JP7588928B1 - Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来サイトカイン産生抑制組成物、犬又は猫用のオーラルケア組成物、歯周病予防剤、口腔内バイオフィルム形成阻害剤、抗炎症剤及び口臭抑制剤 - Google Patents

Abstract

【課題】有効成分それ自体がペットの嗜好性に合致するＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来サイトカイン産生抑制組成物、犬又は猫用のオーラルケア組成物、歯周病予防剤、口腔内バイオフィルム形成阻害剤、抗炎症剤及び口臭抑制剤を提供する。
【解決手段】本発明は、サイクロデキストラン及びその誘導体から選択される少なくとも１種以上の化合物を含有するＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来サイトカイン産生抑制組成物である。この抑制組成物は、犬又は猫用のオーラルケア組成物、歯周病予防剤、口腔内バイオフィルム形成阻害剤、抗炎症剤及び口臭抑制剤に応用できる。
【選択図】図１

Description

本発明は、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来サイトカイン産生抑制組成物、犬又は猫用のオーラルケア組成物、歯周病予防剤、口腔内バイオフィルム形成阻害剤、抗炎症剤及び口臭抑制剤に関する。

イヌやネコ等にもヒトと同様に、歯周病等の様々な口腔トラブルが発生している。ヒトとペットでは全く口腔内環境が異なるため、口腔内に存在する細菌叢（さいきんそう）が異なる。具体的に、ヒトの歯周病の主な原因菌は、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓであるが、イヌやネコの歯周病の主な原因菌は、ヒトの原因菌とは異なるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅである。

ペット歯周病等の口腔用トラブルに対処するものとして、明日葉抽出物を有効成分として含有するＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅに対する歯周病予防剤が提案されている（特許文献１参照）。特許文献１に記載の予防剤によると、明日葉抽出物がＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅに対する抗菌作用（生育抑制効果）を発揮し、これによりイヌやネコの歯周病予防を期待できる。

特開２０１５－０６７５３９号公報

しかしながら、明日葉抽出物液はペットの嗜好性に合わないことから、特許文献１に記載の予防剤の場合、カラギーナン、ペクチン、ジェランガム、アルギン酸及びその塩から選ばれる１種以上と併用することが求められる。嗜好性の悪いものはペットが受け付けず、ペットへの口腔用組成物の使用においては、嗜好性が極めて重要である。また、ペットはうがいをせず飲み込むため、高い安全性が求められ、使用方法がヒトは異なる。このため、ヒトの口腔用組成物の技術がそのままペットに応用することができない場合も多い。そのため、歯周病予防に寄与する有効成分それ自体が他の成分と併用することなくペットの嗜好性に合致し、開発の自由度をよりいっそう高めた組成物の提供が求められる。

本発明は、このような問題に鑑みてなされたものであり、有効成分それ自体がペットの嗜好性に合致するＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来サイトカイン産生抑制組成物、犬又は猫用のオーラルケア組成物、歯周病予防剤、口腔内バイオフィルム形成阻害剤、抗炎症剤及び口臭抑制剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、環状オリゴ糖であるサイクロデキストランがそれ自体でＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来のサイトカイン産生抑制機能を発揮することを見出し、本発明を完成するに至った。具体的に、本発明では、以下のようなものを提供する。

第１の特徴に係る発明は、サイクロデキストラン及びその誘導体から選択される少なくとも１種以上の化合物を含有するＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来サイトカイン産生抑制組成物を提供する。

第２の特徴に係る発明は、第１の特徴に係る抑制組成物を含有する犬又は猫用オーラルケア組成物を提供する。第３の特徴に係る発明は、第１の特徴に係る抑制組成物を含有する犬又は猫用歯周病予防剤を提供する。第４の特徴に係る発明は、第１の特徴に係る抑制組成物を含有する犬又は猫用口腔内バイオフィルム形成阻害剤を提供する。第５の特徴に係る発明は、第１の特徴に係る抑制組成物を含有する犬又は猫用抗炎症剤を提供する。第６の特徴に係る発明は、第１の特徴に係る抑制組成物を含有する犬又は猫用口臭抑制剤を提供する。

図１は、サイクロデキストランの構造式の一例である。サイクロデキストランは、４～３３個のグルコースがα－１，６グルコシド結合で環状に連結した環状イソマルトオリゴ糖であり、甘みがなく、無味無臭である。そのため、食品の味や香りに影響を与えないことから、犬や猫の嗜好性が高い。また、サイクロデキストランは、水溶性が極めて高く、等量以下の水に溶解するため、犬や猫がうがいをせず飲み込んでも問題ないだけの安全性を有する。また、サイクロデキストランは、熱、酸、アルカリに対して安定であるため、オーラルケア組成物、歯周病予防剤、口腔内バイオフィルム形成阻害剤、抗炎症剤及び口臭抑制剤を提供するに際して開発の自由度が高い。

本発明によると、有効成分それ自体がペットの嗜好性に合致するＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来サイトカイン産生抑制組成物、犬又は猫用のオーラルケア組成物、歯周病予防剤、口腔内バイオフィルム形成阻害剤、抗炎症剤及び口臭抑制剤を提供できる。

図１は、サイクロデキストラン（ＣＩ）の構造式の一例である。 図２は、シクロデキストリン（ＣＤ）の構造式の一例である。 図３は、〔試験１〕ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘのＰ．ｇｕｌａｅに対する殺菌作用の結果である。 図４は、〔試験２〕ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘによるＰ．ｇｕｌａｅのバイオフィルム形成阻害作用の結果（ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ濃度とＯＤとの関係）である。 図５は、〔試験３〕ハイドロキシアパタイトディスクに対するＰ．ｇｕｌａｅ及びそのバイオフィルムの電子顕微鏡観察結果（コントロール）である。 図６は、〔試験３〕ハイドロキシアパタイトディスクに対するＰ．ｇｕｌａｅ及びそのバイオフィルムの電子顕微鏡観察結果（ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ濃度５％）である。 図７は、〔試験４〕Ｐ．ｇｕｌａｅによるマウスマクロファージ細胞の炎症性サイトカイン産生に及ぼすＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘの効果を示す図である。 図８は、〔試験６〕ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘの口臭原因物質（メチルメルカプタン等）に対する消臭作用の結果である。 図９は、〔試験７〕ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘのＰ．ｇｕｌａｅ菌による不溶性グルカン産生阻害作用調査の結果である。

以下、本発明の具体的な実施形態について、詳細に説明するが、本発明は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。

＜Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来サイトカイン産生抑制組成物＞
本発明に係るサイトカイン産生抑制組成物は、サイクロデキストラン及びその誘導体から選択される少なくとも１種以上の化合物を含有する。

〔サイクロデキストラン及びその誘導体〕
図１は、サイクロデキストラン（ＣＩ）の構造式の一例である。サイクロデキストランは、４～３３個のグルコースがα－１，６グルコシド結合で環状に連結した環状イソマルトオリゴ糖である。

サイクロデキストランの類似化合物としてシクロデキストリンが知られている。図２は、シクロデキストリン（ＣＤ）の構造式の一例である。ＣＩとＣＤとは、複数個のグルコースが環状に連結した環状オリゴ糖である点で共通するが、次の点で相違する。第１に、ＣＩは、４～３３個のグルコースが結合するのに対し、ＣＤは、６～８個のグルコースが結合する点で異なる。第２に、ＣＩは、グルコースがα－１，６グルコシド結合で連結するのに対し、ＣＤは、グルコースがα－１，４グルコシド結合で連結する点で異なる。第３に、ＣＩの分子構造は、口径が大きく浅いのに対し、ＣＤの分子構造は、口径が小さく深い点で異なる。第４に、ＣＩは、水への溶解性が高いのに対し、ＣＤは、水への溶解性が低い点で異なる。

一例として、ＣＩは、バチルス属の微生物の培養液や環状イソマルト糖合成酵素の反応液から得ることができる（特許第３０７５８７３号、特許第３１１７３２８号参照）。微生物や酵素を利用してＣＩを得た場合、分枝していないＣＩと、分枝したＣＩの混合物として得られる。サイクロデキストランの誘導体としては、当該混合物のうち分枝したＣＩが挙げられる。

〔任意成分（添加剤）〕
本発明のサイトカイン産生抑制組成物には、ＣＩ及びその誘導体から選択される少なくとも１種以上の他に、本発明の効果を損なわない範囲で任意成分（添加剤）を１種単独で又は２種以上を適宜組み合わせ、常用量を必要に応じて配合することができる。

任意成分としては、界面活性剤、研磨剤、結合剤、湿潤剤、発泡剤、滞留剤、香料、酸味料、着色剤、ｐＨ調整剤、保存料・防腐剤、甘味剤、有効成分、粘稠剤等が挙げられる。以下に任意成分の具体例を示すが、本発明の組成物に配合可能な成分はこれらに制限されるものではない。

［界面活性剤］
界面活性剤としては、犬又は猫の口腔に供される組成物に配合されるものであれば特に制限なく使用できる。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、アニオン界面活性、両性界面活性剤等が挙げられる。

非イオン界面活性剤として、糖又は糖アルコールの脂肪酸エステルであるショ糖脂肪酸エステル、マルトース脂肪酸エステル、マルチトール脂肪酸エステル、マルトトリイトール脂肪酸エステル、マルトテトレイトール脂肪酸エステル、マルトペンタイトール脂肪酸エステル、マルトヘキサイトール脂肪酸エステル、マルトヘプタイトール、脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ラクトース脂肪酸エステル、ラクチトール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体、グリセリンエステルのポリオキシエチレンエーテル、アルキロールアミド等が挙げられる。上記脂肪酸は炭素数１２～１８のものを用いることが好ましい。

アニオン界面活性剤として、Ｎ－アシルアミノ酸塩、α－オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩等が挙げられる。具体的には、アルキル鎖の炭素数が１０～１６のα－オレフィンスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｎ－ラウロイルグルタミン酸ナトリウム、Ｎ－パルミトイルグルタミン酸ナトリウム等のＮ－アシルグルタミン酸ナトリウム、Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ－ミリストイルサルコシンナトリウム等のＮ－アシルサルコシンナトリウム、Ｎ－ラウロイルメチルタウリンナトリウム、Ｎ－ミリストイルメチルタウリンナトリウム等のＮ－メチル－Ｎ－アシルタウリンナトリウム等が挙げられる。

両性界面活性剤として、２－アルキル－Ｎ－カルボキシメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン、ラウリルメチルアミノ酢酸ベタイン等が挙げられる。

界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、アニオン界面活性剤が好ましく、口腔粘膜刺激性等使用感の面から、非イオン界面活性剤が好ましい。特に糖又は糖アルコールの脂肪酸エステルがより好ましい。

［研磨剤］
研磨剤としては、結晶性シリカ、非晶性シリカ、シリカゲル、アルミノシリケート等のシリカ系研磨剤、ゼオライト、リン酸水素カルシウム無水和物、リン酸水素カルシウム２水和物、ピロリン酸カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化アルミニウム、アルミナ、炭酸マグネシウム、第３リン酸マグネシウム、ケイ酸ジルコニウム、第３リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、第４リン酸カルシウム、合成樹皮系研磨剤等が挙げられる。

［結合剤］
結合剤としては、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、キサンタンガム、アラビアガム、グアーガム、ローカストビーンガム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。

［湿潤剤］
湿潤剤としては、グリセリン、濃グリセリン、ジグリセリン、ソルビット、マルチトール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、キシリトール、ポリエチレングリコール等の多価アルコール等の１種又は２種以上を使用できる。

［発泡剤］
発泡剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、アルキルスルホコハク酸ナトリウム、ヤシ油脂肪酸モノグリセリンスルホン酸ナトリウム、α－オレフィンスルホン酸ナトリウム、Ｎ－アシルグルタメート等のＮ－アシルアミノ酸塩、２－アルキル－Ｎ－カルボキシメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、マルチトール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等が挙げられ、これらの１種又は２種以上を併用することができる。

［滞留剤］
サイトカイン産生抑制組成物の有効成分を滞留（持続）させるための滞留剤として、流動パラフィン、流動パラフィン及びポリエチレンの混合物であるゲル化炭化水素、植物油、ミツロウ等が使用でき、これらを１種又は２種以上を併用することができる。なお、ゲル化炭化水素は、ゲル化剤としての役割も果たす。

［香料］
香料としては、天然香料、合成香料等の油脂香料や粉末香料を１種又は２種以上を使用するのが好ましいが、特に限定されない。香料としては、天然香料、合成香料等の油脂香料や粉末香料を１種又は２種以上使用するのが好ましいが、特に限定されない。例えば、天然香料として、マスティック油、パセリ油、アニス油、ユーカリ油、ウィンターグリーン油、カシア油、メントール油、スペアミント油、ペパーミント油、レモン油、コリアンダー油、オレンジ油、マンダリン油、ライム油、ラベンダー油、ローレル油、カモミール油、カルダモン油、キャラウェイ油、ベイ油、レモングラス油、パインニードル油、ネロリ油、ローズ油、ジャスミン油、イリスコンクリート、アブソリュートペパーミント、アブソリュートローズ、オレンジフラワー、シトラス油、ミックスフルーツ油、ストロベリー油、シナモン油、クローブ油、グレープ油等が挙げられる。

単品香料としては、青葉アルコール、カルボン、アネトール、サリチル酸メチル、シンナミックアルデヒド、リナロール、リナリールアセテート、リモネン、メントン、メンチルアセテート、ピネン、オクチルアルデヒド、シトラール、プレゴン、カルビールアセテート、アニスアルデヒド、エチルアセテート、エチルブチレート、アリルシクロヘキサンプロピオネート、メチルアンスラニレート、エチルメチルアンスラニレート、バニリン、ウンデカラクトン、ヘキサナール、エチノンアルコール、プロピルアルコール、ブタノール、イソアミルアルコール、ヘキセノール、ジメチルサルフェイド、シクロテン、フルフラール、トリメチルピラジン、エチルラクテート、エチルリオアセテート等が挙げられる。単品香料及び／又は天然香料も含む調合香料として、ストロベリーフレーバー、アップルフレーバー、バナナフレーバー、パイナップルフレーバー、グレープフレーバー、マンゴーフレーバー、メロンフレーバー、トロピカルフルーツフレーバー、スイカフレーバー、バターフレーバー、ミルクフレーバー、ヨーグルトフレーバー、フルーツミックスフレーバー、ハーブミントフレーバー等が挙げられる。また、香料の形態は、精油、抽出物、固形物、又はこれらを噴霧乾燥した粉体でもよい。

［酸味料］
酸味料としては、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸等の有機酸が挙げられる。

［着色剤］
着色剤としては、ベニバナ赤色素、クチナシ黄色素、クチナシ青色素、シソ色素、紅麹色素、赤キャベツ色素、ニンジン色素、ハイビスカス色素、カカオ色素、スピルリナ青色素、クマリンド色素等の天然色素や赤色３号、赤色１０４号、赤色１０５号、赤色１０６号、黄色４号、黄色５号、緑色３号、青色１号等の法定色素、リボフラビン、銅クロロフィンナトリウム、二酸化チタン等が挙げられる。

［ｐＨ調整剤］
ｐＨ調整剤としては、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸等の有機酸とそのナトリウム塩やカリウム塩、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等のリン酸塩、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等の炭酸塩等が挙げられる。

［保存料・防腐剤］
保存料・防腐剤としては、安息香酸及びその塩、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン等のパラベン類（パラオキシ安息香酸エステル）、ソルビン酸及びその塩、エチレンジアミン四酢酸塩、塩化ベンザルコニウム等が挙げられる。

［他の甘味剤］
他の甘味剤として、サッカリンナトリウム、アスパルテーム、トレハロース、ステビオサイド、ステビアエキス、ｐ－メトキシシンナムアルデヒド、ネオヘスペリジルジヒドロカルコン、ペリラルチン、キシリトール等がある。

［有効成分］
本発明のサイトカイン産生抑制組成物には、上記のほか、更なる有効成分を配合してもよい。そのような有効成分として塩化リゾチーム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、モノフルオロリン酸ナトリウム、硝酸カリウム、ポリリン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ヒノキチオール、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、アスコルビン酸塩類、クロルヘキシジン塩類、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ビサボロール、トリクロサン、イソプロピルメチルフェノール、トコフェロール、酢酸トコフェロール、ε－アミノカプロン酸、トラネキサム酸、アルミニウムヒドロキシルアラントイン、乳酸アルミニウム、ジヒドロコレステロール、グリチルレチン酸、グリチルリチン酸塩類、銅クロロフィリン塩、塩化ナトリウム、グァイアズレンスルホン酸塩、デキストラナーゼ、塩酸ピリドキシン、薬用ハイドロキシアパタイト等が挙げられ、これらの１種又は２種以上を配合することができる。

〔剤型〕
本発明のサイトカイン産生抑制組成物に関し、剤型は特に限定されない。サイトカイン産生抑制組成物が液体製剤の場合は、溶剤として水や、エタノール、プロパノール等の炭素数３以下の低級アルコール等を配合し得る。また、サイトカイン産生抑制組成物の剤型は、練り歯磨き剤、ジェル、液状歯磨き剤、粉末状歯磨き剤、洗口剤、フィルム剤、チューインガム、ペットフード用添加物又はパスタ等から選択され得る。

水の配合量は、ＣＩの含有量が適切であれば特に限定されるものでなく、サイトカイン産生抑制組成物１００質量部に対して２０～９８質量％が好ましく、低級アルコールを配合する場合の含有量は１～２０質量％が好ましい。

サイトカイン産生抑制組成物は、各種成分を混合することにより得ることができる。例えば、各種成分を水等の溶媒に混合して撹拌することにより調製できる。

サイトカイン産生抑制組成物の２５℃におけるｐＨは４．０～９．０が好ましく、５．０～８．０がより好ましい。ペースト状の組成物とする場合の２５℃におけるｐＨは５．５～９．０が好ましく、スプレー用の組成物とする場合は４．５～８．５が好ましく、シート等の含浸液の組成物とする場合は４．５～８．５が好ましい。

また、サイトカイン産生抑制組成物の２５℃における粘度は、使用性の点から、ブルックフィールド型粘度計を用いて測定した場合、１～５０，０００ｍＰａ・ｓが好ましく、５～２０，０００ｍＰａ・ｓがより好ましい。ジェル、ペースト状の組成物とする場合の２５℃における粘度は１０～５０，０００ｍＰａ・ｓが好ましく、スプレー用の組成物とする場合は１～１，０００ｍＰａ・ｓが好ましく、シート等の含浸液の組成物とする場合は１～５００ｍＰａ・ｓが好ましい。

〔使用方法〕
本発明のサイトカイン産生抑制組成物は、ペット、特にイヌ又はネコの口腔内に適用されるものである。使用方法としては、まず歯面、歯茎、歯と歯の間、歯と歯茎の間等に口腔用組成物を塗布する。塗布方法としては、飼育者の指で塗布する方法、歯ブラシ、綿棒、適宜形状のガーゼ、シート、又は歯磨き用の玩具あるいはロープ等の用具を用いて塗布する方法、ノズル等が取り付けられた容器、スプレー等の容器に組成物を充填し、直接塗布する方法等が挙げられる。塗布後に、飼育者の指、上記用具を用いて、歯の表面、歯と歯の間、歯と歯茎の間をこすり磨きして清掃してもよい。なお、上記用具には、塗布・含浸等により、サイトカイン産生抑制組成物が予め用具に取り付けられたセットでもよく、塗布直前に用具にサイトカイン産生抑制組成物をつけてよい。また、液状組成物を原液もしくは飲用水に混ぜることによって投与することもできる。

また、ドッグフードやキャットフード、スナック、サプリメントにサイトカイン産生抑制組成物を配合し、ペットが当該ドッグフード等を食す形で提供してもよい。

本発明のサイトカイン産生抑制組成物は、サイクロデキストラン及びその誘導体から選択される少なくとも１種以上の化合物を含有する。サイクロデキストランは、４～３３個のグルコースがα－１，６グルコシド結合で環状に連結した環状イソマルトオリゴ糖であり、甘みがなく、無味無臭である。そのため、食品の味や香りに影響を与えないことから、犬や猫の嗜好性が高い。また、サイクロデキストランは、水溶性が極めて高く、等量以下の水に溶解するため、犬や猫がうがいをせず飲み込んでも問題ないだけの安全性を有する。よって、本発明によると、有効成分それ自体がペットの嗜好性に合致するＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来サイトカイン産生抑制組成物を提供できる。

＜サイトカイン産生抑制組成物の応用＞
サイクロデキストランは、熱、酸、アルカリに対して安定であるため、本発明のサイトカイン産生抑制組成物と同様の配合条件で、犬又は猫用のオーラルケア組成物、歯周病予防剤、口腔内バイオフィルム形成阻害剤、抗炎症剤及び口臭抑制剤に応用できる。

＜Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来グルカン産生抑制組成物＞
本発明は、更に、サイクロデキストラン及びその誘導体から選択される少なくとも１種以上の化合物を含有するＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来グルカン産生抑制組成物をも提供する。本発明は如何なる理論にも拘束されるものではないが、サイクロデキストラン及びその誘導体から選択される少なくとも１種の化合物を含有する組成物には、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来の水溶性グルカンや、非水溶性グルカンの産生を抑制する作用も認められる。このため、このような組成物を服用することにより、犬や猫の口腔内において、バイオフィルムの形成が阻害される。そして、バイオフィルムの形成が阻害されることにより、犬や猫の口腔内におけるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ等の菌体の接着が抑制されるので、結果的に炎症の発生が抑制され、口腔内の健康状態が好適に維持される。

なお、本実施形態のグルカン産生抑制組成物に配合できる各種任意成分や、グルカン産生抑制組成物の剤型・使用方法については、サイトカイン産生抑制組成物において説明した内容をそのまま援用する。

＜グルカン産生抑制組成物の応用＞
サイクロデキストランは、熱、酸、アルカリに対して安定であるため、本発明のグルカン産生抑制組成物と同様の配合条件で、犬又は猫用の口腔内バイオフィルム形成阻害剤や抗炎症剤に応用できる。すなわち、本発明は、グルカン産生抑制組成物を含有する犬又は猫用の口腔内バイオフィルム形成阻害剤や抗炎症剤をも提供する。

＜Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来メチルメルカプタン及び／又は硫化水素産生産生抑制組成物＞
本発明は、更に、サイクロデキストラン及びその誘導体から選択される少なくとも１種以上の化合物を含有するＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来メチルメルカプタン産生産生抑制組成物や、サイクロデキストラン及びその誘導体から選択される少なくとも１種以上の化合物を含有するＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来硫化水素産生抑制組成物をも提供する。本発明は如何なる理論にも拘束されるものではないが、サイクロデキストラン及びその誘導体から選択される少なくとも１種の化合物を含有する組成物には、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来のメチルメルカプタンや、硫化水素の産生を抑制する作用も認められる。このため、このような組成物を服用することにより、犬や猫の口腔内において、口臭の原因となるにおい物質の発生が抑制されるので、結果的に口臭の発生が抑制され、口腔内の健康状態が好適に維持される。

なお、本実施形態のメチルメルカプタン及び／又は硫化水素産生抑制組成物に配合できる各種任意成分や、メチルメルカプタン及び／又は硫化水素産生抑制組成物の剤型・使用方法については、サイトカイン産生抑制組成物において説明した内容をそのまま援用する。

＜メチルメルカプタン及び／又は硫化水素産生抑制組成物の応用＞
サイクロデキストランは、熱、酸、アルカリに対して安定であるため、本発明のメチルメルカプタン及び／又は硫化水素産生抑制組成物と同様の配合条件で、犬又は猫用の口臭抑制剤に応用できる。すなわち、本発明は、メチルメルカプタン及び／又は硫化水素産生抑制組成物を含有する犬又は猫用の口臭抑制剤をも提供する。

本試験では、犬及び猫の代表的な歯周病原菌であるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ（Ｐ．ｇｕｌａｅ）に対するＣＩの殺菌作用、口臭軽減効果、及び歯周病菌によって誘導された炎症に対する抗炎症作用を確認した。対照として、ヒトの代表的な歯周病原菌であるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）についても同様の確認を行った。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるもので
はない。

＜試験方法＞

〔試験１〕ＣＩのＰ．ｇｕｌａｅに対する殺菌作用
歯周病原性細菌Ｐ．ｇｕｌａｅ及びに着目し、ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ（少なくともＣＩとデキストランとを含有し、ＣＩ含有量が１３％以上，日新製糖株式会社）共培養下での増殖抑制効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで調査した。Ｐ．ｇｕｌａｅ菌は嫌気性菌用ヒツジ血液寒天培地（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に播種して嫌気条件下で３日間培養した後、ウマ溶血液加ブルセラブロス液体培地（極東製薬工業株式会社）にて濁度が１．０となるように調整した。Ｐ．ｇｕｌａｅ懸濁液にＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘを０．０１～２．５％の割合で混合し、１０分間、１時間、４時間及び２４時間，３７℃、嫌気条件下で培養した後の生菌活性をＢａｃＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（プロメガ）を用いて測定した。

対照として、Ｐ．ｇｕｌａｅをＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに置き換えた試験も行った。

〔試験２〕ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘによるＰ．ｇｕｌａｅのバイオフィルム形成阻害作用
Ｐ．ｇｕｌａｅ菌を含む歯周病菌は、歯に付着し複数の菌同士が集合することによってバイオフィルムを形成する。細菌の塊である歯垢もバイオフィルムの一種で、バイオフィルムが形成されることによって、抗菌薬を含む外的な治療に対して抵抗力を持つことになる。本試験では、Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＤＯＪＩＮＤＯ）とＰ． ｇｕｌａｅ菌懸濁液を用いて、ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ（０．０３９％～５．０００％）共培養下でのバイオフィルム形成能を調査した。

〔試験１〕で調製したＰ．ｇｕｌａｅ菌液２０μＬにＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ混合菌液１８０μＬを添加し、ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ０．０３９％～５．０００％となるように混合した。９６ｗｅｌｌプレートに各濃度８ｗｅｌｌとなるように２００μＬを添加し、９６－ｐｅｇ Ｌｉｄを被せて３７℃インキュベーター内で遮光嫌気条件下にて２４時間培養した。２４時間後に菌を含まないＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ混合培養液２００μＬを別の９６ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間培養後のプレートから９６－ｐｅｇ Ｌｉｄを移して被せ、３７℃インキュベーター内にて遮光嫌気条件下でさらに７２時間培養した。７２時間後に９６－ｐｅｇ Ｌｉｄを生理食塩水で２回洗浄後、クリスタルバイオレット液で３０分間染色し、生理食塩水で再度洗浄した後にエタノールで染色液を抽出し、抽出した液の５９０ｎｍ吸光度をプレートリーダーで測定した。同じ条件の検査を２回繰り返し、再現性を確認した。

対照として、Ｐ．ｇｕｌａｅをＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに置き換えた試験も行った。

〔試験３〕ハイドロキシアパタイトディスクに対するＰ．ｇｕｌａｅ及びそのバイオフィルムの電子顕微鏡観察
〔試験２〕で確認したＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘのバイオフィルム形成阻害作用を実際の歯の成分と同様のハイドロキシアパタイトディスクを用いて走査型電子顕微鏡により確認した。歯周病菌はＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘと結合することで毒素の排出や活性が阻害されている可能性が示唆される。本試験では、Ｐ．ｇｕｌａｅ菌と各ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘの結合能を走査型電子顕微鏡により調査した。〔試験２〕と同様の方法で培養したＰ．ｇｕｌａｅ菌を終濃度が５％となるように培養液に懸濁したＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ（１ｍＬ）と混合し、２４時間１２ｗｅｌｌプレート内でハイドロキシアパタイトディスクと共培養した後、菌を含まないＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ混合培養液に置き換え、さらに７２時間培養後のハイドロキシアパタイトの歯周病菌及びバイオフィルムを走査型電子顕微鏡で観察した。

〔試験４〕Ｐ．ｇｕｌａｅによるマウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）の炎症性サイトカイン産生に及ぼすＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘの効果
低及び高濃度ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘにより処理したＰ．ｇｕｌａｅによるマウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）から産生される炎症性サイトカイン（ＩＬ－６）量をＥＬＩＳＡ法により測定した。

ＲＡＷ２６４．７細胞は１０％牛胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地で培養継代し、それぞれ１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ウェル培養プレートに播種し、コンフルエント状態になるまで３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。Ｐ．ｇｕｌａｅは、細胞への接種直前に１０％牛胎児血清及び抗生物質無添加の各培地に濁度が１．０となるように調整し、精製水ないしＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘを０．００４５～２．５％の割合で混合し、５分間静置した。細菌液を同量の１０％牛胎児血清及び抗生物質無添加のＤＭＥＭ培地と混合し、細胞に播種後２４時間の培養液中のＩＬ－６を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。

対照として、Ｐ．ｇｕｌａｅをＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに置き換えた試験も行った。

〔試験５〕統計検定
試験１から試験４の各試験項目について、コントロール群と各ベントナイト投与群間の統計学的有意差の有無を危険率５及び１％レベルで解析した。媒体対照群と被験物質群間でのデータについては、まずＢａｒｔｌｅｔｔの等分散検定を行った。この検定によって全用量群における分散が均一（ｐ＞０．０５）であるという判定が出た場合には、一元配置分散分析法を用いて群間の有意差の有無を調べた。その結果群間に有意差が認められたとき（ｐ≦０．０５）は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較法を実施して対照群と各投与群間における有意差の有無を判定した。Ｂａｒｔｌｅｔｔの等分散検定で各群の分散が等しくない（ｐ≦０．０５）という判定が出た場合は，Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓの検定法を用いて群間の有意差の有無を調べた。その結果群間に有意差が認められたとき（ｐ≦０．０５）は、Ｄｕｎｎｅｔｔ型のノンパラメトリックな多重比較法を用いて対照群と各投与群間における有意差の有無を判定した。

〔試験６〕ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ の口臭原因物質（メチルメルカプタン等）に対する消臭作用
まず、歯周病における口臭の主要原因物質であるメチルメルカプタンに着目し、メチルメルカプタンに対する ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ（少なくともＣＩとデキストランとを含有し、ＣＩ－７～ＣＩ－１２の含有量が約２０．４％、日新製糖株式会社；試験６についても同様）の直接的な消臭効果を調査した。メチルメルカプタン標準品（富士フィルム和光純薬株式会社）とＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘを０．６２５～２．５％の割合で混合して集気びんに静置し、３０分後のメチルメルカプタン濃度をオーラルクロマ（簡易ガスクロマトグラフィー、ＮＩＳＳＨＡエフアイエス株式会社）により評価した。１ｍＬシリンジを用いてガスを１ｍＬ採取し、オーラルクロマに添加することで測定した。次に、犬の歯周病の進行に大きく関与する歯周病原性細菌Ｐ．ｇｕｌａｅに着目し、ＣＩＤｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ共培養下での口臭物質産生抑制効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで調査した。Ｐ．ｇｕｌａｅ菌は嫌気性菌用ヒツジ血液寒天培地（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に播種して嫌気条件下で３日間培養した後、ウマ溶血液加ブルセラブロス液体培地（極東製薬工業株式会社）にて濁度が１．０となるように調整した。Ｐ．ｇｕｌａｅ菌懸濁液にＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ を０．６２５～２．５％の割合で混合し、２４時間３７℃、嫌気条件下で培養した後のメチルメルカプタンおよび硫化水素の産生量をオーラルクロマを用いて測定した

〔試験７〕ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘのＰ．ｇｕｌａｅ菌による不溶性グルカン産生阻害作用調査
Ｐ．ｇｕｌａｅ菌を含む歯周病菌は、歯に付着し複数の菌同士が集合することによってバイオフィルムを形成する。先行研究にてＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘが濃度依存的にＰ．ｇｕｌａｅ菌によるバイオフィルム形成を阻害する事がわかっている。バイオフィルムは糖からグルコシルトランスフェラーゼ－Ｉ（ＧＴＦ）等により生成される不溶性グルカン（ムタン）によってバイオフィルムが構築される。本実験では、バイオフィルムの主要な構成要素である不溶性グルカン生成に及ぼすＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘの効果を検証した。ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ（０．６２５～２．５％）共培養下でＰ．ｇｕｌａｅ菌液とブドウ糖（２ｇ／Ｌ）を、３７℃インキュベーター内、遮光嫌気条件下で７２時間培養し、遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１０分）と滅菌蒸留水ないし冷７０％エタノールによる洗浄を繰り返す。１Ｍ ＮａＯＨで２時間培養する事で得られた不溶性グルカンをフェノール硫酸法により定量した。標準糖にはグルコースを用いた。

〔試験８〕統計検定
試験６及び試験７の各試験項目について、コントロール群とＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ投与群間の統計学的有意差の有無を危険率５％及び１％レベルで解析した。一元配置分散分析法を用いて群間の有意差の有無を調べた。その結果群間に有意差が認められたとき（ｐ≦０．０５）は，Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較法を実施して対照群と各投与群間における有意差の有無を判定した。

＜結果＞
〔試験１〕ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘのＰ．ｇｕｌａｅに対する殺菌作用
試験１の結果を図３に示す。ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘの混合によるＰ．ｇｕｌａｅの殺菌効果は認められなかった。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓについても同様に、殺菌効果は認められなかった。

Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの培養後１時間において軽度な細菌数の減少は認められたが、他の時間には影響がなく、減少も非常に軽微であったため殺菌効果はないと判断した。そのほかの時間軸で統計学的に有意な増加がみられるポイントも散見されたが、いずれもばらつきが大きく生菌数には影響がないことが示唆された。

〔試験２〕ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘによるＰ．ｇｕｌａｅのバイオフィルム形成阻害作用
試験２の結果を図４に示す。Ｐ．ｇｕｌａｅ及びＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（対照）いずれの歯周病菌も２．５％以上でコントロールと比較して有意なバイオフィルムの形成阻害が認められたが、その効果はＰ．ｇｕｌａｅでより顕著であった。いずれの実験においても５％濃度ではバイオフィルムの形成がコントロール（ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ不含有）と比較して著しく抑えられていた。

〔試験３〕ハイドロキシアパタイトディスクに対するＰ．ｇｕｌａｅ及びそのバイオフィルムの電子顕微鏡観察
バイオフィルム形成能評価と同様のスケジュールにてハイドロキシアパタイトディスク上でＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ５％とＰ．ｇｕｌａｅ菌を共培養した。図５は、コントロールの観察結果であり、図６は、ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ５％のときの観察結果である。図５及び図６から、ＣＩ－ＤｅｘｔｒａｎによるＰ．ｇｕｌａｅ菌のバイオフィルム形成阻害が確認された。

〔試験４〕Ｐ．ｇｕｌａｅによるマウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）の炎症性サイトカイン産生に及ぼすＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘの効果
試験４の結果を図７に示す。事前にＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘで処理したＰ．ｇｕｌａｅ菌によるマクロファージ細胞から産生される炎症性サイトカイン（ＩＬ－６）量を測定することで、ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘが抗炎症に及ぼす影響を調査した。菌無処置群（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）と比較して培養液にＰ．ｇｕｌａｅ菌のみを添加した群では、ＩＬ－６産生量が有意に増加する一方で、その産生量の増加はＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎｍｉｘ処理により、濃度依存的に有意に減少した。

培養液にＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ菌のみを添加した群においても、ＩＬ－６産生量が有意に増加した。そして、ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ処理を行っても、サイトカイン産生抑制効果は認められなかった。

これは、サイクロデキストラン及びその誘導体がＰ．ｇｕｌａｅ由来のサイトカイン産生量を特異的に抑制できることを示唆するといえる。歯周病菌Ｐ．ｇｕｌａｅは、サイクロデキストラン及びその誘導体と結合することで毒素の排出や活性が特異的に阻害されるものと推測される。

〔試験６〕ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘの口臭原因物質（メチルメルカプタン等）に対する消臭作用
図８は、〔試験６〕ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘの口臭原因物質（メチルメルカプタン等）に対する消臭作用の結果である。ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘの混合によるメチルメルカプタンに対する直接的な消臭作用は認められなかった。一方、Ｐ．ｇｕｌａｅとＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘを共培養する事でメチルメルカプタンおよび硫化水素の産生量は濃度依存的に減少し、メチルメルカプタン濃度は１．２５％および２．５％、硫化水素は２．５％濃度のＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘにより有意に産生が阻害された。

〔試験７〕ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘのＰ．ｇｕｌａｅ菌による不溶性グルカン産生阻害作用調査
ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘを０．６２５％～２．５％濃度でＰ．ｇｕｌａｅ菌と共培養した時の不溶性グルカン形成能評価結果を図９に示す。不溶性グルカン（ムタン）の産生量はＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘの濃度依存的に減少し、１．２５％および２．５％濃度ではコントロールと比較して有意な減少が認められた。

＜考察＞
本試験では、犬及び猫の代表的な歯周病原菌であるＰ．ｇｕｌａｅに対するＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘの殺菌作用、バイオフィルム形成能、及びＰ．ｇｕｌａｅによって誘導された炎症反応に対する抗炎症作用について調査を行った。

歯周病菌液とＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘを混合培養した場合、曝露後１０分～２４時間で殺菌作用が認められなかった。

次に、ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘが歯周病菌からのバイオフィルム形成に及ぼす影響を調査した。結果、Ｐ．ｇｕｌａｅ濃度が２．５％以上でコントロールと比較して有意なバイオフィルム形成阻害が認められ、５％濃度ではバイオフィルム形成がほぼ認められなかった。また、その抑制効果はＰ．ｇｕｌａｅの方がＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに比べて大きかった。

また、５％ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘによるＰ．ｇｕｌａｅ菌の増殖抑制及びバイオフィルム形成阻害作用はハイドロキシアパタイトディスクを用いた電子顕微鏡観察でも顕著に認められた。

また、ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘが、口腔内の炎症に主体的に関与するマクロファージ細胞から産生される炎症性サイトカイン量にも及んでいるかを確認した。結果、歯肉炎や歯周炎、歯の融解に関連するＰ．ｇｕｌａｅにより誘発されるＩＬ－６産生がＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ曝露により有意に減少していた。一方で、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓにより誘発されるサイトカイン産生には効果が認められなかった。

サイクロデキストランはＰ．ｇｕｌａｅおよびＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓによるグルカン形成を有意に阻害する事により、バイオフィルム形成、その後の歯垢形成を阻害する可能性が示唆された。また、歯周病菌の定着を防ぐことで口臭抑制や炎症の進行を抑制する効果も期待できることから、サイクロデキストランは人間および小動物の歯周病ケアに有用であると考えられる。

Claims (2)

1. サイクロデキストラン、並びにバチルス属の微生物の培養液及び／又は環状イソマルト糖合成酵素の反応液から検出されるサイクロデキストラン誘導体から選択される少なくとも１種以上の化合物を０．０１％以上含有するＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来サイトカイン産生抑制組成物。
2. 請求項１に記載の抑制組成物を含有する犬又は猫用抗炎症剤。