以上の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物は、薬理学分野において公知であるかまたは今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、このような調製方法は、活性成分を、賦形剤及び／または１つ以上の他の補助成分と結合させるステップと、次に、望ましい場合または任意選択により、生成物を、所望の単回または複数回投与単位に、分割、成形及び／またはパッケージングするステップとを含む。
本開示に係る医薬組成物は、単一単位用量、及び／または複数の単一単位用量として、調製、パッケージ、及び／または大量販売され得る。本明細書で使用する場合、「単位用量」は、所定の量の活性成分（例えば、脂質ナノ粒子）を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は、一般に、対象に投与され得る活性成分の投与量、及び／またはこのような投与量の好都合な割合、例えば、このような投与量の２分の１もしくは３分の１に等しい。
医薬組成物は、様々な投与経路及び方法に適切な様々な形態で調製され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、液体剤形（例えば、乳剤、マイクロエマルション、ナノ乳剤、溶液、懸濁液、シロップ、及びエリキシル剤）、注射用形態、固体剤形（例えば、カプセル、錠剤、丸剤、粉剤、及び顆粒剤）、局所及び／または経皮投与のための剤形（例えば、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉剤、溶液、スプレー、吸入剤、及びパッチ剤）、懸濁液、粉剤、及び他の形態で調製され得る。
経口及び非経口投与のための液体剤形としては、限定はされないが、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルション、ナノ乳剤、溶液、懸濁液、シロップ、及び／またはエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加えて、液体剤形は、当該技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、及びそれらの混合物を含み得る。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、さらなる治療薬及び／または予防薬、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味料、香味料、及び／または芳香剤などのさらなる薬剤を含み得る。非経口投与のための特定の実施形態では、組成物は、クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、及び／またはそれらの組み合わせなどの可溶化剤と混合される。
注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液が、適切な分散剤、湿潤剤、及び／または懸濁化剤を用いて、公知の技術に従って製剤化され得る。滅菌注射用製剤は、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液のような、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤及び／または溶媒中の滅菌注射用溶液、懸濁液、及び／または乳剤であり得る。用いられ得る許容可能なビヒクル及び溶媒の中でも、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。滅菌固定油は、通常、溶媒または懸濁媒体として用いられる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性固定油が用いられ得る。オレイン酸などの脂肪酸が、注射薬の調製に使用され得る。
注射用製剤は、例えば、細菌捕捉フィルタを介した濾過によって、及び／または使用前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体に溶解または分散され得る滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって滅菌され得る。
活性成分の効果を長く持続させるために、多くの場合、皮下または筋肉内注射から活性成分の吸収を遅らせるのが望ましい。これは、難水溶性の結晶性または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成することができる。その際、薬剤の吸収速度は、その溶解速度に左右されるが、この溶解速度は、今度は、結晶サイズ及び結晶形態に左右され得る。あるいは、非経口投与された薬剤形態の吸収の遅延は、薬剤を油媒体に溶解または懸濁させることによって達成される。注入可能なデポー形態は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中で薬剤のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。薬剤対ポリマーの比率及び用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬剤放出の速度が制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。デポー注入可能製剤は、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション中に薬剤を閉じ込めることによって調製される。
直腸または膣投与のための組成物は、典型的に、坐薬であり、これは、周囲温度では固体であるが、体温では液体であるため、直腸または膣腔において溶解し、活性成分を放出する、カカオ脂、ポリエチレングリコールまたは坐薬ワックスなどの適切な無刺激の賦形剤と組成物を混合することによって調製され得る。
経口投与用の固体剤形としては、カプセル、錠剤、丸剤、フィルム、粉剤、及び顆粒剤が挙げられる。このような固体剤形では、活性成分は、少なくとも１つの不活性な薬学的に許容される賦形剤、例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム及び／または充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及びケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、及びアカシア）、保湿剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、第四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール）、吸収剤（例えば、カオリン及びベントナイト粘土、ケイ酸塩）、及び潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、及びそれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤及び丸剤の場合、剤形は、緩衝剤を含み得る。
類似のタイプの固体組成物が、ラクトースまたは乳糖並びに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いて、軟質及び硬質の充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いられ得る。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤、及び顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティング及び医薬製剤分野で周知の他のコーティングなどのコーティング及びシェルを用いて調製され得る。それらは、任意選択により、乳白剤を含んでもよく、活性成分（複数可）のみを、または、任意選択により遅延して、腸管の特定の部分において優先的に放出する組成物のものであり得る。使用され得る包埋組成物の例としては、ポリマー物質及びワックスが挙げられる。類似のタイプの固体組成物が、ラクトースまたは乳糖並びに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いて、軟質及び硬質の充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いられ得る。
組成物の局所及び／または経皮投与のための剤形としては、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉剤、溶液、スプレー、吸入剤、及び／またはパッチ剤が挙げられる。一般に、活性成分は、任意選択により、滅菌条件下で、薬学的に許容される賦形剤及び／または任意の必要な防腐剤及び／または緩衝剤と混合される。さらに、本開示は、経皮パッチ剤の使用を想定し、経皮パッチ剤は、多くの場合、身体への化合物の制御送達をもたらすという追加の利点を有する。このような剤形は、例えば、化合物を適切な媒体に溶解及び／または分散させることによって調製され得る。その代わりにまたはそれに加えて、速度制御膜を提供するか、及び／または化合物をポリマーマトリックス及び／またはゲルに分散させるかのいずれかによって、速度が制御され得る。
本明細書に記載される皮内医薬組成物を送達するのに使用するための適切な装置としては、米国特許第４，８８６，４９９号；同第５，１９０，５２１号；同第５，３２８，４８３号、同第５，５２７，２８８号、同第４，２７０，５３７号；同第５，０１５，２３５号、同第５，１４１，４９６号、及び同第５，４１７，６６２号に記載されるものなどの短針装置が挙げられる。皮内組成物は、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／３４８５０に記載されるものなどの、皮膚への針の有効貫入長さを制限する装置及びその機能的同等物によって投与され得る。液体ジェット式注射器及び／または角質層を貫通し、真皮に到達する噴流を生成する針を介して液体組成物を真皮に送達するジェット式注射装置が好適である。ジェット式注射装置は、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号、同第５，５９９，３０２号、同第５，３３４，１４４号、同第５，９９３，４１２号、同第５，６４９，９１２号、同第５，５６９，１８９号、同第５，７０４，９１１号、同第５，３８３，８５１号、同第５，８９３，３９７号、同第５，４６６，２２０号、同第５，３３９，１６３号、同第５，３１２，３３５号、同第５，５０３，６２７号、同第５，０６４，４１３号、同第５，５２０，６３９号、同第４，５９６，５５６号、同第４，７９０，８２４号、同第４，９４１，８８０号、同第４，９４０，４６０号；及びＰＣＴ公開ＷＯ９７／３７７０５及びＷＯ９７／１３５３７に記載されている。圧縮ガスを用いて、粉末状のワクチンを皮膚の外層から真皮へと加速させる弾道粉末／粒子送達装置が好適である。その代わりにまたはそれに加えて、従来の注射器が、皮内投与の古典的なマントー法に使用され得る。
局所投与に適切な製剤としては、限定はされないが、塗布剤、ローション、クリーム、軟膏及び／またはペーストなどの水中油型及び／または油中水型エマルション、及び／または溶液及び／または懸濁液などの液体及び／または半液体製剤が挙げられる。局所投与可能な製剤は、例えば、約１％～約１０％（ｗｔ／ｗｔ）の活性成分を含み得るが、活性成分の濃度は、溶媒への活性成分の溶解限度と同程度に高くてもよい。局所投与用の製剤は、本明細書に記載されるさらなる成分の１つ以上をさらに含み得る。
医薬組成物は、口腔を介した経肺投与に適切な製剤として調製、パッケージ、及び／または販売され得る。このような製剤は、活性成分を含む乾燥粒子を含み得る。このような組成物は、好都合には、推進剤の流れを誘導して、粉末を分散させ得る乾燥粉末リザーバを含む装置を用いた、及び／または密閉容器内で低沸点推進剤に溶解及び／または懸濁された活性成分を含む装置などの自己推進溶媒／粉末分配容器を用いた投与のための乾燥粉末の形態である。乾燥粉末組成物は、糖などの固体微粉希釈剤を含んでもよく、好都合には、単位剤形で提供される。
低沸点推進剤は、一般に、大気圧で６５°Ｆ以下の沸点を有する液体推進剤を含む。一般に、推進剤は、組成物の５０％～９９．９％（ｗｔ／ｗｔ）を構成してもよく、活性成分は、組成物の０．１％～２０％（ｗｔ／ｗｔ）を構成してもよい。推進剤は、液体の非イオン性及び／または固体のアニオン性界面活性剤及び／または固体の希釈剤（活性成分を含む粒子と同程度の粒径を有し得る）などのさらなる成分をさらに含み得る。
肺送達のために製剤化される医薬組成物は、溶液及び／または懸濁液の液滴の形態で活性成分を提供し得る。このような製剤は、活性成分を含む、任意選択により滅菌した水性及び／または希アルコール性溶液及び／または懸濁液として調製、パッケージ、及び／または販売され得、好都合には、任意の噴霧及び／または霧化装置を用いて投与され得る。このような製剤は、限定はされないが、サッカリンナトリウムなどの香味料、揮発性油、緩衝剤、表面活性剤、及び／またはメチルヒドロキシ安息香酸塩などの防腐剤を含む１つ以上のさらなる成分をさらに含み得る。この投与経路によって提供される液滴は、約１ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。
肺送達に有用であることが本明細書に記載される製剤は、医薬組成物の鼻内送達に有用である。鼻内投与に適切な別の製剤は、活性成分を含み、かつ約０．２μｍ～５００μｍの平均粒子を有する粗粉末である。このような製剤は、鼻から吸い込む方法で、すなわち、鼻の近くに保持した粉末の容器から鼻腔を介した高速吸入によって投与される。
経鼻投与に適切な製剤は、例えば、わずか約０．１％（重量／重量）程度から１００％（重量／重量）もの活性成分を含んでもよく、本明細書に記載されるさらなる成分の１つ以上を含み得る。医薬組成物は、口腔投与に適切な製剤として調製、パッケージ、及び／または販売され得る。このような製剤は、例えば、従来の方法を用いて作製される錠剤及び／またはトローチ剤の形態であってもよく、例えば、０．１％～２０％（重量／重量）の活性成分を含んでもよく、残りが、経口溶解性及び／または分解性組成物並びに、任意選択により、本明細書に記載されるさらなる成分の１つ以上を含む。あるいは、口腔投与に適切な製剤は、活性成分を含む、粉末及び／またはエアロゾル化及び／または霧化溶液及び／または懸濁液を含み得る。このような粉末化、エアロゾル化、及び／またはエアロゾル化製剤は、分散されると、約０．１ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均粒径及び／または液滴径を有してもよく、本明細書に記載される任意のさらなる成分の１つ以上をさらに含み得る。
医薬組成物は、眼投与に適切な製剤として調製、パッケージ、及び／または販売され得る。このような製剤は、例えば、水性または油性液体賦形剤中の活性成分の０．１／１．０％（ｗｔ／ｗｔ）の溶液及び／または懸濁液を含む、例えば、点眼薬の形態であり得る。このような点眼薬は、緩衝剤、塩、及び／または本明細書に記載される任意のさらなる他の成分の１つ以上をさらに含み得る。有用である他の眼投与可能な製剤としては、微結晶形態及び／またはリポソーム製剤として活性成分を含むものが挙げられる。点耳薬及び／または点眼薬は、本開示の範囲内であると考えられる。
細胞内でポリペプチドを生成する方法
本開示は、哺乳動物細胞内で目的のポリペプチドを生成する方法を提供する。ポリペプチドを生成する方法は、細胞を、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰを含む本開示の製剤と接触させることを含む。細胞を脂質ナノ粒子と接触させると、ｍＲＮＡは、細胞に取り込まれ、細胞内で翻訳されて、目的のポリペプチドを生成し得る。
一般に、哺乳動物細胞を、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰと接触させるステップは、インビボ、エクスビボ、培養下、またはインビトロで行われ得る。細胞と接触させる脂質ナノ粒子の量、及び／またはその中のｍＲＮＡの量は、接触させる細胞または組織のタイプ、投与手段、脂質ナノ粒子及びその中のｍＲＮＡの物理化学的特性（例えば、サイズ、電荷、及び化学組成）、及び他の要因に左右され得る。一般に、有効量の脂質ナノ粒子は、細胞内の効率的なポリペプチド生成を可能にする。効率の測定基準としては、ポリペプチド翻訳（ポリペプチド発現によって示される）、ｍＲＮＡ分解のレベル、及び免疫応答指標が挙げられる。
ｍＲＮＡを含むＬＮＰを、細胞と接触させるステップは、トランスフェクションを含むかまたは引き起こし得る。ＬＮＰの脂質成分を含むリン脂質は、例えば、細胞膜または細胞内膜と相互作用し、及び／またはそれと融合することによって、トランスフェクションを促進し、及び／またはトランスフェクション効率を高め得る。トランスフェクションは、細胞内のｍＲＮＡの翻訳を可能にし得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子は、治療的に使用され得る。例えば、ＬＮＰに含まれるｍＲＮＡは、（例えば、翻訳可能領域において）治療用ポリペプチドをコードし、細胞内に接触及び／または侵入（例えば、トランスフェクション）すると治療用ポリペプチドを作製し得る。他の実施形態では、ＬＮＰに含まれるｍＲＮＡは、対象の免疫を改善し、または高め得るポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、顆粒球コロニー刺激因子またはトラスツズマブをコードし得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰに含まれるｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子と接触させた細胞に実質的に存在しない１つ以上のポリペプチドを置換し得る組み換えポリペプチドをコードし得る。１つ以上の実質的に存在しないポリペプチドは、コード遺伝子またはその調節経路の変異のため欠落していることがある。あるいは、ｍＲＮＡの翻訳によって作製された組み換えポリペプチドは、細胞内、細胞の表面に存在するか、または細胞から分泌される内因性タンパク質の活性に拮抗し得る。拮抗的組み換えポリペプチドは、変異によって引き起こされる改変活性または局在化などの、内因性タンパク質の活性によって引き起こされる有害作用に対抗するのが望ましいことがある。別の改変では、ｍＲＮＡの翻訳によって作製される組み換えポリペプチドは、細胞内、細胞の表面に存在するか、または細胞から分泌される生物学的部分の活性に間接的にまたは直接拮抗し得る。拮抗される生物学的部分としては、限定はされないが、脂質（例えば、コレステロール）、リポタンパク質（例えば、低比重リポタンパク）、核酸、炭水化物、及び小分子毒素が挙げられる。ｍＲＮＡの翻訳によって作製される組み換えポリペプチドは、細胞内、例えば、核などの特定の区画内の局在化のために操作され得、または細胞からの分泌または細胞の細胞膜への転位のために操作され得る。
いくつかの実施形態では、細胞を、ｍＲＮＡを含むＬＮＰと接触させることは、外因性核酸に対する細胞の自然免疫応答を低減し得る。細胞は、翻訳可能領域を含む第１の量の第１の外因性ｍＲＮＡを含む第１の脂質ナノ粒子と接触され得、第１の外因性ｍＲＮＡに対する細胞の自然免疫応答のレベルが決定され得る。続いて、細胞は、第２の量の第１の外因性ｍＲＮＡを含む第２の組成物と接触され得、ここで、第２の量は、第１の量と比較して第１の外因性ｍＲＮＡのより少ない量である。あるいは、第２の組成物は、第１の外因性ｍＲＮＡと異なる第１の量の第２の外因性ｍＲＮＡを含み得る。細胞を、第１及び第２の組成物と接触させるステップは、１回以上繰り返され得る。さらに、細胞内のポリペプチド生成（例えば、翻訳）の効率は、任意選択により決定され得、細胞は、標的タンパク質生成効率が達成されるまで、第１及び／または第２の組成物と繰り返し再接触され得る。
治療薬を細胞及び器官に送達する方法
本開示は、核酸などの治療薬及び／または予防薬を、哺乳動物細胞もしくは臓器に送達する方法を提供する。細胞への治療薬及び／または予防薬の送達は、核酸などの治療薬及び／または予防薬を含むＬＮＰを含む本開示の製剤を、対象に投与することを含み、ここで、組成物の投与は、細胞を組成物と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質、細胞毒性剤、放射性イオン、化学療法剤、または核酸（ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡなど）は、細胞もしくは臓器に送達され得る。治療薬及び／または予防薬がｍＲＮＡである場合、細胞を脂質ナノ粒子と接触させると、翻訳可能なｍＲＮＡは、細胞内で翻訳されて、目的のポリペプチドを生成し得る。しかしながら、実質的に翻訳不可能なｍＲＮＡも、細胞に送達され得る。実質的に翻訳不可能なｍＲＮＡは、ワクチンとして有用であり得、及び／または細胞内での他の種の発現を低減するように、細胞の翻訳成分を隔離し得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、細胞（例えば、特定の器官またはその系の細胞）の特定のタイプまたはクラスを標的にし得る。いくつかの実施形態では、目的の治療薬及び／または予防薬を含むＬＮＰは、哺乳動物の肝臓、腎臓、脾臓、大腿骨、または肺に特異的に送達され得る。特定のクラスの細胞、器官、またはその系もしくは群への特異的送達は、例えば、哺乳動物へのＬＮＰの投与後に、他の目的地と比較して、より高い割合の、治療薬及び／または予防薬を含む脂質ナノ粒子が、目的の送達先（例えば、組織）に送達されることを意味する。いくつかの実施形態では、特異的送達は、別の目的地（例えば、脾臓）と比較して、標的化された目的地（例えば、肝臓などの目的の組織）の組織１ｇ当たり治療薬及び／または予防薬の量の２倍、５倍、１０倍、１５倍、または２０倍超の増加をもたらし得る。いくつかの実施形態では、目的の組織は、肝臓、腎臓、肺、脾臓、大腿骨、血管の血管内皮（例えば、冠動脈内または大腿骨内）または腎臓、及び腫瘍組織（例えば、腫瘍内投与によって）からなる群から選択される。
標的化または特異的送達の別の例として、タンパク質－結合パートナー（例えば、抗体またはその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチド）または細胞表面上の受容体をコードするｍＲＮＡが、ＬＮＰに含まれ得る。ｍＲＮＡは、脂質、炭水化物、または他の生物学的部分の合成及び細胞外局在化を指令するために、さらにまたは代わりに使用され得る。あるいは、ＬＮＰの他の治療薬及び／または予防薬または要素（例えば、脂質またはリガンド）は、ＬＮＰが、受容体を含む標的細胞集団とより容易に相互作用し得るように、特定の受容体（例えば、低比重リポタンパク質受容体）に対するそれらの親和性に基づいて選択され得る。いくつかの実施形態では、リガンドとしては、限定はされないが、特異的結合対のメンバー、抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖抗体、ラクダ化抗体及びその断片、ヒト化抗体及びその断片、及びその多価形態；単一特異性たは二重特異性抗体を含む多価結合試薬、例えば、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片、ｓｃＦｖタンデム、二重特異性抗体、三重特異性抗体、または四重特異性抗体；及びアプタマー、受容体、及び融合タンパク質が挙げられる。
いくつかの実施形態では、リガンドは、細胞標的特異性の調整を可能にし得る表面結合抗体であり得る。これは、特異性の高い抗体が、所望の標的化部位のための目的のエピトープに対して増加され得るため、特に有用である。いくつかの実施形態では、複数の抗体が、細胞の表面において発現され、各抗体は、所望の標的に対して異なる特異性を有し得る。このような手法は、標的とする相互作用の親和性及び特異性を高めることができる。
リガンドは、例えば、細胞の所望の局在化または機能に基づいて、生物学分野の当業者によって選択され得る。いくつかの実施形態では、タモキシフェンなどのエストロゲン受容体リガンドは、細胞を、細胞表面に増加した数のエストロゲン受容体を有するエストロゲン依存性の乳癌細胞に標的化することができる。リガンド／受容体相互作用の他の非限定例としては、ＣＣＲ１（例えば、関節リウマチ、及び／または多発性硬化症における炎症関節組織または脳の治療のために）、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８（例えば、リンパ節組織に対する標的化）、ＣＣＲ６、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０（例えば、腸組織に標的化するために）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ１０（例えば、皮膚に標的化するために）、ＣＸＣＲ４（例えば、一般的な向上した移動のために）、ＨＣＥＬＬ（例えば、炎症及び炎症性疾患、骨髄の治療のために）、α４β７（例えば、腸粘膜標的化のために）、及びＶＬＡ－４ＮＣＡＭ－１（例えば、内皮に対する標的化）が挙げられる。一般に、標的化（例えば、癌転移）に関与する任意の受容体が、本明細書に記載される方法及び組成物における使用に利用され得る。
標的細胞としては、限定はされないが、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心臓細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、β細胞、下垂体細胞、滑膜表層細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、及び腫瘍細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、肝細胞を標的にし得る。アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）などのアポリポタンパク質が、身体内の中性またはほぼ中性の脂質含有脂質ナノ粒子と結合することが示されており、肝細胞の表面に見られる低比重リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）などの受容体と結合することが知られている。従って、対象に投与される、中性またはほぼ中性の電荷を有する脂質成分を含むＬＮＰが、対象の身体内のａｐｏＥを獲得することができるため、治療薬及び／または予防薬（例えば、ＲＮＡ）を、ＬＤＬＲを含む肝細胞に、標的化して送達することができる。
疾患及び障害を治療する方法
脂質ナノ粒子は、疾患、障害、または病態を治療するのに有用であり得る。特に、このような組成物は、欠損したまたは異常なタンパク質またはポリペプチド活性によって特徴付けられる疾患、障害、または病態を治療するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、欠損したまたは異常なポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰを含む本開示の製剤が、細胞に投与または送達され得る。ｍＲＮＡのその後の翻訳により、ポリペプチドが生成され、それによって、ポリペプチドに起因する活性の非存在または異常な活性に起因する問題を低減するかまたはなくすことができる。翻訳は急速に起こり得るため、この方法及び組成物は、敗血症、脳卒中、及び心筋梗塞などの急性疾患、障害、または病態の治療に有用であり得る。ＬＮＰに含まれる治療薬及び／または予防薬は、所与の種の転写の速度を変化させ、それによって、遺伝子発現に影響を与えることも可能であり得る。
組成物が投与され得る原因の機能不全または異常なタンパク質またはポリペプチド活性によって特徴付けられる疾患、障害、及び／または病態としては、限定はされないが、希少疾患、感染症（ワクチン及び治療薬の両方として）、癌及び増殖性疾患、遺伝性疾患（例えば、嚢胞性線維症）、自己免疫疾患、糖尿病、神経変性疾患、心血管及び腎血管疾患、並びに代謝性疾患が挙げられる。複数の疾患、障害、及び／または病態が、欠損した（または適切なタンパク質機能が起こらないほど実質的に低下された）タンパク質活性によって特徴付けられ得る。このようなタンパク質は、存在しないことがあり、またはそれらは、実質的に機能しないことがある。機能不全タンパク質の具体例は、ＣＦＴＲタンパク質の機能不全タンパク質変異体を生成し、嚢胞性線維症を引き起こす、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節（ＣＦＴＲ）遺伝子のミスセンス変異体である。本開示は、ＲＮＡと、本開示は、ＲＮＡと、式（Ｉ）で表される脂質、リン脂質（任意選択により不飽和である）、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含む脂質成分とを含むＬＮＰを投与することによって、対象におけるこのような疾患、障害、及び／または病態を治療するための方法を提供し、ここで、ＲＮＡは、対象の細胞内に存在する異常なタンパク質活性に拮抗するかまたは他の形で克服するポリペプチドをコードするｍＲＮＡであり得る。
本開示は、１つ以上の治療薬及び／または予防薬、例えば、核酸を含む脂質ナノ粒子、及びそれを含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。治療薬及び予防薬という用語は、本開示の特徴及び実施形態に関して、本明細書において同義的に使用され得る。その治療用組成物、またはイメージング、診断、もしくは予防用組成物は、疾患、障害、及び／または病態の予防、治療、診断、またはイメージング、及び／または任意の他の目的に有効な任意の適度な量及び任意の投与経路を用いて、対象に投与され得る。所与の対象に投与される具体的な量は、対象の種、年齢、及び全般的な状態、投与の目的、具体的な組成物、投与方法などに応じて変化し得る。本開示に係る組成物は、投与の容易さ及び投与量の均一性のために投与単位形態で製剤化され得る。しかしながら、本開示の組成物の１日総使用量が、担当医によって適切な医学的判断の範囲内で決定されることが理解されよう。任意の特定の患者についての具体的な治療有効、予防有効、または適切な用量レベル（例えば、イメージングのための）は、もしあれば、治療される障害の重症度及び治療される障害が何であるか、用いられる１つ以上の治療薬及び／または予防薬、用いられる具体的な組成物、患者の年齢、体重、全体的な健康、性別、及び食習慣、投与時間、投与経路、及び用いられる具体的な医薬組成物の排せつ速度；治療の継続期間、用いられる具体的な医薬組成物と組み合わせて、またはそれと同時に使用される薬剤、及び医療分野で周知の同様の要因を含む様々な要因に左右される。
１つ以上の治療薬及び／または予防薬を含むＬＮＰは、任意の経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のナノ粒子組成物を含む予防、診断、またはイメージング組成物を含む組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、皮下、心室内、経皮もしくは皮内、皮内、直腸、膣内、腹腔内、眼内、網膜下、硝子体内、局所（例えば、粉剤、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、及び／または液滴による）、粘膜、経鼻、口腔、経腸、硝子体、腫瘍内、舌下、鼻腔内を含む、様々な経路の１つ以上によって；気管内注入、気管支注入、及び／または吸入によって；経口スプレー及び／または粉末、経鼻スプレー、及び／またはエアロゾルとして、及び／または門脈カテーテルを介して投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内に、筋肉内に、皮内に、動脈内に、腫瘍内に、皮下に、眼内に、網膜下に、硝子体内に、または吸入によって投与され得る。しかしながら、本開示は、薬剤送達の科学の起こり得る進歩を考慮に入れて、任意の適切な経路による、本明細書に記載される組成物の送達または投与を包含する。一般に、最も適切な投与経路は、１つ以上の治療薬及び／または予防薬を含むナノ粒子組成物の性質（例えば、血流及び胃腸管などの様々な身体環境内でのその安定性）、患者の状態（例えば、患者が特定の投与経路に耐えられるかどうか）などを含む様々な要因に左右される。
ある特定の実施形態では、本開示に係る組成物は、所与の用量で、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇの治療薬及び／または予防薬（例えば、ｍＲＮＡ）を送達するのに十分な投与量レベルで投与され得、ここで、１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の用量は、対象の体重１ｋｇ当たり１ｍｇの治療薬及び／または予防薬を提供する。いくつかの実施形態では、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量の、ＬＮＰの治療薬及び／または予防薬（例えば、ｍＲＮＡ）が投与され得る。他の実施形態では、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇの用量の治療薬及び／または予防薬が投与され得る。ある特定の実施形態では、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇの用量が投与され得る。他の実施形態では、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇの用量が投与され得る。用量は、ｍＲＮＡ発現及び／または治療、診断、予防薬、またはイメージング効果の所望のレベルを得るために、１日１回以上、同じかまたは異なる量で投与され得る。所望の投与量が、例えば、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、３日毎、毎週、隔週、３週間毎、または４週間毎に送達され得る。ある特定の実施形態では、所望の投与量が、複数回の投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、またはそれ以上の投与）を用いて送達され得る。いくつかの実施形態では、例えば、外科手術の前もしくは後、または急性疾患、障害、もしくは病態の場合、単回用量が、投与され得る。
１つ以上の治療薬及び／または予防薬、例えば、核酸を含む脂質ナノ粒子は、１つ以上の他の治療、予防、診断、またはイメージング剤と組み合わせて使用され得る。「と組み合わせて」とは、複数の薬剤が同時に投与されるか、及び／または一緒に送達するために製剤化されなければならないことを意味することを意図しないが、これらの送達方法は、本開示の範囲内である。いくつかの実施形態では、１つ以上の異なる治療薬及び／または予防薬を含む１つ以上の脂質ナノ粒子は、組み合わせて投与され得る。組成物は、１つ以上の他の所望の治療薬または医療手順と同時に、またはその前に、またはその後に投与され得る。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量及び／または時間スケジュールで投与される。いくつかの実施形態では、本開示は、それらの生物学的利用能を向上させ、それらの代謝を抑制及び／または調節し、それらの排泄を阻害し、及び／または体内でのそれらの分布を調節する薬剤と組み合わせた、組成物、またはそのイメージング、診断、もしくは予防用組成物の送達を包含する。
組み合わせて用いられる治療、予防、診断、またはイメージング活性剤は、単一の組成物として一緒に投与されるか、または異なる組成物として別個に投与され得ることがさらに理解されよう。一般に、組み合わせて使用される薬剤は、それらが個々に用いられるレベルを超えないレベルで用いられることが予測される。いくつかの実施形態では、組み合わせて用いられるレベルは、個々に用いられるレベルより少ない。
併用レジメンに用いるための治療法（治療薬または手順）の特定の組み合わせは、所望の治療薬及び／または手順の適合性並びに達成しようとする所望の治療効果を考慮に入れる。用いられる治療法は、同じ障害について所望の効果を達成することができ（例えば、癌を治療するのに有用な組成物は、化学療法剤と同時に投与され得る）、またはそれらは、異なる効果（例えば、注入に関連する反応などの、何らかの有害な作用の制御）を達成することができることも理解されよう。
ＬＮＰは、組成物の有効性及び／または治療濃度域を増大するために、薬剤と組み合わせて使用され得る。このような薬剤は、例えば、抗炎症性化合物、ステロイド（例えば、コルチコステロイド）、スタチン、エストラジオール、ＢＴＫ阻害剤、Ｓ１Ｐ１アゴニスト、グルココルチコイド受容体調節因子（ＧＲＭ）、または抗ヒスタミンであり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、デキサメタゾン、メトトレキサート、アセトアミノフェン、Ｈ１受容体遮断薬、またはＨ２受容体遮断薬と組み合わせて使用され得る。いくつかの実施形態では、必要とする対象を治療し、または治療薬及び／または予防薬を、対象（例えば、哺乳動物）に送達する方法は、ＬＮＰを投与する前に、対象を１つ以上の薬剤で前処理することを含み得る。いくつかの実施形態では、対象は、有用な量（例えば、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、または任意の他の有用な量）のデキサメタゾン、メトトレキサート、アセトアミノフェン、Ｈ１受容体遮断薬、またはＨ２受容体遮断薬で前処理され得る。前処理は、脂質ナノ粒子の投与の前の２４時間以内（例えば、２４時間、２０時間、１６時間、１２時間、８時間、４時間、２時間、１時間、５０分、４０分、３０分、２０分、または１０分以内）に行われてもよく、例えば、投与量を増加させて、１回、２回、またはそれ以上行われ得る。
当業者は、本明細書に記載される本開示に係る特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または単なる日常的な実験を用いて、それを確認することができるであろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることは意図されず、添付の特許請求の範囲に記載されるとおりである。
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、矛盾する記載がない限り、または文脈上他の意味であることが明らかでない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。群の１つ以上の構成要素間に「または」を含む特許請求の範囲または本明細書の記載は、矛盾する記載がない限り、または文脈上他の意味であることが明らかでない限り、群の構成要素の１つ、２つ以上、または全てが、所与のプロダクトまたはプロセスに存在するか、それに用いられるか、またはそれに関連している場合、満たされると考えられる。本開示は、群のちょうど１つの構成要素が、所与のプロダクトまたはプロセスに存在するか、それに用いられるか、またはそれに関連している実施形態を含む。本開示は、群の構成要素の２つ以上、または全てが、所与のプロダクトまたはプロセスに存在するか、それに用いられるか、またはそれに関連している実施形態を含む。
「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることを意図され、追加の要素またはステップの包含を許容するが、それを必要とするわけではないことも留意される。従って、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が本明細書において使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語も、包含され、開示される。本明細書全体にわたって、組成物が、特定の成分を有する、包含する、または含むと記載される場合、組成物はまた、記載される成分から本質的になるか、またはからなることが考えられる。同様に、方法またはプロセスが、特定のプロセスステップを有する、包含する、または含むと記載される場合、プロセスはまた、記載されるプロセスステップから本質的になるか、またはからなることが考えられる。さらに、ステップの順序または特定の動作を行う順序が、本発明が動作可能なままである限り、重要でないことが理解されるべきである。さらに、２つ以上のステップまたは動作を同時に行うことができる。
範囲が示される場合、両端の値が含まれる。さらに、特に記載されない限り、または文脈及び当業者の理解から他の意味であることが明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈上特に明記されない限り、当該範囲の下限の単位の１０分の１まで、本開示の様々な実施形態における記載範囲内のあらゆる特定の値または部分範囲を想定し得ることが理解されるべきである。
さらに、先行技術に含まれる本開示のいずれかの特定の実施形態が、請求項のいずれか１つ以上から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。このような実施形態は、当業者に公知であると見なされるため、それらは、除外が本明細書に明示されていない場合であっても、除外され得る。
全ての引用資料、例えば、本明細書で引用される参照文献、刊行物、特許出願、データベース、データベースエントリー、及び技術は、引用に際して明示的に記載されていない場合であっても、参照により本出願に援用される。引用資料と本出願の記載内容に矛盾が生じる場合、本出願の記載内容が優先されるものとする。
本開示が記載されたが、以下の実施例は、例示説明として提供され、限定するものではない。
実施例１：事後負荷試験
初期実験は、事後負荷（ＰＨＬ）効果を解明するために設定された。例えば、実験は、プロセスの上流セクション内（すなわち、脂質沈殿の直後、約１ｍｓ～１，８００，０００ｍｓ下流）での、ｍＲＮＡの予め形成された小胞への添加を記載する。例えば、図１～５を参照されたい。
図１は、同程度のｍＲＮＡ封入またはｍＲＮＡ封入の増加が、長いＬＮＰ滞留時間でｍＲＮＡを導入する場合に観察されることを示すグラフである。封入は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ蛍光アッセイを介して評価した。
図２は、同程度のｍＲＮＡ封入またはｍＲＮＡ封入の著しい増加が、対照（点線）と比べて、長いＬＮＰ滞留時間でｍＲＮＡを導入する場合に観察されることを示すグラフである。封入は、イオン交換（ＡＥＸ）アッセイを介して評価した。
図３は、ｍＲＮＡが初期粒子形成（「標準」）中に含まれる標準プロセスと比べて、同程度の粒子形態が事後負荷（「ＰＨＬ）」プロセスモードで観察されることを示す凍結ＥＭ画像である。
図４は、標準ロットプロセスと比べて、事後負荷プロセスバッチにおける構造的特徴（ｑ＝約１．３ｎｍ－１、算出された格子面間隔５～６ｎｍ）の増加を示す小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）解析である。
図５は、標準プロセスに対するＰＨＬプロセスのインビボ性能を示し、予防ワクチンの状況におけるＰＨＬの最初の用量反応（プライムの３週間後）の増加を示して、かつ、ブーストの２週間後に観察される同程度の総ＩｇＧを示すプロットである。Ａ～Ｄエントリーは、比較として標準プロセスの代替バージョンを反映する。
実施例２：事後負荷の「ベッドサイド」または「現場混合」適用
第２に、ＰＨＬ概念を「ベッドサイド」または「現場混合」実施形態に適用した。これには、粒子形成とｍＲＮＡ封入の間により著しい時間遅延（すなわち、数か月～数年）を伴う。簡潔に言えば、空のＬＮＰをｍＲＮＡの不在下で処理し、保管し、使用前にｍＲＮＡカードと混合する。拡張性の高い空のＬＮＰプロセスを開発した。最初に、粒径が現場混合プロセスにおける効率的な混合及びｍＲＮＡ封入の決定的なパラメーターであり、それにより直径（１００ｎｍ未満）の小さいＬＮＰが、現場混合プロセス中にｍＲＮＡ封入の改善をもたらした。連続した、拡張性の高いナノ沈殿プロセスが、ＬＮＰ直径及び多分散性を制御する試みにおいて開発された。粒子成熟（すなわち、合体による成長）が、均一性及び狭い多分散性指標の促進に重要な因子であると判断した。上流ナノ沈殿の最適化のための実験設計を条件付けることによって、温度及び％エタノール（混合比）は、１２．５％のエタノールを標的にする第２のエタノール滴下ステップ（アセテート希釈）前に、総滞留時間を固定させながら変化させた。粒子成熟は、１５％未満のエタノールで停止した。プロセス温度及び％エタノールの調節により粒径制御が可能になり、多分散性が減少した。例えば、図６～３５を参照されたい。
図６は、ＬＮＰ分散の初期直径がｍＲＮＡ封入に対して有した効果を示し、かつ、直径の減少したＬＮＰバッチがｍＲＮＡ封入の増加をもたらしたことを示すグラフである。
図７は、エタノール含有量及び温度が、動的光散乱（ＤＬＳ）特徴付けを介して、ＬＮＰ多分散指数（ＰＤＩ）に影響を及ぼす決定的なパラメーターであることを示すモデルフィッティングであり、このモデルフィッティングにより、低ＰＤＩ（例えば、３０％エタノール、４０℃）に有利である有利な範囲のプロセス条件の算出が可能になった。
図８は、エタノール含有量及び温度が、ＤＬＳ特徴付けを介して、ＬＮＰ直径に影響を及ぼす決定的なパラメーターであることを示すモデルフィッティングであり、このモデルフィッティングにより、粒径を本明細書に記載されるプロセスによるｍＲＮＡ封入の好ましい範囲（１００ｎｍ未満）に制御するのに好ましい有利な範囲のプロセス条件の算出が可能になった。
図９は、空のＬＮＰ生成プロセスが構造的特徴に影響を及ぼしたことを、小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）解析によって示し、全てのプロセス条件により、ｑ＝１．４ｎｍ－１（算出された格子面間隔：約４ｎｍ）で顕著な特徴を有する粒子が得られたことを示すグラフである。熟成させないプロセスＡにより、ｑ＝０．４５（算出された格子面間隔：約１４ｎｍ）でさらなる特徴が生成された。この特徴は、凍結ＴＥＭ解析を介して、試料中の小さなリポソームまたはミセル構造の集団と関連している。熟成時間を組み込んだプロセスＢ及びＣは、プロセスＡと比較して、多分散性（ＤＬＳ解析を介して）及び構造均一性（凍結ＴＥＭ解析を介して）の改善を示した。
図１０は、本明細書に記載されるプロセスを介して負荷したｍＲＮＡが、ｑ＝１．３ｎｍ－１（算出された格子面間隔：約５ｎｍ）で顕著な特徴を有する、高い構造度を示す粒子を生成したことを示すグラフである。熟成時間及び低ＰＤＩに好ましい最適なプロセス条件を利用するプロセスＢ及びＣは、プロセスＡと比較して、多分散性の減少及び構造均一性の改善を示した。
図１１は、本明細書に記載される手順で生成されたバッチのプロセスＡ（標準）と比べて、プロセスＢ（成熟の増加）で観察された粒子均一性の改善を示す凍結ＥＭ画像である。
図１２は、ＬＮＰ形成の連続ナノ沈殿プロセスを示す例示のプロセスフロー図である。
図１３は、スクロースが、ＬＮＰ分散の凍結保護効果を呈し、凍結／融解ストレス後に粒子直径を保存することができ、有利なスクロース濃度が１５重量％超であると決定されたことを示すグラフである。
図１４は、凍結防止賦形剤スクロースを含むことで、本明細書に記載されるプロセスを介したｍＲＮＡ封入の完了が可能になったことを示すグラフである（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ）。
図１５Ａ及び１５Ｂは、液体状態（約５０ｎｍ）におけるナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）によって特徴付けられたＬＮＰの標準一次集団（１５Ａ）、及び、製剤（アセテート－スクロース）に凍結乾燥を施し、蒸留脱イオン水中で再構成した後の一次ナノ粒子集団の保存（１５Ｂ）を示すグラフである。
図１６は、液体製品及び凍結乾燥／再構成製品のＬＮＰ製剤の重なり粒子分布を示すグラフである。
図１７は、インビトロ発現の増加が、ｐＨ５．７５と比較して、ｐＨ５．０の凍結乾燥製剤で観察されたことを示すグラフである。
図１８は、現場混合プロセスにおける組み合わせ前に、ｍＲＮＡ及びＬＮＰ溶液のｐＨ値を変化させることによって有利なｐＨが決定されたことを示すグラフである。粒径制御は、ｐＨ６．０未満で有利に達成された。
図１９は、本明細書に記載されるプロセスにおける組み合わせ前に、ｍＲＮＡ及びＬＮＰ溶液のｐＨ値を変化させることによって有利なｐＨが決定され、封入の増加がｐＨ６．０未満で達成されたことを示すグラフである（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ）。
図２０は、本明細書に記載されるプロセスにおける組み合わせ前に、ｍＲＮＡ及びＬＮＰ溶液のｐＨ値を変化させることによって有利なｐＨが決定され、封入の増加がｐＨ６．０未満で達成されたことを示すグラフである（ＡＥＸアッセイ）。
図２１は、本明細書に記載されるプロセスにおいて、ＬＮＰ及びｍＲＮＡ溶液中のＮａＣｌのモル濃度を共に変化させることによってイオン強度感度が評価され、ｍＲＮＡ封入に好ましい有利な濃度が、２００ｍＭ未満であったことを示すグラフである。
図２２は、ｍＲＮＡ封入におけるバッチ間のばらつきの少なさが、本明細書に記載されるプロセスで観察され、ｍＲＮＡ負荷ＬＮＰが、２４時間の経時変化後に一貫性のあるｍＲＮＡ封入を示したことを示すグラフである。
図２３は、ＤＬＳ測定を介した、粒径に対する注入流量の影響を示すグラフであり、ｍＲＮＡの溶液は、ＬＮＰの緩衝液を含有するバイアルに直接注入し、得られた粒子直径は、注入速度に敏感であった。
図２４は、ｍＲＮＡ封入に対する注入流量の影響を示すグラフであり（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ）、ｍＲＮＡの溶液は、ＬＮＰの緩衝液を含有するバイアルに直接注入した。
図２５は、本明細書に記載されるプロセスを介して負荷したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子製剤が、ｑ＝１．３ｎｍ－１（算出された格子面間隔：約５ｎｍ）で顕著な特徴を有する、高い構造度を示す粒子を含み、同程度の構造的特徴が、様々な流量で観察された（試料９～１４）ことを示すグラフである。
図２６は、ＬＮＰ溶液中にＰＥＧ脂質複合体を増加レベルで添加することで、ｍＲＮＡとの混合後に粒径が減少したことを示すグラフである。
図２７は、ＬＮＰ溶液中にＰＥＧ脂質複合体を増加レベルで添加することが、ｍＲＮＡ封入に影響を与えなかったことを示すグラフである。
図２８は、本明細書に記載されるプロセスを介して負荷したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子製剤が、ｑ＝１．３ｎｍ－１（算出された格子面間隔：約５ｎｍ）で顕著な特徴を有する、高い構造度を示す粒子を含み、同程度の構造的特徴が、混合ステップに含まれるモル％のＰＥＧ－脂質で観察されたことを示すグラフである。
図２９は、ＬＮＰ溶液中にＰＥＧ脂質複合体を増加レベルで添加することで、混合本明細書に記載されるプロセスにおける注入流量への敏感さが減少したことを示すグラフである。
図３０は、ＬＮＰ溶液中にＰＥＧ脂質複合体を増加レベルで添加することで、封入が増加したことを示すグラフ（Ｒｉｂｏｓｔａｒアッセイ）である。
図３１は、混合産物の中和が、ｍＲＮＡ封入の増加（ＡＥＸアッセイ）をもたらし、中和が、濃縮リン酸ナトリウム溶液の添加を介して標的ｐＨ値に達成され得ることを示すグラフである。
図３２は、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイが、混合産物のｐＨ中和に対する敏感さを検出することができず、中和が、濃縮リン酸ナトリウム溶液の添加を介して標的ｐＨ値に達成されたことを示すグラフである。
図３３は、混合産物の中和が、増加したＬＮＰ直径（約１０ｎｍ）をもたらし、中和が、濃縮リン酸ナトリウム溶液の添加を介して標的ｐＨ値に達成されたことを示すグラフである。
図３４は、本明細書に記載されるプロセスを介して負荷したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子製剤が、ｑ＝１．３ｎｍ－１（算出された格子面間隔：約５ｎｍ）で顕著な特徴を有する、高い構造度を示す粒子を含み、１．３ｎｍ－１の僅かな減少が中和で観察され、さらに、混合産物のさらなる中和が、０．３ｎｍ－１（格子面間隔：約２１ｎｍ）で構造特徴の低下をもたらしたことを示すグラフである。
図３５は、本明細書に記載される混合製剤プロセス（「ＰＨＬプロセス」）の効力の、対照（「ベンチマークプロセス」）に対する増加を示し、標準プロセスモードと比較して、本明細書に記載される混合プロセスによる抗原特異的Ｔ細胞応答の増加を示すグラフである。
等価物
本発明の１つ以上の実施形態の詳細が、上記の付随する説明に記載される。本明細書に記載されたのと類似または同等の任意の方法及び材料を、本開示の実施または試験に使用することができるが、ここでは好ましい方法及び材料を記載する。本開示の他の特徴、目的及び利点は、本明細書及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。本明細書及び添付の特許請求の範囲において、単数形は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数の指示対象を含む。他に記載がない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。本明細書で引用する全ての特許及び刊行物は、全体として参照により本明細書で援用する。
前述の記載は、例示説明のみを目的として提示したものであり、本発明を、開示された形態そのものに限定するものではなく、本明細書に添付の特許請求の範囲により限定することを意図している。

Claims (26)

  1. 脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の作製方法であって、
    イオン化可能脂質を含む脂質溶液を、第１の緩衝剤を含む水性緩衝溶液と混合し、それにより脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子溶液を形成すること、及び
    核酸を含む核酸溶液を前記脂質ナノ粒子溶液に添加し、それにより前記核酸と会合する前記脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を形成すること
    を含み、
    前記水性緩衝溶液は約４．８～約５．５のｐＨを有し、
    前記イオン化可能脂質が、
    ｉ）式（ＩＬ－１）：

    の化合物、またはその塩もしくは異性体であり、式中、
    Ｒ １ は、Ｃ ５－３０ アルキル、Ｃ ５－２０ アルケニル、－Ｒ ＊ ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
    Ｒ ２ 及びＲ ３ は、独立して、Ｈ、Ｃ １－１４ アルキル、Ｃ ２－１４ アルケニル、－Ｒ ＊ ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ ＊ ＯＲ”からなる群から選択され、またはＲ ２ 及びＲ ３ は、それらが結合される原子と一緒に、複素環または炭素環を形成し、
    Ｒ ４ は、水素、Ｃ ３－６ 炭素環、－（ＣＨ ２ ） ｎ Ｑ、－（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ） ２ 、及び非置換Ｃ １－６ アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ ２ ） ｎ Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ ３ 、－ＣＸ ２ Ｈ、－ＣＸＨ ２ 、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ） ２ Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｒ ８ 、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ） ２ Ｒ ８ 、－Ｏ（ＣＨ ２ ） ｎ ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ ９ ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ ９ ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ） ２ Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ ９ ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ ９ ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｃ（＝ＮＲ ９ ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｃ（＝ＮＲ ９ ）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ） ２ Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、及び各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
    各Ｒ ５ は、独立して、Ｃ １－３ アルキル、Ｃ ２－３ アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
    各Ｒ ６ は、独立して、Ｃ １－３ アルキル、Ｃ ２－３ アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
    Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ） ２ －，－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、ここで、Ｍ”は、結合、Ｃ １－１３ アルキルまたはＣ ２－１３ アルケニルであり、
    Ｒ ７ は、Ｃ １－３ アルキル、Ｃ ２－３ アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
    Ｒ ８ は、Ｃ ３－６ 炭素環及び複素環からなる群から選択され、
    Ｒ ９ は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ ２ 、Ｃ １－６ アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ） ２ Ｒ、－Ｓ（Ｏ） ２ Ｎ（Ｒ） ２ 、Ｃ ２－６ アルケニル、Ｃ ３－６ 炭素環及び複素環からなる群から選択され、
    各Ｒは、独立して、Ｃ １－３ アルキル、Ｃ ２－３ アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
    各Ｒ’は、独立して、Ｃ １－１８ アルキル、Ｃ ２－１８ アルケニル、－Ｒ ＊ ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
    各Ｒ”は、独立して、Ｃ ３－１５ アルキル及びＣ ３－１５ アルケニルからなる群から選択され、
    各Ｒ ＊ は、独立して、Ｃ １－１２ アルキル及びＣ ２－１２ アルケニルからなる群から選択され、
    各Ｙは、独立して、Ｃ ３－６ 炭素環であり、
    各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、及び
    ｍは、５、６、７、８、９，１０，１１、１２、及び１３から選択され、及び式中、Ｒ ４ が、－（ＣＨ ２ ） ｎ Ｑ、－（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ） ２ である場合、（ｉ）ｎが、１、２、３、４または５である場合、Ｑは、－Ｎ（Ｒ） ２ ではなく、または（ｉｉ）ｎが、１または２である場合、Ｑは、５、６、または７員のヘテロシクロアルキルではないか、
    ｉｉ）式（ＩＬ－ＩＩ）：

    の化合物、またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｌは、１、２、３、４及び５から選択され、Ｍ １ は、結合またはＭ’であり、Ｒ ４ は、水素、非置換Ｃ １－３ アルキル、または－（ＣＨ ２ ） ｎ Ｑであり、ここで、ｎは、２、３、または４であり、及びＱは、－ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ） ２ Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ ８ 、－ＮＨＣ（＝ＮＲ ９ ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ ９ ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、及びＲ ２ 及びＲ ３ は、独立して、Ｈ、Ｃ １－１４ アルキル、及びＣ ２－１４ アルケニルからなる群から選択されるか、または
    ｉｉｉ）式（ＩＬ－ＩＩＩ）：

    の化合物、またはその塩もしくは異性体であり、式中、
    Ｗは、

    であり、
    環Ａは、

    であり、
    ｔは、１または２であり、
    Ａ １ 及びＡ ２ は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、
    Ｚは、ＣＨ ２ または不在であり、式中、ＺがＣＨ ２ である場合、破線（１）及び（２）は、各々、単結合を表し、及びＺが不在である場合、破線（１）及び（２）は、両方とも不在であり、
    Ｒ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３ 、Ｒ ４ 、及びＲ ５ は、独立して、Ｃ ５－２０ アルキル、Ｃ ５－２０ アルケニル、－Ｒ’ＭＲ’、－Ｒ ＊ ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ ＊ ＯＲ”からなる群から選択され、
    Ｒ ｘ１ 及びＲ ｘ２ は各々独立して、ＨまたはＣ １－３ アルキルであり、
    各Ｍは、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ） ２ －、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
    Ｍ ＊ は、Ｃ １ －Ｃ ６ アルキルであり、
    Ｗ １ 及びＷ ２ は各々独立して、－Ｏ－及び－Ｎ（Ｒ ６ ）－からなる群から選択され、
    各Ｒ ６ は、独立して、Ｈ及びＣ １－５ アルキルからなる群から選択され、
    Ｘ １ 、Ｘ ２ 、及びＸ ３ は、独立して、結合、－ＣＨ ２ －、－（ＣＨ ２ ） ２ －、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－（ＣＨ ２ ） ｎ －Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ ２ ） ｎ －、－（ＣＨ ２ ） ｎ －Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－（ＣＨ ２ ） ｎ －、－（ＣＨ ２ ） ｎ －ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－（ＣＨ ２ ） ｎ －、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
    各Ｙは、独立して、Ｃ ３－６ 炭素環であり、
    各Ｒ ＊ は、独立して、Ｃ １－１２ アルキル及びＣ ２－１２ アルケニルからなる群から選択され、
    各Ｒは、独立して、Ｃ １－３ アルキル及びＣ ３－６ 炭素環からなる群から選択され、
    各Ｒ’は、独立して、Ｃ １－１２ アルキル、Ｃ ２－１２ アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
    各Ｒ”は、独立して、Ｃ ３－１２ アルキル、Ｃ ３－１２ アルケニル及び－Ｒ ＊ ＭＲ’からなる群から選択され、及び
    ｎは、１～６の整数であり、
    式中、環Ａが、

    である場合、
    ｉ）Ｘ １ 、Ｘ ２ 、及びＸ ３ の少なくとも１つは－ＣＨ ２ －でなく、及び／または
    ｉｉ）Ｒ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３ 、Ｒ ４ 、及びＲ ５ の少なくとも１つは－Ｒ”ＭＲ’である、前記方法。
  2. 前記脂質ナノ粒子溶液の前記脂質ナノ粒子が、空の脂質ナノ粒子である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記脂質ナノ粒子溶液の前記脂質ナノ粒子が、約１５０ｎｍ未満、約１２５ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約９０ｎｍ未満、約８０ｎｍ未満、約７５ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満、約６５ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５５ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約４５ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３５ｎｍ未満、または約３０ｎｍ未満の平均直径を有する、請求項１に記載の方法。
  4. 前記脂質ナノ粒子溶液の前記脂質ナノ粒子が、約２５ｎｍ～約１２５ｎｍ、約３０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約３５ｎｍ～約１００ｎｍ、約４０ｎｍ～約９０ｎｍ、約４５ｎｍ～約８０ｎｍ、または約５０ｎｍ～約７０ｎｍの平均直径を有する、請求項１に記載の方法。
  5. 前記脂質溶液が、約７．０～約８．０、約７．１～約７．８、約７．２～約７．６、または約７．３～約７．５の範囲のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
  6. 前記核酸溶液が、約４．５～約６．５、約４．８～約６．２５、約４．８～約６．０、約５．０～約５．８、または約５．２～約５．５の範囲のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
  7. 前記脂質ナノ粒子溶液が、約４．５～約６．２５、約４．６～約６．０、約４．８～約５．８、約５．０～約５．７５、約５．０～約５．５の範囲のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
  8. 前記脂質ナノ粒子製剤が、約４．５～約６．０、約４．６～約５．８、約４．８～約５．６、約５．０～約５．５、または約５．１～約５．４の範囲のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
  9. 前記脂質ナノ粒子溶液または前記脂質ナノ粒子製剤が、前記イオン化可能脂質のｐＫａ未満のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
  10. 前記核酸が、リボ核酸である、請求項１に記載の方法。
  11. 前記核酸が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記脂質溶液及び／または前記脂質ナノ粒子溶液が、第１の有機溶媒をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  13. 前記水性緩衝溶液、核酸溶液、及び／または前記脂質ナノ粒子溶液が、第１の水性緩衝液を含む、請求項１に記載の方法。
  14. 前記水性緩衝溶液、核酸溶液、及び／または前記脂質ナノ粒子溶液が、第２の水性緩衝液、第２の有機溶媒、または両方をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  15. 前記第１の水性緩衝液及び前記第２の水性緩衝液が、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、及びトリス緩衝液からなる群から選択される少なくとも１つの緩衝液である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記第１の有機溶媒、前記第２の有機溶媒、または両方が、アルコールである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記脂質溶液、前記核酸溶液、または両方が、第３の有機溶媒をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  18. 前記第３の有機溶媒が、アルコールである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記脂質ナノ粒子製剤を処理することをさらに含み、前記脂質ナノ粒子製剤を処理することは、濾過、ｐＨ調整、緩衝液交換、透析、濃縮、凍結、凍結乾燥、及びパッキングのうちから選択される少なくとも１つのステップを含む、請求項１に記載の方法。
  20. 前記脂質溶液、前記脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）溶液、及び／または前記脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤が、封入剤をさらに含み、前記封入剤が、
    ｉ）式（ＥＡ－Ｉ）：

    の化合物、またはその塩もしくは異性体であり、式中、
    Ｒ ２０１ 及びＲ ２０２ は各々独立して、Ｈ、Ｃ １ －Ｃ ６ アルキル、Ｃ ２ －Ｃ ６ アルケニル、及び（Ｃ＝ＮＨ）Ｎ（Ｒ １０１ ） ２ からなる群から選択され、式中、各Ｒ １０１ は、独立して、Ｈ、Ｃ １ －Ｃ ６ アルキル、及びＣ ２ －Ｃ ６ アルケニルからなる群から選択され、
    Ｒ ２０３ は、Ｃ １ －Ｃ ２０ アルキル及びＣ ２ －Ｃ ２０ アルケニルからなる群から選択され、
    Ｒ ２０４ は、Ｈ、Ｃ １ －Ｃ ２０ アルキル、Ｃ ２ －Ｃ ２０ アルケニル、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ １ －Ｃ ２０ アルキル）、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ ２ －Ｃ ２０ アルケニル）、Ｃ（Ｏ）（ＮＨＣ １ －Ｃ ２０ アルキル）、及びＣ（Ｏ）（ＮＨＣ ２ －Ｃ ２０ アルケニル）からなる群から選択され、
    ｎ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から選択されるか、
    ｉｉ）式（ＥＡ－ＩＩ）：

    の化合物、またはその塩もしくは異性体であり、式中、
    Ｘ １０１ は、結合、ＮＨ、またはＯであり、
    Ｒ １０１ 及びＲ １０２ は各々独立して、Ｈ、Ｃ １ －Ｃ ６ アルキル、及びＣ ２ －Ｃ ６ アルケニルからなる群から選択され、
    Ｒ １０３ 及びＲ １０４ は各々独立して、Ｃ １ －Ｃ ２０ アルキル及びＣ ２ －Ｃ ２０ アルケニルからなる群から選択され、及び
    ｎ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から選択されるか、または
    ｉｉｉ）エチル・ラウロイルアルギン酸またはその塩もしくは異性体である、請求項１に記載の方法。
  21. 前記脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤対前記核酸の重量／重量比が、約５：１～約６０：１の範囲である、請求項１に記載の方法。
  22. 前記脂質ナノ粒子または脂質ナノ粒子製剤が、リン脂質、ＰＥＧ脂質、構造脂質、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含み、前記構造脂質が、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、又はアルファ－トコフェロールである、請求項１に記載の方法。
  23. 前記脂質ナノ粒子及び／または脂質ナノ粒子製剤が、
    約４０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質、
    約５～１５ｍｏｌ％のリン脂質、
    約３５～４５ｍｏｌ％の構造脂質、または
    約０．０１～２．０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質
    を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ＰＥＧ脂質は、
    ｉ）ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、及びＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールから選択されるか、
    ｉｉ）式（ＰＬ－Ｉ）：

    の化合物、またはその塩もしくは異性体であり、式中、
    Ｒ３は、－ＯＲＯであり、
    ＲＯは、水素、任意選択により置換されたアルキル、または酸素保護基であり、
    ｒは、１～１００の整数であり、両端を含み、
    Ｌ１は、任意選択により置換されたＣ１－１０アルキレンであり、式中、前記任意選択により置換されたＣ１－１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンは、任意選択により置換されたカルボシクリレン、任意選択により置換されたヘテロシクリレン、任意選択により置換されたアリーレン、任意選択により置換されたヘテロアリーレン、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、－ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）によって独立して置き換えられ、
    Ｄは、クリックケミストリーによって得られる部分または生理学的条件下で切断可能な部分であり、
    ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
    Ａは、

    の式であり、
    Ｌ２の各例は、独立して、結合または任意選択により置換されたＣ１－６アルキレンであり、式中、前記任意選択により置換されたＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位は、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）によって任意選択により置き換えられ、
    Ｒ２の各例は、独立して、任意選択により置換されたＣ１－３０アルキル、任意選択により置換されたＣ１－３０アルケニル、または任意選択により置換されたＣ１－３０アルキニルであり、任意選択により、式中、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、任意選択により置換されたカルボシクリレン、任意選択により置換されたヘテロシクリレン、任意選択により置換されたアリーレン、任意選択により置換されたヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、－Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（０）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏによって独立して置き換えられ、
    ＲＮの各例は、独立して、水素、任意選択により置換されたアルキル、または窒素保護基であり、
    環Ｂは、任意選択により置換されたカルボシクリル、任意選択により置換されたヘテロシクリル、任意選択により置換されたアリール、または任意選択により置換されたヘテロアリールであり、及び
    ｐは、１または２であるか、
    ｉｉｉ）式（ＰＬ－ＩＩ）：

    の化合物、またはその塩もしくは異性体であり、式中、
    Ｒ３は、－ＯＲＯであり、
    ＲＯは、水素、任意選択により置換されたアルキルまたは酸素保護基であり、
    ｒは、１～１００の整数であり、
    Ｒ５は、任意選択により置換されたＣ１０－４０アルキル、任意選択により置換されたＣ１０－４０アルケニル、または任意選択により置換されたＣ１０－４０アルキニルであり、及び任意選択により、Ｒ５の１つ以上のメチレン基は、任意選択により置換されたカルボシクリレン、任意選択により置換されたヘテロシクリレン、任意選択により置換されたアリーレン、任意選択により置換されたヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏによって置き換えられ、及び
    ＲＮの各例は、独立して、水素、任意選択により置換されたアルキル、または窒素保護基であるか、または
    ｉｖ）式（ＰＬ－ＩＩＩ）：

    の化合物、またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｓが、１～１００の整数である、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記リン脂質が、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、及びスフィンゴミエリンから選択される、請求項２２に記載の方法。
  26. 前記イオン化可能脂質が、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、及び（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））から選択される、請求項２２に記載の方法。
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PIETER R. CULLIS，LIPID NANOPARTICLE SYSTEMS FOR ENABLING GENE THERAPIES，MOLECULAR THERAPY，米国，JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF GENE THERAPY，2017年07月，VOL:25, NR:7，PAGE(S):1467-1475，http://dx.doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.03.013，GENE AND CELL THERAPY

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