JP7415575B2 - マニピュレーションシステム及びマニピュレーションシステムの駆動方法 - Google Patents

マニピュレーションシステム及びマニピュレーションシステムの駆動方法 Download PDF

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Description

本発明は、マニピュレーションシステム及びマニピュレーションシステムの駆動方法に関する。
バイオテクノロジ分野において、顕微鏡観察下で細胞や卵にＤＮＡ溶液や細胞を注入する等のように、微小な対象物に微細な操作を行うマイクロマニピュレーションシステムが知られている。微小対象物を保持するための保持用ピペットで微小対象物の位置を固定しつつ、操作用ピペットを微小対象物に突き刺して、微小対象物内の操作対象にインジェクション操作が行われる。
特許文献１には、取得した撮像画像のデータから微小対象物及び操作対象の位置座標を検出し、検出結果に基づいて穿孔経路及び操作位置を決定する技術が開示されている。
特開２０１７－１２４４５２号公報
ところで、特許文献１のマニピュレーションシステムにおいて、微小対象物及び操作対象について取得される位置座標は、取得した撮像画像のＸ－Ｙ座標、すなわち水平面上の座標のみであり、Ｚ座標は含まれない。細胞の核等、目視であっても視認に熟練の技術を必要とされる操作対象を検出する場合では、操作対象に焦点が完全に一致している状態を認識することは困難であるため、操作対象のＺ軸方向位置を正確に把握することが難しい。このため、操作用ピペットと操作対象のＺ軸方向位置が一致せず、インジェクション操作時に操作対象に操作用ピペットの先端が刺さらない恐れがある。
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作対象に好適に穿孔操作することができるマニピュレーションシステム及びマニピュレーションシステムの駆動方法を提供することを目的とする。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムは、細胞が載置される試料ステージと、前記細胞を保持するための第１ピペットを備える第１マニピュレータと、前記第１ピペットに保持された前記細胞を操作するための第２ピペットを備える第２マニピュレータと、前記細胞を撮像する撮像部と、前記試料ステージ、前記第１ピペット、前記第２ピペット及び前記撮像部を制御し、前記撮像部による撮像画像における前記細胞の核小体の輪郭の濃度値の微分値が所定の閾値より小さい場合、前記撮像部側又は前記試料ステージ側に、前記第１ピペットを移動させるコントローラと、を備える。
これによれば、操作者の目視による判断によらず、撮像画像から検出した核小体の輪郭の濃度値の微分値に基づいて、核小体の中心位置が焦点位置からずれているか否かを判断することができる。核小体の中心位置が焦点位置からずれている場合は、第１ピペットを撮像部側又は試料ステージ側に移動させて調節することによって、立体構造である核小体に対して好適な位置で操作することができる。また、これらの動作を自動で行うため、操作者の熟練度及び技術によらず、操作対象の細胞に好適に穿孔操作することができる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記コントローラは、前記撮像画像における前記核小体の周辺の濃度値及び前記核小体の内部の濃度値との濃度差に基づいて、前記試料ステージの前記細胞を載置するＸ－Ｙ平面に直交するＺ軸方向における前記核小体の中心位置を決定し、決定した前記核小体の中心位置に基づいて、前記第１ピペットを前記撮像部側又は前記試料ステージ側に移動させる距離を決定する。これによれば、操作者の目視による判断によらず、撮像画像から検出した核小体の周辺の濃度値及び内部の濃度値との濃度差に基づいて、核小体の中心位置が焦点位置に対して、どの程度ずれているかを判断することができる。したがって、核小体の中心位置の調整のために移動させる第１ピペットの移動距離を決定できるので、１度で第１ピペットを好適な位置に移動させることができ、調整が容易である。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記コントローラは、前記撮像画像を取得した焦点位置と、決定した前記核小体の中心位置とのずれ量を、前記第１ピペットを前記撮像部側又は前記試料ステージ側に移動させる距離として決定する。これによれば、核小体の中心位置の調整のために移動させる第１ピペットの移動距離を容易に決定できる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記コントローラは、前記撮像画像における前記核小体の輪郭の濃度値の微分値が所定の閾値より小さい場合、前記核小体の輪郭の濃度値の微分値が所定の閾値以上になるまで、前記撮像部側又は前記試料ステージ側に、前記第１ピペットを所定距離ずつ移動させる。これによれば、調整中の核小体の輪郭の濃度値の微分値を都度確認するので、より好適に核小体の中心位置が焦点位置に合わせることができる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記コントローラは、前記撮像画像における前記核小体の周辺の濃度値と前記核小体の内部の濃度値との濃度差に基づいて、前記第１ピペットを移動させる方向を前記撮像部に近付く方向又は前記試料ステージに近付く方向に決定する。これによれば、操作者の目視による判断によらず、撮像画像から検出した核小体の周辺の濃度値及び内部の濃度値との濃度差に基づいて、核小体の中心位置が焦点位置に対して、試料ステージ側と撮像部側とのいずれかにずれているかを判断することができる。したがって、核小体の中心位置の調整のために移動させる第１ピペットの移動方向を決定できるので、調整が容易である。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記コントローラは、前記撮像画像における前記核小体の周辺の濃度値と前記核小体の内部の濃度値との濃度差が所定の閾値以上である場合、前記第１ピペットを移動させる方向を、前記試料ステージに近付く方向に決定する。これによれば、一定の判断基準をもって、核小体の中心位置が焦点位置に対して撮像部側にずれていると、操作者の熟練度及び技術によらず、判断することができる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記コントローラは、前記撮像画像における前記核小体の周辺の濃度値と前記核小体の内部の濃度値との濃度差が所定の閾値以下である場合、前記第１ピペットを移動させる方向を、前記撮像部に近付く方向に決定する。これによれば、一定の判断基準をもって、核小体の中心位置が焦点位置に対して試料ステージ側にずれていると、操作者の熟練度及び技術によらず、判断することができる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムの駆動方法は、細胞が載置される試料ステージと、前記細胞を保持するための第１ピペットを備える第１マニピュレータと、前記第１ピペットに保持された前記細胞を操作するための第２ピペットを備える第２マニピュレータと、前記細胞を撮像する撮像部と、を備えるマニピュレーションシステムの駆動方法であって、前記撮像部に前記細胞を撮像させるステップと、撮像画像から前記細胞の核小体の輪郭を検出するステップと、前記核小体の輪郭の濃度値の微分値が所定の閾値より小さい場合、撮像部側又は前記試料ステージ側に、前記第１ピペットを移動させるステップと、を含む。
これによれば、操作者の目視による判断によらず、撮像画像から検出した核小体の輪郭の濃度値の微分値に基づいて、核小体の中心位置が焦点位置からずれているか否かを判断することができる。核小体の中心位置が焦点位置からずれている場合は、第１ピペットを撮像部側又は試料ステージ側に移動させて調節することによって、立体構造である核小体に対して好適な位置で操作することができる。また、これらの動作を自動で行うため、操作者の熟練度及び技術によらず、操作対象の細胞に好適に穿孔操作することができる。
本発明によれば、操作者の熟練度及び技術によらず、操作対象に好適に穿孔操作することができるマニピュレーションシステム及びマニピュレーションシステムの駆動方法を提供することができる。
図１は、実施形態に係るマニピュレーションシステムの構成を模式的に示す図である。 図２は、微動機構の一例を示す断面図である。 図３は、マニピュレーションシステムの制御ブロック図である。 図４は、平面視における操作対象の細胞の一例を示す模式図である。 図５は、側方視における操作対象の細胞の一例を示す模式図である。 図６は、図５に示す細胞の核小体の濃度分布を説明する説明図である。 図７は、側方視における操作対象の細胞の別の一例を示す模式図である。 図８は、図７に示す細胞の核小体の濃度分布を説明する説明図である。 図９は、側方視における操作対象の細胞のさらに別の一例を示す模式図である。 図１０は、図９に示す細胞の核小体の濃度分布を説明する説明図である。 図１１は、実施形態のマニピュレーションシステムの動作の第一例を示すフローチャート図である。 図１２は、実施形態のマニピュレーションシステムの動作の第二例を示すフローチャート図である。
本発明を実施するための形態（実施形態）につき、図面を参照しつつ詳細に説明する。以下の実施形態に記載した内容により本発明が限定されるものではない。また、以下に記載した構成要素には、当業者が容易に想定できるもの、実質的に同一のものが含まれる。さらに、以下に記載した構成要素は適宜組み合わせることが可能である。
［システムの構成］
まず、マニピュレーションシステム１０の物理構成について、図１及び図２を参照して説明する。図１は、実施形態に係るマニピュレーションシステム１０の構成を模式的に示す図である。図２は、微動機構４４の一例を示す断面図である。マニピュレーションシステム１０は、顕微鏡観察下で細胞等の微小対象物である試料を操作するためのシステムである。図１において、マニピュレーションシステム１０は、顕微鏡ユニット１２と、第１マニピュレータ１４と、第２マニピュレータ１６と、マニピュレーションシステム１０を制御するコントローラ（制御装置）４３とを備えている。顕微鏡ユニット１２の両側に第１マニピュレータ１４と第２マニピュレータ１６とが分かれて配置されている。
撮像部としての顕微鏡ユニット１２は、撮像素子を含むカメラ１８と、顕微鏡２０と、試料ステージ２２とを備えている。細胞等の微小対象物である試料を載置する試料ステージ２２の基準面は、Ｘ軸－Ｙ軸平面に平行なＸ－Ｙ平面である。試料ステージ２２は、シャーレ等の試料保持部材１１を支持可能であり、試料保持部材１１の直上に顕微鏡２０が配置される。顕微鏡ユニット１２は、顕微鏡２０とカメラ１８とが一体構造となっており、試料保持部材１１に向けて光を照射する光源（図示は省略している）を備えている。なお、カメラ１８は、顕微鏡２０と別体に設けてもよい。
試料保持部材１１には、試料を含む溶液が収容される。溶液は、例えば、パラフィンオイル等である。試料保持部材１１の試料に光が照射され、試料保持部材１１の試料で反射した光が顕微鏡２０に入射すると、試料に関する光学像は、顕微鏡２０で拡大された後、カメラ１８で撮像される。カメラ１８で撮像された画像を基に試料の観察が可能となっている。
図１に示すように、第１マニピュレータ１４は、第１ピペット保持部材２４と、Ｘ－Ｙ軸テーブル２６と、Ｚ軸テーブル２８と、Ｘ－Ｙ軸テーブル２６を駆動する駆動装置３０と、Ｚ軸テーブル２８を駆動する駆動装置３２とを備える。第１マニピュレータ１４は、Ｘ軸－Ｙ軸－Ｚ軸の３軸構成のマニピュレータである。なお、本実施形態において、水平面内の一方向をＸ軸方向、水平面内においてＸ軸方向と交差する方向をＹ軸方向、Ｘ軸方向及びＹ軸方向のそれぞれと交差する方向（すなわち鉛直方向）をＺ軸方向とする。
Ｘ－Ｙ軸テーブル２６は、駆動装置３０の駆動により、Ｘ軸方向又はＹ軸方向に移動可能となっている。Ｚ軸テーブル２８は、Ｘ－Ｙ軸テーブル２６上に上下移動可能に配置され、駆動装置３２の駆動によりＺ軸方向に移動可能になっている。駆動装置３０、３２は、コントローラ４３に接続されている。
第１ピペット保持部材２４は、Ｚ軸テーブル２８に連結され、先端に毛細管チップである第１ピペット２５が取り付けられている。第１ピペット保持部材２４は、Ｘ－Ｙ軸テーブル２６とＺ軸テーブル２８の移動に従って３次元空間を移動領域として移動し、試料保持部材１１に収容された試料を、第１ピペット２５を介して保持することができる。すなわち、第１マニピュレータ１４は、微小対象物の保持に用いられる保持用マニピュレータであり、第１ピペット２５は、微小対象物の保持手段として用いられるホールディングピペットである。微小対象物は、例えば、第１ピペット２５と連通されているシリンジポンプ２９（図３参照）によって、第１ピペット２５の先端にて吸引保持される。第１ピペット２５の内部圧力は、シリンジポンプ２９から供給される圧力の制御値により制御される。
図１に示す第２マニピュレータ１６は、第２ピペット保持部材３４と、Ｘ－Ｙ軸テーブル３６と、Ｚ軸テーブル３８と、Ｘ－Ｙ軸テーブル３６を駆動する駆動装置４０と、Ｚ軸テーブル３８を駆動する駆動装置４２とを備える。第２マニピュレータ１６は、Ｘ軸－Ｙ軸－Ｚ軸の３軸構成のマニピュレータである。
Ｘ－Ｙ軸テーブル３６は、駆動装置４０の駆動により、Ｘ軸方向又はＹ軸方向に移動可能となっている。Ｚ軸テーブル３８は、Ｘ－Ｙ軸テーブル３６上に上下移動可能に配置され、駆動装置４２の駆動によりＺ軸方向に移動可能になっている。駆動装置４０、４２は、コントローラ４３に接続されている。
第２ピペット保持部材３４は、Ｚ軸テーブル３８に連結され、先端にガラス製の第２ピペット３５が取り付けられている。第２ピペット保持部材３４は、Ｘ－Ｙ軸テーブル３６とＺ軸テーブル３８の移動に従って３次元空間を移動領域として移動し、試料保持部材１１に収容された試料を人工操作することが可能である。すなわち、第２マニピュレータ１６は、微小対象物の操作（ＤＮＡ溶液の注入操作や穿孔操作等）に用いられる操作用マニピュレータであり、第２ピペット３５は、微小対象物のインジェクション操作手段として用いられるインジェクションピペットである。微小対象物は、例えば、第２ピペット３５と連通されている注入ポンプ３９（図３参照）によって、第２ピペット３５の先端から溶液等が注入される。第２ピペット３５の内部圧力は、注入ポンプ３９から供給される圧力の制御値により制御される。
Ｘ－Ｙ軸テーブル３６とＺ軸テーブル３８は、第２ピペット保持部材３４を、試料保持部材１１に収容された試料等の操作位置まで粗動駆動する粗動機構（３次元移動テーブル）として構成されている。また、Ｚ軸テーブル３８と第２ピペット保持部材３４との連結部には、ナノポジショナとして微動機構４４が備えられている。微動機構４４は、第２ピペット保持部材３４をその長手方向（軸方向）に移動可能に支持するとともに、第２ピペット保持部材３４をその長手方向（軸方向）に沿って微動駆動するように構成される。
図２に示すように微動機構４４は、第２ピペット保持部材３４を駆動対象とする圧電アクチュエータ４４ａを備える。圧電アクチュエータ４４ａは、筒状のハウジング８７と、ハウジング８７の内部に設けられた転がり軸受８０、８２と、圧電素子９２とを含む。ハウジング８７の軸方向に第２ピペット保持部材３４が挿通される。転がり軸受８０、８２は、第２ピペット保持部材３４を回転可能に支持する。圧電素子９２は、印加される電圧に応じて第２ピペット保持部材３４の長手方向に沿って伸縮する。第２ピペット保持部材３４の先端側（図２左側）には第２ピペット３５（図１参照）が取り付けられ固定される。
第２ピペット保持部材３４は、転がり軸受８０、８２を介してハウジング８７に支持される。転がり軸受８０は、内輪８０ａと、外輪８０ｂと、内輪８０ａと外輪８０ｂとの間に設けられたボール８０ｃとを備える。転がり軸受８２は、内輪８２ａと、外輪８２ｂと、内輪８２ａと外輪８２ｂとの間に設けられたボール８２ｃとを備える。各外輪８０ｂ、８２ｂがハウジング８７の内周面に固定され、各内輪８０ａ、８２ａが中空部材８４を介して第２ピペット保持部材３４の外周面に固定される。このように、転がり軸受８０、８２は、第２ピペット保持部材３４を回転自在に支持するようになっている。
中空部材８４の軸方向の略中央部には、径方向外方に突出するフランジ部８４ａが設けられている。転がり軸受８０は、フランジ部８４ａに対して第２ピペット保持部材３４の軸方向の先端側に配置され、転がり軸受８２はフランジ部８４ａに対して後端側に配置される。内輪間座としてのフランジ部８４ａを挟んで転がり軸受８０の内輪８０ａと、転がり軸受８２の内輪８２ａとが配置される。第２ピペット保持部材３４の外周面にねじ加工が施されており、内輪８０ａの先端側及び内輪８２ａの後端側からロックナット８６及びロックナット８６が第２ピペット保持部材３４に螺合されて、転がり軸受８０、８２の軸方向の位置が固定される。
円環状のスペーサ９０は、転がり軸受８０、８２と同軸に外輪８２ｂの軸方向後端側に配置される。スペーサ９０の軸方向後端側には、円環状の圧電素子９２がスペーサ９０と略同軸に配置され、さらにその軸方向後端側にはハウジング８７の蓋８８が配置される。蓋８８は、圧電素子９２を軸方向に固定するためのもので、第２ピペット保持部材３４が挿通する孔部を有する。蓋８８は、例えば、ハウジング８７の側面に不図示のボルトにより締結されていてもよい。なお、圧電素子９２は、棒状又は角柱状としてスペーサ９０の周方向に略等配となるように並べても良く、第２ピペット保持部材３４を挿通する孔部を有した角筒としても良い。
圧電素子９２はスペーサ９０を介して転がり軸受８２と接している。圧電素子９２は、リード線（図示せず）を介して制御回路としてのコントローラ４３に接続されている。圧電素子９２は、コントローラ４３からの印加電圧に応答して第２ピペット保持部材３４の軸方向に沿って伸縮し、第２ピペット保持部材３４をその軸方向に沿って微動させるようになっている。第２ピペット保持部材３４が軸方向に沿って微動すると、この微動が第２ピペット３５（図１参照）に伝達され、第２ピペット３５の位置が微調整されることになる。また、圧電素子９２により第２ピペット保持部材３４が軸方向に振動すると、第２ピペット３５も軸方向に振動する。このように微動機構４４により、微小対象物への操作（ＤＮＡ溶液や細胞の注入操作や穿孔操作等）の際には、より正確な操作が可能となり、圧電素子９２による穿孔作用の向上を実現できる。
なお、上述の微動機構４４は、微小対象物の操作用の第２マニピュレータ１６に設けられるとしているが、図１に示すように微小対象物の固定用の第１マニピュレータ１４に微動機構４４と同様の微動機構５４を設けてもよく、省略することも可能である。
［システムの制御構成］
次に、コントローラ４３によるマニピュレーションシステム１０の制御について図３を参照して説明する。図３は、マニピュレーションシステム１０の制御ブロック図である。
コントローラ４３は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）等のマイクロプロセッサを有する演算処理装置を含む演算部４６Ａ、ＲＯＭ（Read Only Memory）又はＲＡＭ（Random Access Memory）等のメモリを有する記憶装置を含む記憶部４６Ｂ、及び入出力インターフェース装置等のハードウェア資源を備える。コントローラ４３の機能は、記憶部４６Ｂに格納された所定のプログラムを演算部４６Ａが実行することで実現される。コントローラ４３は、演算部４６Ａによる演算結果に従って、各構成要素に各種機能を実行させる制御信号を出力する。
コントローラ４３は、顕微鏡ユニット１２の焦点合わせ機構８１、第１マニピュレータ１４の駆動装置３０、駆動装置３２、シリンジポンプ２９、第２マニピュレータ１６の駆動装置４０、駆動装置４２、圧電素子９２、注入ポンプ３９を制御し必要に応じて設けられたドライバやアンプ等を介してそれぞれに制御信号を出力する。コントローラ４３は、駆動装置３０、３２、４０、４２にそれぞれ駆動信号ＶＸＹ、ＶＺ（図１参照）を供給する。駆動装置３０、３２、４０、４２は、駆動信号ＶＸＹ、ＶＺに基づいてＸ－Ｙ－Ｚ軸方向に駆動する。コントローラ４３は、微動機構４４にナノポジショナ制御信号ＶＮ（図１参照）を供給して、微動機構４４の制御を行ってもよい。
コントローラ４３は、情報入力手段としてジョイスティック４７と、キーボード、マウス又はタッチパネル等の入力部４９とが接続されている。ジョイスティック４７は公知のものを用いることができる。ジョイスティック４７は、基台と、基台から直立するハンドル部とを備えており、ハンドル部を傾斜させるように操作することで駆動装置３０、４０のＸ－Ｙ駆動を行うことができ、ハンドル部をねじることで駆動装置３２、４２のＺ駆動を行うことができる。ジョイスティック４７は、シリンジポンプ２９、圧電素子９２、注入ポンプ３９の各駆動を操作するためのボタン４７Ａを備えていてもよい。また、コントローラ４３は、液晶パネル等の表示部４５が接続される。表示部４５にはカメラ１８で取得した顕微鏡画像や各種制御用画面が表示されるようになっている。なお、入力部４９としてタッチパネルが用いられる場合には、表示部４５の表示画面にタッチパネルを重ねて用い、操作者が表示部４５の表示画像を確認しつつ入力操作を行うようにしてもよい。
図３に示すように、コントローラ４３は、さらに画像入力部４３Ａ、画像処理部４３Ｂ、画像出力部４３Ｃ及び位置検出部４３Ｄを備えている。顕微鏡２０を通してカメラ１８で撮像した画像信号ＶＰＩＸ（図１参照）が画像入力部４３Ａに入力される。画像処理部４３Ｂは、画像入力部４３Ａから画像信号を受け取って、画像処理を行う。画像処理部４３Ｂは、画像入力部４３Ａから受け取った画像信号をグレースケール化して、グレースケール画像に基づいてエッジ抽出処理やパターンマッチングを行う。画像出力部４３Ｃは、画像処理部４３Ｂで画像処理された画像情報を表示部４５へ出力する。
位置検出部４３Ｄは、カメラ１８で撮像された微小対象物である細胞１００（図４等参照）等の位置や、第２ピペット３５によるインジェクション操作を行う操作対象である細胞１００の核小体１１４（図４等参照）等の位置を、画像処理後の画像情報に基づいて検出することができる。位置検出部４３Ｄは、画像情報に基づいてカメラ１８の撮像領域内における細胞１００等の有無を検出することができる。また、位置検出部４３Ｄは、第１ピペット２５及び第２ピペット３５の位置を検出してもよい。画像入力部４３Ａ、画像処理部４３Ｂ、画像出力部４３Ｃ及び位置検出部４３Ｄは、演算部４６Ａにより制御される。
コントローラ４３は、位置検出部４３Ｄからの位置情報、及び細胞１００等の有無の情報に基づいて、第１マニピュレータ１４及び第２マニピュレータ１６を制御する。本実施形態において、コントローラ４３は、第１マニピュレータ１４及び第２マニピュレータ１６を所定のシーケンスで自動的に駆動する。かかるシーケンス駆動は、記憶部４６Ｂにあらかじめ保存された所定のプログラムによる演算部４６Ａの演算結果に基づいて、コントローラ４３が順次それぞれに駆動信号を出力することで行われる。
［操作対象の検出方法及び位置座標取得方法］
次に、図４から図１０を参照して、微小対象物である試料の操作対象の検出方法と、操作対象の位置座標取得方法と、について説明する。図４は、平面視における操作対象の細胞１００の一例を示す模式図である。本実施形態において、試料は細胞１００である。また、細胞１００は、前核期受精卵である。また、細胞１００への操作は、ＤＮＡ溶液のインジェクション操作である。また、本実施形態において、細胞１００への第２ピペット３５の挿入方向は、Ｘ軸方向に平行である。挿入方向に直交する交差方向は、Ｙ軸方向に平行である。
細胞１００は、試料保持部材１１に収容される。細胞１００は、細胞膜１０２と、核１１０と、を含む。細胞膜１０２は、流動性を有し、細胞１００の内外を隔てる生体膜である。核１１０は、細胞膜１０２に覆われた細胞１００の内部に存在する。核１１０は、核膜１１２と核小体１１４とを有する。核小体１１４は、核膜１１２に覆われた核１１０の内部に存在する。細胞１００は、第１ピペット２５に保持された状態で、第２ピペット３５によってインジェクション操作される。
ＤＮＡ溶液等のインジェクションにおいては、ＤＮＡ溶液等を、核膜１１２の内部に注入する必要がある。核膜１１２は、低コントラストかつ形状が不定であるため、エッジ抽出処理等の一般的な画像処理手段による検出が困難である。そこで、核膜１１２より高コントラストの核小体１１４を検出し、取得した核小体１１４の位置座標に基づいて、穿孔操作及びインジェクション操作を実行する。
核小体１１４の検出には、例えば、幾何学マッチングを利用する。本実施形態における幾何学マッチングでは、顕微鏡ユニット１２による撮像画像から、楕円形状の円弧パターンに合致する部分を核小体１１４として定義し、円弧の中心のＸＹ座標を、核小体１１４の中心位置ＣのＸ座標Ｃｘ及びＹ座標Ｃｙとして取得する。
核小体１１４は、立体構造であるため、撮像画像内に核小体１１４が検出されても、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚが焦点位置Ｆｚ（図５、図７及び図９参照）とずれている状態で検出される場合がある。第２ピペット３５による細胞１００（図５参照）の穿孔操作及びインジェクション操作において、穿孔位置及びインジェクション位置のＺ座標、すなわち第２ピペット３５の先端のＺ座標は、焦点位置Ｆｚに一致させて行う。したがって、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚと焦点位置Ｆｚとのずれ量Ｌ（図７及び図９参照）に基づいて、細胞１００を保持する第１ピペット２５をＺ軸方向に移動させ、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚを焦点位置Ｆｚに合わせる必要がある。
図５は、側方視における操作対象の細胞１００の一例を示す模式図である。図６は、図５に示す細胞１００の核小体１１４の濃度分布を説明する説明図である。図７は、側方視における操作対象の細胞１００の別の一例を示す模式図である。図８は、図７に示す細胞１００の核小体１１４の濃度分布を説明する説明図である。図９は、側方視における操作対象の細胞１００のさらに別の一例を示す模式図である。図１０は、図９に示す細胞１００の核小体１１４の濃度分布を説明する説明図である。図５、図７及び図９は、細胞１００を水平方向から視た図である。図６、図８及び図１０では、撮像画像に表示される核１１０と、核小体１１４の中心位置Ｃを通る直線α上の濃度値Ｂの分布を示したグラフとを示す。
濃度値Ｂは、グレースケール化された撮像画像における階調値に対応する。撮像画像は、例えば、２５６階調の８ｂｉｔである場合、濃度値Ｂは、白色から黒色まで２５６段階で示される。図５から図１０に示すように、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚと焦点位置Ｆｚとのずれ量Ｌは、撮像画像における核１１０内の階調の濃淡分布と相関がある。
図５及び図６に示す一例において、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚは、焦点位置Ｆｚに一致する。この際、図６に示すように、核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅは、後述の図７から図１０に示す核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚが焦点位置Ｆｚに一致しない細胞１００に比べて大きい。エッジ強度Ｓｅとは、濃度値Ｂの変化の度合いであり、例えば、図６、図８及び図１０に示すグラフの傾き、すなわち濃度値Ｂの微分値である。なお、図６に示す撮像画像内において、核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉと、核小体１１４の周辺１１４ｏの濃度値Ｂｏとの濃度差は、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚが焦点位置Ｆｚに一致する場合の濃度差である。例えばインジェクションが成功した際の、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚが焦点位置Ｆｚに一致する場合の濃度差のデータ、基準の濃度差として、コントローラ４３の記憶部４６Ｂ（図３参照）に予め蓄積して記憶されている。
図７及び図８に示す別の一例において、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚは、焦点位置Ｆｚよりも上方にある。本実施形態では、顕微鏡ユニット１２が試料ステージ２２を下方視しているので、核小体１１４の中心位置Ｃは、焦点位置Ｆｚよりも顕微鏡ユニット１２側にある。この際、図８に示すように、核小体１１４の内部１１４ｉの濃度は周辺１１４ｏの濃度よりも濃く、暗く視える。すなわち、核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉは、核小体１１４の周辺１１４ｏの濃度値Ｂｏより高い。また、核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉは、焦点位置Ｆｚに一致した場合（図６参照）の濃度値Ｂｉよりも高い。また、核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅは、図５及び図６に示す細胞１００に比べて小さい。
図９及び図１０に示すさらに別の一例において、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚは、焦点位置Ｆｚよりも下方にある。本実施形態では、顕微鏡ユニット１２が試料ステージ２２を下方視しているので、核小体１１４の中心位置Ｃは、焦点位置Ｆｚよりも試料ステージ２２側にある。この際、図１０に示すように、核小体１１４の内部１１４ｉの濃度は周辺１１４ｏの濃度よりも薄く、明るく視える。すなわち、核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉは、核小体１１４の周辺１１４ｏの濃度値Ｂｏより低い。また、核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉは、焦点位置Ｆｚに一致した場合（図６参照）の濃度値Ｂｉよりも低い。また、核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅは、図５及び図６に示す細胞１００に比べて小さい。
このように、ずれ量Ｌが大きいほど核小体１１４の輪郭１１４ｅがぼやけてエッジ強度Ｓｅが小さくなり、ずれ量Ｌが小さいほど核小体１１４の輪郭１１４ｅがはっきりしてエッジ強度Ｓｅが大きくなる。また、ずれ方向が顕微鏡ユニット１２側である場合（図７、及び図８参照）に核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉが焦点位置Ｆｚに一致している場合（図６参照）と比べて高くなり、ずれ方向が試料ステージ２２側である場合に核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉが焦点位置Ｆｚに一致している場合と比べて低くなる。
マニピュレーションシステム１０では、核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅと、核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉと、核小体１１４の周辺１１４ｏの濃度値Ｂｏとに基づいて、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚを推定する。より詳しくは、演算部４６Ａ（図３参照）は、核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅが所定の閾値以上か否かを判断する。所定の閾値は、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚと焦点位置Ｆｚ（第２ピペット３５の位置）とが一致する、例えばインジェクションが成功した際の、予め蓄積された濃度値Ｂの過去データに基づいて設定される。演算部４６Ａは、核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅが所定の閾値以上であると判断した場合、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚが焦点位置Ｆｚに一致するものとして扱う。この場合の一致とは、インジェクション操作に支障がない範囲での微細なずれを許容するものである。
マニピュレーションシステム１０は、一例として、濃度値Ｂｏ及び濃度値Ｂｉに基づいて推定したずれ量Ｌの分、細胞１００を保持している第１ピペット２５をＺ軸方向に移動させることで、核小体１１４の中心位置Ｃを焦点位置Ｆｚに一致させてもよい。また、ずれ量Ｌの分、第２ピペット３５を移動させることで、核小体１１４の中心位置Ｃを焦点位置Ｆｚに一致させてもよい。
より詳しくは、まず、演算部４６Ａ（図３参照）は、核小体１１４の中心位置Ｃを通る所定の直線α上において、核小体１１４の周辺１１４ｏの濃度値Ｂｏ及び核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉを取得する。次に、演算部４６Ａは、核小体１１４の周辺１１４ｏの濃度値Ｂｏと核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉとの濃度差を算出する。次に、演算部４６Ａは、算出した濃度差と、所定の参照データとに基づいて、ずれ量Ｌとずれ方向とを推定する。所定の参照データは、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚと焦点位置Ｆｚとが一致する、例えばインジェクションが成功した際の、予め蓄積された核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉと核小体１１４の周辺１１４ｏの濃度値Ｂｏとの濃度差のデータを含む。演算部４６Ａは、推定したずれ量Ｌ及びずれ方向から、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚを決定する。演算部４６Ａは、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚと焦点位置Ｆｚとに基づいて、第１ピペット２５の移動距離及び移動方向を決定する。演算部４６Ａは、第１マニピュレータ１４を駆動して、第１ピペット２５を決定した移動方向に決定した移動距離を移動させる。
マニピュレーションシステム１０は、別の一例として、濃度値Ｂｏ及び濃度値Ｂｉに基づいて推定したずれ方向に、第１ピペット２５をＺ軸方向に所定距離ずつ移動させることで、核小体１１４の中心位置Ｃを焦点位置Ｆｚに一致させてもよい。
より詳しくは、まず、演算部４６Ａ（図３参照）は、核小体１１４の中心位置Ｃを通る所定の直線α上において、核小体１１４の周辺１１４ｏの濃度値Ｂｏ及び核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉを取得する。次に、演算部４６Ａは、核小体１１４の周辺１１４ｏの濃度値Ｂｏと核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉとの濃度差が所定の閾値以上か否かを判断する。所定の閾値は、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚと焦点位置Ｆｚとが一致しない、例えばインジェクションが失敗した際の予め蓄積された濃度値Ｂの過去データに基づいて設定される。演算部４６Ａは、濃度差が所定の閾値以上であると判断した場合、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚが焦点位置Ｆｚより上方にある（図７、及び図８参照）ものとして判断する。すなわち、演算部４６Ａは、第１ピペット２５を移動させる方向を、下方向に決定する。演算部４６Ａは、濃度差が所定の閾値以下であると判断した場合、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚが焦点位置Ｆｚより下方にある（図９、及び図１０参照）ものとして判断する。すなわち、演算部４６Ａは、第１ピペット２５を移動させる方向を、上方向に決定する。
次に、演算部４６Ａ（図３参照）は、第１マニピュレータ１４を駆動して、第１ピペット２５を決定した方向に所定距離ずつ移動させる。第１ピペット２５を１回で移動させる所定距離は、前述したインジェクション操作に支障がない範囲として核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚと焦点位置Ｆｚとの微細なずれの許容値以下であることが好ましい。マニピュレーションシステム１０は、演算部４６Ａが第１ピペット２５を１回所定距離移動させるごとに、細胞１００の画像データを取得し直し、核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅを取得する。マニピュレーションシステム１０は、核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅが所定の閾値以上になるまで、第１ピペット２５の移動と核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅの取得とを繰り返す。
［システムの動作］
次にマニピュレーションシステム１０の駆動方法について説明する。マニピュレーションシステム１０の動作を開始する前に、操作者は、まず、図１に示すカメラ１８の視野内に、第１ピペット２５及び第２ピペット３５を配置する。ここで、第１ピペット２５の先端の高さは試料保持部材１１の底面よりわずかに上の位置とする。操作者は、次に、顕微鏡２０の焦点合わせ機構８１を用いて、焦点を第１ピペット２５に合わせる。操作者は、焦点を第１ピペット２５に合わせた状態で、焦点が合うように第２ピペット３５の高さを調整する。操作者は、次に、試料保持部材１１内の細胞１００の周辺を、カメラ１８の視野と重なるように試料ステージ２２を移動させる。操作者は、さらに、細胞１００に第１ピペット２５の先端を近付けても細胞１００が動かないことを確認する。これは、図３に示すシリンジポンプ２９が平衡状態であることを確認するためである。以上の準備により、細胞１００は、第１ピペット２５及び第２ピペット３５の近傍に配置される。
図１１は、実施形態のマニピュレーションシステム１０の動作の第一例を示すフローチャート図である。マニピュレーションシステム１０は、試料保持部材１１に載置された複数の細胞１００に対し、１つの細胞１００ごとに操作を行い、複数の細胞１００について操作を繰り返し実行する。コントローラ４３は、複数の細胞１００に対する操作を自動で実行する。マニピュレーションシステム１０による自動操作は、例えば、ＰＣソフト上の開始ボタンを押すことで開始され、コントローラ４３が図１１に示すステップＳＴ２０１の処理を開始する。
まず、ステップＳＴ２０１において、操作者は、マニピュレーションシステム１０が複数回の操作を実行した後、操作を終了する回数である操作終了回数Ｎｅを、図３に示す入力部４９を介してコントローラ４３に設定する。１つの細胞１００ごとに操作を行うので、操作終了回数Ｎｅは、操作を行う細胞１００の個数である。コントローラ４３に操作終了回数Ｎｅが入力されると、演算部４６Ａは、入力された操作終了回数Ｎｅをコントローラ４３の記憶部４６Ｂに記憶させる。ステップＳＴ２０２において、演算部４６Ａ（図３参照）は、実行した操作回数のカウンタ値である操作実行回数ＮをＮ＝０として記憶部４６Ｂ（図３参照）に記憶させる。
次に、ステップＳＴ２０３において、演算部４６Ａは、操作対象の細胞１００を第１ピペット２５で保持させる。具体的には、まず、コントローラ４３の画像処理部４３Ｂは、顕微鏡２０を通してカメラ１８が撮像した画像データの画像処理を行う。コントローラ４３の位置検出部４３Ｄは、画像処理によって、カメラ１８の画面上における第１ピペット２５の先端中央の位置座標及び第２ピペット３５の先端中央の位置座標を検出する。次に、演算部４６Ａは、第１マニピュレータ１４を駆動して、検出結果に基づいて、第１ピペット２５を所定位置へ移動させる。所定位置は、第１ピペット２５の先端中央が操作対象の細胞１００に対向する位置である。さらに、演算部４６Ａは、第１マニピュレータ１４のシリンジポンプ２９を駆動させ、第１ピペット２５の吸引を実行させる。シリンジポンプ２９が駆動すると、第１ピペット２５の内部は陰圧となり、第１ピペット２５の開口に向かって試料保持部材１１の溶液の流れが発生する。細胞１００は、溶液とともに吸引されて、第１ピペット２５の先端に吸着し、保持される。ここで、細胞１００が保持されたかを確認するために、第１ピペット２５の先端近傍に細胞１００があるか、画像処理によって検出して判断するようにしてもよい。
次に、ステップＳＴ２０４において、画像処理部４３Ｂは、細胞１００の画像データを取得する。ステップＳＴ２０５において、演算部４６Ａは、画像を取得した焦点位置Ｆｚを取得する。演算部４６Ａは、取得した焦点位置Ｆｚを、記憶部４６Ｂに記憶させる。ステップＳＴ２０６において、位置検出部４３Ｄは、取得した画像データに基づいて、細胞１００及び核小体１１４の位置及び形状を画像処理シーケンスにより検出する。ステップＳＴ２０７において、位置検出部４３Ｄは、核小体１１４が検出されたか否かを判断する。ステップＳＴ２０７において、核小体１１４が検出されないと判断された場合（ステップＳＴ２０７；Ｎｏ）、ステップＳＴ２０６に戻り、画像処理部４３Ｂは、再び細胞１００及び核小体１１４の位置及び形状を画像シーケンスにより再度検出する。ステップＳＴ２０７において、核小体１１４が検出されないと判断した場合、ステップＳＴ２０４に戻って、画像処理部４３Ｂが細胞１００の画像データを再度取得してもよい。ステップＳＴ２０４において、画像データを再度取得する前に、演算部４６Ａは、第１ピペット２５による細胞１００の保持を一時解除して細胞１００の姿勢を変更させるようにしてもよい。ステップＳＴ２０７において、核小体１１４が検出されたと判断された場合（ステップＳＴ２０７；Ｙｅｓ）、ステップＳＴ２０８に移行する。
核小体１１４が検出されたと判断された場合（ステップＳＴ２０７；Ｙｅｓ）、ステップＳＴ２０８において、演算部４６Ａは、核小体１１４の中心位置ＣのＸ座標Ｃｘ及びＹ座標Ｃｙを取得する。演算部４６Ａは、取得した中心位置ＣのＸ座標Ｃｘ及びＹ座標Ｃｙを、記憶部４６Ｂに記憶させる。
ステップＳＴ２０９において、演算部４６Ａは、核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅが所定の閾値以上か否かを判断する。所定の閾値は、記憶部４６Ｂに予め記憶されているものとする。ステップＳＴ２０９において、核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅが所定の閾値以上であると判断された場合（ステップＳＴ２０９；Ｙｅｓ）、ステップＳＴ２１０に移行する。ステップＳＴ２０９において、核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅが所定の閾値より小さいと判断された場合（ステップＳＴ２０９；Ｎｏ）、ステップＳＴ２１１に移行する。
核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅが所定の閾値以上である場合（ステップＳＴ２０９；Ｙｅｓ）、ステップＳＴ２１０において、演算部４６Ａは、ステップＳＴ２０５で取得した焦点位置Ｆｚを、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚとして決定する（Ｃｚ＝Ｆｚ）。演算部４６Ａは、決定した中心位置ＣのＺ座標Ｃｚを、記憶部４６Ｂに記憶させる。
核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅが所定の閾値より小さい場合（ステップＳＴ２０９；Ｎｏ）、ステップＳＴ２１１において、演算部４６Ａは、核小体１１４の中心位置Ｃを通る所定の直線α上において、核小体１１４の周辺１１４ｏの濃度値Ｂｏ及び核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉを取得する。演算部４６Ａは、取得した濃度値Ｂｏ及び濃度値Ｂｉを、記憶部４６Ｂに記憶させる。ステップＳＴ２１２において、演算部４６Ａは、濃度値Ｂｏ及び濃度値Ｂｉに基づいて、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚを決定する。より詳しくは、演算部４６Ａは、核小体１１４の周辺１１４ｏの濃度値Ｂｏと核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉとの濃度差を算出する。演算部４６Ａは、算出した濃度差と、所定の参照データとに基づいて、ずれ量Ｌとずれ方向とを推定する。演算部４６Ａは、推定したずれ量Ｌ及びずれ方向から、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚを決定する。
ステップＳＴ２１０又はステップＳＴ２１２で核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚを決定した後、ステップＳＴ２１３において、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚに基づいて、第１ピペット２５をＺ軸方向に移動させる。演算部４６Ａは、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚと焦点位置Ｆｚとに基づいて、第１ピペット２５の移動距離及び移動方向を決定する。演算部４６Ａは、第１マニピュレータ１４を駆動して、第１ピペット２５を決定した移動方向に決定した移動距離を移動させる。
ステップＳＴ２１４において、演算部４６Ａは、第２ピペット３５で細胞１００へのインジェクション操作を実行させる。具体的には、まず、演算部４６Ａは、ステップＳＴ２０３で取得した第２ピペット３５の先端の位置座標と、ステップＳＴ２０８で取得した核小体１１４の中心位置ＣのＸＹ座標（Ｃｘ，Ｃｙ）と、焦点位置Ｆｚ（核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚ）とに基づいて、第２ピペット３５の先端を所定の挿入開始位置に移動させる。次に、演算部４６Ａは、第２ピペット３５をＸ軸方向に所定速度で移動させ、細胞膜１０２及び核膜１１２を穿孔させる。これにより、第２ピペット３５の先端は、核膜１１２内に差し込まれる。さらに、演算部４６Ａは、第２マニピュレータ１６の注入ポンプ３９を駆動させ、細胞１００に対するＤＮＡ溶液等のインジェクション操作を実行させる。演算部４６Ａは、例えば、予め設定された時間、注入ポンプ３９を駆動させてインジェクション操作を実行させてもよい。画像処理部４３Ｂは、インジェクション操作中に画像処理を実行し、核膜１１２の膨らみを検出して、ＤＮＡ溶液等のインジェクションが完了したか判断してもよい。
インジェクション操作を実行した後、ステップＳＴ２１５において、演算部４６Ａは、第１マニピュレータ１４を駆動して、第１ピペット２５を所定の初期位置へ移動させる。演算部４６Ａは、第２マニピュレータ１６を駆動して、第２ピペット３５を所定の初期位置へ移動させる。
ステップＳＴ２１６において、演算部４６Ａは、操作実行回数Ｎのカウンタ値を１つ増やして、Ｎ＝Ｎ＋１として記憶部４６Ｂに記憶させる。ステップＳＴ２１７において、演算部４６Ａは、操作実行回数Ｎが操作終了回数Ｎｅに達したか否かを判断する。ステップＳＴ２１７において、操作実行回数Ｎが操作終了回数Ｎｅよりも小さいと判断された場合（ステップＳＴ２１７；Ｎｏ）、ステップＳＴ２０３に戻って別の細胞１００に対する保持操作、細胞１００及び核小体１１４の検出操作、核膜１１２内へのインジェクション操作を繰り返し実行する。ステップＳＴ２１７において、操作実行回数Ｎが操作終了回数Ｎｅ以上と判断された場合（ステップＳＴ２１７；Ｙｅｓ）、予め設定された個数の細胞１００に対する操作が終了し、図１１に示すフローチャートの処理を終了する。
図１２は、実施形態のマニピュレーションシステム１０の動作の第二例を示すフローチャート図である。図１２に示すステップＳＴ３０１～ステップＳＴ３０８の処理は、第一例のステップＳＴ２０１～ステップＳＴ２０８の処理と同様であるため、説明を省略する。第二例の処理において、コントローラ４３は、ステップＳＴ３０８を終了すると、ステップＳＴ３０９の処理を開始する。
ステップＳＴ３０９において、演算部４６Ａは、核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅが所定の閾値以上か否かを判断する。所定の閾値は、記憶部４６Ｂに予め記憶されているものとする。ステップＳＴ３０９において、核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅが所定の閾値より小さいと判断された場合（ステップＳＴ３０９；Ｎｏ）、ステップＳＴ３１０に移行する。ステップＳＴ３０９において、核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅが所定の閾値以上であると判断された場合（ステップＳＴ３０９；Ｙｅｓ）、ステップＳＴ３１６に移行する。
核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅが所定の閾値より小さい場合（ステップＳＴ３０９；Ｎｏ）、ステップＳＴ３１０において、演算部４６Ａは、核小体１１４の中心位置Ｃを通る所定の直線α上において、核小体１１４の周辺１１４ｏの濃度値Ｂｏ及び核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉを取得する。演算部４６Ａは、取得した濃度値Ｂｏ及び濃度値Ｂｉを、記憶部４６Ｂに記憶させる。
ステップＳＴ３１１において、演算部４６Ａは、濃度値Ｂｏ及び濃度値Ｂｉに基づいて、第１ピペット２５のＺ軸上の移動方向を決定する。より詳しくは、演算部４６Ａは、核小体１１４の周辺１１４ｏの濃度値Ｂｏと核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉとの濃度差が所定の閾値以上か否かを判断する。所定の閾値は、記憶部４６Ｂに予め記憶されているものとする。演算部４６Ａは、濃度差が所定の閾値以上であると判断した場合、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚが焦点位置Ｆｚより上方にあるものとして判断する。すなわち、演算部４６Ａは、第１ピペット２５を移動させる方向を、下方向に決定する。演算部４６Ａは、濃度差が所定の閾値以下であると判断した場合、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚが焦点位置Ｆｚより下方にあるものとして判断する。すなわち、演算部４６Ａは、第１ピペット２５を移動させる方向を、上方向に決定する。
次に、ステップＳＴ３１２において、演算部４６Ａは、第１マニピュレータ１４を駆動して、第１ピペット２５をステップＳＴ３１１で決定した方向のＺ軸方向に所定距離移動させる。所定距離は、予め設定され、記憶部４６Ｂに予め記憶されているものとする。演算部４６Ａは、移動後の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚを、記憶部４６Ｂに記憶させる。ステップＳＴ３１３において、画像処理部４３Ｂは、細胞１００の画像データを取得する。ステップＳＴ３１４において、位置検出部４３Ｄは、取得した画像データに基づいて、細胞１００及び核小体１１４の位置及び形状を画像処理シーケンスにより検出する。
ステップＳＴ３１５において、演算部４６Ａは、核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅが所定の閾値以上か否かを判断する。ステップＳＴ３１５において、核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅが所定の閾値より小さいと判断された場合（ステップＳＴ３１５；Ｎｏ）、ステップＳＴ３１２に戻り、ステップＳＴ３１５でＹｅｓと判断されるまでステップＳＴ３１２からステップＳＴ３１５を繰り返し実行する。ステップＳＴ３１５において、核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅが所定の閾値以上であると判断された場合（ステップＳＴ３１５；Ｙｅｓ）、ステップＳＴ３１６に移行する。
核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅが所定の閾値以上である場合（ステップＳＴ３０９；Ｙｅｓ、又はステップＳＴ３１５；Ｙｅｓ）、ステップＳＴ３１６において、演算部４６Ａは、ステップＳＴ３０５で取得した焦点位置Ｆｚを、核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚとして決定する（Ｃｚ＝Ｆｚ）。すなわち、演算部４６Ａは、現在の核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚが、焦点位置Ｆｚに一致しているものとして判断する。
ステップＳＴ３１７において、演算部４６Ａは、第２ピペット３５で細胞１００へのインジェクション操作を実行させる。具体的には、まず、演算部４６Ａは、ステップＳＴ３０３で取得した第２ピペット３５の先端の位置座標と、ステップＳＴ３０８で取得した核小体１１４の中心位置ＣのＸＹ座標（Ｃｘ，Ｃｙ）と、焦点位置Ｆｚ（核小体１１４の中心位置ＣのＺ座標Ｃｚ）とに基づいて、第２ピペット３５の先端を所定の挿入開始位置に移動させる。次に、演算部４６Ａは、第２ピペット３５をＸ軸方向に所定速度で移動させ、細胞膜１０２及び核膜１１２を穿孔させる。これにより、第２ピペット３５の先端は、核膜１１２内に差し込まれる。さらに、演算部４６Ａは、第２マニピュレータ１６の注入ポンプ３９を駆動させ、細胞１００に対するＤＮＡ溶液等のインジェクション操作を実行させる。演算部４６Ａは、例えば、予め設定された時間、注入ポンプ３９を駆動させてインジェクション操作を実行させてもよい。画像処理部４３Ｂは、インジェクション操作中に画像処理を実行し、核膜１１２の膨らみを検出して、ＤＮＡ溶液等のインジェクションが完了したか判断してもよい。
インジェクション操作を実行した後、ステップＳＴ３１８において、演算部４６Ａは、第１マニピュレータ１４を駆動して、第１ピペット２５を所定の初期位置へ移動させる。演算部４６Ａは、第２マニピュレータ１６を駆動して、第２ピペット３５を所定の初期位置へ移動させる。
ステップＳＴ３１９において、演算部４６Ａは、操作実行回数Ｎのカウンタ値を１つ増やして、Ｎ＝Ｎ＋１として記憶部４６Ｂに記憶させる。ステップＳＴ３２０において、演算部４６Ａは、操作実行回数Ｎが操作終了回数Ｎｅに達したか否かを判断する。ステップＳＴ３２０において、操作実行回数Ｎが操作終了回数Ｎｅよりも小さいと判断された場合（ステップＳＴ３２０；Ｎｏ）、ステップＳＴ３０３に戻って別の細胞１００に対する保持操作、細胞１００及び核小体１１４の検出操作、核膜１１２内へのインジェクション操作を繰り返し実行する。ステップＳＴ３２０において、操作実行回数Ｎが操作終了回数Ｎｅ以上と判断された場合（ステップＳＴ３２０；Ｙｅｓ）、予め設定された個数の細胞１００に対する操作が終了し、図１２に示すフローチャートの処理を終了する。
以上説明したように、本実施形態のマニピュレーションシステム１０は、試料ステージ２２と、第１マニピュレータ１４と、第２マニピュレータ１６と、顕微鏡ユニット１２と、コントローラ４３と、を備える。試料ステージ２２には、細胞１００が載置される。第１マニピュレータ１４は、細胞１００を保持するための第１ピペット２５を備える。第２マニピュレータ１６は、第１ピペット２５に保持された細胞１００を操作するための第２ピペット３５を備える。顕微鏡ユニット１２は、細胞１００を撮像する。コントローラ４３は、試料ステージ２２、第１ピペット２５、第２ピペット３５及び顕微鏡ユニット１２を制御する。コントローラ４３は、顕微鏡ユニット１２による撮像画像における細胞１００の核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅ（濃度値Ｂの微分値）が所定の閾値より小さい場合、顕微鏡ユニット１２側又は試料ステージ２２側に、第１ピペット２５を移動させる。
これにより、操作者の目視による判断によらず、撮像画像から検出した核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅ（濃度値Ｂの微分値）に基づいて、核小体１１４の中心位置ＣがＺ軸方向に焦点位置Ｆｚからずれているか否かを判断することができる。核小体１１４の中心位置Ｃが焦点位置Ｆｚからずれている場合は、第１ピペット２５を顕微鏡ユニット１２側又は試料ステージ２２側に移動させて調節することによって、立体構造である核小体１１４に対して好適な位置で操作することができる。また、これらの動作を自動で行うため、操作者の熟練度及び技術によらず、操作対象の細胞１００に好適に穿孔操作することができる。
また、本実施形態のコントローラ４３は、撮像画像における核小体１１４の周辺１１４ｏの濃度値Ｂｏ及び核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉとの濃度差に基づいて、Ｚ軸方向における核小体１１４の中心位置Ｃ（Ｚ座標Ｃｚ）を決定し、決定した核小体１１４の中心位置Ｃに基づいて、第１ピペット２５を顕微鏡ユニット１２側又は試料ステージ２２側に移動させる距離を決定する。これにより、操作者の目視による判断によらず、撮像画像から検出した核小体１１４の周辺１１４ｏの濃度値Ｂｏ及び内部１１４ｉの濃度値Ｂｉとの濃度差に基づいて、核小体１１４の中心位置Ｃが焦点位置Ｆｚに対して、どの程度ずれているかを判断することができる。したがって、核小体１１４の中心位置Ｃの調整のために移動させる第１ピペット２５の移動距離を決定できるので、１度で第１ピペット２５を好適な位置に移動させることができ、調整が容易である。
さらに、本実施形態のコントローラ４３は、撮像画像を取得した焦点位置Ｆｚと、決定した核小体１１４の中心位置Ｃ（Ｚ座標Ｃｚ）とのＺ軸方向のずれ量Ｌを、第１ピペット２５を顕微鏡ユニット１２側又は試料ステージ２２側に移動させる距離として決定する。これにより、核小体１１４の中心位置Ｃの調整のために移動させる第１ピペット２５の移動距離を容易に決定できる。
また、本実施形態のコントローラ４３は、撮像画像における核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅ（濃度値Ｂの微分値）が所定の閾値より小さい場合、核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅが所定の閾値以上になるまで、顕微鏡ユニット１２側又は試料ステージ２２側（Ｚ軸方向）に、第１ピペット２５を所定距離ずつ移動させる。これによれば、調整中の核小体１１４の輪郭１１４ｅのエッジ強度Ｓｅを都度確認するので、より好適に核小体１１４の中心位置Ｃ（Ｚ座標Ｃｚ）が焦点位置Ｆｚに合わせることができる。
また、本実施形態のコントローラ４３は、撮像画像における核小体１１４の周辺１１４ｏの濃度値Ｂｏと核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉとの濃度差に基づいて、Ｚ軸方向において第１ピペット２５を移動させる方向を顕微鏡ユニット１２に近付く方向又は試料ステージ２２に近付く方向に決定する。これにより、操作者の目視による判断によらず、撮像画像から検出した核小体１１４の周辺１１４ｏの濃度値Ｂｏ及び内部１１４ｉの濃度値Ｂｉとの濃度差に基づいて、核小体１１４の中心位置Ｃ（Ｚ座標Ｃｚ）が焦点位置Ｆｚに対して、試料ステージ２２側（下方）と顕微鏡ユニット１２側（上方）とのいずれかにずれているかを判断することができる。したがって、核小体１１４の中心位置Ｃの調整のために移動させる第１ピペット２５の移動方向を決定できるので、調整が容易である。
また、本実施形態のコントローラ４３は、撮像画像における核小体１１４の周辺１１４ｏの濃度値Ｂｏと核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉとの濃度差が所定の閾値以上である場合、Ｚ軸方向において第１ピペット２５を移動させる方向を、試料ステージ２２に近付く方向（下方向）に決定する。これによれば、一定の判断基準をもって、核小体１１４の中心位置Ｃ（Ｚ座標Ｃｚ）が焦点位置Ｆｚに対して顕微鏡ユニット１２側（上方）にずれていると、操作者の熟練度及び技術によらず、判断することができる。
また、本実施形態のコントローラ４３は、撮像画像における核小体１１４の周辺１１４ｏの濃度値Ｂｏと核小体１１４の内部１１４ｉの濃度値Ｂｉとの濃度差が所定の閾値以下である場合、Ｚ軸方向において第１ピペット２５を移動させる方向を、顕微鏡ユニット１２に近付く方向（上方向）に決定する。これによれば、一定の判断基準をもって、核小体１１４の中心位置Ｃ（Ｚ座標Ｃｚ）が焦点位置Ｆｚに対して試料ステージ２２側（下方）にずれていると、操作者の熟練度及び技術によらず、判断することができる。
１０ マニピュレーションシステム
１１ 試料保持部材
１２ 顕微鏡ユニット（撮像部）
１４ 第１マニピュレータ
１６ 第２マニピュレータ
１８ カメラ
２０ 顕微鏡
２２ 試料ステージ
２４ 第１ピペット保持部材
２５ 第１ピペット
２６ Ｘ－Ｙ軸テーブル
２８ Ｚ軸テーブル
２９ シリンジポンプ
３０、３２ 駆動装置
３４ 第２ピペット保持部材
３５ 第２ピペット
３６ Ｘ－Ｙ軸テーブル
３８ Ｚ軸テーブル
３９ 注入ポンプ
４０、４２ 駆動装置
４３ コントローラ（制御装置）
４３Ａ 画像入力部
４３Ｂ 画像処理部
４３Ｃ 画像出力部
４３Ｄ 位置検出部
４４、５４ 微動機構
４４ａ 圧電アクチュエータ
４５ 表示部
４６Ａ 演算部
４６Ｂ 記憶部
４７ ジョイスティック
４７Ａ ボタン
４９ 入力部
８０、８２ 転がり軸受
８０ａ、８２ａ 内輪
８０ｂ、８２ｂ 外輪
８０ｃ、８２ｃ ボール
８１ 焦点合わせ機構
８４ 中空部材
８４ａ フランジ部
８６ ロックナット
８７ ハウジング
８８ 蓋
９０ スペーサ
９２ 圧電素子
１００ 細胞
１０２ 細胞膜
１１０ 核
１１２ 核膜
１１４ 核小体
１１４ｏ 周辺
１１４ｉ 内部
１１４ｅ 輪郭
Ｃ 中心位置
Ｃｘ Ｘ座標
Ｃｙ Ｙ座標
Ｃｚ Ｚ座標
Ｆｚ 焦点位置
Ｌ ずれ量
α 直線
Ｂ、Ｂｏ、Ｂｉ 濃度値
Ｓｅ エッジ強度
ＶＸＹ、ＶＺ 駆動信号
ＶＮ ナノポジショナ制御信号
ＶＰＩＸ 画像信号
Ｎ 操作実行回数
Ｎｅ 操作終了回数

Claims (7)

  1. 細胞が載置される試料ステージと、
    前記細胞を保持するための第１ピペットを備える第１マニピュレータと、
    前記第１ピペットに保持された前記細胞を操作するための第２ピペットを備える第２マニピュレータと、
    前記細胞を撮像する撮像部と、
    前記試料ステージ、前記第１ピペット、前記第２ピペット及び前記撮像部を制御するコントローラと、
    を備え、
    前記コントローラは、
    前記撮像部による撮像画像における前記細胞の核小体の周辺の濃度値及び前記核小体の内部の濃度値との濃度差に基づいて、前記試料ステージの前記細胞を載置するＸ－Ｙ平面に直交するＺ軸方向における前記核小体の中心位置を決定し、決定した前記核小体の中心位置に基づいて、前記第１ピペットを前記撮像部側又は前記試料ステージ側に移動させる距離を決定し、
    前記撮像画像における前記核小体の輪郭の濃度値の微分値が所定の閾値より小さい場合、前記撮像部側又は前記試料ステージ側に、前記第１ピペットを移動させる、
    マニピュレーションシステム。
  2. 前記コントローラは、前記撮像画像を取得した焦点位置と、決定した前記核小体の中心位置とのずれ量を、前記第１ピペットを前記撮像部側又は前記試料ステージ側に移動させる距離として決定する、
    請求項１に記載のマニピュレーションシステム。
  3. 細胞が載置される試料ステージと、
    前記細胞を保持するための第１ピペットを備える第１マニピュレータと、
    前記第１ピペットに保持された前記細胞を操作するための第２ピペットを備える第２マニピュレータと、
    前記細胞を撮像する撮像部と、
    前記試料ステージ、前記第１ピペット、前記第２ピペット及び前記撮像部を制御するコントローラと、
    を備え、
    前記コントローラは、
    前記撮像部による撮像画像における前記細胞の核小体の輪郭の濃度値の微分値が所定の閾値より小さい場合、前記撮像画像における前記核小体の周辺の濃度値と前記核小体の内部の濃度値との濃度差に基づいて、前記第１ピペットを移動させる方向を前記撮像部に近付く方向又は前記試料ステージに近付く方向に決定し、決定した方向に、前記第１ピペットを移動させる、
    マニピュレーションシステム。
  4. 細胞が載置される試料ステージと、
    前記細胞を保持するための第１ピペットを備える第１マニピュレータと、
    前記第１ピペットに保持された前記細胞を操作するための第２ピペットを備える第２マニピュレータと、
    前記細胞を撮像する撮像部と、
    前記試料ステージ、前記第１ピペット、前記第２ピペット及び前記撮像部を制御するコントローラと、
    を備え、
    前記コントローラは、
    前記撮像部による撮像画像における前記細胞の核小体の周辺の濃度値と前記核小体の内部の濃度値との濃度差が所定の閾値以上である場合、前記第１ピペットを移動させる方向を、前記試料ステージに近付く方向に決定し、
    前記撮像画像における前記核小体の輪郭の濃度値の微分値が所定の閾値より小さい場合、前記試料ステージに近付く方向に、前記第１ピペットを移動させる、
    マニピュレーションシステム。
  5. 細胞が載置される試料ステージと、
    前記細胞を保持するための第１ピペットを備える第１マニピュレータと、
    前記第１ピペットに保持された前記細胞を操作するための第２ピペットを備える第２マニピュレータと、
    前記細胞を撮像する撮像部と、
    前記試料ステージ、前記第１ピペット、前記第２ピペット及び前記撮像部を制御するコントローラと、
    を備え、
    前記コントローラは、
    前記撮像部による撮像画像における前記細胞の核小体の周辺の濃度値と前記核小体の内部の濃度値との濃度差が所定の閾値以下である場合、前記第１ピペットを移動させる方向を、前記撮像部に近付く方向に決定し、
    前記撮像画像における前記核小体の輪郭の濃度値の微分値が所定の閾値より小さい場合、前記撮像部に近付く方向に、前記第１ピペットを移動させる、
    マニピュレーションシステム。
  6. 前記コントローラは、前記撮像画像における前記核小体の輪郭の濃度値の微分値が所定の閾値より小さい場合、前記核小体の輪郭の濃度値の微分値が所定の閾値以上になるまで、前記撮像部側又は前記試料ステージ側に、前記第１ピペットを所定距離ずつ移動させる、
    請求項３から５のいずれか１項に記載のマニピュレーションシステム。
  7. 細胞が載置される試料ステージと、
    前記細胞を保持するための第１ピペットを備える第１マニピュレータと、
    前記第１ピペットに保持された前記細胞を操作するための第２ピペットを備える第２マニピュレータと、
    前記細胞を撮像する撮像部と、
    を備えるマニピュレーションシステムの駆動方法であって、
    前記撮像部に前記細胞を撮像させるステップと、
    撮像画像から前記細胞の核小体の輪郭を検出するステップと、
    前記核小体の輪郭の濃度値の微分値が所定の閾値より小さい場合、前記撮像画像における前記核小体の周辺の濃度値と前記核小体の内部の濃度値との濃度差に基づいて、前記第１ピペットを移動させる方向を前記撮像部に近付く方向又は前記試料ステージに近付く方向に決定するステップと、
    決定した方向に、前記第１ピペットを移動させるステップと、
    を含むマニピュレーションシステムの駆動方法。
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