JP7455418B2 - 広域溶存酸素および有機炭素耐性を有する脱窒菌剤とその使用、脱窒バイオフィルムとその使用。 - Google Patents
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Description
本発明は、環境微生物学の技術分野に関し、具体的には、バチルス・アミロリクファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ｙｅｌ１４およびフェーカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＣＨＯ６の選別・育種、ならびにこれらの２つの微生物からなる細菌システムとその水域脱窒における用途に関する。
急速な工業化・都市化に伴い、水域の窒素汚染問題はますます深刻化している。窒素循環は多くの物質循環過程と密接に関係しており、水域の富栄養化の程度を決定する重要な要因であるため、汚染水域からの脱窒の効率化は大きな関心事である。生物学的脱窒技術は、その経済的・環境的な利点から、現在では水質汚染管理における一般的な手法となっている。従来の生物学的脱窒プロセスでは、好気の条件下で独立栄養細菌のアンモニア酸化細菌と硝酸化細菌がアンモニアを硝酸塩に酸化し、無酸素条件下で脱窒細菌が硝酸塩を窒素ガスに還元して脱窒を実現する。しかし、汚染水域の溶存酸素濃度は通常大きく変動し、微生物の機能活動を阻害するさまざまな有害汚染物質が含まれていることが多いため、水域からアンモニアや硝酸性窒素を効果的に除去することは困難である。水域からの脱窒は、水質汚濁防止の焦点と困難な課題となっている。
研究の進みに伴い、従属栄養性アンモニア酸化細菌、嫌気性アンモニア酸化細菌、好気性脱窒細菌など、さまざまな新規脱窒機能性微生物が発見された。これらの新しい脱窒機能性微生物は、一般的な解毒機能性微生物と比較して、汚染水域の処理において適用範囲が広く、実用性がより明らかである。従来のアンモニア酸化プロセスと比較して、従属栄養アンモニア酸化細菌は有機炭素源の存在下でアンモニア性窒素を亜硝酸性窒素に酸化することができるので、汚染水域によく見られる有機炭素源によるアンモニア酸化の阻害を克服でき、従来の脱窒プロセスと比べて、好気性脱窒細菌は高い溶存酸素条件で脱窒を実行できるので、従来の脱窒細菌が硝酸塩を窒素に還元するために無酸素状態である必要があるというデメリットを克服することができる。この２種類の機能性細菌を組み合わせることで、汚染水域の処理でよく見られる有機炭素源によるアンモニア酸化の阻害や溶存酸素による脱窒プロセスの阻害を克服し、より柔軟で効率的な全窒素除去を達成することが期待されている。しかし、現在までに従属栄養性アンモニア酸化細菌と好気性脱窒細菌はほとんど得られておらず、従属栄養性アンモニア酸化と好気性脱窒の両方の機能を兼ね備えた微生物はまだ報告されていない。
本発明は、汚染水域中の有機炭素と溶存酸素が生物学的脱窒活性を阻害する水汚染処理課題を解決し、溶存酸素および有機炭素耐性を有する脱窒機能性菌剤を提供して、水域中のアンモニア性窒素と全窒素を効率的に除去することができる。
本発明は、まず従属栄養アンモニア酸化機能と好気性脱窒機能を兼ねるバチルス・アミロリクファシエンスｙｅｌ１４、および嫌気性と好気性の条件下で脱窒機能を有するフェーカリゲネスＣＨＯ６を分離する。
本発明は、これらの２つの機能性菌を利用して、嫌気性と好気性の条件下で汚染水域中のアンモニア性窒素と全窒素を効率的に除去できる機能性菌剤を開発した。
本発明は、開発した脱窒菌剤の廃棄物浸出液のような高濃度アンモニア性窒素廃水に対する脱窒能力を検証した。
本発明で分離したバチルス・アミロリクファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ｙｅｌ１４およびフェーカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＣＨＯ６は、２０２１年５月２７日に広東省微生物菌種保存センター（ＣＧＭＣＣ）に保存され、住所：広東省広州市先烈中路１００号大院５９ビルディング５階、郵便番号：５１００７０、保存番号はそれぞれ：ＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６１６９９とＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６１７００である。
本発明で提供されるフェーカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＣＨＯ６は、広東省広州市石井河の水域沈殿物から由来し、分離方法としては、菌群ＳＢ８を単細胞スクリーナーで可視化して分離・選別して得られた単細胞を、液体培地に接種して２０日間培養したものであり、培地成分：グルコース（１０ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ３（２．５２ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．５ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（１ｇ／Ｌ）、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．０６ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．０６ｇ／Ｌ）、Ｋ２ＳＯ４（３．４８ｇ／Ｌ）およびＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．０５ｇ／Ｌ）、溶媒は水であった。液体培地で増殖した菌液を採取し、上記培地の寒天の固形平板上で培養したところ、不規則な丸いコロニーができ、不透明で白色であり、好気性と嫌気性の環境下でも生存できる。本菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定によって、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ １３１１１と９９．４１％の類似性を有するため、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＣＨＯ６と命名された。
本発明で提供されたバチルス・アミロリクファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ｙｅｌ１４は、貴州省六盤水市の廃棄物プラスチックゴミ袋から分離され、増殖用の培地はポテト培地（ＰＤＢ,２４ｇ／Ｌ）であった。その形態学と生理学的特徴：本菌が３０℃、４８ ｈ培養した後、不規則な楕円形のコロニーができ、黄色みを帯びて不透明であり、コロニー表面に水滴が付着した。本菌は好気性、一部嫌気性の条件下でも生存でき、増殖ｐＨが６．５～８．５である。本菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列決定およびＢＬＡＳＴ分析によって、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＭＰＡ菌株と９９．７８％の類似性を有するため、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｙｅｌ１４と命名された。
本発明は、２つの菌株の通常培地での脱窒能力が検証され：
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＣＨＯ６をそれぞれＲ２Ａ（１２ｇ／Ｌ）+ＮＯ２ -（１７．５ ｍＭ）+ＮＨ４ +（３．５ ｍＭ）とＲ２Ａ（１２ｇ／Ｌ）+ＮＯ３ -（１６ ｍＭ）の培地に接種し、好気性培養（１８０ｒｐｍ、３０℃）と嫌気性培養（３０℃、９９．９９％ Ｎ２で満たされた嫌気性箱）を実行してその硝化能力、脱窒能力と窒素除去能力を検証した。その結果から分かるように、Ｒ２Ａ（１２ｇ／Ｌ）+ＮＯ２ -（１７．５ ｍＭ）+ＮＨ４ +（３．５ ｍＭ）培地で１０日間培養した後、菌株ＣＨＯ６の好気性脱窒能力と嫌気性脱窒能力が同等であり、約２５％（図２）であった。Ｒ２Ａ（１２ｇ／Ｌ）+ＮＯ３ -（１６ ｍＭ）培地での脱窒能力が最も顕著であり、好気性と嫌気性の条件下で、それぞれ６６％と７１％の脱窒能力が得られた（図２）。さらに窒素イオン含有化合物を分析すると、好気性と嫌気性の条件下でも、菌株ＣＨＯ６がＲ２Ａ（１２ｇ／Ｌ）+ＮＯ２ -（１７．５ ｍＭ）+ＮＨ４ +（３．５ ｍＭ）培地中のＮＯ２ -を脱窒作用により全部除去でき（図３中の＜１＞、＜２＞）、対照組と比較すると、ＮＨ４ +は顕著に変化しなかった。Ｒ２Ａ（１２ｇ／Ｌ）+ＮＯ３ -（１６ ｍＭ）培地で、菌株ＣＨＯ６は高い脱窒能力を有し、脱窒でほぼすべてのＮＯ３ -を除去することができる（図４中の＜１＞、＜２＞）。
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＣＨＯ６をそれぞれＲ２Ａ（１２ｇ／Ｌ）+ＮＯ２ -（１７．５ ｍＭ）+ＮＨ４ +（３．５ ｍＭ）とＲ２Ａ（１２ｇ／Ｌ）+ＮＯ３ -（１６ ｍＭ）の培地に接種し、好気性培養（１８０ｒｐｍ、３０℃）と嫌気性培養（３０℃、９９．９９％ Ｎ２で満たされた嫌気性箱）を実行してその硝化能力、脱窒能力と窒素除去能力を検証した。その結果から分かるように、Ｒ２Ａ（１２ｇ／Ｌ）+ＮＯ２ -（１７．５ ｍＭ）+ＮＨ４ +（３．５ ｍＭ）培地で１０日間培養した後、菌株ＣＨＯ６の好気性脱窒能力と嫌気性脱窒能力が同等であり、約２５％（図２）であった。Ｒ２Ａ（１２ｇ／Ｌ）+ＮＯ３ -（１６ ｍＭ）培地での脱窒能力が最も顕著であり、好気性と嫌気性の条件下で、それぞれ６６％と７１％の脱窒能力が得られた（図２）。さらに窒素イオン含有化合物を分析すると、好気性と嫌気性の条件下でも、菌株ＣＨＯ６がＲ２Ａ（１２ｇ／Ｌ）+ＮＯ２ -（１７．５ ｍＭ）+ＮＨ４ +（３．５ ｍＭ）培地中のＮＯ２ -を脱窒作用により全部除去でき（図３中の＜１＞、＜２＞）、対照組と比較すると、ＮＨ４ +は顕著に変化しなかった。Ｒ２Ａ（１２ｇ／Ｌ）+ＮＯ３ -（１６ ｍＭ）培地で、菌株ＣＨＯ６は高い脱窒能力を有し、脱窒でほぼすべてのＮＯ３ -を除去することができる（図４中の＜１＞、＜２＞）。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｙｅｌ１４をそれぞれＰＤＢ（２４ｇ／Ｌ）+ＮＯ２
-（１３．２ ｍＭ）+ＮＨ４
+（３．３ ｍＭ）とＰＤＢ（２４ｇ／Ｌ）+ＮＯ３
-（１１．８ ｍＭ）の培地に接種し、好気性培養（１８０ｒｐｍ、３０℃）と嫌気性培養（３０℃、９９．９９％ Ｎ２で満たされた嫌気性箱）を実行した。菌株ｙｅｌ１４はＰＤＢ（２４ｇ／Ｌ）+ＮＯ２
-（１３．２ ｍＭ）+ＮＨ４
+（３．３ ｍＭ）では好気性脱窒能力を持たず、嫌気性脱窒がわずか１１．４２％であった（図２）。同様に、菌株ｙｅｌ１４がＰＤＢ（２４ｇ／Ｌ）+ＮＯ３
-（１１．８ ｍＭ）培地で好気性脱窒能力を持たず、嫌気性脱窒能力がわずか７．３７％であった（図２）。菌株ｙｅｌ１４の脱窒能力が非常に低く、これは、体系中の窒素イオン含有化合物が窒素ガスに変換されず、イオン形式で変換することからである可能性がある。具体的には、菌株ｙｅｌ１４をＰＤＢ（２４ｇ／Ｌ）+ＮＯ２
-（１３．２ ｍＭ）+ＮＨ４
+（３．３ ｍＭ）で好気性培養するとき、培地に存在しないＮＯ３
-（１．２４８ ｍＭ）を生成でき（図３中の＜３＞）、嫌気性条件下で培養するとき、４７％のＮＨ４
+（図３中の＜６＞）をＮＯ３
-（０．４４７ ｍＭ）（図３中の＜４＞）とＮＯ２
-（２．６８３ ｍＭ）（図３中の＜５＞）に変換できる。ＰＤＢ（２４ｇ／Ｌ）+ＮＯ３
-（１１．８ ｍＭ）では、菌株ｙｅｌ１４の好気性脱窒能力が高く、９４．８％に達したが、嫌気性脱窒能力が非常に低く、大量のＮＯ２
-（２．９８ ｍＭ）が蓄積され（図４中の＜３＞、＜４＞）、これは、体系中の全窒素（ＴＮ）が除去されないからである可能性がある。
要約に、好気性または嫌気性の条件下で、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＣＨＯ６は高い脱窒能力（ＮＯ３
-とＮＯ２
-除去）を有するが、アンモニア酸化能力を持たない。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｙｅｌ１４は好気性の条件下で一定の脱窒能力（ＮＯ３
-除去）を有するが、嫌気性の条件下で、その脱窒能力が非常に低く、大量のＮＯ２
-が蓄積された。さらに、菌株ｙｅｌ１４は嫌気性の条件下で、４７％のＮＨ４
+をＮＯ２
-とＮＯ３
-に変換できる。したがって、菌株ＣＨＯ６とｙｅｌ１４を混和して培養し、菌株ｙｅｌ１４により廃棄物浸出液中のＮＨ４
+をＮＯ２
-とＮＯ３
-に変換した後、菌株ＣＨＯ６の脱窒作用によりＮ２に変換して、脱窒目的を達成する。
本発明はバチルス・アミロリクファシエンスｙｅｌ１４とフェーカリゲネスＣＨＯ６の廃棄物浸出液における好気性、嫌気性および室温静置培養のときの脱窒状況を検証した。
菌株ＣＨＯ６、ｙｅｌ１４とその１：１で複合したコロニーＣＨＯ６-ｙｅｌ１４をそれぞれ廃棄物浸出液（恵州廃棄物埋立地、成熟型、>１０年）に接種し、なんの栄養液も添加しなかった。その結果から分かるように、菌株ＣＨＯ６とｙｅｌ１４を単独で廃棄物浸出液に接種して培養する状況と比較すると、複合フローラＣＨＯ６-ｙｅｌ１４は好気性と嫌気性の条件下で、良好な脱窒効果を有し、それぞれ廃棄物浸出液中の４７０．５ ｍｇ／Ｌと７２４．８ ｍｇ／Ｌの全窒素を除去できる（図５中の＜１＞、＜３＞）。イオンクロマトグラフィーで測定したところ、複合したコロニーＣＨＯ６-ｙｅｌ１４は高アンモニア性窒素の廃棄物浸出液に対してより良好なアンモニア性窒素除去能力と適応能力を有し、好気性、室温静置と嫌気性の条件下でそれぞれ４４．４％、３７．５３％と３８．９５％のアンモニア性窒素除去率に達した（図６中の＜１＞、＜２＞、＜３＞）。
したがって、本発明の第１目的は、バチルス・アミロリクファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）とフェーカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）を含む広域溶存酸素および有機炭素耐性を有する脱窒菌剤を提供することである。
好ましくは、前記バチルス・アミロリクファシエンスはバチルス・アミロリクファシエンスｙｅｌ１４であり、保存番号：ＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６１６９９、前記フェーカリゲネスはフェーカリゲネスＣＨＯ６であり、保存番号：ＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６１７００である。
好ましくは、前記の脱窒菌剤は機能性担体をさらに含む。
本発明の第２目的は、脱窒バイオフィルムの作製における前記脱窒菌剤の用途を提供することである。
本発明の第３目的は、前記の脱窒菌剤を含有する脱窒バイオフィルムを提供することである。
本発明の第４目的は、水域脱窒における前記の脱窒菌剤または脱窒バイオフィルムの用途を提供することである。
好ましくは、好気性または嫌気性の条件下での水域中の窒素除去における前記の脱窒菌剤または脱窒バイオフィルムの用途。
好ましくは、前記水域中の窒素には、アンモニア性窒素ＮＨ４
+-Ｎ、硝酸性窒素ＮＯ３
--Ｎまたは亜硝酸性窒素ＮＯ２
--Ｎ中の１つ以上が含まれる。
本発明の第５目的は、汚水脱臭および／または廃棄物浸出液脱臭における前記の脱窒菌剤または脱窒バイオフィルムの用途を提供することである。
本発明の第６目的は、前記の脱窒菌剤を窒素含有廃水に直接投入し、または生化学反応器で前記の脱窒菌剤と窒素含有廃水を混合して処理する、水域脱窒方法を提供することである。好ましくは、前記の脱窒菌剤と一定量の機能性担体を混合した後窒素含有廃水を処理するための生化学反応器に投入する。
本発明は以下の有益な効果を有する。
本発明は、バチルス・アミロリクファシエンスｙｅｌ１４とフェーカリゲネスＣＨＯ６を用いて、嫌気性と好気性の条件下でも汚染水域中のアンモニア性窒素と全窒素を効率的に除去できる機能性菌剤を開発し、汚染水域中の溶存酸素および有機炭素による生物学的脱窒の阻害を効果的に克服することができる。本発明で開発した菌剤は嫌気性と好気性の条件下で廃棄物浸出液中のアンモニア性窒素と全窒素を効率的に除去でき、菌株ｙｅｌ１４とＣＨＯ６を単独で廃棄物浸出液に接種して培養する状況と比較すると、複合フローラＣＨＯ６-ｙｅｌ１４は好気性と嫌気性の条件下でも、より良好な脱窒効果を有し、２つの菌株の相乗的な脱窒作用により、大きな工学的応用および幅広い市場応用展望を持っている。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｙｅｌ１４は、２０２１年５月２７日に広東省微生物菌種保存センター（ＧＤＭＣＣ）に保存され、住所：広東省広州市先烈中路１００号大院５９ビルディング５階、郵便番号：５１００７０、保存番号：ＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６１６９９。
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＣＨＯ６は２０２１年５月２７日に広東省微生物菌種保存センター（ＧＤＭＣＣ）に保存され、住所：広東省広州市先烈中路１００号大院５９ビルディング５階、郵便番号：５１００７０、保存番号：ＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６１７００。
本発明の目的、技術手段および有益な技術的効果をより明確にするために、以下、実施例と併せて、本発明をより詳細に説明する。なお、本明細書で説明される実施例は本発明を解釈する目的のみであり、本発明の保護範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例で具体的な条件が示されていない試験方法は、通常の一般的な条件に従い、または各メーカーが推奨する条件に従ったものである。
実施例１
実施例１
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＣＨＯ６とＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｙｅｌ１４の具体的な分離・選別・育種過程は以下のとおりであり：
（１）Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＣＨＯ６の分離・培養：
（１）Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＣＨＯ６の分離・培養：
本発明で提供されるＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＣＨＯ６は、工業的に汚染された広東省広州市石井河の水域沈殿物から由来し、分離方法としては、コロニーＳＢ８（平板上で増殖可能な単コロニー、このコロニーは従来技術で得られ、Ｑｉａｎ Ｙ．Ｆ．, Ｘｕ Ｍ．Ｙ．, ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ａｎｄ Ｐｅｔｒｉｍｏｎａｓ ｆｏｒ ｓｕｌｆａｔｅ-ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｈａｚａｒｄ．Ｍａｔｅｒ．、２０２１、４０７という文献に掲載されている）を単細胞スクリーナーで（長春長光辰英生物科学機器有限公司）可視化して棒状微生物を選別して得られた単細胞であり（図７）、液体培地で２０日間培養した後、菌液の濁りを観察し（３０℃,１０％Ｈ２+１０％ＣＯ２+８０％Ｎ２の嫌気性箱）、濁った菌液を上記培地の寒天固形平板上でスクライブし、同定した。Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＣＨＯ６のコロニーは不規則な丸い形状であり、不透明で白色であり、好気性と嫌気性の環境下でも生存できる。本菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定により、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ １３１１１と９９．４１％の類似性を有するため、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＣＨＯ６と命名され、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＣＨＯ６の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示される。上記液体培地成分：グルコース（１０ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ３（２．５２ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．５ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（１ｇ／Ｌ）、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．０６ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．０６ｇ／Ｌ）、Ｋ２ＳＯ４（３．４８ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．０５ｇ／Ｌ）、溶媒は水であり、培地の固形平板は液体培地に質量％１．５％寒天を添加したものである。培地の調製方法は、各成分を水に加え、攪拌して溶解し、減菌することで得られる。
（２）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｙｅｌ１４の分離・培養：
本発明で提供されるＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｙｅｌ１４は、貴州省六盤水市の廃棄物プラスチックゴミ袋から分離され、分離した培地はポテト培地（ＰＤＢ, ２４ｇ／Ｌ、広東環凱微生物科技有限公司より提供）。廃棄物プラスチック上のコロニーを滅菌水に加え、ピペットで５回往復させた後、５０μＬをＰＤＢ平板上に塗布し（質量％１．５％の寒天を含む）、３０℃の恒温箱で１週間培養した後、単コロニーを選択してさらに純化させた。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｙｅｌ１４のコロニーは不規則な楕円形であり、黄色みを帯びて不透明であり、コロニー表面に水滴が付着した。本菌は好気性、一部嫌気性の条件下でも生存でき、生長ｐＨが６．５～８．５である。本菌株が１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定およびＢＬＡＳＴ分析により、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＭＰＡ菌株と９９．７８％の類似性を有するため、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｙｅｌ１４と命名され、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｙｅｌ１４の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示される。得られた微生物のアンモニア酸化能力、脱窒能力を検証した。多くの微生物の検証では、最終的にＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｙｅｌ１４は良好なアンモニア酸化機能を有することが発見し、次の実験候補株として選定された。
バチルス・アミロリクファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ｙｅｌ１４は２０２１年５月２７日に広東省微生物菌種保存センター（ＧＤＭＣＣ）に保存され、住所：広東省広州市先烈中路１００号大院５９ビルディング５階、郵便番号：５１００７０、保存番号：ＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６１６９９である。
フェーカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＣＨＯ６は２０２１年５月２７日に広東省微生物菌種保存センター（ＧＤＭＣＣ）に保存され、住所：広東省広州市先烈中路１００号大院５９ビルディング５階、郵便番号：５１００７０、保存番号：ＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６１７００である。
実施例２
実施例２
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＣＨＯ６とＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｙｅｌ１４の通常培地での脱窒能力が検証され：
２種類の菌株が異なる培地から分離されるので、Ｒ２ＡとＰＤＢ培地という２種類の異なる基礎培地を選定して脱窒能力を検証した。体積％が１％の接種量で、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＣＨＯ６を１リットルの培地Ｒ２Ａ（１２ｇ／Ｌ）+ＮＯ２
-（１７．５ ｍＭ）+ＮＨ４
+（３．５ ｍＭ）に接種してそのＮＨ４
+酸化能力とＮＯ２
-の還元能力を検証し、１リットルの培地Ｒ２Ａ（１２ｇ／Ｌ）+ ＮＯ３
-（１６ ｍＭ）に接種して菌株ＣＨＯ６の脱窒能力を検証した。それぞれ好気性（１８０ｒｐｍ、３０℃）条件下と嫌気性（３０℃、９９．９９％Ｎ２で満たされた嫌気性箱）条件下でＣＨＯ６の脱窒能力を検証する必要がある。その中で、ＮＯ３
-、ＮＯ２
-とＮＨ４
+のイオン濃度は、イオンクロマトグラフィー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定され、全窒素（ＴＮ）はＴＯＣメーター（島津製作所）で測定された。
体積％が１％の接種量で、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｙｅｌ１４を１リットルの培地ＰＤＢ（２４ｇ／Ｌ）+ＮＯ２
-（１３．２ ｍＭ）+ ＮＨ４
+（３．３ ｍＭ）とＰＤＢ（２４ｇ／Ｌ）+ ＮＯ３
-（１１．８ ｍＭ）にそれぞれ接種し、同時に好気性培養（１８０ｒｐｍ、３０℃）と嫌気性培養（３０℃、９９．９９％ Ｎ２で満たされた嫌気性箱）を行い、ｙｅｌ１４の脱窒能力を検証した。
菌株ＣＨＯ６またはｙｅｌ１４が接種されていない対応の培地をブランク対照組（ＣＫ）とした。
結果によると、菌株ＣＨＯ６をＲ２Ａ（１２ｇ／Ｌ）+ＮＯ２
-（１７．５ ｍＭ）+ＮＨ４
+（３．５ ｍＭ）培地で１０日間培養した後、菌株ＣＨＯ６の好気性脱窒能力と嫌気性脱窒能力が同等であり、好気性脱窒能力と嫌気性脱窒能力がそれぞれ２５．３２％と２６．３５％であった（図２）。Ｒ２Ａ（１２ｇ／Ｌ）+ ＮＯ３
-（１６ ｍＭ）培地で１０日間培養した後、菌株ＣＨＯ６の脱窒能力が最も顕著であり、好気性と嫌気性の条件下で、それぞれ６６％と７１％の脱窒能力に達した（図２）。さらに、窒素イオン含有化合物を分析すると、好気性と嫌気性の条件下でも、菌株ＣＨＯ６はＲ２Ａ（１２ｇ／Ｌ）+ＮＯ２
-（１７．５ ｍＭ）+ＮＨ４
+（３．５ ｍＭ）培地中のＮＯ２
-を脱窒作用により全部除去できる（図３中の＜１＞、＜２＞）、対照組と比較すると、ＮＨ４
+が顕著に変化しなかった。Ｒ２Ａ（１２ｇ／Ｌ）+ ＮＯ３
-（１６ ｍＭ）培地では、菌株ＣＨＯ６が高い脱窒能力を有し、脱窒過程によりほぼ全部のＮＯ３
-を除去できる（９９％）（図４中の＜１＞、＜２＞）。
菌株ｙｅｌ１４をＰＤＢ（２４ｇ／Ｌ）+ＮＯ２
-（１３．２ ｍＭ）+ ＮＨ４
+（３．３ ｍＭ）で１０日間培養した後、好気性脱窒能力を持たず、好気性脱窒効率がゼロであり、嫌気性脱窒がわずか１１．４２％であった（図２）。同様に、菌株ｙｅｌ１４をＰＤＢ（２４ｇ／Ｌ）+ ＮＯ３
-（１１．８ ｍＭ）培地で１０日間培養した後、好気性脱窒能力を持たず、好気性脱窒能力もゼロであり、嫌気性脱窒能力がわずか７．３７％であった（図２）。菌株ｙｅｌ１４の脱窒能力が非常に低く、これは、体系中の窒素イオン含有化合物が窒素ガスに変換されず、イオン形式で変換することからである可能性がある。具体的には、菌株ｙｅｌ１４をＰＤＢ（２４ｇ／Ｌ）+ＮＯ２
-（１３．２ ｍＭ）+ＮＨ４
+（３．３ ｍＭ）で好気性培養するとき、培地に存在しないＮＯ３
-（１．２４８ ｍＭ）を生成でき（図３中の＜３＞）、嫌気性条件下で培養するとき、４７％のＮＨ４
+（図３中の＜６＞）をＮＯ３
-（０．４４７ ｍＭ）（図３中の＜４＞）とＮＯ２
-（２．６８３ ｍＭ）（図３中の＜５＞）に変換できる。ＰＤＢ（２４ｇ／Ｌ）+ＮＯ３
-（１１．８ ｍＭ）では、菌株ｙｅｌ１４の好気性脱窒能力が高く、９４．８％に達したが、嫌気性脱窒能力が非常に低く、大量のＮＯ２
-（２．９８2 ｍＭ）が蓄積され（図４中の＜３＞、＜４＞）、これは、体系中の全窒素（ＴＮ）が除去されないからである可能性がある。
要約すると、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＣＨＯ６は好気性または嫌気性の条件下で高い脱窒機能（ＮＯ３
- とＮＯ２
-除去）を有するが、アンモニア酸化能力を持たなく、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ ｙｅｌ１４は好気性の条件下でのみ一定のＮＯ３
-脱窒作用（ＮＯ３
-除去）を有し、嫌気性の条件下ではほとんど脱窒機能を有さないが、本菌はアンモニア酸化能力を有し、ＮＨ４
+をＮＯ２
-またはＮＯ３
-に変換できる（図２～４）。
実施例３
実施例３
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＣＨＯ６とＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ ｙｅｌ１４を廃棄物浸出液に応用し、具体的には以下のように実施し：
恵州廃棄物浸出液処理場（広東省恵州市恵城区永聯路、成熟型、>１０年）から原液を採集し、-４℃の低温倉庫に保存して用意する。Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＣＨＯ６とＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｙｅｌ１４の複合効果を検証するために、それぞれ菌株ＣＨＯ６とｙｅｌ１４を対数増殖期まで培養し、１：１の体積比で複合したコロニーＣＨＯ６-ｙｅｌ１４を１リットルの廃棄物浸出液原液に接種して、接種量が１体積％であった。菌株ＣＨＯ６またはｙｅｌ１４が接種されていない廃棄物浸出液をブランク対照組（ＣＫ）とし、設置培養方法は以下のとおりであり：
好気性培養：ＣＫ（３組）、ＣＨＯ６（３組）、ｙｅｌ１４（３組）、ＣＨＯ６-ｙｅｌ１４（３組）、１８０ｒｐｍ、３０℃加振器、
室温静置培養：ＣＫ（３組）、ＣＨＯ６（３組）、ｙｅｌ１４（３組）、ＣＨＯ６-ｙｅｌ１４（３組）、
嫌気性培養：ＣＫ（３組）、ＣＨＯ６（３組）、ｙｅｌ１４（３組）、ＣＨＯ６-ｙｅｌ１４（３組）、３０℃、９９．９９％ Ｎ２で満たされた嫌気性培養箱。
培養時間が１０日間であった。
好気性培養：ＣＫ（３組）、ＣＨＯ６（３組）、ｙｅｌ１４（３組）、ＣＨＯ６-ｙｅｌ１４（３組）、１８０ｒｐｍ、３０℃加振器、
室温静置培養：ＣＫ（３組）、ＣＨＯ６（３組）、ｙｅｌ１４（３組）、ＣＨＯ６-ｙｅｌ１４（３組）、
嫌気性培養：ＣＫ（３組）、ＣＨＯ６（３組）、ｙｅｌ１４（３組）、ＣＨＯ６-ｙｅｌ１４（３組）、３０℃、９９．９９％ Ｎ２で満たされた嫌気性培養箱。
培養時間が１０日間であった。
菌株ＣＨＯ６とｙｅｌ１４の廃棄物浸出液での脱窒過程が図１に概略的に示される。結果によると、上記３つの培養条件下で、菌株ＣＨＯ６、ｙｅｌ１４とコロニーＣＨＯ６-ｙｅｌ１４は廃棄物浸出液で一定の脱窒能力およびアンモニア性窒素除去能力を有する。菌株ＣＨＯ６とｙｅｌ１４を廃棄物浸出液に単独で接種して培養する場合と比較すると、複合フローラＣＨＯ６-ｙｅｌ１４は良好な脱窒効果を有し、好気性、室温静置と嫌気性の条件下でそれぞれ廃棄物浸出液中の４７０．５ ｍｇ／Ｌ、２４１．６７ ｍｇ／Ｌと７２４．８３ ｍｇ／Ｌの全窒素を除去できる（図５中の＜１＞、＜２＞、＜３＞）。イオンクロマトグラフィー測定により、複合フローラＣＨＯ６-ｙｅｌ１４は高アンモニア性窒素の廃棄物浸出液環境ではより高いアンモニア性窒素除去能力と適応能力を有し、好気性、室温静置と嫌気性の条件下でそれぞれ４４．４％、３７．５３％と３８．９５％のアンモニア性窒素除去率に達した（図６中の＜１＞、＜２＞、＜３＞）。
以上、本発明の好ましい実施形態を説明したが、上記好ましい実施形態は本発明の制限として理解されなく、本発明の保護範囲は特許請求の範囲に従うべきである。当業者にとって、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、多くの改良と装飾を加えることができ、これらの改良と装飾も本発明の保護範囲に含まれるものとする。
Claims (7)
- バチルス・アミロリクファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）およびフェーカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）を含み、前記バチルス・アミロリクファシエンスはバチルス・アミロリクファシエンスｙｅｌ１４であり、保存番号：ＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６１６９９、前記フェーカリゲネスはフェーカリゲネスＣＨＯ６であり、保存番号：ＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６１７００である、ことを特徴とする広域溶存酸素および有機炭素耐性を有する脱窒菌剤。
- 脱窒バイオフィルムの作製における請求項１に記載の脱窒菌剤の使用。
- 請求項１に記載の脱窒菌剤を含有する、ことを特徴とする脱窒バイオフィルム。
- 水域脱窒における請求項１に記載の脱窒菌剤または請求項３に記載の脱窒バイオフィルムの使用。
- 好気性または嫌気性の条件下で水域中の窒素を除去する、ことを特徴とする請求項４に記載の使用。
- 前記水域中の窒素には、アンモニア性窒素ＮＨ４+-Ｎ、硝酸性窒素ＮＯ３--Ｎまたは亜硝酸性窒素ＮＯ２--Ｎ中の１つ以上が含まれる、ことを特徴とする請求項５に記載の使用。
- 汚水脱臭および／または廃棄物浸出液脱臭における請求項１に記載の脱窒菌剤または請求項３に記載の脱窒バイオフィルムの使用。
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