JP7212416B2 - ジンセノサイドrg4又はジンセノサイドrg2、rg4、rg6及びrh1の混合物(rgx 365)を有効成分として含む脱毛防止又は発毛促進用薬学組成物 - Google Patents

ジンセノサイドrg4又はジンセノサイドrg2、rg4、rg6及びrh1の混合物(rgx 365)を有効成分として含む脱毛防止又は発毛促進用薬学組成物 Download PDF

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Description

本発明は、ジンセノサイドRg4、又はジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物(Rgx 365)を有効成分として含む、脱毛防止又は発毛促進用薬学組成物に関する。
人の毛髪は、約10万~15万本程度であり、各毛髪は、異なる成長周期を有する。毛髪成長周期は3段階となっており、毛髪が最も活発に成長する成長期(anagen stage)、毛髪の退化が始まる退行期(catagen stage)、及び毛髪の成長が止まったり休んだりする休止期(telogen stage)、を反復する。その結果、全毛髪の約15%に該当する毛髪が休止期と退行期に置かれており、一日平均で50~100本の毛髪が正常に脱落し再生産される。
一般に、脱毛は、成長期の毛髪の割合が低く、退行期又は休止期の毛髪の割合が高くなることにより、異常に毛髪が脱落する本数が増加してしまい、正常に毛髪が存在すべき部位に毛髪がない状態のことを指す。従来は一連の老化現象として認識されてきたが、最近では、過度なストレス、頭皮の血液循環不良、アンドロゲン分泌過剰、脂漏性皮膚炎、遺伝的要因、栄養欠乏、鉄分欠乏、薬剤、甲状腺機能の低下などが原因として思われている。
毛髪成長を促進する薬物として、米国FDA(Food and Drug Administration)で公認されたものとして、ミノキシジル(minoxidil)、フィナステリド(finasteride)、プロペシア(propecia)などがある。しかしながら、広く用いられているミノキシジル含有発毛剤は、FDAから一般医薬品として承認された製剤ではあるが、女性には投与不可で、皮膚刺激、かゆみ、紅潮、脱毛の悪化などの副作用がある短所があり、フィナステリド製剤は、妊産婦に対しては胎児の奇形を誘発することがあり、長期投与時には性欲減退、勃起不全、射精障害などの副作用が報告されているため、服用に注意すべきであり、プロペシア製剤は、男性の女性化を招くことがあり、月経年齢の女性には奇形児出産の憂慮が高いという問題がある。したがって、副作用がなく、長期使用時にも安全であり、頭皮状態を改善して脱毛防止及び発毛促進効果がある新しい物質を開発する必要性がある。
ジンセノサイド(ginsenoside)とは、人参(ginseng)と配糖体(glycoside)との合成語で、他の植物から発見されるサポニンとは違い、特異な化学構造及び薬理効能を有することが知られている。ジンセノサイドは、トリテルペノイド(triterpenoid)系列のダンマラン(dammarane)骨格に、グルコース(glucose)、アラビノース(arabinose)、キシロース(xylose)、ラムノース(rhamnose)などが結合している中性配糖体であり、現在、約30種以上の化学構造が明らかになっており、化学構造の特性によって、プロトパナキサジオール(protopanaxadiol,PPD)系(19種)、プロトパナキサトリオール(protopanaxatriol,PPT)系(10種)及びオレアナン(oleanane)系(1種)に区分される。
水参や白参に存在する主要ジンセノサイドは、Rg1、Re、Rf、Rh1、Rb1、Rb2、Rc、Rdなどで、全ジンセノサイドの80~90%以上を占める。希少ジンセノサイドは、上記の多量で存在するジンセノサイドから糖の一部が欠落したり脱水反応が起きたりして生成されるが、人参を水とアルコールで抽出する場合には微量で存在する。
ジンセノサイドによる薬理活性は、希少ジンセノサイドによって現れ、免疫力強化、抗炎症、抗アレルギー、抗癌、血圧降下、抗コレステロール、抗血栓、抗老化、抗酸化、頭脳活動促進、皮膚の美容効果などが主要効能として知られている(Kim,Y.S.et al.,Arch Pharm Res.,23(5),518-524,2000;Shibata,S.,J Korean Med Sci.,16(suppl)、S28-37,2001;Tachikawa,E.et al.,Biochem Pharmacol.,66(11),2213-2221,2003;Tsai,S.C.et al.,Chin J Physiol.,46(1),1-7,2003)。
一方、ジンセノサイドRg4、又はジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物を有効成分として含む脱毛防止又は発毛促進用組成物と関連している従来先行文献として、特許文献1:韓国公開特許第10-2017-0094632号には、ジンセノサイドRg2が強化された紅参抽出物を含む脱毛防止用シャンプーを開示し、特許文献2:韓国登録特許第10-1819418号には、ジンセノサイドRh1、Rb1、Rc、Rg3が混合された複合物を含む育毛促進及び脱毛防止用化粧料組成物を開示し、特許文献3:韓国公開特許第10-2014-0058923号には、ジンセノサイドRg1及びReを含む毛髪成長促進用又は脱毛防止用化粧料組成物を開示し、非特許文献1:[Park,G.H.et al.,J Med Food.,18(3),354-362,2015]には、紅参抽出物の毛髪成長促進効果を開示したことがある。しかしながら、本発明のようにジンセノサイドRg4、又はジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1を含む混合物が、脱毛防止又は発毛促進の効果を有することを言及した報告はなかった。
そこで、本発明者らは、ジンセノサイドを研究する過程で、ジンセノサイドRg4、又はジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物が、単一ジンセノサイドRg2、Rg6及びRh1と人参抽出物及び紅参抽出物に比べて、脱毛防止又は発毛促進の効果に特に優れていることを確認し、本発明を完成するに至った。
韓国公開特許第10-2017-0094632号 韓国登録特許第10-1819418号 韓国公開特許第10-2014-0058923号
Park,G.H.et al.,J Med Food.,18(3),354-362,2015
本発明の目的は、ジンセノサイドRg4、又はジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物(Rgx 365)を有効成分として含む、脱毛防止又は発毛促進用薬学組成物、化粧料組成物及び健康機能食品を提供することにある。
本発明は、ジンセノサイドRg4、又はジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物を有効成分として含む、脱毛防止又は発毛促進用薬学組成物に関する。
前記混合物は、ジンセノサイドRg2 35~45重量%、ジンセノサイドRg4 30~40重量%、ジンセノサイドRg6 10~20重量%、及びジンセノサイドRh1 1~5重量%が含まれていることを特徴とする。それぞれの単一ジンセノサイドを前記重量%となるように混合することも可能であり、当該技術分野における通常の方法によって製造可能な方法であればいずれも本発明に含まれるが、ジンセノサイドReに蒸留水130~160重量部を混合した後、4~6時間、110~140℃の温度範囲、及び0.11~0.16MPaの圧力条件で高温高圧で処理し、カラム分離し、前記混合物を得ることが好ましい。
前記薬学組成物は、一般に用いられる薬学的に許容可能な担体と共に適宜の形態で剤形化可能である。“薬学的に許容可能”とは、生理学的に許容され、人に投与されるとき、通常、胃腸障害、目眩などのアレルギー反応又はこれと類似の反応を起こさないことをいう。また、前記組成物は、それぞれ、通常の方法によって経口、局所及び経皮で投与されてよく、任意の剤形、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態で剤形化し使用されてよい。
剤形に特に制限はないが、好ましくは、クリーム、ゲル、軟膏、硬膏剤、ローション剤、液剤、乳濁液、パウダー及びスプレーからなる群から選ばれる剤形の皮膚外用剤が使用可能である。
前記皮膚外用剤は、皮膚の外部に塗布する如何なるものも含む総称でよく、化粧品学又は皮膚科学的に許容可能な媒質又は基剤を含有して剤形化してよい。
前記皮膚外用剤の剤形がクリーム又はゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク又は酸化亜鉛などが用いられてよい。
前記皮膚外用剤の剤形がパウダー又はスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、ケイ酸カルシウム又はポリアミドパウダーが使用されてよく、特に、スプレーの場合には、さらに、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン/ブタン又はジメチルエーテルのような推進剤を含むことができる。
前記皮膚外用剤の剤形が液剤又は乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶媒和剤又は乳濁化剤が使用され、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール又はソルビタンの脂肪酸エステルがある。
前記皮膚外用剤は、経皮吸収を増加させる製剤、例えば、これに限定されるものではないが、特にジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、界面活性剤、アゾン(Azone)、アルコール、アセトン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールを含むことができる。前記組成物の塗布頻度は、それぞれの被験者の必要によって非常に変わってよく、塗布頻度は、毎月乃至1日10回、好ましくは毎週乃至1日4回、より好ましくは1週3回乃至1日3回、さらに好ましくは1日1回乃至2回が提案される。
一方、本発明の薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与でき、本発明の用語“投与”とは、適切な方法で個体に所定の物質を導入することを意味する。前記組成物の投与経路は、目的組織に到達できる如何なる一般的な経路で投与されてもよく、例えば、経口、直腸、静脈、筋肉、皮下、腹腔又は局所投与されてよいが、これに制限されない。
前記用語“個体”とは、ヒトを含め、ラット、マウス、家畜などのあらゆる動物を意味し、好ましくは、ヒトを含む哺乳動物であってよい。
前記用語“薬学的に有効な量”とは、医学的治療に適用可能な合理的な受恵/危険の割合で疾患を治療するのに十分であり且つ副作用を起こさない程度の量を意味し、有効容量レベルは、患者の性別、年齢、体重、健康状態、疾病の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与方法、投与時間、投与経路、及び排出比率、治療期間、配合又は同時に使用される薬物を含む要素及びその他医学分野によく知られた要素に基づき、当業者により容易に決定されてよい。好ましくは、本発明のジンセノサイドは、固形分を基準に、1日0.0001~100mg/体重kgで、好ましくは0.001~100mg/体重kgで投与できる。投与は、前記推奨投与量を1日に1回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。
他の一面において、本発明は、ジンセノサイドRg4、又はジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物を有効成分として含む脱毛防止又は発毛促進用化粧料組成物に関する。
前記化粧料組成物は、当業界で通常製造される如何なる剤形で製造されてもよく、溶液、乳濁液、懸濁液、ペースト、ゲル、パウダー、柔軟水、ローション、クリーム、エッセンス、スプレー、シャンプー、リンス及び石鹸からなる群から選ばれる剤形で製造可能であるが、これに制限されるものではない。
また、前記化粧料組成物は、前記有効成分に加え、化粧料に通常許容される如何なる成分も含むことができる。例えば、乳化剤、粘増剤、油剤、界面活性剤、潤滑剤、アルコール類、水溶性高分子剤、ゲル化剤、安定化剤、ビタミン、無機塩類、乳化剤、香料のような一般の補助剤、そして担体を含むことができる。これらの成分は、剤形又は使用目的に応じて、その添加量を化粧料固有の効果を損傷させない範囲内で選択できる。
本発明の化粧料組成物に含まれる化粧品学的に許容可能な担体は、化粧料組成物の剤形によって様々である。
本発明の剤形が溶液又は乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤又は乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール又はソルビタンの脂肪酸エステルなどが用いられてよい。
本発明の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノール又はプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、又はトラカントなどが用いられてよい。
本発明の剤形がペースト、クリーム又はゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛などが用いられてよい。
本発明の剤形がパウダー又はスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、ケイ酸カルシウム、ポリアミドパウダーなどが用いられてよく、特に、スプレーである場合には、さらに、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン/ブタン又はジメチルエーテルのような推進剤を含むことができる。
前記ジンセノサイドRg4、又はジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物が含まれている化粧料組成物は、毎日使用可能であり、また、定められていない期間にも使用可能であり、好ましくは、使用者の年齢、皮膚状態又は皮膚タイプ、前記ジンセノサイドRg4、又はジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物の濃度によって使用量、使用回数及び期間を調節することができる。
さらに他の一面において、本発明は、ジンセノサイドRg4、又はジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物を有効成分として含む、脱毛防止又は発毛促進用健康機能食品に関する。
前記健康機能食品は、有用な機能性を有する原料や成分を使用して製造又は加工した食品のことを指し、例えば、健康補助食品、機能性食品、栄養剤、補助剤などのいずれをも含む。
前記ジンセノサイドは、健康機能食品全重量に対して、好ましくは0.001重量%~50重量%、より好ましくは0.001重量%~30重量%、最も好ましくは0.001重量%~10重量%で添加されてよい。
本発明の健康機能食品は、錠剤、カプセル剤、丸剤及び液剤などの形態を含み、本発明のジンセノサイドRg4、又はジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物を添加できる食品には、例えば、各種食品類、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤などがある。
本発明は、ジンセノサイドRg4、又はジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物を有効成分として含む、脱毛防止又は発毛促進用組成物に関する。前記ジンセノサイドRg4、又はジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物を、ヒト毛嚢毛乳頭細胞に処理すると、毛嚢の形成及び成長を誘導できる3次元球体の形成及び大きさの増加効果に優れる、毛嚢細胞の活性化及び再生に重要なWnt/β-カテニン信号伝達活性化効果に優れる、且つ、毛嚢の形成及び成長に重要なALPL、VCAN、BMP2及びFGF7遺伝子の発現量増加効果に優れるので、脱毛防止及び発毛促進用組成物として有用に使用可能である。
A及びBは、2次元(monolayer)及び3次元(spheroid)にそれぞれ培養したヒト毛嚢毛乳頭細胞において、本発明の実施例1(ジンセノサイドRg4)の濃度別処理による細胞生存率を確認した結果である。
A及びBは、2次元(monolayer)及び3次元(spheroid)にそれぞれ培養したヒト毛嚢毛乳頭細胞において、本発明の実施例2(Rgx 365)の濃度別処理による細胞生存率を確認した結果である。
A、B及びCは、3次元に培養したヒト毛嚢毛乳頭細胞において、本発明の実施例1(ジンセノサイドRg4)又は比較例1(ジンセノサイドRg2)の処理による3次元球体(3D spheroid)形成の有無及び大きさを位相差顕微鏡で確認し、これを数値化してグラフで示した結果である。
3次元に培養したヒト毛嚢毛乳頭細胞において、本発明の実施例2(Rgx 365)の処理による3次元球体(3D spheroid)の大きさを確認した結果である。
Aは、HEK293細胞において本発明の実施例1(ジンセノサイドRg4)の処理によるTCF/LEF活性程度を確認した結果であり、B、C及びDは、ヒト毛嚢毛乳頭細胞において本発明の実施例1(ジンセノサイドRg4)の処理によるβ-カテニン、WNT5A及びLEF1のmRNA発現量を確認した結果である。
A、B、C及びDは、3次元に培養したヒト毛嚢毛乳頭細胞において本発明の実施例1(ジンセノサイドRg4)処理によるALPL、VCAN、FGF7及びBMP2のmRNA発現量を確認した結果である。
A、B及びCは、3次元に培養したヒト毛嚢毛乳頭細胞において本発明の実施例2(Rgx 365)処理によるALPL、VCAN及びFGF7のmRNA発現量を確認した結果である。
以下、本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。ただし、本発明は、ここで説明される実施例に限定されず、他の形態で具体化してもよく、これらの実施例は、むしろ、ここで紹介される内容が徹底且つ完全になり、当業者に本発明の思想を十分に伝達するために提供するものである。
<実施例1.ジンセノサイドRg4の製造>
韓国登録特許第10-1783295号を参照して、ジンセノサイドReからジンセノサイドRg4を製造した。
<実施例2.ジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物(Rgx 365)の製造>
韓国特許出願番号第10-2019-0041458号を参照して、ジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物(Rgx 365)を製造した。
<実験例1.細胞培養>
先行文献[Topouzi,H.et al.,Exp Dermatol.,26(6),491-496,2017;Higgins,C.A..et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,110(49),19679-19688,2013;Higgins,C.A..et al.,Exp Dermatol.,19(6),546-548,2010]を参照して、ヒト毛嚢毛乳頭細胞(HDP cell)を、一般的な2次元平面培養(monolayer culture)と、実ヒト毛嚢の構造と類似な3次元球体培養(spheroid culture)で培養した。
まず、2次元平面培養は、ヒト毛嚢毛乳頭細胞に幹細胞培地(mesenchymal stem cell medium(MSCM),Innoprot,Bizakaia,Spain)及び5%ウシ胎児血清(FBS,Thermo Fisher Scientific,Inc.,Waltham,MA,USA)を添加し、37℃、5% CO条件を揃えた細胞培養器で培養した。
次に、ヒト毛嚢毛乳頭細胞の3次元球体培養は、プレート(round-bottom ultra-low attachment microplate,Corning,NY,USA)で前記幹細胞培地及び5%ウシ胎児血清を使用して37℃、5% CO条件で培養した。
HEK293細胞は、10%ウシ胎児血清、ペニシリン(50U/ml)、ストレプトマイシン(50U/ml)を含有するDMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,Thermo Fisher Scientific,Inc.)培地を添加し、37℃、5% CO条件で培養した。
<実験例2.細胞生存率確認>
本発明の実施例で処理したヒト毛嚢毛乳頭細胞における細胞生存率を、WST-1アッセイ(WST-1 assay kit,water soluble tetrazolium salt、株式会社デイルラブサービス、大韓民国)で確認した。
まず、前記実験例1で2次元又は3次元培養したヒト毛嚢毛乳頭細胞を、96ウェルプレート(96-well plate及び96-well round-bottom ultra-low attachment microplate)に1×10細胞/ウェルの濃度で分注し、37℃、5% CO条件で24時間培養した。その後、培養液を除去した後、実施例1又は2を濃度別に処理した培地を加えて48時間培養した。48時間後に、WST-1溶液を10μl添加して30分間反応させ、iMarkマイクロプレートリーダ(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)で450nmで吸光度を測定した。信頼度を確保するために3回反復実験し、実験結果は図1及び図2に示した。
図1及び図2を参照すると、本発明の実施例1及び2は、処理濃度に関係なく、2次元又は3次元培養されたヒト毛嚢毛乳頭細胞において、無処理群と同等な細胞生存率を示しているので、細胞毒性を示さない物質であることが確認できた。
<実験例3.脱毛防止及び発毛促進効果確認>
実験例3-1.3次元球体(3D spheroid)形成確認
先行文献[Higgins,C.A..et al.,Exp Dermatol.,19(6),546-548,2010;Higgins,C.A..et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,110(49),19679-19688,2013;Kang,B.M.et al.,J Invest Dermatol.,132(1),237-239,2012]を参照すると、3次元球体培養されたヒト毛嚢毛乳頭細胞は、2次元で平面培養されたヒト毛嚢毛乳頭細胞に比べて、毛嚢(hair follicle)の形成及び成長を誘導できることが報告された。また、先行文献[Whiting,D.A.,J Am Acad Dermatol.,45(3Suppl),S81-S86,2001;de Lacharriere,O.et al.,Arch Dermatol.,137(5),641-646,2001;Jahoda,C.A.,Exp Dermatol.,7(5),235-248,1998]には、毛嚢の毛乳頭大きさの減少は、脱毛患者の毛嚢小型化(miniaturization)を発生させ得ることが報告されたことがある。したがって、前記実験例1で3次元球体培養した細胞に本発明の実施例を処理し、3次元球体の形成及び大きさの変化を確認することにより、脱毛防止及び発毛促進効果を確認した。
まず、ヒト毛嚢毛乳頭細胞の3次元球体形成の有無及び大きさ変化を観測するために、前記実験例1で3次元球体培養した細胞を、96ウェルプレート(96-well round-bottom ultra-low attachment microplate)に5×10細胞/ウェルの濃度で分注して培養した後、本発明の実施例1、2又は比較例1(ジンセノサイドRg2)を48時間、濃度別に処理した。その後、位相差顕微鏡(phase-contrast microscope)でヒト毛嚢毛乳頭細胞の3次元球体形成の有無及び大きさを確認し、それを図3及び図4に示した。
図3及び図4について説明すると、3次元に培養したヒト毛嚢毛乳頭細胞に実施例1又は2を処理する場合、無処理群とは違い、濃度依存的に3次元球体の形成が増加し、また、3次元球体の大きさも大きくなることが確認できた。
特に、図3Cを参照すると、3次元に培養したヒト毛嚢毛乳頭細胞に、実施例1のジンセノサイドRg4を処理する場合、比較例1のジンセノサイドRg2を処理する場合に比べて、3次元球体の形成及び大きさが2~3倍も増加し、脱毛防止及び発毛促進効果において、実施例1のジンセノサイドRg4がより優れていることが確認できた。
このような結果から、ジンセノサイドRg4、又はジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物(Rgx 365)は、毛髪成長力及び脱毛抑制力に関する誘導能(inductive property)に優れていることが分かった。
実験例3-2.Wnt/β-カテニン信号伝達活性化確認
先行文献[Andl,T.et al.,Dev Cell.,2(5),643-653,2002;Kishimoto,J.et al.,Genes Dev.,14(10),1181-1185,2000]を参照すると、Wnt/β-カテニン信号伝達系は、毛嚢の形成を促進し、毛髪周期の成長期の間に発現する遺伝子を維持し活性化する上で重要な役割を担うと報告されている。したがって、Wnt/β-カテニンは、毛嚢細胞の活性化及び再生において非常に重要な位置を占めているので、前記実験例1で培養した細胞に本発明の実施例を処理し、Wnt/β-カテニン信号伝達活性化効果から脱毛防止及び発毛促進効果を確認した。
Wnt/β-カテニン信号伝達活性化の有無は、β-カテニンによって活性化される転写因子であるTCF/LEFに特異的に反応し得るように、TCF/LEFルシフェラーゼ組換えレポータープラスミド(TCF/LEF luciferase reporter plasmid,TOPFlash,Merck-Millipore,Darmstadt,Germany)及びプロモーター内突然変異が誘発されたレポータープラスミド(FOPFlash,Merck-Millipore,Darmstadt,Germany)を用いて測定した。
まず、TCF/LEFルシフェラーゼ組換えレポータープラスミド(TOPFlash(TCF/LEF-wt)又はFOPFlash(TCF/LEF-mut))及びβ-ガラクトシダーゼ(β-galactosidase)プラスミドを、リポフェクタミン3000(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,Inc.)で前記実験例1で培養したHEK293細胞に処理し、形質転換を誘導した。形質転換された細胞に、実施例1を20μg/mlで24時間処理した後、、passive lysisバッファー(Promega,Madison,WI,USA)で細胞破砕液を作り、D-ルシフェリン(D-luciferin)を添加し、Glomax(R)96マイクロプレート照度計(Turner Biosystem,Sunnyvale,CA,USA)でルシフェラーゼ活性度を測定した。β-ガラクトシダーゼ活性は、Luminescent β-galactosidase Detection Kit II(Clontech Laboratories Inc.,USA)を用いて測定し、当該結果値に基づいてルシフェラーゼ活性値を導出し、図5のAに示した。信頼度を確保するために3回反復実験した。
次に、前記ルシフェラーゼ活性結果を検証するために、Wnt/β-カテニン信号伝達に関与するβ-カテニン、WNT5A、LEF1のmRNA分析を行った。まず、3次元球体培養させたヒト毛嚢毛乳頭細胞に、実施例1(20μg/ml)を48時間処理した後、TRIzol溶液(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific)を用いて細胞内RNAを抽出した。抽出したRNA 2μgにM-MLV逆転写酵素を処理してcDNAを合成し、合成されたcDNAにHOT FIREPol EvaGreen qPCR Mix Plus(Solis BioDyne,Tartu,Estonia)溶液とWnt/β-カテニンターゲット遺伝子であるβ-カテニン、WNT5A、LEF1のプライマーセットをそれぞれ混合した後、Step OnePlus Real-Time PCR(Applied Biosystems;Thermo Fisher Scientific)を行った。β-アクチンハウスキーピング遺伝子(Housekeeping gene)の発現を基準にして各遺伝子発現値を導出し、mRNA発現量分析結果を図5のB~Dに示した。
図5について説明すると、本発明の実施例1は、無処理群(対照群)に比べて、TCF/LEFの活性化が2倍以上増加し、β-カテニン、WNT5A、LEF1のmRNA発現数値も2倍以上増加した。したがって、本発明の実施例1(ジンセノサイドRg4)は、Wnt/β-カテニン信号伝達活性を促進させる効果に優れており、毛髪成長を促進できる組成物であることが分かった。
実験例3-3.毛乳頭細胞シグネチャー遺伝子(dermal papilla signature gene)発現確認及び毛嚢形成能に関連したマーカー確認
毛乳頭細胞で発現するシグネチャー遺伝子には、3次元培養時に発現が有意に増加し、毛嚢誘導及び成長能力に関連している重要タンパク質であるALP(alkaline phosphatase)、毛嚢形成に必須の役割を担当するVCAN(versican)、毛乳頭細胞機能に必須であるBMP2(bone morphogenetic protein 2)、毛髪成長に関与するFGF7(fibroblast growth factor 7)などがある。したがって、前記実験例1で3次元球体培養したヒト毛嚢毛乳頭細胞に、本発明の実施例を処理し、ALPL、VCAN、BMP2及びFGF7のmRNA発現量変化を測定することにより、脱毛防止及び発毛促進の効果を確認した。
ALPL、VCAN、BMP2及びFGF7のmRNA発現量の変化は、前記実験例3-2におけるβ-カテニン、WNT5A、LEF1mRNAの分析過程と同一に行い、β-カテニン、WNT5A、LEF1のプライマーセットの代わりにALPL、VCAN、FGF7、BMP2プライマーセットを用いてmRNA発現量分析結果を得、これを図6及び図7に示した。
図6及び図7について説明すると、3次元球体培養したヒト毛嚢毛乳頭細胞に本発明の実施例1又は実施例2を処理する場合、無処理群である対照群に比べて、ALPL、VCAN、BMP2及びFGF7の発現量がいずれも増加し、脱毛防止及び発毛促進の効果に優れていることが確認できた。
このような結果から、本発明のジンセノサイドRg4、又はジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物は、脱毛防止又は発毛促進用組成物として有用に使用可能であることが分かった。
<製剤例1.親水性軟膏剤の製造>
本発明の実施例2のジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物(Rgx 365)を用いて、下記表1に記載の組成によって通常の方法で親水性軟膏剤を製造した。
Figure 0007212416000001
<製剤例2.柔軟水の製造>
本発明の実施例2のジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物(Rgx 365)を用いて、下記表2に記載の組成によって通常の方法で柔軟水を製造した。
Figure 0007212416000002
<製剤例3.クリームの製造>
本発明の実施例2のジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物(Rgx 365)を用いて、下記表3に記載の組成によって通常の方法でクリームを製造した。
Figure 0007212416000003
<製剤例4.健康機能食品の製造>
本発明の実施例2(ジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物、Rgx 365)20g、ビタミン混合物適量、ビタミンAアセテート70mg、ビタミンE 1.0mg、ビタミンB1 0.13mg、ビタミンB2 0.15mg、ビタミンB6 0.5mg、ビタミンB12 0.2μg、ビタミンC 10mg、ビオチン10μg、ニコチン酸アミド1.7mg、葉酸50μg、パントテン酸カルシウム0.5mg、無機質混合物適量、硫酸第1鉄1.75mg、酸化亜鉛0.82mg、炭酸マグネシウム25.3mg、第1リン酸カリウム15mg、第2リン酸カルシウム55mg、クエン酸カリウム90mg、炭酸カルシウム100mg、塩化マグネシウム24.8mgを混ぜて顆粒としたが、用途によって様々な剤形に変形させて製造してもよい。また、前記のビタミン及びミネラル混合物の組成比を任意に変形実施しても構わなく、通常の健康機能食品製造方法によって前記の成分を混合して製造してもよい。
<製剤例5.健康機能性飲料の製造>
本発明の実施例2(ジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物、Rgx 365)1g、クエン酸0.1g、フラクトオリゴ糖100g、精製水900gを混ぜ、通常の飲料製造方法によって撹拌、加熱、濾過、殺菌、冷蔵して飲料を製造した。

Claims (11)

  1. ジンセノサイドRg4を有効成分として含む
    ことを特徴とする脱毛防止又は発毛促進用薬学組成物。
  2. ジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物を有効成分として含む
    ことを特徴とする脱毛防止又は発毛促進用薬学組成物。
  3. 前記混合物は、ジンセノサイドRg2 35~45重量%、ジンセノサイドRg4 30~40重量%、ジンセノサイドRg6 10~20重量%、及びジンセノサイドRh1 1~5重量%が含まれている
    請求項2に記載の脱毛防止又は発毛促進用薬学組成物。
  4. ジンセノサイドRg4を有効成分として含む
    ことを特徴とする脱毛防止又は発毛促進用化粧料組成物。
  5. ジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物を有効成分として含む
    ことを特徴とする脱毛防止又は発毛促進用化粧料組成物。
  6. 前記混合物は、ジンセノサイドRg2 35~45重量%、ジンセノサイドRg4 30~40重量%、ジンセノサイドRg6 10~20重量%、及びジンセノサイドRh1 1~5重量%が含まれている
    請求項5に記載の脱毛防止又は発毛促進用化粧料組成物。
  7. 前記化粧料組成物は、溶液、乳濁液、懸濁液、ペースト、ゲル、パウダー、柔軟水、ローション、クリーム、エッセンス、スプレー、シャンプー、リンス及び石鹸からなる群から選ばれる剤形で製造される
    請求項4又は5に記載の脱毛防止又は発毛促進用化粧料組成物。
  8. ジンセノサイドRg4を有効成分として含む
    ことを特徴とする脱毛防止又は発毛促進用健康機能食品。
  9. ジンセノサイドRg2、Rg4、Rg6及びRh1の混合物を有効成分として含む
    ことを特徴とする脱毛防止又は発毛促進用健康機能食品。
  10. 前記混合物は、ジンセノサイドRg2 35~45重量%、ジンセノサイドRg4 30~40重量%、ジンセノサイドRg6 10~20重量%、及びジンセノサイドRh1 1~5重量%が含まれている
    請求項9に記載の脱毛防止又は発毛促進用健康機能食品。
  11. 前記健康機能食品は、錠剤、カプセル剤、丸剤及び液剤からなる群から選ばれる剤形で製造される
    請求項8又は9に記載の脱毛防止又は発毛促進用健康機能食品。

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