JP7329048B2 - Ｄ－プシコース結晶及びその製造方法 - Google Patents

Description

本出願は、Ｄ－プシコース含有溶液から高い収率でＤ－プシコース結晶を製造する方法に関する。

Ｄ－プシコース（Pscicose）は、フルクトース（D-fructose）のエピマーであり、希少糖として知られる機能性糖類の一種である。また、砂糖の約６０～７０％の高甘味度を示すものの、熱量はほとんどゼロカロリーであり、糖尿病の予防及び改善に効能があることが知られている。さらに、プシコースは、溶解性にも優れることが知られており、食品への活用が注目されている素材の１つである。エピマー化反応により生産されたＤ－プシコースを含む反応液は約２０～３０％（ｗ／ｗ）のＤ－プシコース固形分を含む低純度であるので、それを９８％以上のＤ－プシコース結晶剤形に製造するために、クロマトグラフィーや結晶化技術などの分離精製技術が必要である。通常、糖類の結晶化方法として、過飽和状態における準安定領域（metastable zone，飽和濃度と自発的結晶が析出する最低過飽和濃度間の範囲）内で結晶の成長を誘導する原理を用いる。Ｄ－プシコースは、過飽和濃度範囲においても結晶生成速度と結晶成長速度がほとんど変化しないという特性を有するので、粒成長、結晶化条件が厳しい糖類に分類される。

準安定領域の濃度においては結晶核形成（crystal nucleation）などの結晶化現象は起こらないが、外部から新規結晶を投入すれば結晶成長（crystal growth）が起こり、結晶の大きさが大きくなる。すなわち、結晶を生成するために、飽和濃度以上の溶液に種晶（seed）を投入すると、準安定領域（metastable zone）で種晶が成長することにより結晶が成長する。

Ｄ－プシコースは、スクロースに比べて結晶の成長速度が非常に遅いので、冷却結晶化法を用いるのが一般的であり、産業化のために経済性の高い技術の開発が求められている。

Ｄ－プシコースを結晶化する過程で大量のエタノールを用いる方法が報告されており（非特許文献１）、前記文献の方法により結晶核の成長は起こるが、結晶の成長は起こらない。具体的には、結晶化工程中に無定形の塊によるブロッキング（Blocking）現象が生じ、微粒子結晶が生成される原因となる。工程中にブロックが発生すると、結晶化器の外部に移送することが困難になり、粉砕も行えないので、生産収率が低くなる。また、通常、糖類結晶化産業において結晶粒度の大きさは重要な因子として認識されており、大量生産システムにおいて生成される結晶が微粒子であると、結晶遠心分離機から母液（crystal mother liquor）と共に排出されやすくなり、分離されて残った微粒子は乾燥時に結晶が固結する現象が生じて篩分け工程で除外されるので、最終製品の生産量が少なくなり、商品性が低下する。よって、このような微粒子結晶は、大量生産方法に適さない。また、エタノールを用いた糖類の結晶化において、最終的に残留するエタノールの濃度が高いと、それによる異味、異臭が発生するので、糖類結晶製品の商品性が低下する。

韓国公開特許第１０－２０１１－００３５８０５号公報 韓国登録特許第１０－１２０３８５６号公報 韓国登録特許第１０－１４５５７５９号公報 韓国公開特許第１０－２０１５－００４７１１１号公報

Kei T、et、al.、J. Biosci. Bioeng.、90(4)、453-455、2000

本発明者らは、操業可能な許容範囲のＤ－プシコース濃縮溶液と有機溶媒を用いて結晶の回収率を増加させ、結晶粒度を成長させることができることを確認し、結晶化製造工程の流動性及び製品としての商品性が改善された、ＭＡ２００以上の結晶粒度を有する純度９８％（ｗ／ｗ）以上の異味／異臭のない高純度Ｄ－プシコースを製造する方法を開発した。

本出願は、Ｄ－プシコース（psicose）結晶であって、結晶全体を１００％（ｗ／ｗ）とすると、９８％（ｗ／ｗ）以上のＤ－プシコース、及び０．００１～０．０５％（ｗ／ｗ）のエタノールを含むＤ－プシコース結晶を提供することを目的とする。

また、本出願は、Ｄ－プシコース含有溶液と有機溶媒を混合する第１ステップと、第１ステップで得られた混合液に種晶（seed）を投入し、その後冷却してＤ－プシコース結晶を含むマスキットを得る第２ステップとを含む、Ｄ－プシコース結晶の製造方法を提供することを目的とする。

本願のＤ－プシコース結晶の製造方法においては、Ｄ－プシコース含有溶液に有機溶媒を混合し、その後種晶を添加して徐々に冷却する結晶化方法により、Ｄ－プシコース溶液からのＤ－プシコース結晶の収率が高くなるだけでなく、異味／異臭がなく、大量生産に活用するのに十分な大きさと適切な形状を有するＤ－プシコース結晶を製造することができる。

実施例１で製造したＤ－プシコース結晶の顕微鏡写真である。 実施例１で製造したＤ－プシコース結晶の粒度分析結果である。 実施例２で製造したＤ－プシコース結晶組成物の粒度分析結果である。 実施例６で生成したＤ－プシコース結晶ケーキの形状を示す図である。 実施例１のＤ－プシコース結晶表面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。 比較例のＤ－プシコース結晶表面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。 安息角測定方法を示す図である。

以下、本出願をより詳細に説明する。

なお、本願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。

また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本発明の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本発明に含まれることが意図されている。

前記課題を解決するための本出願の一態様は、Ｄ－プシコース（psicose）結晶であって、結晶全体を１００％（ｗ／ｗ）とすると、９８％（ｗ／ｗ）以上のＤ－プシコース、及び０．００１～０．０５％（ｗ／ｗ）のエタノールを含むＤ－プシコース結晶を提供する。

本出願における「Ｄ－プシコース（psicose）」とは、低い熱量の単糖類であり、Ｃ_６Ｈ_１２Ｏ_６の分子式及び次の構造式を有するものを意味する。Ｄ－プシコースには、鎖状の構造以外にも、ａｌｐｈａ型及びｂｅｔａ型の六角環状の構造も含まれる
。

本願における「Ｄ－プシコース結晶」とは、Ｄ－プシコース分子が規則的な繰り返し構造に配置された固体を意味し、繰り返し構造を有さない無定形の固体の塊とは異なる。本願のＤ－プシコース結晶は、９８％（ｗ／ｗ）以上、具体的には９８．５％（ｗ／ｗ）以上、より具体的には９９％（ｗ／ｗ）以上の純度を有するものであってもよい。

本願のＤ－プシコース結晶を製造する上でエタノールを添加するステップを伴うので、Ｄ－プシコース結晶にはエタノールが極微量含まれてもよい。前記エタノールの含有量は、０．０５％（ｗ／ｗ）以下、具体的には０．０４％（ｗ／ｗ）以下、より具体的には０．０３％（ｗ／ｗ）以下である。例えば、前記エタノール含有量は、０．００１～０．０５％（ｗ／ｗ）、０．００１～０．０４％（ｗ／ｗ）、０．００１～０．０３％（ｗ／ｗ）、０．００５～０．０５％（ｗ／ｗ）、０．００５～０．０４％（ｗ／ｗ）、０．００５～０．０３％（ｗ／ｗ）、０．０１～０．０５％（ｗ／ｗ）、０．０１～０．０４％（ｗ／ｗ）、０．０１～０．０３％（ｗ／ｗ）、０．０２～０．０５％（ｗ／ｗ）、０．０２～０．０４％（ｗ／ｗ）又は０．０２～０．０３％（ｗ／ｗ）であってもよい。本願の非限定的な一実施例によれば、エタノールを前記含有量で含むと、異味／異臭が発生しないので、エタノールが添加されていないＤ－プシコース結晶と同等に用いることができ（試験例２）、エタノールを極微量含むことにより、Ｄ－プシコース結晶の表面が滑らかになり、エタノールが添加されていないＤ－プシコース結晶に比べて光沢やツヤが良くなる（試験例３）。また、エタノールを極微量含むことにより、Ｄ－プシコース結晶の流動性が増加し、種晶が分散した状態で結晶化されるので、高い収率及び結晶化度を有する（試験例４）。前記結晶の流動性は、流動性の測定及び安息角の測定により確認することができる。安息角とは、まだ固結していない堆積物が斜面上に堆積する際に流れ落ちずに堆積する最大の傾斜角を意味する。安息角は、Ｄ－プシコース結晶組成物が水平板面上に設置された漏斗を所定速度で通過するようにし、その後組成物の上面の角度を分度器で測定することができる（図６）。

前記％（ｗ／ｗ）は、重量％と混用されてもよい。これは、全結晶１００重量部に対する結晶重量、又は結晶を含む溶液１００重量部に対する結晶重量を意味する。具体的には、全結晶１００重量部に対するＤ－プシコース結晶重量、又は結晶を含む溶液１００重量部に対するＤ－プシコース結晶重量を意味する。前記結晶は、乾燥固形分（Dry solid、DS）を含んでもよい。

また、本願における「結晶平均粒度」とは、結晶の平均の大きさを示す尺度を意味する。

Ｄ－プシコースの結晶粒度を測定する方法は、限定されるものではなく、当該技術分野で通常用いられる方法を用いることができる。結晶粒度を測定する例として、比較法（ＦＧＣ）、切断法（ＦＧＩ）、求積法（ＦＧＰ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本願のＤ－プシコース結晶は、結晶の平均粒度（ＭＡ：面積平均）が６０μｍ以上、１００μｍ以上、１５０μｍ以上、２００μｍ以上、２３０μｍ以上、２５０μｍ以上、３００μｍ以上又は３２０μｍ以上であってもよい。例えば、１００μｍ～５００μｍ、１５０μｍ～４５０μｍ、２００μｍ～４００μｍ、２３０μｍ～４００μｍ、３００μｍ～４００μｍ、３２０μｍ～４００μｍ又は３２０μｍ～３９０μｍであってもよい。

本願Ｄ－プシコース結晶のｄ１０は、結晶分布の下位１０％に相当する値であり、１００μｍ以上、１１０μｍ以上、１３０μｍ以上又は１５０μｍ以上であってもよい。例えば、１００μｍ～２００μｍ、１００μｍ～１８０μｍ、１１０μｍ～１８０μｍ、１１０μｍ～１６０μｍ、１３０μｍ～１８０μｍ、１３０μｍ～１６０μｍ、１５０μｍ～１８０μｍ又は１５０μｍ～１６０μｍであってもよい。

本願Ｄ－プシコース結晶のｄ５０は、結晶分布の下位５０％に相当する値であり、中央値（Median）と混用されてもよく、１００μｍ以上、１５０μｍ以上、２００μｍ以上、２３０μｍ以上、２５０μｍ以上、３００μｍ以上又は３１０μｍ以上であってもよい。例えば、１００μｍ～５００μｍ、１５０μｍ～４５０μｍ、２００μｍ～４００μｍ、２３０μｍ～４００μｍ、３００μｍ～４００μｍ、３２０μｍ～４００μｍ又は３１０μｍ～３９０μｍであってもよい。

本願Ｄ－プシコース結晶のｄ９０は、結晶分布の下位９０％に相当する値であり、２００μｍ以上、２５０μｍ以上、３００μｍ以上、３３０μｍ以上、３５０μｍ以上、４００μｍ以上又は５００μｍ以上であってもよい。例えば、２００μｍ～８００μｍ、２５０μｍ～７００μｍ、３００μｍ～６５０μｍ、３３０μｍ～６００μｍ、３５０μｍ～６００μｍ、４００μｍ～６００μｍ又は５００μｍ～５９０μｍであってもよい。

本願Ｄ－プシコース結晶の粒度分布は、相対標準偏差又は相対粒度分布により確認することができる。

前記相対標準偏差は、標準偏差を平均粒度で割った百分率の値であり、３０％～６０％、３５％～５５％、３７％～５０％、３８％～４８％又は４０％～４６％であってもよい。

相対粒度分布は、ｄ９０とｄ１０の差でｄ５０を割った値であり、０．８～１．５、０．９～１．４又は１．０～１．３であってもよい。

こうすることにより、結晶遠心分離機から母液と共に消失するＤ－プシコース結晶の量が減少し、結晶が固結する現象を減少させることができる。よって、このような粒径を有する本願のＤ－プシコース結晶は、大量生産に適している。

前記課題を解決するための本願の他の態様は、Ｄ－プシコース含有溶液と有機溶媒を混合する第１ステップと、第１ステップで得られた混合液に種晶（seed）を投入し、その後冷却してＤ－プシコース結晶を含むマスキットを得る第２ステップとを含む、Ｄ－プシコース結晶の製造方法を提供する。

前記「Ｄ－プシコース含有溶液」は、Ｄ－プシコースが溶解しているか、分散している溶液であればいかなるものでもよい。前記Ｄ－プシコース含有溶液は、Ｄ－プシコースを９０％（ｗ／ｗ）以上、具体的には９１％（ｗ／ｗ）以上、９２％（ｗ／ｗ、ＤＳ）以上、９３％（ｗ／ｗ）以上、９４％（ｗ／ｗ）以上又は９５％（ｗ／ｗ）以上含有する高純度のＤ－プシコース含有溶液であるが、これらに限定されるものではない。

前記Ｄ－プシコース含有溶液は、Ｄ－プシコース生産用基質を酵素で処理することによりエピマー化反応させて得た溶液であってもよく、それを分離又は精製したものであってもよい。前記基質と酵素の例として、フルクトースとＤ－プシコースエピメラーゼが挙げられ、フルクトース－６－リン酸とＤ－プシコース－６－リン酸エピメラーゼ及びＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化酵素が挙げられるが、これらに限定されるものではない。具体的には、前記Ｄ－プシコース含有溶液は、フルクトースをＤ－プシコースエピマー化反応させて得た溶液を精製したものであってもよい。より具体的には、前記エピマー化反応に基質として用いるフルクトースは、３０～５０ｂｒｉｘ（％）の濃度、３０～４０℃の温度で用水に溶解させて用いることができる。本願におけるｂｒｉｘ（％）とは、溶液全体の重量に対するＤ－プシコース又はフルクトースの重量の百分率を意味する。ここで、フルクトースは、後続のクロマトグラフィーにより分離されるフルクトース含有溶液と混合してもよく、３０～４０℃の温度、３０～５０ｂｒｉｘ（％）の濃度で用いることができる。ここで、前記クロマトグラフィーにより分離されるフルクトース含有溶液としては、純度７０％（ｗ／ｗ）以上、具体的には７５％（ｗ／ｗ）以上のフルクトース含有分画を用いることができる。

前記Ｄ－プシコースエピマー化反応は、プシコースエピマー化酵素、その変異体、前記酵素を産生する菌株又はその培養物の存在下でフルクトースをエピマー化してＤ－プシコースを生成するものであってもよい。本願に用いられるＤ－プシコースエピマー化酵素は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、フラボニフラクター・プラウティ（Flavonifractor plauti）、クロストリジウム・ハイレモンアエ（Clostridium hylemonae）などの様々なドナー微生物由来の酵素又は変異体であってもよい。前記形質転換用菌株としては、大腸菌（Escherichia coli）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、バシラス（Bacillus）属、アスペルギルス（Aspergillus）属が挙げられるが、これらの菌株に限定されるものではない。前記大腸菌に形質転換された菌株としては、例えばＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２４－ＡＴＰＥ［特許文献１］、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２４－ＡＴＰＥ－２［特許文献２］などが挙げられ、前記コリネバクテリウム属菌株としては、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＪ－１－ＡＴＰＥ［特許文献１の寄託番号ＫＣＣＭ１１０４６］、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＦＩＳ－１－ＡＴＰＥ－２［特許文献２の寄託番号ＫＣＣＭ１１２０４Ｐ］、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＣＪ ＫＹ［特許文献３の寄託番号ＫＣＣＭ１１４０３Ｐ］、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＦＩＳ－２－ＡＴＰＥ－２［特許文献４（韓国特許出願第１０－２０１５－００４７１１１号）の寄託番号ＫＣＣＭ１１６７８Ｐ］などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

例えば、前記エピマー化反応は、プシコースエピマー化酵素、その変異体、前記酵素を産生する菌株又はその培養物を担体、例えばアルギン酸ナトリウムに固定化し、前記固定化した酵素を異性化反応装置、例えばカラムに充填し、その後前記充填したカラムにフルクトースを含む溶液を供給するものであってもよい。前記装置内の温度は、エピマー化反応のために、４０～７０℃の温度、例えば４０～５５℃の温度を維持するようにしてもよい。ここで、供給されるフルクトースを含む溶液は、例えば１時間当たり５～２０℃ずつ、４０～６０℃の温度、例えば５０℃の温度に熱交換器により昇温し、ＳＶ［Space Velocity：流量（Ｌ）／時間（Ｈｒ）／樹脂量（Ｌ）］０．５～３で通過させる。エピマー化反応により生成されたＤ－プシコースの純度は、約１５～約３５％（ｗ／ｗ）、例えば約２０～約３０％（ｗ／ｗ）であってもよい。

前記エピマー化されたＤ－プシコースを含有する溶液は、冷却してもよい。前記冷却は、前記溶液の温度又は周囲の温度を２５～４５℃の範囲、具体的には３０～４０℃の範囲に冷却するものである。具体的には、１時間当たり１～１０℃ずつ徐々に冷却してもよく、前記冷却には熱交換器を用いてもよい。

前記Ｄ－プシコース含有溶液は、Ｄ－プシコースを含有する原液を分離及び／又は精製して得たものであってもよい。すなわち、本願のＤ－プシコース結晶の製造方法は、第１ステップの前に、Ｄ－プシコースを含有する原液を分離及び／又は精製するステップを含んでもよい。

前記Ｄ－プシコース含有溶液は、Ｄ－プシコースを含有する原液を精製して得たものであってもよい。具体的には、前記精製は、脱色剤を充填したカラムを通過させる脱色、イオン交換樹脂クロマトグラフィーによる脱塩、及び連続クロマトグラフィーからなる群から選択される１つ以上によるものであってもよい。

より具体的には、前記エピマー化されたＤ－プシコースを含有する溶液を冷却し、その後脱色剤を充填したカラムに通液して脱色し、強酸性陽イオン交換樹脂と弱塩基性陰イオン交換樹脂を充填したカラムにより精製するものであってもよい。強塩基性陰イオン樹脂を用いると、２５～４５℃の低温でもＤ－プシコースが変性して純度低下が起こり得るので、高い収率でＤ－プシコースを製造するために、弱塩基性陰イオン交換樹脂を用いてもよく、具体的には１００％弱塩基性陰イオン交換樹脂を用いてもよい。イオン成分の効果的除去のために、陽イオン交換樹脂と陰イオン交換樹脂を同時に用いてもよい。その場合、陽イオン交換樹脂と陰イオン交換樹脂の比率は１：０．５～１：３であってもよい。前記イオン精製の間、２５～４５℃の温度、具体的には３０～４０℃の温度が維持されると、Ｄ－プシコースの変性を防止することができる。こうすることにより、Ｄ－プシコース含有溶液中に不純物として含まれるイオン成分が除去される。前記イオン精製後のイオン性成分の含有量は、電気伝導度計で測定した場合に、２０マイクロジーメンスパーセンチメートル以下、具体的には１０マイクロジーメンスパーセンチメートル以下である。イオン精製された溶液中のＤ－プシコースの純度は、約１０～約３５％（ｗ／ｗ）である。この冷却とイオン精製においては、後続のＤ－プシコース結晶化ステップで生成される母液を蒸留することにより、エタノールを除去して再使用してもよい。前記精製したＤ－プシコース含有溶液は、濃縮及び冷却してもよい。

前記濃縮は、前記イオン精製したＤ－プシコース含有溶液をＤ－プシコース濃度が５０～７０ｂｒｉｘ（％）の範囲、例えば５５～６５ｂｒｉｘ（％）の範囲になるように濃縮する工程である。具体的には、５０～８０℃の温度、例えば５５～７０℃の温度で濃縮してもよい。ここで、濃縮には、Ｄ－プシコース変性防止のために低温濃縮機を用いてもよい。前記濃縮後に、冷却を行ってもよい。冷却を行う場合、溶液又は周囲の温度が前記濃縮の際の温度より約１０℃以上低い温度になるように冷却してもよい。例えば、冷却温度は、４０～６０℃の範囲であってもよい。冷却速度は１時間当たり５～２５℃ずつ徐々に冷却してもよく、前記冷却には熱交換器を用いてもよい。ここで、濃縮と冷却においては、後続のＤ－プシコース結晶化過程で生成される母液を蒸留することにより、エタノールを除去して再使用してもよい。

前記Ｄ－プシコース含有溶液は、Ｄ－プシコースを含有する溶液からフルクトースを分離して得た溶液であってもよい。具体的には、クロマトグラフィーによりフルクトース含有溶液を分離してもよい。

クロマトグラフィーとは、Ｄ－プシコースとイオン樹脂に付着した金属イオン間の小さな結合力の差を用いてＤ－プシコースを分離するものであり、例えば連続クロマトグラフィーが挙げられる。クロマトグラフィーに用いられるイオン樹脂は、Ｋ、Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ残基が付着した強酸性陽イオン交換樹脂であってもよい。具体的には、Ｄ－プシコースとフルクトースを分離することのできるイオン樹脂であってもよく、例えばＫ、Ｃａ又はＮａであってもよい。前記クロマトグラフィーにより、フルクトース含有溶液と精製されたＤ－プシコース含有溶液が得られる。前記精製されたＤ－プシコース含有溶液は、純度９０％（ｗ／ｗ）以上、例えば純度９５％（ｗ／ｗ）以上のＤ－プシコースを含む溶液であってもよい。具体的には、Ｄ－プシコース純度が９０～９９％（ｗ／ｗ）以上であってもよい。フルクトース含有溶液は、純度７０％（ｗ／ｗ）以上のフルクトースを含む溶液であってもよい。前記クロマトグラフィーにおいて分離されたフルクトース含有溶液は、Ｄ－プシコースエピマー化反応に再使用してもよい。フルクトースを変性させて分離するのではなく、クロマトグラフィーにより分離すると、Ｄ－プシコースエピマー化反応に再使用することができるので、全収率を高めることができる。再使用の前に、２５～４５℃の範囲、３０～４０℃の範囲に冷却するステップをさらに含んでもよい。

本願のＤ－プシコース含有溶液は、濃縮したものであってもよい。例えば、得られた純度９５％（ｗ／ｗ）以上の精製したＤ－プシコース溶液を濃縮することにより、Ｄ－プシコースの濃度が７５ｂｒｉｘ（％）以上、例えば８０ｂｒｉｘ（％）以上になるようにしてもよい。前記濃縮は、具体的には５０～８０℃の温度、例えば５５～７０℃の温度で濃縮してもよい。ここで、濃縮には、Ｄ－プシコース変性防止のために低温濃縮機を用いてもよい。

本願のＤ－プシコース結晶の製造方法は、Ｄ－プシコース含有溶液と有機溶媒を混合する第１ステップを含む。よって、Ｄ－プシコースを一部沈殿させることができる。また、後述する種晶の添加及び冷却により、特に高い収率で結晶を分離することができる。

前記第１ステップの混合は、２０～６０℃で行ってもよい。具体的には、３５～６０℃で行ってもよく、より具体的には４０～６０℃で行ってもよい。前記温度より低いと、準安定領域を超える過飽和状態になり、結晶成長ではない新たな結晶核の生成を招き、結晶成長が阻害されるという問題が生じ、温度が高いと、混合する過程で有機溶媒が揮発し、回収率の低下及びオイルミストの発生による安全上の問題が生じる。

前記有機溶媒は、アルコールであってもよく、具体的にはエタノール、メタノール及びイソプロピルアルコールから選択される１つ以上が含まれるものであってもよい。

前記有機溶媒は、水分：有機溶媒が１：０．５以上、１：０．７以上又は１：１以上であってもよく、例えば１：０．５～１：１０、１：０．７～１： １０、１：１～１：１０、１：１～１：９又は１：１～１：８の混合物であってもよい。

本願のＤ－プシコース結晶の製造方法は、前記混合液にＤ－プシコース種晶（seed）を投入し、その後冷却してＤ－プシコース結晶を含むマスキット（massecuite）を得る第２ステップを含む。ここで、マスキットとは、Ｄ－プシコース種晶が結晶化反応を始めたときの結晶と溶液が混合されたスラリー状態を意味する。

Ｄ－プシコース結晶の製造方法において最も達成が困難なことは、結晶の大きさや形状の制御である。本願においては、Ｄ－プシコース含有溶液に有機溶媒を混合し、その後種晶を添加して徐々に冷却する結晶化方法により、それらを達成することができる。

本願におけるＤ－プシコース種晶とは、Ｄ－プシコースで主に構成された微粒結晶を意味し、前記有機溶媒混合液中のＤ－プシコースの過飽和度を準安定領域内に一定に保ちながら添加されるものである。前記有機溶媒混合液は粘度が低いので、添加されたＤ－プシコース種晶が容易に分散する。このような低い粘度及び高い分散力の条件下では、結晶の成長が良好に行われる。前記Ｄ－プシコース種晶は、１００μｍ以下の種結晶であってもよく、具体的には４０～１００μｍの大きさの種結晶であってもよい。前記Ｄ－プシコース種晶は、混合液の総重量に対して０．０１～１％（ｗ／ｗ）の重量％で投入してもよい。

本願の製造方法において、Ｄ－プシコース種晶を添加しないと、無定形のＤ－プシコースの塊が生成され、所望の大きさ及び形状を有するＤ－プシコース結晶が生成されない。前記Ｄ－プシコース種晶は、分散した形態で前記混合液に投入されることが好ましい。前記種晶の投入後に、冷却条件を調節すると結晶が成長する。

冷却条件に関して、冷却前に混合する第１ステップの温度は前述した通りであり、第２ステップで冷却した最終温度は８～３０℃、８～２５℃、８～２０℃、１０～３０℃、１０～２５℃又は１０～２０℃であってもよい。このような温度調節により、新たな結晶生成を抑制し、結晶の大きさを大きくし、収率を高めることができる。第２ステップで冷却した最終温度が前記範囲より高いと、Ｄ－プシコース結晶の回収率が低下し、低いと、核生成を誘発し、１００μｍ未満の微粒子が多量に発生するので、乾燥すると結晶が固結する現象を招き、最終製品の生産量が少なくなり、商品性が低下する。

本願においては、前記冷却の速度を調節することにより、Ｄ－プシコース結晶の成長率を調節してもよい。具体的には、前記冷却は、０．０５～１．４℃／ｈｏｕｒ、０．６～１．４℃／ｈｏｕｒ、０．７～１．３℃／ｈｏｕｒ、０．８～１．２℃／ｈｏｕｒ又は０．９～１．１℃／ｈｏｕｒの速度で行ってもよい。他の例として、前記冷却速度は、準安定領域の範囲で冷却するように調節してもよい。冷却速度が前記範囲より速いと、前記混合液は、準安定領域を外れて過飽和領域に急激に進入し、微粒子の多量発生が誘発される。また、非常に低い冷却速度は、単位時間当たりの生産性を減少させ、大量生産に非効率をもたらす。

前記第２ステップにおける冷却及び／又は結晶化は、２０～７０時間又は３０～７０時間行ってもよい。

本願の非限定的な一実施例によれば、有機溶媒の使用及び冷却速度の制御によりＤ－プシコース結晶を製造すると、整形されたプシコース結晶ブロックが生成される。

本願の製造方法は、前記マスキットからＤ－プシコース結晶を分離及び乾燥する第３ステップをさらに含んでもよい。具体的には、第１ステップ及び第２ステップで得られた前記マスキットから有機溶媒を過剰量含むＤ－プシコース結晶を分離してもよい。

前記マスキットからＤ－プシコース結晶を分離するステップは、結晶を分離する方法であればいかなる方法を用いてもよく、例えば遠心脱水機を用いてもよい。前記分離した結晶は、結晶全体を１００％（ｗ／ｗ）とすると、有機溶媒が０．０７％（ｗ／ｗ）以上、０．１％（ｗ／ｗ）以上、０．１３％（ｗ／ｗ）以上であってもよく、例えば０．０７％（ｗ／ｗ）～０．５％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）～０．３％（ｗ／ｗ）又は０．１３％（ｗ／ｗ）～０．２％（ｗ／ｗ）であってもよい。

前記有機溶媒を過剰量含むＤ－プシコース結晶を乾燥させることにより、結晶全体を１００％（ｗ／ｗ）とすると、９８％（ｗ／ｗ）以上のＤ－プシコース及び０．０５％（ｗ／ｗ）以下の有機溶媒を含むＤ－プシコース結晶が得られる。得られるＤ－プシコース結晶については前述した通りである。

本願の製造方法は、前記第３ステップでＤ－プシコース結晶を分離した結晶母液から有機溶媒を回収し、その後前記第１ステップの有機溶媒として再使用する第４ステップをさらに含んでもよい。

さらに、前記第４ステップで有機溶媒を除去した結晶母液を第１ステップのＤ－プシコース溶液の作製に再使用する第５ステップをさらに含んでもよい。

本願の製造方法による収率、すなわち前記第１ステップのＤ－プシコース含有溶液中に存在するＤ－プシコースの重量に対する、最終的に得られるＤ－プシコース結晶の重量百分率は、６５％（ｗ／ｗ）以上、７０％（ｗ／ｗ）以上、７５％（ｗ／ｗ）以上又は８０％（ｗ／ｗ）以上であってもよい。

すなわち、本願における収率は、次の式で表される。

[数１]
収率（％）＝（脱水及び乾燥したＤ－プシコース結晶の重量／結晶化する前の原液中のＤ－プシコース重量）×１００

前記収率の計算において、結晶化する前の原液中のＤ－プシコース重量の測定は、ＨＰＬＣ分析により原液中のＤ－プシコース（ｇ／Ｌ）を測定し、予め測定しておいた結晶化原液の量（Ｌ）を前記測定したＤ－プシコース（ｇ／Ｌ）に代入することにより、特定原液の量（Ｌ）に含まれるＤ－プシコースの重量（ｇ）を計算してもよい。

さらに、前記結晶化において分離した母液、すなわちマスキットから脱水した上清は、蒸留により有機溶媒を回収すると、Ｄ－プシコース溶液と混合する第１ステップでの再使用が可能であり、蒸留後に有機溶媒が除去されたＤ－プシコースを含む溶液を３０℃に冷却し、前記水素基に置換された強酸性陽イオン交換樹脂及び水酸化基に置換された弱塩基性陰イオン交換樹脂を充填したカラムに再循環するか、連続クロマトグラフィーに再循環するか、又は第１ステップに再循環するようにしてもよい。Ｄ－プシコース結晶化の際に生成される母液は、純度７５％（ｗ／ｗ）以上、純度８５％（ｗ／ｗ）以上、純度９５％（ｗ／ｗ）以上のＤ－プシコース含有分画であってもよい。

以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの
実施例は本出願を例示するものにすぎず、本出願がこれらに限定されるものではない。

純度９８％（ｗ／ｗ）以上、エタノール０．０５％（ｗ／ｗ）以下の高純度Ｄ－プシコース結晶組成物の製造
（１）微生物を用いた低純度Ｄ－プシコース溶液の生産
純度９５％（ｗ／ｗ）以上の５０ｂｒｉｘ（％）フルクトース溶液（酵素反応基質溶液）を準備した。エピマー化酵素反応は、特許文献１（韓国特許出願第１０－２００９－０１１８４６５号）に開示されているように、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０４６Ｐの菌株から分離したＤ－プシコースエピマー化酵素をアルギン酸ナトリウム担体に固定化して異性化反応装置（異性化塔，ハンジュ機械工業）に充填し、その後前記準備した酵素反応基質溶液を熱交換器により１時間当たり５～２０℃ずつ、５０℃の温度に昇温し、ＳＶ［Space Velocity：流量（Ｌ）／時間（Ｈｒ）／樹脂量（Ｌ）］０．５で通液することにより、エピマー化反応させたＤ－プシコース溶液を得た。ここで、Ｄ－プシコースの純度は約２４％（ｗ／ｗ）であった。

（２）Ｄ－プシコース溶液の精製
前記エピマー化反応させたＤ－プシコース溶液を熱交換器により１時間当たり５～１０℃ずつ、３０～４０℃の温度に第１冷却し、その後脱色剤を充填したカラムに通液して脱色し、水素基に置換された強酸性陽イオン交換樹脂及び水酸化基に置換された弱塩基性陰イオン交換樹脂を充填したカラムにＳＶ３で通液して脱塩し、最終イオン成分が電気伝導度計による測定で１０マイクロジーメンスパーセンチメートル以下となるように調節し、脱塩した酵素反応液のＤ－プシコースの純度を２４％（ｗ／ｗ）に維持した。

（３）クロマトグラフィーを用いた高純度Ｄ－プシコース溶液の分離
前記イオン精製したＤ－プシコース含有溶液を低温濃縮機（強制薄膜濃縮機，Forced Thin Film Evaporator，ウェルクロンハンテック）に投入し、５５～７０℃の温度、１０～１５分間の短時間で濃度を６０ｂｒｉｘ（％）に濃縮し、熱交換器により１時間当たり５～２５℃ずつ第２冷却し、５０～６０℃でカルシウム活性基が付着した強酸性陽イオン交換樹脂を充填したカラムにおける連続クロマトグラフィーにより、Ｄ－プシコースの純度が９５％（ｗ／ｗ）以上の精製されたＤ－プシコース溶液と、フルクトースの純度が７０％（ｗ／ｗ）以上のフルクトース含有溶液に分離した。

前記連続クロマトグラフィーで分離した純度７０％（ｗ／ｗ）以上のフルクトース含有溶液を回収し、１時間当たり２０～３０℃ずつ冷却し、３０℃でフルクトースのエピマー化工程に再循環させた。

（４）Ｄ－プシコース溶液の濃縮、有機溶媒処理及び冷却による結晶化
前記連続クロマトグラフィーで分離した純度９５％（ｗ／ｗ）以上の精製されたＤ－プシコース溶液を５５～７０℃の温度で濃縮して濃度を８５．０ｂｒｉｘ（％）に調節し、濃縮した純度９５％（ｗ／ｗ）以上のＤ－プシコース溶液を熱交換器により１時間当たり５～２０℃ずつ、４０℃の温度に急速に冷却し、その後固形分を除いた水分に対する重量部の比で水分：エタノール＝１：１．１３に相当するエタノールを混合した。

前記４０℃に冷却したエタノールを混合したＤ－プシコース溶液に適量の種晶（seed）を投入し、その後１時間当たり１℃の冷却速度で最終温度１０℃に冷却して３０時間結晶化することにより、Ｄ－プシコース結晶を含むマスキットを得た。

前記Ｄ－プシコース結晶を含むマスキットを高速遠心脱水機に入れて４，０００ｒｐｍで１０分間回転させることにより、上清を流出させ、エタノールを過剰量含むＤ－プシコース結晶を得た。ここで、脱イオン水又はエタノールを噴霧することにより残留する上清を洗浄することができ、得られたＤ－プシコース結晶に含まれるエタノールの濃度は約０．１５％（ｗ／ｗ）であった。

前記回収したエタノールを過剰量含むＤ－プシコース結晶を流動層乾燥機又は真空乾燥機に移動し、１時間～２時間乾燥させて過剰量のエタノールを除去し、エタノール０．０３％（ｗ／ｗ）を含む純度９８％（ｗ／ｗ）以上のＤ－プシコース結晶を得た。乾燥後に得られたＤ－プシコースの結晶量は２，２５２ｇであり、前記連続クロマトグラフィーで分離して濃縮したＤ－プシコース溶液中に存在する２，７８０ｇの約８１％が回収された。結晶の大きさはＭＡ３３６であった（図１及び図２）。

さらに、前記結晶化において分離された母液、すなわちマスキットから脱水した上清は、蒸留によりエタノールを回収すると、Ｄ－プシコース溶液と混合するステップでの再使用が可能であり、蒸留後にエタノールが除去されたＤ－プシコースを含む溶液を３０℃に冷却し、前記水素基に置換された強酸性陽イオン交換樹脂及び水酸化基に置換された弱塩基性陰イオン交換樹脂を充填したカラムに再循環するか、連続クロマトグラフィーステップで再循環することができる。

純度９８％（ｗ／ｗ）以上、エタノール０．０５％（ｗ／ｗ）以下の高純度Ｄ－プシコース結晶組成物の製造
実施例１で１．０ｂｒｉｘ（％）に濃縮したＤ－プシコース含有溶液を５０℃に冷却し、固形分を除いた水分に対する重量部の比で水分：エタノール＝１：９に相当するエタノールを混合することと、１時間当たり０．５℃の冷却速度で最終温度２０℃まで６０時間とすることを除いて、実施例１と同様に純度９８％（ｗ／ｗ）以上、エタノール０．０５％（ｗ／ｗ）以下の高純度Ｄ－プシコース結晶組成物を製造した。

得られた純度９８％（ｗ／ｗ）以上、エタノール０．０５％（ｗ／ｗ）以下を含むＤ－プシコースの結晶量は２，３０７ｇであり、初期に溶解したＤ－プシコース２，７８０ｇの約８３％が回収された。結晶の大きさはＭＡ２４１であった（図３）。

純度９８％（ｗ／ｗ）以上、エタノール０．０５％（ｗ／ｗ）を含むＤ－プシコース結晶組成物の製造
実施例１で乾燥時間を３０分～１時間とすることを除いて、実施例１と同様に純度９８％（ｗ／ｗ）以上の高純度Ｄ－プシコース結晶組成物を製造した。

得られたＤ－プシコース結晶は、エタノール０．０５％（ｗ／ｗ）を含み、純度９８％（ｗ／ｗ）以上であった。

純度９８％（ｗ／ｗ）以上、エタノール０．０６％（ｗ／ｗ）を含むＤ－プシコース結晶組成物の製造
実施例１で乾燥時間を１０～２０分とすることを除いて、実施例１と同様に純度９８％（ｗ／ｗ）以上の高純度Ｄ－プシコース結晶組成物を製造した。

得られたＤ－プシコース結晶は、エタノール０．０６％（ｗ／ｗ）を含み、純度９８％（ｗ／ｗ）以上であった

混合する有機溶媒の種類を変更した高純度Ｄ－プシコース結晶の製造
実施例１で濃縮したＤ－プシコース含有溶液にメタノール、イソプロピルアルコールを混合することを除いて、実施例１と同様に純度９８％（ｗ／ｗ）以上の高純度Ｄ－プシコース結晶を製造した。

メタノールを用いた場合に得られたＤ－プシコース結晶の収率は３３％であり、平均粒度はＭＡ１０９であった。

イソプロピルアルコールを用いた場合に得られたＤ－プシコース結晶の収率は３２％であり、平均粒度はＭＡ６１であった。

有機溶媒を用いるものの、冷却速度制御を行わない高純度Ｄ－プシコース結晶組成物の製造
実施例２で濃縮したＤ－プシコース含有溶液から固形分を除いた水分に対する重量部の比で水分：エタノール＝１：４に相当するエタノールを混合することと、種晶投入後の冷却速度の制御を行うことなく３０分～１時間以内に最終温度２０℃に冷却し、３０時間結晶化することを除いて、実施例２と同様に純度９８％（ｗ／ｗ）以上、エタノール０．０５％（ｗ／ｗ）以下を含む高純度Ｄ－プシコース結晶組成物を製造した。

得られたＤ－プシコースの結晶量は１，０５６ｇであり、初期に溶解したＤ－プシコースの約３８％が回収され、生成されたＤ－プシコース結晶ブロックは１，０８４ｇ、３９％であることが確認された。

比較例．有機溶媒を用いない冷却結晶方法による高純度Ｄ－プシコース結晶の製造
実施例２で濃縮したＤ－プシコース含有溶液を初期温度４０℃に冷却し、その後エタノールを混合せずに８０時間かけて２０℃に冷却することを除いて、実施例２と同様に純度９８％（ｗ／ｗ）以上の高純度Ｄ－プシコース結晶を製造した。

得られたＤ－プシコース結晶の収率は５３％であり、平均粒度はＭＡ３７４であった。

試験例１．残留エタノール除去効果の確認
実施例１（残留エタノール０．０３％（ｗ／ｗ）以下を含む）、比較例、実施例４及び実施例３の高純度Ｄ－プシコース結晶を粉末形態で検査員に所定量摂取させ、その後差異が識別されるか否かを３点検査により評価した。２つの試験群を３つの選択肢として並べ、検査員は並べた順序を知らないまま３つの選択肢を順に摂取し、味が異なる１つを選択するようにした。２０人の検査員に計３回試験を行い、全検査回数における正解率に差があるか否かを評価した。評価に用いたＤ－プシコース結晶と残留エタノール濃度％（ｗ／ｗ）を表１に示し、評価結果を表２に示す。評価は、正解数をカウントし、全回答数と正解数を有意性検定表と比較して統計的有意性があるか否かを決定するものとする。６０回検査をした場合は、正解数が２７回以上であれば、有意な品質差があるものと判定する。

有機溶媒を用いない方法で製造したＤ－プシコース結晶（比較例）に比べて、残留エタノール０．０５％（ｗ／ｗ）以下を含むＤ－プシコース結晶（実施例１及び３）は、官能的差異がないことが確認された。よって、残留エタノールを所定レベルの濃度以下に調節すると、本来のＤ－プシコース結晶と同等の味を実現できることが分かった。

試験例２．残留エタノール除去による異味／異臭強度低減効果の確認 試験例１で試験に用いたものと同一の試験群（表１）において、異味／異臭強度を評価した。２０人の検査員にＤ－プシコース結晶を摂取させ、その後異味／異臭強度を数値（異味／異臭強度の最大を５点とする）で表現させた。評価結果を表３に示す。有機溶媒を用いない方法で製造したＤ－プシコース結晶の比較例と比較して、残留エタノール０．０５％（ｗ／ｗ）以下を含むＤ－プシコース結晶（実施例１及び３）は、異味／異臭に差異がないことが確認された。よって、残留エタノールを所定レベルの濃度以下に除去すると、異味／異臭は本来のＤ－プシコース結晶と同等になることが分かった。

試験例３．エタノール含有による滑らかな表面効果の確認
実施例１（残留エタノール０．０３％（ｗ／ｗ）以下を含む）と比較例の高純度Ｄ－プシコース結晶の表面をＳＥＭ調査した。その結果を図５に示す。

比較例のエタノールを添加していないＤ－プシコース結晶（図５ｂ）に比べて、実施例１のエタノールを添加したＤ－プシコース結晶（図５ａ）の表面が滑らかであることが確認された。よって、エタノール添加によりＤ－プシコース結晶表面の滑らかさが向上し、光沢やツヤが良くなることが分かった。

試験例４．エタノール含有による結晶流動性向上効果の確認
試験例４．１ 流動性の測定
有機溶媒を用いない方法で製造したＤ－プシコース結晶（比較例）と比較した、残留エタノール０．０３％（ｗ／ｗ）以下を含むＤ－プシコース結晶（実施例１）の流動性を評価した。流動性の評価のために流動性測定器を用いた。

表４は流動性測定器の測定条件を示す表である。

[数２]
流動性＝［（投入粉末重量－Ｔｒａｙ残留粉末重量）／投入粉末重量×１００）］

数式２の結果値が大きいほど結晶の流動性が大きいことを示す。

試験例４．２ 安息角の測定
さらに、安息角を測定してエタノール含有による流動性向上効果を確認した。安息角とは、まだ固結していない堆積物が斜面上に堆積する際に流れ落ちずに堆積する最大の傾斜角を意味し、安息角が小さいほど結晶の流動性が大きいことを示す（図６）。

安息角は、Ｄ－プシコース結晶組成物が水平板面上に設置された漏斗を所定速度で通過するようにし、その後組成物の上面の角度を分度器で測定した。

表５は流動性及び安息角の測定結果を示す表である。表５において、エタノールを添加したＤ－プシコースの流動性が大きくなることが確認された。これは、エタノールを含むＤ－プシコースは粘度が低いので、種晶が分散した状態で結晶化させることにより、高い収率及び結晶化度が得られることを示唆するものである。

以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。

Claims (14)

1. Ｄ－プシコース（psicose）結晶であって、結晶全体を１００％（ｗ／ｗ）とすると、９８％（ｗ／ｗ）以上のＤ－プシコース、及び０．００１～０．０５％（ｗ／ｗ）のエタノールを含むＤ－プシコース結晶。
2. 平均粒度（ＭＡ）が２００μｍ以上であることを特徴とする、請求項１に記載のＤ－プシコース結晶。
3. Ｄ－プシコース含有溶液と、前記Ｄ－プシコース含有溶液中の水分：エタノールが１：０．５以上の混合物であるようにエタノールを混合する第１ステップと、
   第１ステップで得られた混合液に種晶（seed）を投入し、その後冷却してＤ－プシコース結晶を含むマスキットを得る第２ステップとを含む、請求項１に記載のＤ－プシコース結晶の製造方法。
4. 前記第１ステップの混合は４０～６０℃で行い、第２ステップで冷却した最終温度は１０～２０℃である、請求項３に記載のＤ－プシコース結晶の製造方法。
5. 前記第２ステップは、冷却速度を調節して準安定領域内で種晶が成長するようにすることを特徴とする、請求項３に記載のＤ－プシコース結晶の製造方法。
6. 前記第２ステップにおいて、冷却速度を０．０５～１．４℃／ｈｏｕｒにして行うものである、請求項５に記載のＤ－プシコース結晶の製造方法。
7. 前記第２ステップにおいて、冷却及び結晶化を２０～７０時間行うものである、請求項３に記載のＤ－プシコース結晶の製造方法。
8. 前記Ｄ－プシコース含有溶液は、Ｄ－プシコースを９５％（ｗ／ｗ）以上含む、請求項３に記載のＤ－プシコース結晶の製造方法。
9. 前記第１ステップのＤ－プシコース含有溶液中に存在するＤ－プシコース含有量に対する、最終的に得られるＤ－プシコース結晶の重量百分率は、６５％（ｗ／ｗ）以上である、請求項３に記載のＤ－プシコース結晶の製造方法。
10. 前記Ｄ－プシコース含有溶液は、Ｄ－プシコースの濃度が８０～８５ｂｒｉｘである、請求項３に記載のＤ－プシコース結晶の製造方法。
11. 前記マスキットからＤ－プシコース結晶を分離及び乾燥する第３ステップをさらに含む、請求項３に記載のＤ－プシコース結晶の製造方法。
12. 前記第３ステップでＤ－プシコース結晶を分離した結晶母液からエタノールを回収し、その後回収したエタノールを前記第１ステップのエタノールとして再使用する第４ステップをさらに含む、請求項１１に記載のＤ－プシコース結晶の製造方法。
13. 前記第３ステップでＤ－プシコース結晶を分離した結晶母液からエタノールを除去した後に、結晶母液をＤ－プシコース含有溶液の作製に再使用する第５ステップをさらに含む、請求項１１に記載のＤ－プシコース結晶の製造方法。
14. 前記乾燥によりＤ－プシコース結晶のエタノール濃度が０．０５％（ｗ／ｗ）以下に調節される、請求項１１に記載のＤ－プシコース結晶の製造方法。