JP7251867B1 - 容器、及び細胞輸送装置 - Google Patents

Abstract

底壁及び側壁を備える細胞観察用の容器であって、前記底壁に観察面が形成され、前記観察面に基準線及び前記基準線の近傍において特定領域を示す指示部が表示される、容器。

Description

本発明は、容器、及び細胞輸送装置に関する。本願は、２０２１年７月２７日に、日本に出願された特願２０２１－１２２５５３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

細胞培養には、様々な培養容器が使用されている。培養容器の一例として、特許文献１や特許文献２には一般に「Ｔフラスコ」の名称で知られる形状の容器が記載されている。

培養容器内の細胞の数や状態の経時変化を顕微鏡下で観察することにより、細胞培養の様子を確認することができる。経時変化を観察するためには同一領域を異なるタイミングで観察する必要があるが、一回観察した後に一旦顕微鏡の視野を移動させた場合や顕微鏡の観察ステージから培養容器を取り外した場合には、次の観察で前回観察した領域を再び特定することは容易ではない。

同一視野の顕微鏡観察を行う方法として、培養容器の観察領域の周囲にマジックインキ等で印を付ける方法、穴の小さい多穴プレートを用いて培養を行う方法、底面に碁盤の目のような格子模様を有する培養容器を使用する方法等がある。

特許第２６８３７３２号公報 特許第６５７２２４０号公報

しかしながら、これらの方法には、マジックインキが細胞に接触すると細胞への悪影響が懸念される点、容器底壁の裏面にマジックインキで印を付けた場合には観察面と裏面の印とが焦点深度内に収まらない点、多穴プレートにおいて観察対象の穴を特定するのは容易でない点、周期的な格子模様において観察領域を特定するのは容易でない点といった課題が存在する。

また、高価な顕微鏡には、ステージ駆動機構や画像認識技術等を利用して前回の観察領域と同じ領域を特定できるものも存在するが、そのような技術が採用されていない簡便な構成の顕微鏡を使用する場合、同一視野内の細胞観察を行うことは容易ではない。

本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、簡便な構成で容易に同一視野内の細胞観察を行うことができる容器、培養細胞の製造方法、及び細胞輸送装置を提供する。

本発明は以下の態様を含む。
［１］底壁及び側壁を備える細胞観察用の容器であって、前記底壁に観察面が形成され、前記観察面に基準線及び前記基準線の近傍において特定領域を示す指示部が表示される、容器。
［２］前記特定領域は、同一視野内の細胞の経時変化を観察するための観察対象領域である、［１］に記載の容器。
［３］前記基準線及び前記指示部は、前記観察面に直交する方向において前記観察面を基準として細胞観察用の顕微鏡の対物レンズの焦点深度内に位置する、［１］又は［２］に記載の容器。
［４］前記指示部は、前記特定領域を取り囲む枠線である、［１］～［３］のいずれか１つに記載の容器。
［５］前記基準線は、一方向に沿って前記観察面の一側から他側へ延在する線である、［１］～［４］のいずれか１つに記載の容器。
［６］前記指示部は、前記基準線の一端部に配置された第１領域を示す第１指示部、前記基準線の中央部に配置された第２領域を示す第２指示部、及び前記第１領域と前記第２領域との間に配置された第３領域を示す第３指示部を含む、［５］に記載の容器。
［７］前記基準線及び前記指示部のうち少なくとも一方は、前記底壁に形成された凹部である、［１］～［６］のいずれか１つに記載の容器。
［８］前記基準線及び前記指示部のうち少なくとも一方は、前記底壁上又は前記底壁下に配置された膜部材に形成されている、［１］～［６］のいずれか１つに記載の容器。
［９］前記膜部材は、一方の面に前記基準線及び前記指示部のうち少なくとも一方を有し、前記一方の面が前記底壁に向くように前記底壁上又は前記底壁下に配置される、［８］に記載の容器。
［１０］前記特定領域の面積は、５ｍｍ^２以下である、［１］～［９］のいずれか１つに記載の容器。
［１１］［１］～［１０］のいずれか１つに記載の容器に細胞及び培養液を入れる工程と、前記容器内で前記細胞を培養する工程と、を含む、培養細胞の製造方法。
［１２］第１の培養皿と第２の培養皿とを有する細胞輸送装置であって、前記第１の培養皿は、底壁を備え、前記第２の培養皿は、底面に多孔質膜を備え、前記第２の培養皿は、前記第１の培養皿と前記多孔質膜とに囲まれた隙間を有した状態で、前記第１の培養皿の上部に装着され、前記第１の培養皿の前記底壁に観察面が形成され、前記観察面に基準線及び前記基準線の近傍において特定領域を示す指示部が表示される、細胞輸送装置。
［１３］前記多孔質膜は、滅菌フィルタである、［１２］に記載の細胞輸送装置。
［１４］前記第１の培養皿の前記底壁は、前記基準線及び前記指示部が形成された膜部材である、［１２］又は［１３］に記載の細胞輸送装置。
［１５］天面、底面、及び側面を備えた、細胞観察用の円柱状容器であって、
多孔質膜を少なくとも天面に備え、底面に観察面が形成され、前記観察面に基準線及び前記基準線の近傍において特定領域を示す指示部が表示される、容器。
［１６］前記多孔質膜は、滅菌フィルタである、［１５］に記載の細胞輸送装置。
［１７］前記底面は、前記基準線及び前記指示部が形成された膜部材である、［１５］又は［１６］に記載の細胞輸送装置。

本発明によれば、簡便な構成で容易に同一視野内の細胞観察を行うことができる容器、培養細胞の製造方法、及び細胞輸送装置を提供することができる。

本実施形態の容器の斜視図である。 本実施形態の容器の上面図である。 図２の線Ａ－Ａに沿った本実施形態の容器の断面図である。 図２の線Ａ－Ａに沿った別の実施形態の容器の断面図である。 別の実施形態の容器の上面図である。 （ａ）本実施形態の細胞輸送装置の斜視図である。（ｂ）本実施形態の細胞輸送装置の側面図である。（ｃ）本実施形態の細胞輸送装置の側面図である。（ｄ）第１の培養皿の側面図である。（ｅ）第１の培養皿の上面図である。（ｆ）図６（ｅ）の線Ｂ－Ｂに沿った第１の培養皿の断面図である。（ｇ）第２の培養皿の側面図である。（ｈ）第２の培養皿の上面図である。 （ａ）～（ｄ）本実施形態の細胞輸送装置による細胞輸送方法を示す断面図である。 本実施形態の容器の一例の構造を説明する斜視図である。 実施例１において「端」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。 実施例１において「間」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。 実施例１において「中心」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。 実施例２においての「端」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。 実施例２において「間」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。 実施例２において「中心」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。 実施例３において「端」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。 実施例３において「間」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。 実施例３において「中心」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。 実施例４において播種前の各培養皿、培養液のみを入れた各培養皿の「端」、「間」、「中心」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。 実施例４において播種前の各培養皿、培養液のみを入れた各培養皿の「端」、「間」、「中心」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。 実施例４において０日目（培養２時間目）、１日目、２日目、４日目、７日目、及び１０日目の１枚目の培養皿Ａの「端」、「間」、「中心」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。 実施例４において０日目（培養２時間目）、１日目、２日目、４日目、７日目、及び１０日目の１枚目の培養皿Ａの「端」、「間」、「中心」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。 実施例４において０日目（培養２時間目）、１日目、２日目、４日目、７日目、及び１０日目の１枚目の培養皿Ｂの「端」、「間」、「中心」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。 実施例４において０日目（培養２時間目）、１日目、２日目、４日目、７日目、及び１０日目の１枚目の培養皿Ｂの「端」、「間」、「中心」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。 実施例４において０日目（培養２時間目）、１日目、２日目、４日目、７日目、及び１０日目の１枚目の培養皿Ｃの「端」、「間」、「中心」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。 実施例４において０日目（培養２時間目）、１日目、２日目、４日目、７日目、及び１０日目の１枚目の培養皿Ｃの「端」、「間」、「中心」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。 実施例４において０日目（培養２時間目）、１日目、２日目、４日目、７日目、及び１０日目の１枚目の培養皿Ａの「端」、「間」、「中心」の細胞の計測方法を示すとともに計測値を記入した図である。 実施例４において０日目（培養２時間目）、１日目、２日目、４日目、７日目、及び１０日目の１枚目の培養皿Ａの「端」、「間」、「中心」の細胞の計測方法を示すとともに計測値を記入した図である。 実施例４において０日目（培養２時間目）、１日目、２日目、４日目、７日目、及び１０日目の１枚目の培養皿Ｂの「端」、「間」、「中心」の細胞の計測方法を示すとともに計測値を記入した図である。 実施例４において０日目（培養２時間目）、１日目、２日目、４日目、７日目、及び１０日目の１枚目の培養皿Ｂの「端」、「間」、「中心」の細胞の計測方法を示すとともに計測値を記入した図である。 実施例４において０日目（培養２時間目）、１日目、２日目、４日目、７日目、及び１０日目の１枚目の培養皿Ｃの「端」、「間」、「中心」の細胞の計測方法を示すとともに計測値を記入した図である。 実施例４において０日目（培養２時間目）、１日目、２日目、４日目、７日目、及び１０日目の１枚目の培養皿Ｃの「端」、「間」、「中心」の細胞の計測方法を示すとともに計測値を記入した図である。 実施例４において培養皿Ａ～Ｃの「端」、「間」、「中心」における直径１ｍｍの円形線跡中の細胞数の計測結果と「端」、「間」、「中心」の平均細胞数である。 実施例４において培養皿Ａ～Ｃの「端」、「間」、「中心」における１ｃｍ^２当たりの細胞数と「端」、「間」、「中心」の１ｃｍ^２当たりの平均細胞数である。 実施例４において培養皿Ａ～Ｃの「端」、「間」、「中心」における１ｃｍ^２当たりの細胞数と「端」、「間」、「中心」の１ｃｍ^２当たりの平均細胞数のグラフである。 実施例４において培養皿Ａ～Ｃの「端」、「間」、「中心」の細胞数を平均した１ｃｍ^２当たりの細胞数と培養皿Ａ～Ｃの１ｃｍ^２当たりの平均細胞数である。 実施例４において培養皿Ａ～Ｃの「端」、「間」、「中心」の細胞数を平均した１ｃｍ^２当たりの細胞数と培養皿Ａ～Ｃの１ｃｍ^２当たりの平均細胞数のグラフである。

以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。

［容器］
１実施形態において、本発明は、底壁及び側壁を備える細胞観察用の容器であって、前記底壁に観察面が形成され、前記観察面に基準線及び前記基準線の近傍において特定領域を示す指示部が表示される、容器を提供する。

図１は、本実施形態の容器１の斜視図である。図２は、本実施形態の容器１の上面図である。図３は、図２の線Ａ－Ａに沿った本実施形態の容器１の断面図である。
図１に示すように、容器１は、本体１０及びキャップ２０を備える。本体１０は、培養細胞Ｃや培養液Ｍを収容する収容部１２と、収容部１２に細胞Ｃや培養液Ｍ（図３参照。）を供給するための供給口を有するネック部１４と、を有する。キャップ２０は、ネック部１４の供給口に取り付けられることにより本体１０を密封する。

図１及び図２に示すように、本体１０の収容部１２は横幅が略一定であり、ネック部１４の横幅はキャップ２０が設けられた先端に近づくほど小さくなる。ネック部１４は、先端に向かって上方に傾いている。

本体１０は、底壁３０、側壁３２、及び頂壁３４を有する。底壁３０及び頂壁３４は、上面視で略同じ形状を有し、図２に示すように、収容部１２に対応する長方形とネック部１４に対応する台形とが結合した形状を有する。側壁３２は、底壁３０と頂壁３４とを高さ方向に接続する。図１に示すように、側壁３２は、底壁３０及び頂壁３４の形状に沿って、６つの面を有する。

本体１０は、少なくとも部分的に、可視光に対して透明又は半透明な材料からなる。好ましくは、頂壁３４は、本体１０の内部が上方から視認できるように、可視光に対して透明な材料からなる。好ましくは、本体１０の全体が、可視光に対して透明な材料からなる。

本体１０の材質としては、ソーダ石灰ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、バイコール（登録商標）ガラス、石英ガラス等のガラス材料；ウレタンゴム、ニトリルゴム、シリコーンゴム、シリコーン樹脂（例えば、ポリジメチルシロキサン）、フッ素ゴム、アクリルゴム、イソプレンゴム、エチレンプロピレンゴム、クロロスルホン化ポリエチレンゴム、エピクロルヒドリンゴム、クロロプレンゴム、スチレン・ブタジエンゴム、ブタジエンゴム、ポリイソブチレンゴム等のエラストマー材料；ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（酢酸ビニル－共－無水マレイン酸）、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミン、ポリエチレンテレフタレート（PET）等のポリマーを含むプラスチック；ポリ（酢酸ビニル－共－無水マレイン酸）、ポリ（スチレン－共－無水マレイン酸）、ポリ（エチレン－共－アクリル酸）、又はこれらの誘導体等のコポリマー等が挙げられ、プラスチックが好ましく、特に透明なプラスチックが好ましい。また、かかるプラスチックはシリコンコートが施されていてもよい。

容器１の製造方法としては、圧縮成形法、射出成形法、押出成形法等が挙げられるが、これらに限定されない。

ネック部１４を通して収容部１２に供給された細胞Ｃは、図３に示すように、収容部１２において培養液Ｍ中で培養される。収容部１２内の細胞Ｃは、頂壁３４を通して上方から観察することができる。底壁３０の上面には、観察面Ｓが形成される。すなわち、顕微鏡の焦点を観察面Ｓ（ここでは底壁３０の上面）又はその近傍に合わせて、観察面Ｓ上の細胞Ｃを観察することができる。

図１～図３に示すように、底壁３０には、観察面Ｓ上の細胞Ｃの観察を補助する基準線４０及び指示部４２が形成される。
例えば、基準線４０は、一方向に沿って観察面Ｓの一側から他側へ延在する線である。ここで、本明細書における「線」には、実線だけでなく点線や破線等の全体として線状の構成と認識可能な抽象的な「線」も含まれる。「線」の太さも特に限定されない。

本実施形態では、基準線４０は、本体１０の長手方向に沿って底壁３０の上面の一端（ネック部１４の先端）から他端（収容部１２の末端）まで延在する直線である。例えば、基準線４０は、底壁３０の上面の面積（すなわち、容器１の底面積）を二等分する線である。例えば、底壁３０の上面は、基準線４０を基準として線対称な形状を有する。なお、基準線４０は上記例に限定されず、２以上の線分に分断された線であってもよく、任意の形状の曲線であってもよく、互いに平行又は非平行である２本以上の線を含んでもよく、メッシュ状に配置された複数の直線を含んでもよく、その他の任意の形態であってよい。基準線４０の数は特に限定されず、例えば、１本、２本、３本、又は４本以上である。

指示部４２は、観察面Ｓ上で基準線４０の近傍に位置する特定領域を示す。ここで「ＡがＢの近傍に位置する」とは、一般的な光学顕微鏡を用いた細胞観察において、通常の倍率の顕微鏡視野内にＡ及びＢの両方が少なくとも部分的に含まれ得ることを意味し、ＡとＢとが互いに接する場合や交わる場合等、共通部分を有する場合を含む。したがって、「基準線の近傍に位置する特定領域」と言う場合、基準線から離間した特定領域だけでなく、基準線上に位置する特定領域も含まれる。
例えば、指示部４２は、特定領域を取り囲む枠線である。図１及び図２の例では、指示部４２は、第１指示部４２ａ、第２指示部４２ｂ、第３指示部４２ｃ、第４指示部４２ｄ、及び第５指示部４２ｅを含む。第１指示部４２ａ、第２指示部４２ｂ、及び第３指示部４２ｃは、正方形の枠線であり、第４指示部４２ｄ及び第５指示部４２ｅは、円形の枠線である。第１指示部４２ａは、基準線４０の一端部に配置された第１領域を示し、第２指示部４２ｂは、基準線４０の中央部に配置された第２領域を示し、第３指示部４２ｃは、第１領域と第２領域との間に配置された第３領域を示す。このように、少なくとも観察面Ｓの端部、中心部、及びその中間部の３点に観察対象の特定領域を設定することにより、観察面Ｓ上の細胞の分布を概観的に把握することができる。

指示部４２の形状は特に限定されない。例えば、指示部４２は、特定領域を取り囲む円形、楕円形、多角形その他の任意の閉曲線形状を有することができる。また、特定領域を示すことができれば、指示部４２は必ずしも閉曲線形状でなくてもよい。例えば、指示部４２は、特定領域が正方形である場合には４つの頂点を示す点であってもよく、点線や破線等であってもよく、特定領域の形状の窪みであってもよく、その他の任意の形態であってよい。

指示部４２によって特定される観察面Ｓ上の特定領域は、同一視野内の細胞Ｃの経時変化を観察するための観察対象領域である。指示部４２が設けられていない場合には、収容部１２内の細胞Ｃを複数回観察する場合において、前回の観察時の視野を容易に特定できないため、同一視野内の細胞Ｃの経時変化を観察することが困難である。これに対し、本実施形態に係る容器１を使用した場合、毎回、所定の指示部４２によって特定される同じ特定領域を観察することによって、同一視野内の細胞Ｃの経時変化を観察することができる。また、指示部４２が基準線４０の近傍に配置されているので、まず基準線４０を見つけ、基準線４０に沿って視野を移動させることにより、所望の指示部４２を容易に発見することができる。

指示部４２は、各特定領域を識別するための識別部を有してもよい。識別部は、数字、文字、記号等の任意の識別符号を含む。識別部は、特定領域の位置を示す部分（枠線等）に隣接してもよく、特定領域の位置を示す部分と一体であってもよい。例えば、指示部４２の各々が実線、点線、破線等の異なる種類の枠線である場合には、特定領域の位置を示す部分が識別部としても機能する。

図３に示すように、基準線４０及び指示部４２は、底壁３０に形成された凹部である。例えば、基準線４０及び指示部４２は、底壁３０の上面又は下面に溝部として形成される。基準線４０及び指示部４２に相当する凹部は、物理的手法や化学的手法等の任意の方法で形成され得る。例えば、基準線４０及び指示部４２は、底壁３０の上面又は下面に対してナイフ、パンチ、針等の任意の手段で力を加えることにより、ケガキ線のような刻印として形成され得る。例えば、指示部４２は、指示部４２に対応する先端形状を有するパンチ状のブレードによって形成され得る。このような基準線４０及び指示部４２は、一般的な市販の培養容器に極めて容易に形成することができるので、簡便である。あるいは、基準線４０及び指示部４２は、感光性材料から形成された底壁３０に対して光を照射して照射部分を変形又は変性させることにより形成されてもよい。また、底壁３０を含む本体１０の成形時に、底壁３０が基準線４０及び指示部４２に相当する凹部を有するように成形されてもよい。なお、逆に基準線４０及び指示部４２が底壁３０の上面に凸部として形成されてもよい。例えば、本体１０の成形時に、底壁３０が基準線４０及び指示部４２に相当する凸部を有するように成形されてもよい。

なお、底壁３０に形成される基準線４０及び指示部４２は、上記例に限定されず、任意の方法により底壁３０の一部に形成された視認可能な任意の特徴部であってよい。例えば、基準線４０及び指示部４２は、底壁３０に対する光照射等によって底壁３０の一部を変色させることにより、変色部として形成されてもよい。基準線４０及び指示部４２は、底壁３０の上面又は下面に印刷されてもよく、ペンや鉛筆等で描画されてもよいが、細胞毒性を有する成分が収容部１２内の細胞Ｃに接触しないことが望ましい。例えば、基準線４０及び指示部４２が、底壁３０の上面に描画され、その上に保護膜が形成されてもよい。また、細長い棒状部材やメッシュ部材等の別の部材を底壁３０の上面に配置し、この別の部材の一部又は全部（例えば棒状部材の全体やメッシュ部材の一部）を基準線４０や指示部４２として利用してもよい。また、底壁を有しない筒状の容器を用意して、容器の底に基準線４０及び指示部４２が形成された板部材や膜部材を底壁として取り付けてもよい。なお、本明細書において「底壁」は厚さを問わず、肉厚の壁であってもよく、薄膜であってもよい。

図４は、図２の線Ａ－Ａに沿った別の実施形態の容器１の断面図である。本実施形態では、基準線４０及び指示部４２は、底壁３０上に配置された膜部材５０に形成されている。膜部材５０は、一方の面５０ａに基準線４０及び指示部４２のうち少なくとも一方を有し、一方の面５０ａが底壁３０に向くように底壁３０上に配置される。例えば、基準線４０及び指示部４２は、膜部材５０の下面５０ａに印刷されてもよく、ペンや鉛筆等で描画されてもよい。基準線４０及び指示部４２が印刷又は描画された下面５０ａが底壁３０を向くように配置すると、印刷又は描画された成分が収容部１２内の細胞Ｃに接触しない点で好ましい。
なお、膜部材５０に形成される基準線４０及び指示部４２は上記例に限定されない。例えば、基準線４０及び指示部４２は、膜部材５０に形成された凹部、凸部、折り目、切れ目、ミシン目、穿孔、開口、変色部等、視認可能な任意の特徴部であってよい。

膜部材５０の材質は、本体１０と同じ材質であっても異なる材質であってもよい。例えば、ポリスチレン、ポリホスファゼン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド（例えば、ナイロン等）、ポリエステルアミド、ポリ（アミノ酸）、ポリ無水物、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリアクリレート（アクリル樹脂）、ポリアルキレン（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン等）、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール等）、ポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド等）、ポリアルキレンテレフタレート（例えば、ポリエチレンテレフタレート等）、ポリオルトエステル、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド（例えば、ポリ（塩化ビニル）等）、フルオロカーボンポリマー（例えば、ポリテトラフルオロエチレン等）、環状オレフィンポリマー、ポリビニルピロリドン、ポリエステル、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリヒドロキシ酸（例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド等）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリ［ラクチド－ｃｏ－（ε－カプロラクトン）］、ポリ［グリコリド－ｃｏ－（ε－カプロラクトン）］等）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、及びこれらのコポリマー等が挙げられ、これらに限定されない。

ポリアクリレート（アクリル樹脂）としてより具体的には、例えば、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、ポリ（アクリル酸オクタデシル）等が挙げられる。

中でも、ポリ塩化ビニリデン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル等の透明なプラスチック材料が好ましい。例えば、膜部材５０は、市販のラップ等のフィルムであってよい。

本実施形態における膜部材５０は、上記に例示された材料のうち１種類から構成されていてもよく、２種類以上から構成されていてもよい。また、膜部材５０の材料は、上記例に限定されず、上記以外の合成高分子化合物の他、天然高分子化合物で構成されていてもよく、天然高分子化合物及び合成高分子化合物の両方から構成されていてもよい。

膜部材５０は、任意の方法により底壁３０上に配置され得る。例えば、膜部材５０は、ファンデルワールス力、静電気力、減圧吸着作用等によって底壁３０の上面に張り付いてもよく、任意の接着剤により底壁３０の上面又は側壁３２の内面に貼り付けられてもよい。

基準線４０及び指示部４２は、観察面Ｓに直交する方向において観察面Ｓを基準として細胞観察用の顕微鏡の対物レンズの焦点深度内に位置する。例えば、図３に示すように、基準線４０及び指示部４２が底壁３０の上面に凹部として形成される場合には、観察面Ｓ（すなわち底壁３０の上面）からの凹部の深さは、好ましくは対物レンズの焦点深度以内である。基準線４０及び指示部４２が底壁３０の上面に凸部として形成される場合には、観察面Ｓ（すなわち底壁３０の上面）からの凸部の高さは、好ましくは対物レンズの焦点深度以内である。図４に示すように、基準線４０及び指示部４２が底壁３０上に配置された膜部材５０に形成される場合には、観察面Ｓから膜部材５０の下面５０ａに印刷又は描画された基準線４０及び指示部４２までの距離は、好ましくは対物レンズの焦点深度以内である。
底壁３０の下面に基準線４０及び指示部４２が形成される場合には、観察面Ｓと基準線４０及び指示部４２とがともに対物レンズの焦点深度内に含まれるように、底壁３０の厚さは十分に薄いことが好ましい。

対物レンズの焦点深度Ｄは、一般に以下のＢｅｒｅｋの式で求められる。ここで、ｎはサンプルと対物レンズとの間の媒質の屈折率、ωは観察者の眼の分解能、Ｍは対物レンズ及び接眼レンズの総合倍率、ＮＡは対物レンズの開口数、λは光の波長である。
Ｄ＝ｎ×［（２５００００×ω）／（Ｍ・ＮＡ）＋λ／２ＮＡ^２］（μｍ）
上記式によれば、ｎ＝１、ω＝０．００１４、λ＝０．５５μｍ（可視光）、ＮＡ＝０．９０とすると、総合倍率Ｍ＝５倍の場合には焦点深度Ｄ＝７８μｍ、総合倍率Ｍ＝１０倍の場合には焦点深度Ｄ＝３９μｍ、総合倍率Ｍ＝２０倍の場合には焦点深度Ｄ＝２０μｍ、総合倍率Ｍ＝５０倍の場合には焦点深度Ｄ＝８．１μｍ、総合倍率Ｍ＝１００倍の場合には焦点深度Ｄ＝４μｍである。

例えば、観察面Ｓに直交する方向における観察面Ｓと基準線４０及び指示部４２との距離は、１００μｍ以下、９０μｍ以下、８０μｍ以下、７０μｍ以下、６０μｍ以下、５０μｍ以下、４０μｍ以下、３０μｍ以下、２０μｍ以下、又は１０μｍ以下である。この場合、基準線４０及び指示部４２と観察対象の細胞Ｃとがともに対物レンズの焦点深度内に含まれ得る点で好ましい。図３に示す例において、基準線４０及び指示部４２を形成する凹部の深さは、例えば、１００μｍ以下、９０μｍ以下、８０μｍ以下、７０μｍ以下、６０μｍ以下、５０μｍ以下、４０μｍ以下、３０μｍ以下、２０μｍ以下、又は１０μｍ以下である。図４に示す例において、基準線４０及び指示部４２が形成された膜部材５０の厚さは、例えば、１００μｍ以下、９０μｍ以下、８０μｍ以下、７０μｍ以下、６０μｍ以下、５０μｍ以下、４０μｍ以下、３０μｍ以下、２０μｍ以下、又は１０μｍ以下である。

指示部４２によって示される特定領域の大きさは、特定領域の全体が顕微鏡で観察できるように、かつ特定領域に含まれる細胞Ｃの数が多すぎないように設定されることが好ましい。例えば、特定領域の面積は、５ｍｍ^２以下、４ｍｍ^２以下、３ｍｍ^２以下、２ｍｍ^２以下、１ｍｍ^２以下、０．５ｍｍ^２以下、０．３ｍｍ^２以下、０．２ｍｍ^２以下、又は０．１ｍｍ^２以下である。例えば、特定領域は、１ｍｍ四方、０．５ｍｍ四方、又は０．２５ｍｍ四方の正方形である。あるいは、特定領域は、直径１ｍｍ、直径０．５ｍｍ、又は直径０．２５ｍｍの円である。特定領域が、０．２５ｍｍ四方の正方形である場合、血球計算盤として機能する。

上記例では、基準線４０及び指示部４２がともに同一の方法で形成されているが、基準線４０及び指示部４２は、異なる方法で形成されてもよい。指示部４２が複数の指示部を含む場合には、１以上の指示部は、同一の手法で形成されてもよく、異なる方法で形成されてもよい。

図５は、別の実施形態の容器２の上面図である。図５に示すように、容器２は、上面が開放された丸形の培養皿である。容器２は、本体６０を備える。本体６０は、円形の底壁７０と、底壁７０の周縁から上方に延在する側壁７２と、を備える。なお、容器２は、多角形や楕円形等の他の形状の培養皿であってもよい。
底壁７０に観察面Ｓが形成され、観察面Ｓに基準線８０及び基準線８０の近傍において、特定領域を示す指示部８２が表示される。指示部８２は、第１領域を示す正方形の枠線である第１指示部８２ａ、第２領域を示す正方形の枠線である第２指示部８２ｂ、第３領域を示す正方形の枠線である第３指示部８２ｃ、第４領域を示す円形の枠線である第４指示部８２ｄ、及び第５領域を示す円形の枠線である第５指示部８２ｅを含む。基準線８０及び指示部８２の配置構成や形成方法は、基準線４０及び指示部４２と同様である。

容器の形態は、上記例に限定されない。例えば、容器は、バイアル、ディッシュ、ボトル、フラスコ等の任意の形状の培養容器であってもよく、多数のウェルが形成された多穴プレートであってもよい。各種容器において、培養細胞Ｃが位置する観察面Ｓに基準線８０及び特定領域を示す指示部８２が表示される。

［細胞観察システム］
１実施形態において、本発明は、対物レンズを有する顕微鏡と、前記顕微鏡により観察される細胞を収容する、底壁及び側壁を備える細胞観察用の容器と、を備える細胞観察システムであって、前記底壁に前記顕微鏡のための観察面が形成され、前記観察面に基準線及び前記基準線の近傍において特定領域を示す指示部が表示され、前記基準線及び前記指示部は、前記観察面に直交する方向において前記観察面を基準として前記対物レンズの焦点深度内に位置する、細胞観察システムを提供する。

顕微鏡は、任意の種類の顕微鏡であってよく、例えば光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、位相差顕微鏡等である。対物レンズは、任意の形態のレンズであってよい。

［容器の製造方法］
１実施形態において、本発明は、底壁及び側壁を備える細胞観察用の容器を用意する工程と、前記底壁上に基準線及び前記基準線の近傍において特定領域を示す指示部を形成する工程と、を含む容器の製造方法を提供する。

基準線及び指示部を形成する工程は、任意の方法により実行可能であり、例えば上述した種々の方法により実行可能である。例えば、基準線及び指示部は、物理的手法や化学的手法により、容器の底壁の上面に凹部、凸部等の変形部として、又は変色部等の変性部として形成され得る。あるいは、基準線及び指示部は、例えば容器の底壁への印刷や描画等により、視認可能な材料が容器の底壁に添加されてもよい。また、基準線及び指示部は、膜部材（図４参照）、棒状部材、メッシュ部材等、容器とは別の部材によって形成されてもよい。

［容器の使用方法］
１実施形態において、本発明は、上述の容器の使用方法であって、前記容器内に観察対象の細胞を供給する工程１と、顕微鏡下で前記基準線を特定する工程２と、顕微鏡下で前記基準線に沿って所定の指示部を探索する工程３と、顕微鏡下で前記所定の指示部を特定する工程４と、前記特定された指示部により示される前記特定領域に含まれる細胞を顕微鏡下で観察する工程５と、をこの順に含む、容器の使用方法を提供する。

＜工程１＞
観察対象の細胞Ｃを、培養液Ｍとともに、容器の供給口から収容部内に供給する。必要に応じて、容器内で細胞Ｃの培養が行われる。

＜工程２＞
次いで、細胞Ｃを含む容器を顕微鏡のステージ上に配置する。収容部内を顕微鏡で観察する。まず、観察面Ｓに表示された基準線を特定する。図１及び図２に示すように、基準線が観察面Ｓの一側から他側へ延在していることにより、基準線の特定は顕微鏡下であっても比較的容易である。

＜工程３＞
顕微鏡下で基準線を発見した後、基準線に沿ってステージ又はステージ上の容器自体を一方向に移動させる。指示部は基準線の近傍に配置されているので、上記操作によって所望の特定領域を示す指示部を探索することができる。

＜工程４＞
次いで、観察対象とする特定領域に対応する指示部を顕微鏡下で特定する。例えば、各指示部により示された複数の特定領域のうち、細胞Ｃの数、配置、状態等に基づき、細胞Ｃの観察に適した特定領域を選定することができる。好ましくは、選定した特定領域の全体が顕微鏡の視野に含まれるようにステージ又はステージ上の容器の位置や顕微鏡の倍率を調節する。

＜工程５＞
次いで、特定した指示部により示される特定領域に含まれる細胞Ｃを顕微鏡下で観察する。例えば、特定領域に含まれる細胞像や細胞数を検査する。一定時間の経過後、再び同じ特定領域を観察し、細胞像や細胞数の経時変化を調べることができる。ここで、最初の観察後に容器が一旦顕微鏡のステージから回収されたり、ステージ上の容器の位置が変更されたりすることがある。しかしながら、そのような場合でも、再び工程２～工程４を実行することにより、工程４で特定した指示部を発見し、前回の観察と同じ特定領域を観察することができる。

培養細胞Ｃが容器に保存されて輸送される場合においても、ユーザが輸送前後で細胞Ｃを観察してサンプルの同一性を確認する際に、基準線及び指示部を利用することによって、同一視野の細胞Ｃの比較観察を容易に行うことができる。このように輸送前後で特定領域内の細胞数の計測や細胞形態の観察を行うことにより、輸送される細胞Ｃの品質を保証することができる。

上記の各工程は、ユーザによって実行されてもよく、少なくとも部分的にコンピュータ制御によって実行されてもよい。

［細胞輸送装置］
次いで、上記の技術的思想を応用した細胞輸送装置１００について、図６及び図７を参照して説明する。細胞輸送装置１００は、「容器」の一形態でもある。
１実施形態において、本発明は、第１の培養皿と第２の培養皿とを有する細胞輸送装置であって、前記第１の培養皿は、底壁を備え、前記第２の培養皿は、底面に多孔質膜を備え、前記第２の培養皿は、前記第１の培養皿と前記多孔質膜とに囲まれた隙間を有した状態で、前記第１の培養皿の上部に装着され、前記第１の培養皿の前記底壁に観察面が形成され、前記観察面に基準線及び前記基準線の近傍において特定領域を示す指示部が表示される、細胞輸送装置を提供する。

本明細書において、「多孔質膜」とは、細孔を多数有する膜を意味し、空隙を有する膜、細孔と空隙とを有する膜も包含する。多孔質膜が気相中で液密性を有し、液相中で半透性を有する半透膜であってもよい。多孔質膜としては、例えば、濾紙、半透膜（例えば、限外濾過膜等）、不織布、ガーゼ様メッシュ、各種メンブレンフィルタ等が挙げられ、これらに限定されない。
多孔質膜の細孔の大きさとしては、例えば０．０１μｍ以上１，５００μｍ以下であればよく、例えば０．０１μｍ以上１．０μｍ以下であればよく、例えば０．０１μｍ以上０．４５μｍ以下があればよい。

第２の培養皿の多孔質膜としては、例えば、滅菌フィルタが挙げられる。滅菌フィルタとしては、第２の培養皿に混入した細菌が第１の培養皿の培養空間へ透過しない程度の孔を有する膜であればよく、特別な限定はない。

図６（ａ）～（ｂ）は、本実施形態の細胞輸送装置１００の一例の構造を説明する模式図である。図６（ａ）は、本実施形態の細胞輸送装置１００の斜視図であり、図６（ｂ）は、図６（ａ）の側面図である。
図６（ｂ）～（ｃ）に示すように、細胞輸送装置１００において、第２の培養皿１２０が、隙間１３０の高さを調節可能な状態で、第１の培養皿１１０の上部に装着されている。好ましくは、図１（ｂ）に示すように、第２の培養皿１２０の上部に形成されたフランジの下面が第１の培養皿１１０の側壁の上端面に密着した状態（すなわち、第１の培養皿１１０に対する第２の培養皿１２０の高さ方向の位置を最も低くした状態）において、一定の高さの隙間１３０が形成される。図６（ｃ）は、細胞輸送装置１００において、第２の培養皿１２０が、最も下方に位置する状態から、第２の培養皿１２０が第１の培養皿１１０から引き上げられた状態へ変化させたときの側面図である。図６（ｃ）に示すように、第２の培養皿１２０が第１の培養皿１１０から引き上げられることにより、隙間１３０の高さが増加する。隙間１３０は、第１の培養皿１１０の底面及び内側面と第２の培養皿１２０の底面とに囲まれて画成される。隙間１３０の高さは、第１の培養皿１１０と第２の培養皿１２０との距離を調節することにより調節可能であり、例えば０ｃｍ～１ｃｍが好ましく、０ｃｍ～０．５ｃｍがより好ましい。隙間１３０の高さは、細胞輸送装置１００の用途に応じて、例えば、封入する細胞の体積に応じて調節可能である。

図６（ｄ）は、第１の培養皿１１０の側面図である。図６（ｄ）において、第１の培養皿１１０は、内周面に雌ねじが切られており、雌ねじ構造を有している。図６（ｅ）は、第１の培養皿１１０の上面図である。図６（ｅ）において、第１の培養皿１１０は、底面に「底壁」として膜部材１１２を有している。膜部材１１２には、上述の容器１、２と同様に、基準線１１４及び指示部１１６が形成されている。すなわち、第１の培養皿１１０の底壁は、基準線１１４及び指示部１１６が形成された膜部材１１２である。図６（ｆ）は、図６（ｅ）の線Ｂ－Ｂに沿った第１の培養皿１１０の断面図である。図３に示す容器１と同様に、基準線１１４及び指示部１１６は、膜部材１１２の上面に凹部として形成されている。

図６（ｇ）は、第２の培養皿１２０の側面図である。図６（ｇ）において、第２の培養皿１２０は、外周面に雄ねじが切られており、雄ねじ構造を有している。図６（ｈ）は、第２の培養皿１２０の上面図である。図６（ｈ）において、第２の培養皿１２０は、底面に滅菌フィルタ１２２を有している。

本実施形態では、隙間１３０は、第１の培養皿１１０の側壁の内側面、第１の培養皿１１０の底面の膜部材１１２、及び第２の培養皿１２０の底面の滅菌フィルタ１２２によって囲まれて画成される。隙間１３０は、第１の培養皿１１０の培養空間として利用可能である。好ましくは、隙間１３０は、滅菌フィルタ１２２を除いて細胞輸送装置１００の外部から密閉され、滅菌フィルタ１２２を通じてのみ外部（例えば第２の培養皿１２０の内部空間）と連通することができる。

第１の培養皿１１０と第２の培養皿１２０の間に生じる隙間の高さを調節する手段として、雄ねじ構造の根元にシリコンＯ-リング、金属ワッシャー、又は環状ナイロン膜等を装着した後に雌ねじと螺着してもよい。
第１の培養皿１１０と第２の培養皿１２０との間は、高さを調節可能な隙間１３０を有した状態で装着されていればよく、あるいは、一定の高さの隙間１３０を有した状態で装着されるように底面までの雄ねじ距離を短くした第２の培養皿１２０を用いて装着されていればよく、係合又は嵌合により装着されていることが好ましい。本実施形態においては、第１の培養皿１１０の雄ねじと第２の培養皿１２０の雌ねじとの締め切った状態において、一定の高さを有する隙間１３０が形成されることが好ましい。
図６（ａ）及び図６（ｂ）では、第１の培養皿１１０と第２の培養皿１２０が、螺着により装着されているが、装着機構は問わず、テーパー構造を介して装着されていてもよい。

細胞輸送装置１００は、第１の蓋１４０（図７（ａ）、図７（ｃ）、及び図７（ｄ）参照）及び第２の蓋１５０（図７（ｂ）参照）をさらに備える。
第１の蓋１４０は、第１の培養皿１１０又は第２の培養皿１２０の上面を被覆することができる。第１の蓋１４０は培養皿１１０、１２０の上面を覆うことができれば特に限定されず、任意の構成であってよい。第１の蓋１４０は、必ずしも培養皿１１０、１２０の上面を密封できなくてもよい。例えば、図７（ａ）及び図７（ｃ）に示すように、第１の蓋１４０は、培養皿１１０、１２０に装着された場合に、培養皿１１０、１２０の上端部の外側面と第１の蓋１４０の内側面との間に隙間が形成されるような大きさであってよい。第１の蓋１４０を通して細胞Ｃを顕微鏡で観察する観点から、第１の蓋１４０は、透明又は半透明な材料で構成されることが好ましい。

第２の蓋１５０は、第２の培養皿１２０の上面を被覆及び密封することができる。第２の蓋１５０は第２の培養皿１２０の上面を密封することができれば特に限定されず、任意の構成であってよい。例えば、図７（ｂ）に示すように、第２の蓋１５０は、第２の培養皿１２０に装着された場合に、第２の培養皿１２０の上端部の外側面と第１の蓋１４０の内側面とが緊密に接触するような大きさであってよい。第２の蓋１５０は、透明又は半透明な材料で構成されてもよく、不透明な材料で構成されてもよい。

第１の培養皿１１０及び第２の培養皿１２０の外径は、略同一が好ましい。外径は、６ｍｍ～１５０ｍｍが好ましく、１０ｍｍ～１００ｍｍがより好ましく、１４ｍｍ～６０ｍｍがさらに好ましい。第１の培養皿１１０の内径は、２ｍｍ～１４６ｍｍが好ましく、６ｍｍ～９６ｍｍがより好ましく、１０ｍｍ～５６ｍｍがさらに好ましい。第２の培養皿１２０の内径は、１ｍｍ～１４０ｍｍが好ましく、２ｍｍ～９０ｍｍがより好ましく、３ｍｍ～５０ｍｍがさらに好ましい。
また、細胞輸送装置１００の高さは、０．５ｃｍ～１０ｃｍが好ましく、１ｃｍ～５ｃｍがより好ましい。

第１の培養皿１１０の膜部材１１２としては、例えば、プラスチック製の膜が挙げられる。
図６に示す例では、基準線１１４及び指示部１１６が膜部材１１２の上面に凹部として形成されているが、基準線１１４及び指示部１１６のうち少なくとも一方が膜部材１１２の下面に形成されてもよい。ただし、容器１、２と同様に、観察面Ｓ（本実施形態では膜部材１１２の上面）と基準線１１４及び指示部１１６との距離は、顕微鏡の対物レンズの焦点深度以下であることが好ましい。

基準線１１４及び指示部１１６は、上記例に限定されず、任意の方法で形成されてよい。例えば、基準線１１４及び指示部１１６は、膜部材１１２に印刷又はペンや鉛筆で描画されてもよい。この場合、培養細胞への悪影響を抑制する観点から、基準線１１４及び指示部１１６は、膜部材１１２の下面に形成されるのが好ましい。

膜部材１１２は、第１の培養皿１１０と一体に形成されてもよい。あるいは、第１の培養皿１１０は、膜部材１１２に代えて肉厚の底壁を備えてもよい。この場合、第１の培養皿１１０の底壁の構成は、容器２の底壁と同様であってよい。

膜部材１１２の材質としては、例えば、膜部材５０の材料として上述した各材料が挙げられる。
中でも、ポリスチレン、ポリヒドロキシ酸（例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド等）、ポリエチレンテレフタレート、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリ［ラクチド－ｃｏ－（ε－カプロラクトン）］、ポリ［グリコリド－ｃｏ－（ε－カプロラクトン）］等）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、ポリオルトエステル、又はこれらのコポリマーが好ましい。
本実施形態における膜部材１１２は、上記に例示された材料のうち１種類から構成されていてもよく、２種類以上から構成されていてもよい。また、膜部材１１２の材料は、上記例に限定されず、上記以外の合成高分子化合物の他、天然高分子化合物で構成されていてもよく、天然高分子化合物及び合成高分子化合物の両方から構成されていてもよい。

本実施形態における膜部材１１２の厚さは特に制限されないが、１μｍ～１０００μｍが好ましく、１μｍ～５００μｍがより好ましく、５μｍ～３００μｍがさらに好ましく、１０μｍ～２００μｍが特に好ましい。

本実施形態における滅菌フィルタ１２２の細孔の大きさとしては、細菌の大きさを考慮して、例えば０．０１μｍ～１．０μｍが好ましく、例えば０．０１μｍ～０．５μｍが好ましく、例えば０．０１μｍ～０．２μｍが好ましく、例えば０．０１μｍ～０．１μｍが好ましい。

本実施形態における滅菌フィルタ１２２の厚さは特に制限されないが、１μｍ～１０００μｍが好ましく、１μｍ～５００μｍがより好ましく、５μｍ～３００μｍがさらに好ましく、１０μｍ～２００μｍが特に好ましい。

滅菌フィルタ１２２以外の細胞輸送装置１００の材質としては、容器１の材料として上述した各材料が挙げられ、プラスチックが好ましい。
細胞輸送装置１００の色としては、特に限定されないが、各種顕微鏡を用いて細胞を観察する等の観点から透明色および不透明（遮光）色を適宜選択することが好ましい。また、細胞輸送装置１００には、培養する個々の細胞を識別するための工夫（例えば、着色、印字等）が施されていてもよい。

滅菌フィルタ１２２以外の細胞輸送装置１００の製造方法としては、圧縮成形法、射出成形法、押出成形法等が挙げられるが、これらに限定されない。

第１の培養皿１１０と膜部材１１２の材質が同じ場合には、両者が一体化したものとして捉えてもよい。例えば、第１の培養皿１１０と膜部材１１２の材質がＰＥＴ等プラスチック樹脂である場合、別途ＰＥＴ等プラスチック膜を張らずとも、本発明の範囲内に含まれる。

［培養皿の製造方法］
第１の培養皿１１０は、任意の方法で製造することができる。例えば、第１の培養皿１１０は、圧縮成形法、射出成形法、押出成形法等の任意の方法で膜部材１１２以外の部分を形成し、別途任意の方法で膜部材１１２を製造し、膜部材１１２を膜部材１１２以外の部分に結合することにより製造される。あるいは、第１の培養皿１１０は膜部材１１２を含めて一体成型されてもよい。

第２の培養皿１２０は、任意の方法で製造することができる。例えば、第２の培養皿１２０は、圧縮成形法、射出成形法、押出成形法等の任意の方法で滅菌フィルタ１２２以外の部分を形成し、別途任意の方法で滅菌フィルタ１２２を製造し、滅菌フィルタ１２２を滅菌フィルタ１２２以外の部分に結合することにより製造される。あるいは、第２の培養皿１２０は滅菌フィルタ１２２を含めて一体成型されてもよい。

［細胞輸送装置の使用方法］
本実施形態の細胞輸送装置１００は、細胞の培養、細胞の輸送等に使用することができる。細胞輸送装置１００は、容器として又は細胞培養装置として利用可能である。

［細胞輸送装置による細胞の輸送方法］
本実施形態の細胞の輸送方法は、上述の細胞輸送装置１００を用いる方法である。本実施形態の輸送方法によれば、細胞を安全かつ確実に容易に輸送することができ、輸送される細胞の品質を保証することができ、培養細胞へのコンタミネーションのリスクの高い酵母、カビおよび細菌などの微生物（一般的な大きさ：約０．５μｍ～５μｍ）のコンタミネーションを防止することができ、長期間の輸送にも対応することができる。
本実施形態の輸送方法について、図７（ａ）～（ｄ）を参照して、以下に詳細に説明する。

図７（ａ）～（ｄ）は、本実施形態の細胞輸送装置１００による細胞輸送方法を示す断面図である。
まず、細胞Ｃを懸濁した培養液Ｍを準備する。次いで、上述の第１の培養皿１１０内に細胞Ｃを懸濁した培養液Ｍを注入する。次いで、図７（ａ）に示すように、第１の培養皿１１０の上面を第１の蓋１４０で被覆し、第１の培養皿１１０内で細胞Ｃの培養を行う。

次いで、細胞Ｃを輸送する前に、第１の蓋１４０を通して、第１の培養皿１１０内の細胞Ｃを顕微鏡で観察する。上述の［容器の使用方法］と同様にして、基準線１１４に沿って指示部１１６を探索することにより、観察対象とする特定領域を顕微鏡下で選定し、その特定領域に対応する指示部１１６を特定することができる。特定領域に含まれる細胞Ｃを顕微鏡下で観察し、例えば、特定領域に含まれる細胞像や細胞数を検査する。

次いで、図７（ｂ）に示すように、第１の蓋１４０を取り外して第２の培養皿１２０を第１の培養皿１１０に装着する。好ましくは、第２の培養皿１２０の上部に形成されたフランジの下面が第１の培養皿１１０の側壁の上端面と密着するまで、第１の培養皿１１０の雌ねじと第２の培養皿１２０の雄ねじとを締め切る。第１の培養皿１１０内の培養液Ｍは、滅菌フィルタ１２２を通って第２の培養皿１２０の内部に進入する。細胞Ｃは滅菌フィルタ１２２の小さい穴を通れないので、引き続き第１の培養皿１１０内に位置する。次いで、第２の培養皿１２０に培養液Ｍをさらに注入し、第２の培養皿１２０の上端まで培養液Ｍで満たす。次いで、第２の蓋１５０で第２の培養皿１２０を密封する。これにより、培養皿１１０、１２０の内部の培養空間が完全に培養液Ｍで満たされるので、培養空間内に気泡が存在せず、輸送中に細胞輸送装置１００に加わる振動等の細胞Ｃへの影響が抑制される。また、細胞Ｃが存在する第１の培養皿１１０の培養空間と、第２の培養皿１２０の培養空間とが滅菌フィルタ１２２で仕切られているので、万一第２の蓋１５０の装着操作中等に細菌その他の微生物のコンタミネーションが第２の培養皿１２０内に混入した場合でも、細胞Ｃが存在する第１の培養皿１１０の培養空間へのコンタミネーションは防止される。

次いで、図７（ｂ）の状態で細胞輸送装置１００を輸送する。輸送方法は非凍結輸送で行われる。また、細胞輸送装置１００の輸送は、内部の培養液Ｍの漏れを防ぐ観点から、図２（b）に示すように、ねじを締め切って第１の培養皿１１０と第２の培養皿１２０とを密封した状態で行われるのが好ましい。輸送後は、図７（ｃ）に示すように、密封用の第２の蓋１５０を取り外し、培養液Ｍの約半量を除去した後、第１の蓋１４０を第２の培養皿１２０に装着する。この操作を行う際にも、滅菌フィルタ１２２により、細胞Ｃが存在する第１の培養皿１１０内の培養空間へのコンタミネーションが防止される。

次いで、第１の蓋１４０を通して、第１の培養皿１１０内の細胞Ｃを顕微鏡で観察する。基準線１１４に沿って輸送前に特定した指示部１１６を探索することにより、所望の指示部１１６を容易に発見することができるので、輸送前に観察した特定領域と同一の領域を特定し、観察することができる。すなわち、輸送前後における同一視野での細胞観察を容易に行うことができる。特定領域に含まれる細胞Ｃを顕微鏡下で観察し、例えば、特定領域に含まれる細胞像や細胞数を検査する。これにより、輸送前後における同一の特定領域における細胞像や細胞数を容易に比較することができる。

その後、図７（ｃ）に示すような状態で細胞Ｃの培養を行ってもよく、第２の培養皿１２０を第１の培養皿１１０から取り外した図７（ｄ）に示すような状態で細胞Ｃの培養を行ってもよい。

輸送時の温度としては、例えば４℃以上３７℃以下であってもよく、１８℃以上３７℃以下であってもよい。
輸送時間としては、細胞Ｃの種類、細胞数等により適宜選択することができ、例えば１時間以上１４日以下であってもよく、例えば１２時間以上７日以下であってもよく、例えば１日以上３日以下であってもよい。

［容器］
１実施形態において、本発明は、天面、底面、及び側面を備えた、細胞観察用の円柱状容器であって、多孔質膜を少なくとも天面に備え、底面に観察面が形成され、前記観察面に基準線及び前記基準線の近傍において特定領域を示す指示部が表示される、容器を提供する。

図８は、本実施形態の容器の一例の構造を説明する斜視図である。
図８に示す様に、本実施形態の容器２００は、天面２０３、底面２０１、及び側面２０２を備えた、細胞観察用の円柱状容器である。本実施形態においては、底面２０１はプラスチック膜からなり、天面２０３は、多孔質膜からなる。好ましくは、多孔質膜は側面２０２から脱着可能である。多孔質膜としては、例えば、滅菌フィルタが挙げられる。滅菌フィルタとしては、細菌が容器内へ透過しない程度の孔を有する膜であればよく、特別な限定はない。

本実施形態において、底面２０１に観察面が形成され、前記観察面に基準線及び前記基準線の近傍において特定領域を示す指示部が表示される。図３に示す容器１と同様に、底面は、前記基準線及び前記指示部が形成された膜部材であり、基準線及び指示部は、底面の上面に凹部として形成されている。
基準線及び指示部は、上記例に限定されず、任意の方法で形成されてよい。例えば、基準線及び指示部は、底面に印刷又はペンや鉛筆で描画されてもよい。この場合、培養細胞への悪影響を抑制する観点から、基準線及び指示部は、底面の下面に形成されるのが好ましい。

本実施形態の容器２００の内径は、１ｍｍ以上６０ｍｍ以下であることが好ましく、３ｍｍ以上３５ｍｍ以下であることがより好ましく、５ｍｍ以上２６ｍｍ以下であることがさらに好ましい。
また、本実施形態の容器２００の外径は、３ｍｍ以上６８ｍｍ以下であることが好ましく、５ｍｍ以上４３ｍｍ以下であることがより好ましく、７ｍｍ以上３４ｍｍ以下であることがさらに好ましい。
また、本実施形態の容器２００の厚み（円柱の高さ）は、５μｍ以上であって、５０μｍ以上１５ｍｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以上１０ｍｍ以下であることがより好ましく、２００μｍ以上２．５ｍｍ以下であることがさらに好ましい。
なお、「円柱の高さ」は、容器２００の天面の外側の縁部から、底面の外側の縁部までの距離を意味する。

本実施形態の容器２００の内部容積は、培養液に懸濁した多細胞を注入でき、細胞の活性をアッセイする試験等のインビトロ試験系で用いられる多細胞構造体を構築することができる程度のスモールスケールであればよい。具体的には、例えば、１０ｍＬ以下であることが好ましく、１０μＬ以上５ｍＬ以下であることがより好ましく、１５μＬ以上２ｍＬ以下であることがさらに好ましく、２０μＬ以上１ｍＬ以下であることが特に好ましい。
内部容積が上記上限値以下であることにより、十分に酸素及び培養液の栄養分が供給され、細胞を効率よく長期間に渡り培養することができる。また、内部容積が上記下限値以上であることにより、インビトロ試験系で用いるのに十分な細胞数及び細胞密度の細胞を得ることができる。
本実施形態の容器２００は、ピンセット等で容易に取り扱うことができる。

細胞を輸送する際には、細胞が封入された容器２００を、培養液を含む開閉可能な密封容器に封入し、運搬することができる。運搬方法における密封容器は、開閉可能なものであればよく、特別な限定はない。密封容器としては、例えば、スクリューキャップ付のコニカルチューブ、スクリューキャップ付の細胞培養用フラスコ等が挙げられ、これらに限定されない。本実施形態の容器２００によれば、輸送前後における同一の特定領域における細胞像や細胞数を容易に比較することができる。

以下、図９～図３５を参照して実施例１～４について説明する。本実施例は、発明を限定するものではない。

［実施例１］
６０ｍｍ×１５ｍｍの細胞培養用ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）、製品番号３５３００２、コーニング社製）を用意し、このφ６０ｍｍディッシュの下に目盛りが付いた紙を置いた。次いで、ステンレス鋼製の片刃トリミング用カミソリ（Ｃａｔ Ｎｏ．Ｔ５８６、３８ｍｍ×１９ｍｍ×０．２３（厚さ）ｍｍ、ＧＥＭ社製）をディッシュの底面の一端に上からあてがい、カミソリをディッシュの底面に押し当てながら、目盛りを基準にして、ディッシュの底面の略中心を通るようにしてディッシュの底面の一端から他端へ、上からなぞるようにカミソリを移動させた。

次いで、カミソリで付けた線跡（図５の基準線８０に相当）を目盛りに合わせ、ディッシュの一端から約３ｍｍのところに、φ１ｍｍ生検トレパン（ＲＥＦ：ＢＰＰ－１０Ｆ、ＬＯＴ：１９Ｄ４９、円内面積：０．００７８５ｃｍ^２、カイ インダストリーズ株式会社製）を押し当てた。このとき、トレパンの円形の刃は回転させず、ディッシュの底面に押し当てたまま、力を１～２周させた。形成する円は、できるだけカミソリの基準線に接するか又は近接するようにした。次いで、目盛りに沿って、ディッシュの一端から約１３ｍｍ及び約２５ｍｍのところにも、同様にして円形の跡を付けた。以下、端から約３ｍｍのところの円形線跡を「端」（図５の第１指示部８２ａに相当）、約１３ｍｍのところの円形線跡を「間」（図５の第３指示部８２ｃに相当）、約２５ｍｍのところの円形線跡を「中心」（図５の第２指示部８２ｂに相当）と呼ぶ。

このようにして、φ６０ｍｍ細胞培養ディッシュにカミソリで基準線を付け、トレパンで指示部の円形枠線を付けたものを用意し、培養基材とした。
上記培養基材を使用して、正常ヒト真皮由来線維芽細胞（ＮＨＤＦｓ細胞）を１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で播種し、５ｍＬの培養液中で培養した。播種前（基準線及び円形枠線を付けた後）、培養液のみを入れた段階、播種から２時間後、１日後、４日後、及び７日後の各タイミングで、各サンプルについてディッシュの「端」、「間」、及び「中心」の３点の近傍を観察した。

図９は、実施例１において、播種前、培養液のみを入れた段階、及び播種から２時間後の「端」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。図１０は、実施例１において上記３つのタイミングで「間」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。図１１は、実施例１において上記３つのタイミングで「中心」の近傍を撮影した位相差顕微鏡写真である。対物レンズ４倍、１０倍、２０倍の３種類の倍率による顕微鏡写真を示す（図９の右側は、それぞれの対物レンズで全長１．００ｍｍの目盛りを撮影した位相差顕微鏡写真である）。播種前の写真を「播種前」、培養液のみの写真を「培養液のみ」、播種から２時間後の写真を「播種２時間後」と記載した。円形の線跡によって観察対象の領域を一意に特定でき、細胞像や細胞数を調べることができることが確認された。

播種から２時間後の円形枠線内の細胞数は、「端」で３０ｃｅｌｌｓ、「間」で４４ｃｅｌｌｓ、「中心」で８１ｃｅｌｌｓであった。これらの平均値５１．７ｃｅｌｌｓは、播種密度及び円の面積から計算した理論値７８．５ｃｅｌｌｓから大きく外れていないので、細胞が適切に播種培養されていると考えられる。

［実施例２］
播種密度を０．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２とした点を除き、実施例１と同様にして細胞培養及び観察を行った。

図１２は、実施例２において、播種前、培養液のみを入れた段階、及び播種から２時間後の「端」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。図１３は、実施例２において上記３つのタイミングで「間」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。図１４は、実施例２において上記３つのタイミングで「中心」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。４倍、１０倍、２０倍の３種類の倍率による顕微鏡写真を示す。円形の線跡によって観察対象の領域を一意に特定でき、細胞像や細胞数を調べることができることが確認された。

播種から２時間後の円形枠線内の細胞数は、「端」で３２ｃｅｌｌｓ、「間」で３１ｃｅｌｌｓ、「中心」で９０ｃｅｌｌｓであった。これらの平均値５１．０ｃｅｌｌｓは、播種密度及び円の面積から計算した理論値３９．２５ｃｅｌｌｓから大きく外れていないので、細胞が適切に播種培養されていると考えられる。

［実施例３］
播種密度を０．１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２とした点を除き、実施例１と同様にして細胞培養及び観察を行った。

図１５は、実施例３において、播種前、培養液のみを入れた段階、及び播種から２時間後の「端」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。図１６は、実施例３において上記３つのタイミングで「間」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。図１７は、実施例３において上記３つのタイミングで「中心」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。４倍、１０倍、２０倍の３種類の倍率による顕微鏡写真を示す。円形の線跡によって観察対象の領域を一意に特定でき、細胞像や細胞数を調べることができることが確認された。

播種から２時間後の円形枠線内の細胞数は、「端」で１ｃｅｌｌｓ、「間」で５ｃｅｌｌｓ、「中心」で１８ｃｅｌｌｓであった。これらの平均値８．０ｃｅｌｌｓは、播種密度及び円の面積から計算した理論値７．８５ｃｅｌｌｓから大きく外れていないので、細胞が適切に播種培養されていると考えられる。

［実施例４］
カミソリで付けた線跡を目盛りに合わせ、ディッシュの一端から約５．５ｍｍ、約１５ｍｍ、及び約２５ｍｍのところに円形の跡を付けた以外は、実施例１と同様にして細胞培養及び観察を行った。以下、端から約５．５ｍｍのところの円形線跡を「端」、約１５ｍｍのところの円形線跡を「間」、約２５ｍｍのところの円形線跡を「中心」と呼ぶ。
初期播種密度１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の培養皿３枚について、各培養皿の「端」、「間」、「中心」付近を、０日目（培養２時間目）、１日目、２日目、４日目、７日目、及び１０日目に位相差顕微鏡で同一視野を観察することで、細胞像と細胞数の経時変化を解析した。
１枚目の培養皿Ａから順番に１（端）、２（間）、３（中心）と番号を付した。同様に培養皿の２枚目Ｂに４（端）、５（間）、６（中心）、及び３枚目Ｃに７（端）、８（間）、９（中心）と番号を付した。

図１８及び図１９は、播種前の各培養皿、培養液のみを入れた各培養皿の「端」、「間」、「中心」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。図２０及び図２１は、０日目（培養２時間目）、１日目、２日目、４日目、７日目、及び１０日目の１枚目の培養皿Ａの「端」、「間」、「中心」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。図２２及び図２３は、０日目（培養２時間目）、１日目、２日目、４日目、７日目、及び１０日目の２枚目の培養皿Ｂの「端」、「間」、「中心」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。図２４及び図２５は、０日目（培養２時間目）、１日目、２日目、４日目、７日目、及び１０日目の３枚目の培養皿Ｃの「端」、「間」、「中心」の近傍を撮影した顕微鏡写真である。図２６及び図２７は、０日目（培養２時間目）、１日目、２日目、４日目、７日目、及び１０日目の１枚目の培養皿Ａの「端」、「間」、「中心」の細胞の計測方法を示すとともに計測値を記入した図である。図２８及び図２９は、０日目（培養２時間目）、１日目、２日目、４日目、７日目、及び１０日目の２枚目の培養皿Ｂの「端」、「間」、「中心」の細胞の計測方法を示すとともに計測値を記入した図である。図３０及び図３１は、０日目（培養２時間目）、１日目、２日目、４日目、７日目、及び１０日目の３枚目の培養皿Ｃの「端」、「間」、「中心」の細胞の計測方法を示すとともに計測値を記入した図である。

図３２は、培養皿Ａ～Ｃの「端」、「間」、「中心」における直径１ｍｍの円形線跡中の細胞数の計測結果と「端」、「間」、「中心」の平均細胞数である。図３３は、培養皿Ａ～Ｃの「端」、「間」、「中心」における１ｃｍ^２当たりの細胞数と「端」、「間」、「中心」の１ｃｍ^２当たりの平均細胞数である。図３４は、培養皿Ａ～Ｃの「端」、「間」、「中心」における１ｃｍ^２当たりの細胞数と「端」、「間」、「中心」の１ｃｍ^２当たりの平均細胞数のグラフである。図３５は、培養皿Ａ～Ｃの「端」、「間」、「中心」の細胞数を平均した１ｃｍ^２当たりの細胞数と培養皿Ａ～Ｃの１ｃｍ^２当たりの平均細胞数である。図３６は、培養皿Ａ～Ｃの「端」、「間」、「中心」の細胞数を平均した１ｃｍ^２当たりの細胞数と培養皿Ａ～Ｃの１ｃｍ^２当たりの平均細胞数のグラフである。

結果として、播種した細胞は、いずれの培養皿でも「端」、「間」、「中心」の順に多く存在することが分かった。また、培養２時間目の平均細胞数は１．２５ ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２であり、大半は球状形態を呈する細胞であったが、培養１日目の平均細胞数は１．１２ ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２であり、大半は紡錘形態を呈する細胞であった。
その後、培養２日目より、いずれの培養皿のいずれの部域でも紡錘形態を呈する細胞が経時的に増殖したが、各日とも細胞は、「端」、「間」、「中心」の順に多く存在し、いずれの培養皿でも間の細胞密度は培養皿のほぼ平均であった。
以上の結果は、実際に播種した細胞数は理論値から大きく外れていないが、複数の培養皿を用いて位相差顕微鏡の観察像を比較する際には、「端」は端同士、「中心」は中心同士など同じ部域で実施することが重要であること、また、培養皿の平均細胞密度は、「端」と「中心」の間に相当する部域の細胞密度が反映していることが示唆された。

本発明によれば、簡便な構成で容易に同一視野内の細胞観察を行うことができる容器、培養細胞の製造方法、及び細胞輸送装置を提供することができる。このような同一視野の顕微鏡観察を容易に行える底面を備えた培養容器は、既存の培養容器への適用が可能であるため、公益性が期待できる。また、輸送前後の細胞数及び細胞形態を容易に確認できる培養容器は、ｉＰＳ細胞をはじめ品質保証が重要な様々な細胞の輸送に貢献すると考えられるので、再生医療、創薬、及び動物実験代替法等の分野での利用が期待できる。

１、２…容器、１０、６０…本体、１２…収容部、１４…ネック部、２０…キャップ、３０、７０…底壁、３２、７２…側壁、３４…頂壁、４０、８０…基準線、４２、８２…指示部、５０…膜部材、１００…細胞輸送装置、１１０…第１の培養皿、１１２…膜部材、１１４…基準線、１１６…指示部、１２０…第２の培養皿、１２２…滅菌フィルタ、１３０…隙間、１４０…第１の蓋、１５０…第２の蓋、Ｓ…観察面、Ｃ…細胞、Ｍ…培養液。

Claims (12)

1. 底壁及び側壁を備える細胞観察用の容器であって、
   前記底壁に観察面が形成され、前記観察面に一本の基準線及び前記基準線の近傍において特定領域を示す指示部が表示され、前記指示部は、前記特定領域を取り囲む枠線であり、前記基準線は、一方向に沿って前記観察面の一側から他側へ延在する線であり、前記基準線及び前記指示部のうち少なくとも一方は、前記底壁に形成された凹部である、容器。
2. 前記特定領域は、同一視野内の細胞の経時変化を観察するための観察対象領域である、請求項１に記載の容器。
3. 前記基準線及び前記指示部は、前記観察面に直交する方向において前記観察面を基準として細胞観察用の顕微鏡の対物レンズの焦点深度内に位置する、請求項１又は２に記載の容器。
4. 前記指示部は、前記基準線の一端部に配置された第１領域を示す第１指示部、前記基準線の中央部に配置された第２領域を示す第２指示部、及び前記第１領域と前記第２領域との間に配置された第３領域を示す第３指示部を含む、請求項１に記載の容器。
5. 前記基準線及び前記指示部のうち少なくとも一方は、前記底壁上又は前記底壁下に配置された膜部材に形成されている、請求項１に記載の容器。
6. 前記膜部材は、一方の面に前記基準線及び前記指示部のうち少なくとも一方を有し、前記一方の面が前記底壁に向くように前記底壁上又は前記底壁下に配置される、請求項５に記載の容器。
7. 第１の培養皿と第２の培養皿とを有する細胞輸送装置であって、
   前記第１の培養皿は、底壁を備え、
   前記第２の培養皿は、底面に多孔質膜を備え、
   前記第２の培養皿は、前記第１の培養皿と前記多孔質膜とに囲まれた隙間を有した状態で、前記第１の培養皿の上部に装着され、
   前記第１の培養皿の前記底壁に観察面が形成され、前記観察面に一本の基準線及び前記基準線の近傍において特定領域を示す指示部が表示され、前記指示部は、前記特定領域を取り囲む枠線であり、前記基準線は、一方向に沿って前記観察面の一側から他側へ延在する線であり、前記基準線及び前記指示部のうち少なくとも一方は、前記底壁に形成された凹部である、細胞輸送装置。
8. 前記多孔質膜は、滅菌フィルタである、請求項７に記載の細胞輸送装置。
9. 前記第１の培養皿の前記底壁は、前記基準線及び前記指示部が形成された膜部材である、請求項７又は８に記載の細胞輸送装置。
10. 天面、底面、及び側面を備えた、細胞観察用の円柱状容器であって、
    脱着可能な多孔質膜を少なくとも天面に備え、底面に観察面が形成され、前記観察面に一本の基準線及び前記基準線の近傍において特定領域を示す指示部が表示され、前記指示部は、前記特定領域を取り囲む枠線であり、前記基準線は、一方向に沿って前記観察面の一側から他側へ延在する線であり、前記基準線及び前記指示部のうち少なくとも一方は、前記底面に形成された凹部である、容器。
11. 前記膜は、滅菌フィルタである、請求項１０に記載の容器。
12. 前記底面は、前記基準線及び前記指示部が形成された膜部材である、請求項１０又は１１に記載の容器。

Images