JP7555732B2 - 細胞計測方法及び細胞計測装置 - Google Patents

Description

本発明は、生細胞と死細胞をそれぞれ計測する細胞計測方法及び細胞計測装置に関するものである。

従来、細胞の生死を見分けてそれぞれの細胞数を計測する装置としては、特許文献１に示すように、トリパンブルー等の試薬で染色した細胞に対して、特定の波長の光を照射し、生細胞と死細胞を顕微鏡画像によりカウントするものが考えられている。

しかしながら、顕微鏡画像の場合、一度に計測する細胞数が例えば１００～３００個と少ないため統計誤差が大きく、計測細胞数を増やす場合には計測に時間がかかってしまうという問題がある。

特許第５９０１６４４号公報

そこで、本発明は上記の問題点を解決すべくなされたものであり、多数の生細胞及び死細胞を簡単且つ正確に計測することをその主たる課題とするものである。

すなわち、本発明に係る細胞計測方法は、生細胞及び死細胞を含むサンプルに染色試薬を添加して前記生細胞又は前記死細胞の一方を染色し、染色したサンプルをフローセルに流し、当該フローセルに光を照射して前記フローセルを透過した透過光を検出し、検出した透過光強度に基づいて、前記生細胞及び前記死細胞を計測することを特徴とする。

この細胞計測方法であれば、生細胞及び死細胞の一方を染色したサンプルをフローセルに流し、当該フローセルに光を照射して得られる透過光強度に基づいて生細胞及び死細胞の個数を計測するので、多数の生細胞及び死細胞を簡単且つ正確に計測できるようになる。

生細胞のサイズ及び死細胞のサイズによっては、透過光強度が同等となってしまう場合がある。つまり、染色されていない細胞（例えば生細胞）のサイズが大きく、当該生細胞による散乱光量や吸収量が大きくなることにより透過光強度が小さくなっている場合と、染色された細胞（例えば死細胞）のサイズが小さく、かつ、生細胞による散乱光量や吸収量は大きくないが、染色による吸収量が大きくなることにより透過光強度が小さくなっている場合とで区別が付き難い。
この問題を好適に解決するためには、前記フローセルを流れる前記サンプルの前記生細胞及び前記死細胞の体積情報を計測することが望ましい。
このように生細胞及び死細胞の体積情報を用いることによって透過光強度では区別が付き難い生細胞及び死細胞を容易に区別（分画）できるようになる。

生細胞及び死細胞の体積情報を正確に計測するためには、電気抵抗法（電気的抵抗法又は電気的検知帯法ともいう。）により前記生細胞及び前記死細胞の体積情報を計測することが望ましい。

その他、前記フローセルに光を照射して小角散乱光を検出することにより、前記生細胞及び前記死細胞の体積情報を計測することもできる。このようなものであれば、透過光強度を検出する際にフローセルに照射される光を用いて小角散乱光を検出することができるので、各細胞の透過光強度及び体積情報を同時に計測することができる。

検出された透過光強度と計測された体積情報とを一方を縦軸及び他方を横軸とするグラフ上にプロットすることが望ましい。このようなものであれば、生細胞及び死細胞の分布を視覚的に認識することができ、細胞全体としてどのような状況や時期にあるかを推定することができる。

低コストで染色するためには、前記染色工程は、トリパンブルー試薬により前記死細胞を染色することが望ましい。

また、本発明に係る細胞計測装置は、生細胞又は死細胞の一方が染色試薬により染色されたサンプルが流れるフローセルと、前記フローセルに光を照射する光照射部と、前記フローセルを透過した透過光を検出する光検出部と、前記光検出部により検出された透過光強度に基づいて、前記生細胞及び前記死細胞を計測する細胞計測部とを備えることを特徴とする。

前記フローセルを流れる前記サンプルの前記生細胞及び前記死細胞の体積情報を計測する体積情報計測部をさらに備えることが望ましい。

本発明の細胞計測装置は、前記透過光強度と前記体積情報計測部により得られた体積情報とを一方を縦軸及び他方を横軸とするグラフ上に表示するグラフ表示部をさらに備えることが望ましい。このようなものであれば、生細胞及び死細胞の分布を視覚的に認識することができ、細胞全体としてどのような状況や時期にあるかを推定することができる。

グラフ上において生細胞及び死細胞を見分けやすくするためには、前記グラフ表示部は、前記グラフ上に、生細胞及び死細胞を分画するための分画ラインを表示することが望ましい。

例えばトリパンブルー試薬により死細胞を染色する場合には、死にかけの細胞は、死細胞ほどは染色されないが、生細胞よりは染色されることになる。このため、死にかけの細胞を判別する場合には、生細胞より透過光強度が低く、死細胞より透過光強度が高い範囲で透過光強度を設定することにより、死にかけの細胞を判別することができる。このため、前記細胞計測部は、前記生細胞及び前記死細胞に加えて、死にかけの細胞の個数を計測することができる。そして、前記グラフ表示部は、前記グラフ上に、生細胞、死細胞及び死にかけの細胞を分画するための分画ラインを表示することもできる。

以上に述べた本発明によれば、生細胞及び死細胞の一方を染色したサンプルをフローセルに流し、当該フローセルに光を照射して得られる透過光強度に基づいて生細胞及び死細胞の個数を計測するので、多数の生細胞及び死細胞を簡単且つ正確に計測できるようになる。

本発明の一実施形態に係る細胞計測装置の全体模式図である。 同実施形態の細胞計測に関する要部構成を示す模式図である。 同実施形態の生細胞及び死細胞を分画したグラフを示す図である。 サンプルを染色しない場合のグラフと染色した場合のグラフを示す図である。 同実施形態の生細胞、死細胞及び死にかけの細胞を分画したグラフを示す図である。 同実施形態の細胞計測方法の手順を示す図である。 変形実施形態に係る細胞計測に関する要部構成を示す図である。

以下、本発明の一実施形態に係る細胞計測装置１００について、図面を参照しながら説明する。

＜装置構成＞
本実施形態の細胞計測装置１００は、例えば生体試料などのサンプルに含まれる生細胞及び死細胞を計測するものである。この細胞計測装置１００には、例えばトリパンブルー試薬（ＴＢ試薬）などの染色試薬により死細胞を染色したサンプルを用いて、生細胞及び死細胞を計測する。

具体的に細胞計測装置１００は、図１に示すように、死細胞が染色試薬により染色されたサンプルが流れるフローセル２と、フローセル２に光を照射する光照射部３と、フローセル２を透過した透過光を検出する光検出部４と、光検出部４により検出された透過光強度に基づいて、生細胞及び死細胞を計測する細胞計測部５とを備えている。

フローセル２は、サンプルに含まれる細胞を１つ１つ整列させて流すことができるものであり、図２に示すように、細胞が１つ１つに分かれた状態で追加するアパーチャ２Ａを有する内管２１と、内管２１から流出した細胞を一列に整列した状態で搬送するシース液を流す外管２２とを有している。また、フローセル２は、シース液により搬送されるサンプルに光を照射するための光照射窓Ｗ１と、サンプルを透過した光を検出するための光検出窓Ｗ２とを有している。このフローセル２を用いることで、多数の細胞を正確に測定することができる。

光照射部３は、フローセル２の光照射窓Ｗ１を介して細胞を含むサンプルに光を照射するものであり、アパーチャ２Ａを通過したサンプルの流路上に照射位置Ｘが設定されている。この照射位置Ｘは、アパーチャ２Ａで液が流れる方向の直後に設定されている。具体的に光照射部３は、例えばＬＥＤ（波長６４０ｎｍ）などの光源３１と、当該光源３１の光を前記照射位置Ｘに集光するためのレンズ等の光学系３２とを有している。なお、光源３１は、染色試薬の吸収波長帯域をカバーする白色光又は染色試薬の吸収波長帯域の光を照射するものであれば良い。

光検出部４は、フローセル２の光検出窓Ｗ２を介して細胞を含むサンプルを透過した光を検出するものである。具体的に光検出部４は、透過光を検出する例えばフォトダイオード等の光検出器４１と、当該光検出器４１に透過光を集光するためのレンズ等の光学系４２とを有している。

また、本実施形態の細胞計測装置１００は、図１及び図２に示すように、フローセル２を流れるサンプルの生細胞及び死細胞の体積情報を計測する体積情報計測部６をさらに備えている。

この体積情報計測部６は、電気抵抗法に基づいて細胞の体積情報を計測するものであり、アパーチャ２Ａの上流側に設けられた第１電極６１と、アパーチャ２Ａの下流側に設けられた第２電極６２と、第１電極６１及び第２電極６２間の電気抵抗（インピーダンス）の変化を検出して、アパーチャ２Ａを通過した細胞の数及び体積を算出する体積情報演算部６３とを備えている。なお、本実施形態では、第１電極６１が内管２１内に設けられたノズル内に設置されており、当該ノズルの開口から流れ出たサンプルも内管２１内を流れるシース液によって前記内管２１のアパーチャ２Ａに搬送されるように構成されている。

第１電極６１及び第２電極６２には、例えば定電流電源６４が接続されており、アパーチャ２Ａを細胞が通過する際に生じるインピーダンスの変化に応じて印加電圧がパルス状（パルス電圧）に変化する。体積情報演算部６３は、このパルス電圧をパルス増幅器６５を経由して、そのパルス電圧の数を計数（カウント）することによって、細胞の数を算出し、パルス電圧の高さ又は幅もしくはその組みあわせによって細胞の体積情報を算出する。なお、体積情報演算部６３は、例えば細胞計測装置１００が有する情報処理装置ＣＯＭによりその機能が発揮される。情報処理装置ＣＯＭは、ＣＰＵ、内部メモリ、入出力インターフェイス、ＡＤ変換器等を有する専用乃至汎用のコンピュータである。

細胞計測部５は、情報処理装置ＣＯＭによりその機能が発揮されるものであり、光検出器４１により得られた透過光強度の変化量（又は透過光の消光度）に基づいて、生細胞の個数及び死細胞の個数を計測するものである。透過光強度に基づいて生細胞及び死細胞の判別するためには、透過光強度の変化量の関する閾値を予め設定しておき、透過光強度の変化量が閾値以上の場合には、死細胞であると判別し、透過光強度の変化量が閾値未満の場合には、生細胞であると判別することができる。

ここで、本実施形態の細胞計測部５は、光検出器４１により得られた透過光強度の変化量に加えて、体積情報計測部６により得られた体積情報に基づいて、生細胞の個数及び死細胞の個数を計測するものである。細胞計測部５は、例えば、生細胞の個数及び死細胞の個数だけでなく、細胞の総個数に対する生細胞の割合や死細胞の割合、生死割合（生細胞と死細胞との比）等を算出することもできる。透過光強度及び体積情報に基づいて生細胞及び死細胞の判別するためには、生細胞及び死細胞を判別するための透過光強度の変化量及び体積情報の関係式（以下に説明する分画ラインＬ１に相当）を予め設定しておき、検出された透過光強度の変化量及び検出された体積情報と前記関係式とを比較することにより、生細胞であるか、死細胞であるかを判別する。

なお、ある１つの細胞がアパーチャを通過する時にインピーダンス測定（電気抵抗法）が行なわれ、次いで、その粒子が照射点を通過する時に透過光強度の測定が行われることから、１つの細胞に関するこれら２つの測定結果の間には、タイムラグ（時間的なずれ）が生じる。このため、例えば、アパーチャ及び照射点の距離、及びサンプルの流量やシース液の流量などを用いて、タイムラグを補正して、１つの細胞に関する体積情報と透過光強度の変化量とを対応付ける必要がある。

そして、細胞計測装置１００は、図１及び図３に示すように、光検出部４により検出された透過光強度の変化量と体積情報計測部６により得られた体積情報とを一方を縦軸及び他方を横軸とするグラフ上に表示するグラフ表示部７を有している。このグラフ表示部７も情報処理装置ＣＯＭによりその機能が発揮される。

グラフ表示部７により表示されるグラフにおいて、図３に示すように、透過光強度の変化量が大きく、体積情報が小さい領域は、計測された細胞のうち主として死細胞に分類される領域であり、透過光強度の変化量が小さく、体積情報が大きい領域は、計測された細胞のうち主として生細胞に分類される領域となる。

そして、グラフ表示部７は、グラフ上に、生細胞及び死細胞を分画するための分画ラインＬ１を表示することができる。図３に示す分画ラインＬ１は、直線であるが、曲線又は閉曲線であっても良い。

なお、サンプルを染色しない場合のグラフと染色した場合のグラフとを図４に示す。図４に示すように、染色しない場合には、ほぼすべての細胞が分画ラインＬ１よりも下側に位置しており、生細胞と死細胞とを判別できないことが分かる。

さらに、グラフ表示部７は、図５に示すように、グラフ上に、生細胞、死細胞及び死にかけの細胞を分画するための分画ラインＬ２、Ｌ３を表示することもできる。図５において、分画ラインＬ２は、死細胞と死にかけの細胞とを分画するラインであり、分画ラインＬ３は、死にかけの細胞と生細胞とを分画するラインである。

＜細胞計測方法＞
次に、本実施形態の細胞計測装置１００を用いて自動的に行われる細胞計測方法について図６を参照して説明する。なお、この細胞計測方法は、上記の細胞計測装置１００を用いたものに限られず、その他の細胞計測装置を用いて行っても良い。

まず、生細胞及び死細胞を含むサンプルにトリパンブルー試薬などの染色試薬を添加して、死細胞を染色する（ステップＳ１）。

染色したサンプルを細胞計測装置１００にセットして、細胞計測を開始する。計測を開始すると、染色したサンプルがフローセル２を流れる（ステップＳ２）。そして、体積情報計測部６により、フローセル２を流れるサンプルの生細胞及び死細胞の体積情報が計測される（ステップＳ３）。

また、フローセル２を透過した透過光が光検出器４１により検出される（ステップＳ４）。

そして、細胞計測部５は、光検出器４１により得られた透過光強度の変化量及び体積情報計測部６により得られた体積情報に基づいて、生細胞の個数及び死細胞の個数を計測する（ステップＳ５）。

また、各細胞の透過光強度の変化量と体積情報とを、一方の軸（ここでは縦軸）を透過光強度とし、他方の軸（ここでは横軸）を体積情報とした２次元グラフに、プロットする（ステップＳ６）。これにより、グラフ上において、生細胞及び死細胞の２次元分布が分かる。また、このグラフ上に分画ラインＬ１等を表示して、生細胞及び死細胞の分画を行うことができる。

＜本実施形態の効果＞
このように構成した本実施形態の細胞計測装置１００によれば、生細胞及び死細胞の一方を染色したサンプルをフローセル２に流し、当該フローセル２に光を照射して得られる透過光強度の変化量に基づいて生細胞及び死細胞の個数を計測するので、多数の生細胞及び死細胞を簡単且つ正確に計測できるようになる。ここで、トリパンブルー試薬を用いて死細胞を染色しているので、低コストで生細胞及び死細胞を計測することができる。

また、体積情報計測部６により生細胞及び死細胞の体積情報を計測しているので、透過光強度の変化量では区別が付き難い生細胞及び死細胞を容易に区別（分画）できるようになる。特に、グラフ表示部７が透過光強度の変化量と体積情報とを一方を縦軸及び他方を横軸とするグラフ上にプロットするので、生細胞及び死細胞の分布を視覚的に認識することができ、細胞全体としてどのような状況や時期にあるかを推定することができる。

＜その他の実施形態＞
なお、本発明は前記実施形態に限られるものではない。

例えば、前記実施形態では電気抵抗法に基づいて体積情報を計測しているが、図７に示すように、フローセル２に光を照射して小角散乱光を検出することにより、生細胞及び死細胞の体積情報を計測しても良い。具体的には、前記実施形態の光検出器４１とは別に、小角散乱光を検出する第２の光検出部８を有する構成となる。このとき、第２の光検出部８は、小角散乱光を検出する第２の光検出器８１と、小角散乱光を第２の光検出器８１に集光するレンズ等の光学系８２とを有する。そして、小角散乱光強度が大きいほど細胞が大きく（体積が大きい）、小角散乱光強度が小さいほど細胞が小さい（体積が小さい）ことから、小角散乱光強度から体積情報を取得することができる。

また、前記実施形態では、透過光強度の変化量及び体積情報の両方を用いて、生細胞及び死細胞を分画するものであったが、体積情報を用いることなく、透過光強度の変化量により生細胞及び死細胞を分画するように構成しても良い。この場合、透過光強度の変化量が所定の閾値以上の場合には死細胞であると判別し、所定の閾値未満の場合には生細胞であると判別することが考えられる。

前記実施形態では、内管２１に対する外管２２を流れるシース液と、ノズルに対する内管２１を流れるシース液とによるダブルシース方式で細胞を照射位置Ｘに送り出すものであったが、図７に示すように、シングルシース方式（例えば内管２１に対する外管２２を流れるシース液のみ、又は、ノズルに対する内管２１を流れるシース液のみ）で細胞を照射位置Ｘに送り出すものとしても良い。

その他、本発明の趣旨に反しない限りにおいて様々な実施形態の変形や組み合わせを行っても構わない。

１００・・・細胞計測装置
２・・・フローセル
３・・・光照射部
４・・・光検出部
５・・・細胞計測部
６・・・体積情報計測部
７・・・グラフ表示部
Ｌ１・・・分画ライン（死細胞／生細胞）
Ｌ２・・・分画ライン（死細胞／死にかけの細胞）
Ｌ３・・・分画ライン（死にかけの細胞／生細胞）

Claims (9)

1. 生細胞及び死細胞を含むサンプルに染色試薬を添加して前記生細胞又は前記死細胞の一方を染色し、
   染色したサンプルをフローセルに流し、当該フローセルに光を照射して前記フローセルを透過した透過光を検出し、
   前記フローセルを流れる前記サンプルの前記生細胞及び前記死細胞の体積情報を計測し、
   検出した透過光強度と計測した体積情報とに基づいて、前記生細胞及び前記死細胞を計測する、細胞計測方法。
2. 検出された前記透過光強度と計測された前記体積情報とを一方を縦軸及び他方を横軸とするグラフ上にプロットする、請求項１に記載の細胞計測方法。
3. 電気抵抗法により前記生細胞及び前記死細胞の体積情報を計測する、請求項１又は２に記載の細胞計測方法。
4. 前記フローセルに光を照射して小角散乱光を検出することにより、前記生細胞及び前記死細胞の体積情報を計測する、請求項３に記載の細胞計測方法。
5. トリパンブルー試薬により前記サンプルに含まれる死細胞を染色する、請求項１乃至４の何れか一項に記載の細胞計測方法。
6. 生細胞又は死細胞の一方が染色試薬により染色されたサンプルが流れるフローセルと、
   前記フローセルに光を照射する光照射部と、
   前記フローセルを透過した透過光を検出する光検出部と、
   前記フローセルを流れる前記サンプルの前記生細胞及び前記死細胞の体積情報を計測する体積情報計測部と、
   前記光検出部により検出された透過光強度と前記体積情報計測部により計測された体積情報とに基づいて、前記生細胞及び前記死細胞を計測する細胞計測部とを備える、細胞計測装置。
7. 前記透過光強度と前記体積情報計測部により得られた体積情報とを一方を縦軸及び他方を横軸とするグラフ上に表示するグラフ表示部をさらに備える、請求項６に記載の細胞計測装置。
8. 前記グラフ表示部は、前記グラフ上に、生細胞及び死細胞を分画するための分画ラインを表示する、請求項７に記載の細胞計測装置。
9. 前記グラフ表示部は、前記グラフ上に、生細胞、死細胞及び死にかけの細胞を分画するための分画ラインを表示する、請求項７記載の細胞計測装置。