JP7148629B2 - 虚血再灌流損傷を予防及び／又は治療する漢方薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は漢方医薬の分野に関し、詳しくは虚血再灌流損傷を予防及び／又は治療する漢方薬組成物に関する。

１９６６年、Ｊｅｎｎｉｎｇｓは、初めて虚血再灌流損傷（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ）の概念を提唱し、即ち、組織細胞の低灌流虚血後に血液再供給をした時、組織細胞の虚血性障害を軽減又は回復させなかっただけでなく、逆に虚血性損傷を悪化させたことである。これは、高等動物の生体虚血後再灌流に発生する普遍的な現象である。例えば、心臓手術、冠動脈バイパス、臓器血液供給梗塞後の再通、臓器移植及びショック臓器低灌流是正後には、いずれも再灌流損傷が発生する可能性がある。その損傷の程度は、虚血の時間、側副血行路の状況、好気の程度、再灌流の条件などと密接に関連している。

虚血性疾患に対する治療は、もちろん、第一に血液灌流を回復することであり、組織の酸素欠損と栄養物質の供給不足の状態を解消し、虚血性損傷の発展を阻止したり、回復を促したりすることを目的としている。

近年、ショック治療の進歩及び動脈バイパス術、血栓溶解療法、経皮腔内冠脈血管形成術、心臓外科体外循環、心肺蘇生、断肢再植と臓器移植などの方法の確立と普及に伴い、多くの組織器官が虚血した後に血液再灌流を再実現した。

多くの臨床実践により、この治療は多くの場合に高い効果が得られたため、血液灌流を回復することは虚血性疾患を治療する基本原則となっている。

それに応じて、現在、虚血再灌流損傷を治療している薬物は、ラジカル除去剤と酸化防止剤、カルシウム拮抗剤とチャネル抑制剤、抗炎症薬などがある。

タンジンポリフェノール酸（臨床で使用される剤形は注射用タンジンポリフェノール酸である。）は、その作用が活血、化欝、通脈である。臨床で冠状動脈性硬化症安定型狭心症に用いられ、Ｉ、ＩＩに分級され、狭心症症状表現は軽、中度であり、漢方医弁証は心血郁阻証者であり、胸痛、胸苦し、心悸などの症状が見られた。

サンシチ総サポニン（サンシチ総サポニン）は、臨床上の剤形が注射用血塞通であり、その薬理作用として、冠脈と末梢血管の拡張、末梢抵抗の低下、心拍数の低下、心筋酸素消費量の減少と低下、心筋灌流量の増加、脳血流量の増加、心筋と脳虚血に一定の改善作用があり、血小板凝集を抑制し、血液粘度を下げ、血栓形成を抑制する作用があり、また、本製品は、脂質低下、疲労、耐酸化、マクロフアージ機能の向上と増強などの作用がある。臨床では主に脳血管後遺症、網膜中央静脈閉塞、眼前房出血などに用いられる。

オウギ総サポニンは、臨床的に抗血栓形成に用いられ、免疫、補中益気の作用を増強できる。

現在、タンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニンとオウギ総サポニンの三者を併用する報告はまだ見られない。

本発明の目的は、虚血再灌流損傷を予防及び／又は治療する漢方薬組成物を提供することにある。この漢方薬組成物は、タンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニンとオウギ総サポニンからなる。

タンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニンとオウギ総サポニンの重量比は、（１～１６）：（１～１６）：（１～１６）である。

好ましくは、前記漢方薬組成物中のタンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン、オウギ総サポニンの重量比は、（４～１６）：（１～８）：（１～１６）である。

さらに好ましいは、前記漢方薬組成物中のタンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン、オウギ総サポニンの重量比は、（４～１６）：（１～４）：（１～１６）である。

さらに好ましいは、前記漢方薬組成物中のタンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン、オウギ総サポニンの重量比は、（４～８）：（１～４）：（１～１６）、又は（８～１６）：（１～４）：（１～１６）である。

再び好ましいは、前記漢方薬組成物中のタンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン、オウギ総サポニンの重量比は、（４～８）：１：（５～１６）、又は（４～８）：（１～２）：（１～５）である。

最も効果が高いのは、前記漢方薬組成物中のタンジンポリフェノール酸（ａ）、サンシチ総サポニン（ｂ）、オウギ総サポニン（ｃ）の重量比は、４：１：５である。

本発明に用いる成分のうち：
タンジンポリフェノール酸は、抽出物であり、タンフェノール酸Ｂ、タンジンナトリウム、ローズマリー酸、紫シュウ酸とタンフェノール酸Ｅを含み、各成分の重量百分率はそれぞれ４０～９５％、２０～９５％、３～１５％、２～１０％と０．２～２．２％である。

タンジンポリフェノール酸は、タンジン煎じ薬を濃度２０～９０％のエタノールで抽出し、抽出液をエタノールなしまで濃縮し、抽出物をポリアミドクロマトグラフィーに供し、水又は濃度３０％以下のエタノールで不純物を除去し、濃度３０～９５％のエタノール又は濃度０．０５～０．３％の炭酸水素ナトリウム又は濃度０．０１～０．３％の炭酸ナトリウムで溶出し、溶出液を回収し、ｐＨ１～５．５に調整し、低極性又は無極性のマクロポーラス樹脂に通して、水又は濃度２０％以下のエタノールで不純物を除去し、濃度３０～９５％のエタノールで溶出し、溶出液を回収し、濃縮、乾燥して、タンジンポリフェノール酸を得る方法により製造される。

サンシチ総サポニンは、抽出物であり、含まれる成分として、サンシチサポニンＲ_１含有量が５～２０％、ジンセノサイドＲｂ_１含有量が２０％以上、ジンセノサイドＲｄ含有量が３～１５％、ジンセノサイドＲｇ_１含有量が３０％以上、ジンセノサイドＲｅ含有量が２％以上、５種類のサポニン含有量の合計が８０％以上である。

サンシチ総サポニンは、サンシチ生薬を取り、粗粒に粉砕し、濃度２０～８０％のエタノールを３～１０倍量加えて毎回２～５時間で２回還流抽出し、抽出液を合併し、抽出液をエタノールなしまで減圧濃縮し、遠心分離し、上清液をマクロポーラス吸着樹脂で濃縮し、カラム体積の３～１０倍量の水により糖類及び一部の色素を洗浄で除去し、続いてカラム体積の５～１０倍量の濃度３０～７０％のエタノールで溶出し、エタノール溶出液を収集し、乾燥粉末までに減圧濃縮し、サンシチ総サポニンを得る方法により製造される。

オウギ総サポニンは、抽出物で、オウギ総サポニンの重量百分率含有量が２０～１００％であり、その中、オウギメチルサイドの含有量が２０～９５％である。

オウギ総サポニンは、オウギ煎じ薬を取り、粗粒に粉砕し、濃度２０～７０％のエタノール（０．１～０．５％の炭酸水素ナトリウム含有）を３～１０倍量で毎回２～５時間で２回還流抽出し、抽出液を合併し、抽出液を生薬の２～５倍量の体積まで減圧濃縮し、遠心分離し、上清液をマクロポーラス吸着樹脂で濃縮し、まずカラム体積の２～８倍量の濃度０．１～１％のＮａＯＨ溶液で洗浄し、そしてカラム体積の２～８倍量の濃度２０～６０％のエタノールで溶出し、最後にカラム体積の２～８倍量の濃度７０～９５％のエタノールで溶出し、濃度７０～９５％のエタノール溶出液を収集し、さらにマクロポーラス吸着樹脂により脱色し、カラム体積の２～５倍量の濃度７０～９５％のエタノールで溶出し、流出液及び溶出液を収集し、小体積まで減圧濃縮し、固体を結晶析出し、乾燥固体を集め、オウギ総サポニンを得る方法により製造される。

本発明の他の目的は、漢方薬組成物と薬学的に許容される担体とからなる当該漢方薬組成物を含む製剤を提供することにある。

薬学的に許容できる担体とは、薬学の分野で通常の薬物担体であり、充填剤、結合剤、崩壊剤、滑剤、溶解助剤、懸濁助剤、湿潤剤、色素、溶媒、界面活性剤又は矯味剤から選ばれる１種又は複数種である。

前記充填剤は、澱粉、アルファ化澱粉、デキストリン、グルコース、蔗糖、乳糖、ラクチトール、微結晶セルロース、マンニトール、ソルビトール又はキシリトールから選ばれる。

前記結合剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポビドン、澱粉スラリー、蔗糖、砂糖粉、ジェリー、ゼラチン又はポリエチレングリコールから選ばれる。

前記崩壊剤は、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、架橋ポビドン、低置換ヒドロキシプロピルセルロース又はカルボキシメチルスターチナトリウム又は澱粉から選ばれる。

前記潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、タルク粉、微粉シリカゲル、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００又はラウリルアルコール硫酸ナトリウムから選ばれる。

前記溶解助剤が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、グルコメチルアミン、Ｌ－リシン又はＬ－アルギニンから選ばれる。

前記懸濁助剤は、微粉シリカゲル、ミツロウ、セルロース又は固形ポリエチレングリコールから選ばれる。

前記湿潤剤は、グリセリン、Ｔｗｅｅｎ－８０、エトキシ硬化ヒマシ油又はレシチンから選ばれる。

前記溶媒は、エタノール、液状ポリエチレングリコール、イソプロピルアルコール、Ｔｗｅｅｎ－８０、グリセリン、プロピレングリコール又は植物油から選ばれ、前記植物油は大豆油、ひまし油、落花生油、調合油等から選ばれる。

前記界面活性剤は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ステアリン酸、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン共重合体、脂肪酸ソルタン又はポリソルビド（Ｔｗｅｅｎ）等から選ばれる。

前記矯味剤が、アスパルテーム、スクラロース、香精、ステビオシド、アセスルファムカリウム、クエン酸又はサッカリンナトリウムから選ばれる。

本発明の他の目的は、当該漢方薬組成物の用途を提供することにある。

その一つの用途は、本発明の漢方薬組成物の虚血再灌流損傷の治療及び／又は予防における使用である。本発明に係る虚血再灌流損傷には、脳虚血再灌流損傷、心筋虚血再灌流損傷、腎虚血再灌流損傷、下肢虚血再灌流損傷、脊髄虚血再灌流損傷、網膜虚血再灌流損傷、皮弁虚血再灌流損傷などが含まれるが、これらに限定されない。

本発明に係る虚血再灌流損傷には、血栓溶解による虚血再灌流損傷、動脈バイパス術による虚血再灌流損傷、経皮腔内冠脈血管形成術による虚血再灌流損傷、心臓外科体外循環による虚血再灌流損傷、心肺蘇生による虚血再灌流損傷、断肢再植と臓器移植などによる虚血再灌流損傷が含まれる。

もう一つの用途は、本発明により提供される漢方薬組成物はｔＰＡ（組織型プラスミノーゲン活性化物質）と併用して血栓溶解に用いることができ、第二の用途では、漢方薬組成物とｔＰＡは重量比で１０：（５～２０）で併用される。

漢方薬組成物は、ｔＰＡによる滲出と出血を軽減し、生存率を増加させ、神経損傷を低減することができる。

本発明により提供される漢方薬組成物は、以下の利点を有する。

本発明により提供される漢方薬組成物は、相乗効果があり、虚血再灌流損傷を治療及び／又は予防することができるとともに、ｔＰＡと併用して血栓溶解に用いることができ、効果が高く、副作用が少ない。

各群のラット再灌流２４ｈ脳組織片ＴＴＣ染色画像である。 異なる群のＴＴＣ梗塞面積の統計図である。 再灌流３ｈ後の各群のラットに神経機能学的評価を行う結果を示す。 再灌流２４ｈ後の各群のラットに神経機能学的評価を行う結果を示す。 各群のマウス頚総動脈内血栓の動態変化である。初期値はＦｅＣｌ_３刺激前の基礎値である。１０分はＦｅＣｌ_３刺激開始後１０分を示す（但し、ＦｅＣｌ_３濾紙は総頸動脈を巻いて３分間後に除去された）。４．５時間はＦｅＣｌ_３濾紙が血管を包み始めてから４．５時間、即ち投与開始の時間を示す。５．５時間は投与後１時間を示す。６．５時間は投与後２時間を示す。２４時間は投与後２４時間を示す。 レーザードプラ血流量計でマウス脳表面の血流灌流を検出する画像である。初期値はＦｅＣｌ_３刺激前の基礎値である。１０分はＦｅＣｌ_３刺激開始後１０分を示す（但し、ＦｅＣｌ_３濾紙は総頸動脈を巻いて３分間後に除去された）。４．５時間はＦｅＣｌ_３濾紙が血管を包み始めてから４．５時間、即ち投与開始の時間を示す。５．５時間は投与後１時間を示す。６．５時間は投与後２時間を示す。２４時間は投与後２４時間を示す。 投与後２４時間の脳組織から滲出したエバンスブルー含有量（Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅｌｅａｋａｇｅ）である。図中：^＊偽手術群と比較して、ｐ＜０．０５；^＃ｔＰＡ血栓溶解群と比較して、ｐ＜０．０５；Ｎ＝６。 虚血半影区の脳表面毛細血管後微静脈の血管透過性の様子である。図中：^＊偽手術群と比較して、ｐ＜０．０５；^＃ｔＰＡ血栓溶解群と比較して、ｐ＜０．０５；ｎ≦６。 投与後２４時間の脳血管周囲浮腫、微小血管開放数及び乾湿重量比の変化である。図中：^＊偽手術群と比較して、ｐ＜０．０５；^＃ｔＰＡ血栓溶解群と比較して、ｐ＜０．０５；ｎ≦６。 投与後２４時間後の脳微小血管内皮細胞隙間コネクシンの変化を示す、脳血管内皮細胞隙間結合の透過型電子顕微鏡画像であり、矢印は血管内皮細胞結合（ＴＪ）を示す。右脳虚血半影区皮質ＺＯ－１、ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｏｃｃｌｕｄｉｎｇとＪＡＭのタンパク質ブロットと定量統計である。図中：^＊偽手術群と比較して、ｐ＜０．０５；^＃バックグラウンド群と比較して、ｐ＜０．０５；^†ｔＰＡ血栓溶解群と比較して、ｐ＜０．０５。電子顕微鏡画像Ｎ＝３、その他ｎ≧６である。 体外培養内皮細胞の酸素欠損・酸素回復後のコネクシンの変化、脳微小血管内皮細胞の酸素欠損４．５時間、酸素回復同時にｔＰＡ及び／又はＴ５４１を与え、内皮細胞間の密着連結するＣｌａｕｄｉｎ－５、ＪＡＭ－１及び接着連結するＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎのタンパクイムノブロットの代表図及び統計である。酸素欠損／酸素回復、Ｈｙｐｏｘｉａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ、Ｈ／Ｒ。図中：^＊正常対照群と比較して、ｐ＜０．０５ ｖｓ；^＃モデル群と比較して、ｐ＜０．０５。ｎ≧４。 投与２４時間後の脳出血状況であり、投与２４時間後の脳出血と梗塞の代表図である。マウスの脳組織を１ｍｍの厚さにスライスして出血状況を撮影し、迅速にＴＴＣ染液で染色し、梗塞面積を記録した。その中、図Ａは再灌流２４時間後の脳出血と梗塞の代表図であり、図Ｂはヘモグロビン分光光度測定キットで各群の右半脳組織におけるヘモグロビン含有量を検出するヒストグラムである。図Ｃは各群の梗塞面積の統計である。^＊偽手術群と比較して、ｐ＜０．０５；^＃バックグラウンド群と比較して、ｐ＜０．０５；^†ｔＰＡ血栓溶解群と比較して、ｐ＜０．０５。ｎ≧６。 投与２４時間後の脳虚血皮質基底膜及び関連タンパク質の変化である。図Ａ、走査型電子顕微鏡図は大脳皮質血管基底膜の変化を示し、白矢印で示す。基底膜、ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＢＭ。Ｎ＝３。図Ｂ、タンパクイムノブロットは投与２４時間後のＩＶ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＶ）とラミニン（Ｌａｍｉｎｉｎ）の右脳虚血半影区皮質での発現量を示す。図Ｃ－Ｄ、ＩＶ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＶ）とラミニン（Ｌａｍｉｎｉｎ）のタンパクイムノブロット統計である。^＊偽手術群と比較して、ｐ＜０．０５；^＃バックグラウンド群と比較して、ｐ＜０．０５；^†ｔＰＡ血栓溶解群と比較して、ｐ＜０．０５。Ｎ＝６。 投与２４時間後の脳組織エネルギー変化である。図中：^＊偽手術群と比較してｐ＜０．０５；^†ｔＰＡ血栓溶解群と比較して、ｐ＜０．０５、Ｎ＝６～７。 投与２４時間後の脳組織の酸化ストレス損傷である。図中：^＊偽手術群と比較して、ｐ＜０．０５；^†ｔＰＡ血栓溶解群と比較して、ｐ＜０．０５。ｎ≧６。 投与２４時間後の脳組織ＡＴＰ５Ｄ含有量の変化である。図中：^＊偽手術群と比較して、ｐ＜０．０５；^＃バックグラウンド群と比較して、ｐ＜０．０５；^†ｔＰＡ血栓溶解群と比較して、ｐ＜０．０５。Ｎ＝６。 投与２４時間後の脳組織細胞アポトーシス染色である。その中、図Ａ、１行目には投与２４時間半影区の大脳皮質のＴＵＮＥＬ染色を示す。２行目には、投与２４時間半影区の大脳皮質神経細胞アポトーシスの透過型電子顕微鏡代表図を示す。図Ｂ、ＴＵＮＥＬ陽性細胞カウント数統計である。^＊偽手術群と比較して、ｐ＜０．０５；^＃バックグラウンド群と比較して、ｐ＜０．０５；^†ｔＰＡ血栓溶解群と比較して、ｐ＜０．０５。Ｎ＝６。 投与２４時間後に脳組織細胞のアポトーシスの様子である。図中、^＊は偽手術群と比較して、ｐ＜０．０５；^＃ｔＰＡ血栓溶解群と比較して、ｐ＜０．０５。Ｎ＝６。 体外培養内皮細胞の酸素欠損／酸素回復後のアポトーシスの様子である。図中：^＊正常対照群と比較して、ｐ＜０．０５；^＃モデル群と比較して、ｐ＜０．０５。Ｎ＝６。

実施例１：漢方薬組成物
タンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン、オウギ総サポニンの重量比は、１：２：４である。

実施例２：漢方薬組成物
タンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン、オウギ総サポニンの重量比は、１：４：１６である。

実施例３：漢方薬組成物
タンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン、オウギ総サポニンの重量比は、２：１６：１である。

実施例４：漢方薬組成物
タンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン、オウギ総サポニンの重量比は、８：１：１６である。

実施例５：漢方薬組成物
タンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン、オウギ総サポニンの重量比は、１６：４：１である。

実施例６：漢方薬組成物
タンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン、オウギ総サポニンの重量比は、１６：８：４である。

実施例７：漢方薬組成物
タンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン、オウギ総サポニンの重量比は、４：１：５である。

実験例１：タンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン、オウギメチルサイドの比例スクリーニング実験
３種類の薬物を均一設計に基づいて表１の上位６組を得て、残りの１群は予備実験結果に基づいて計算して、合計７つの用量組（割合）を得た。

実験により７組の効果を検証した。各群の総用量は２０ｍｇ／ｋｇであった。

１．実験方法
１．１実験動物
体重２７０～２９０ｇの雄Ｓｐｒａｇｕ－Ｄａｗｌｅｙラット９０匹は、北京大学医学部動物センターで購入し、合格証番号：ＳＣＸＫ（京）２００６－０００８であった。動物飼育は温度２２±２℃、湿度４０％±５％の条件下で、自由飲食、飲水、１２時間光／暗交代であった。動物は実験前の１２時間、自由飲水のままで断食した。

１．２モデル作成
糸栓法でラット中大脳動脈閉塞（ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ、ＭＣＡＯ）を引き起こし、ラット中大脳動脈Ｉ／Ｒモデルを作成した。詳しくは、複合麻酔薬で実験前の５分間で麻酔し（腹腔注射）、仰臥位でラットを固定し、頚部正中で除毛し、７５％アルコールで消毒し、頚部走行長さ約３ｃｍで正中切開し、胸鎖乳突筋内縁に沿って筋肉と筋膜から離れた後、気管両側甲状腺とその外上方甲状傍腺を避け、頚総、頚外と内頸動脈を慎重に分離した。６－０手術縫合糸は外頸動脈の近心端にあり、外頸動脈と小分岐を電気凝固した。微小動脈クリップで一時的に内頸動脈と総頸動脈を閉塞し、外頸動脈に顕微手術で切り口を切り、調制した先端にシリカゲルでコートされた栓糸（糸体直径０．３８ ｍｍ）を外頸動脈切り口から徐々に内頸動脈を通して大脳中動脈の起始部に挿入し、大脳中動脈の血液供給を閉塞した。糸進行長は総頸動脈分岐部から約１．８ｃｍ～２．２ｃｍであった。９０分間後、栓糸を抜き、皮膚を縫合し、ラット脳Ｉ／Ｒモデルを作成した。

モデルを作成した後、各実験群（各群のラット１０匹）にそれぞれ上記表中の異なる配合比の漢方薬組成物を投与した。偽手術群は同じ手術操作を採用したが、糸栓は挿入しなかった。手術操作中はラット肛門温を（３７．０±０．５℃）に維持し、手術後は引き続き活動を再開するまでに加熱ブランケットでラット肛門温を維持した。２４時間後、再びラットを麻酔し、犠牲し、検体を採集した。

１．３脳梗塞領域染色
ＴＴＣ（２，３，５－ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）染色方法でＩ／Ｒ損傷後のラット脳梗塞を測定した。具体的な方法として、再灌流２４ｈ後、各群のラットの脳を取り出し、脳ポジショナー上で前から後ろに５枚に切って、２％のＴＴＣに入れ、３７℃で１５分間インキュベートし、ＴＴＣ染色を行った。非梗塞区は赤色に染まり、梗塞区は着色しないまま白色のままだった。

脳片ＴＴＣ染色画像を撮影し、画像分析ソフトＩａｍｇｅＪ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて、ＴＴＣ染色梗塞面積が全脳面積に占める割合の値を計算し、脳梗塞の程度を評価した。

１．４神経学的評点
再灌流３ｈ、２４ｈにおいて、各群のラットに対して１８点評価基準に従って神経学的評点を行い、表２に示した。

１８点改良マウス神経学的評点法（ｍＮＳＳ）、正常マウス得点は０点、最大１８点、得点が高いほど神経欠損が深刻であることを示し、具体的な結果評価は表３に示した。

２．実験結果
２．１ＴＴＣ染色結果：図１Ａと図１Ｂに示した。
図１Ａは各群のラット再灌流２４ｈ脳組織片ＴＴＣ染色画像である。図中の白い領域は梗塞領域を示す。図１Ｂは異なる群のＴＴＣ梗塞面積の統計図である（具体的な結果は表４に示した）。

偽手術群と比較して、Ｉ／Ｒ群のラット右脳に明らかな梗塞が出現した。８：１：１６、１６：４：１、１６：８：４及び４：１：５の４つの配合は脳梗塞面積を減らすことができ、その中、８：１：１６及び４：１：５の２つの配合は脳梗塞面積を有意に減らすことができた（図１Ａ）。

２．２神経学的評点結果は、図２Ａ、図２Ｂ（それぞれ再灌流３ｈと２４ｈ後の各群のラットが神経機能学的評価を行った結果を示した）と表４に示した。

図２Ａ、図２Ｂ及び表４の結果は、以下を示す。

偽手術群（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して、再灌流３ｈと２４ｈには、ラット神経機能学評点が有意に低下し、７つの配合群が再灌流３ｈの神経機能学評点の低下に改善作用がなかったが、再灌流２４ｈの場合、８：１：１６、１６：４：１、４：２：１、４：１：５の４つの配合群が、ラット神経機能学評点を有意に改善できた。

以上の実験により、タンジンポリフェノール酸（ａ）、サンシチ総サポニン（ｂ）、オウギ総サポニン（ｃ）の三種類の薬物の割合が（４～１６）：（１～８）：（１～１６）、好ましくは（４～１６）：（１～４）：（１～１６）の範囲にある場合、良好な虚血再灌流損傷の改善作用があることを分かった。

以下の実験は、血栓溶解による虚血再灌流損傷を例に、上記の実験で確定した最適な比例範囲内の異なる群を選び、本発明の漢方薬組成物の血栓溶解後の虚血再灌流損傷に対する保護作用及び血栓溶解促進作用を考察した。しかし、これは本願の保護範囲を制限するものではなく、何らかの原因による虚血再灌流損傷は、ラジカル過多、細胞カルシウム過負荷、炎症反応などを示し、治療方法も同じである。本発明の実験により、本願の漢方薬組成物は血栓溶解後に引き起こした虚血再灌流損傷を治療できることが実証され、同様に本願の漢方薬組成物も他の原因による虚血再灌流損傷を治療できることが導出された。

実験例２：マウス頸動脈血栓に対する血栓溶解促進作用及び血栓溶解脳虚血再灌流損傷の保護作用

１．動物実験モデルの作成と実験群
１．１動物モデルの作成
体重２１±２ｇの雄Ｃ５７ＢＬ／６クリーンクラスマウスは、北京大学医学部実験動物センターで購入した。動物飼育は温度２３±２℃、相対湿度４５±５％の条件下で、自由飲食、飲水、１２時間光／暗交代であった。動物は実験前の１２時間、自由飲水のままで断食した。

ペントバルビツール酸ナトリウム（２％、４５ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内投与により動物を麻酔し、頚部皮膚に皮膚を予備的に消毒した。首の真ん中の切り口を作って、首の総動脈を暴露して分離して、１つの防水パッキンを用いて長さ約２．５～３ｍｍの総頸動脈と周囲組織を隔離した。分離された総頸動脈を１０％ ＦｅＣｌ_３に浸潤した濾紙で約１ｍｍ幅で巻き、３分間後に濾紙を取り除き、０．９％生理食塩水で血管外側を洗浄した。防水パッキンを取り除いた。首の傷を縫合した。虚血開始をＦｅ^３＋刺激開始として定義し、虚血１０分間後に頚部血栓の最大径で血管を閉塞し、虚血１５分間後に頸動脈の遠心端血流量は基礎値の２０％より小さく、かつ虚血４．５時間（即ち再灌流前）で血栓が安定し、血栓面積径が最大で頸動脈血管径の６０％以上を閉塞した動物を選定し、群分けに供した。

１．２実験群分け
１．２．１異なる配合の本発明の漢方薬組成物による血栓溶解後の虚血再灌流損傷に対する保護作用の考察
虚血４．５時間後、ランダムな群分け結果に従って薬物又は生理食塩水治療を行った。マウスの大腿静脈に挿管し、左大腿静脈にｔＰＡ（組織型プラスミノーゲン活性化物質）又は生理食塩水をポンプで注入し、右大腿静脈に本発明の漢方薬組成物又は生理食塩水をポンプで注入し、総薬量の１０％は直接注射し、残りの９０％は、１時間かけて、速度０．１ｍｌ／時間で静脈にポンプで注入した。本発明の漢方薬組成物は３つの配合群を選び、それぞれ以下の通りであった。

Ｔ５４１群（即ち、オウギ総サポニン：タンジンポリフェノール酸：サンシチ総サポニン＝５：４：１）；
Ｔ１４１群（即ち、オウギ総サポニン：タンジンポリフェノール酸：サンシチ総サポニン＝１：４：１）；
Ｔ５８２群（即ち、オウギ総サポニン：タンジンポリフェノール酸：サンシチ総サポニン＝５：８：２）。

乱数表に従ってＣ５７ＢＬ／６マウスを以下の１０群に分けた。

（１）偽手術群、モデル作成時にＦｅ^３＋刺激の代わりに生理食塩水を使用した。
（２）Ｔ５４１高用量バックグラウンド群（偽手術群に基づいて、Ｔ５４１ ２０ｍｇ／ｋｇ投与、バックグラウンド群と略称する。）
（３）血栓群（等体積の生理食塩水投与）
（４）Ｔ５４１高用量血栓溶解群（単独でＴ５４１ ２０ｍｇ／ｋｇ投与）
（５）ｔＰＡ血栓溶解群（ｔＰＡ投与）
（６）Ｔ５４１低用量群（ｔＰａ＋Ｔ５４１ ５ｍｇ／ｋｇ投与）
（７）Ｔ５４１中用量群（ｔＰａ＋Ｔ５４１ １０ｍｇ／ｋｇ投与）
（８）Ｔ５４１高用量群（ｔＰａ＋Ｔ５４１ ２０ｍｇ／ｋｇ投与）
（９）Ｔ１４１群（ｔＰａ＋Ｔ１４１ １２ｍｇ／ｋｇ投与）
（１０）Ｔ５８２群（ｔＰａ＋Ｔ５８２ １５ｍｇ／ｋｇ投与）

その中、ｔＰＡはすべて臨床等価使用量１０ｍｇ／ｋｇを投与した。各群の投与方式を表５に示す。

左大腿静脈にはｔＰＡ臨床等価使用量１０ｍｇ／ｋｇあるいは等体積の生理食塩水対照を投与した。右大腿静脈にはそれぞれの本発明の漢方薬組成物を投与し、それぞれＴ５４１低、中、高用量群、Ｔ１４１群、Ｔ５８２群又は等体積の生理食塩水対照であった。

その中、Ｔ５４１低用量群、中用量群、高用量群及びＴ１４１群、Ｔ５８２群はｔＰＡと同時投与した形式を採用して、本発明の漢方薬組成物の血栓溶解促進作用を評価することができて、本発明の漢方薬組成物の血栓溶解による虚血再灌流損傷に対する治療作用を考察することもできて、動物実験中の各観測指標及び各群の動物使用数を表６に示す。

２４時間生存率及び神経学的評点の各群の数は６以上で、血栓観察、塩化トリフェニルテトラゾリウム（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＴＴＣ）梗塞面積染色、脳血流量及び出血状況観察の各群の数は６であった。偽手術群、Ｔ５４１高用量バックグラウンド群、ｔＰＡ血栓溶解群と最適薬物濃度群を選び、次の観察を行った。エバンスランド滲出、微小循環動態可視化観察、モデル側脳乾湿重量比と分子生物学指標検査の各群の数は６であった。免疫蛍光染色と電子顕微鏡動物の各群の数は３であった。

マウス再灌流後２４時間生存率、神経学的欠陥評点、頸動脈血栓面積変化と脳血流量灌流状況変化を記録し、最適な薬物濃度を選択して、次の分析を行った。

再灌流２４時間後に正置顕微鏡動態微小循環観測システムを用いてマウスの脳微小循環動態変化を観察し、中大脳動脈領域、前動脈領域と脳表面毛細血管後微小静脈のアルブミン滲出状況を記録した。

再灌流２４時間後にマウスを犠牲して脳を採取し、脳組織の出血状況と梗塞面積の大きさを観察し、出血後の脳組織におけるヘモグロビン含有量を測定した。脳組織の乾湿重量比とエバンスランド滲出の程度を検査し、組織浮腫状況を反映した。脳組織ＴＵＮＥＬ染色でアポトーシスの重症度を観察した。コネクシンＯｃｃｌｕｄｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ－５、ＪＡＭ－１、ＺＯ－１、ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ及び基底膜成分であるラミニンｌａｍｉｎｉｎのタンパクイムノブロット分析と、一部のコネクシンとｌａｍｉｎｉｎの免疫蛍光で染色を行い、血管損傷時の血液脳関門の変化状態を観察した。走査型電子顕微鏡と透過型電子顕微鏡で脳虚血再灌流後の構造変化を検出した。酵素免疫吸着で脳組織ＭＤＡ、８－ＯＨｄＧ、ＡＴＰ／ＡＤＰ／ＡＭＰ及びミトコンドリア複合体ｉ、ＩＩ及びＩＶ活性の変化を測定した。

１．２．２本発明の漢方薬組成物と単離された各成分の総頸動脈血栓溶解後の再灌流損傷に対する治療作用の比較
本発明の漢方薬組成物と、単離された各単独成分（オウギ総サポニン、タンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン）又は両成分配合群とのｔＰＡ血栓溶解による再灌流損傷に対する治療作用を比較するため、本実験は、ｔＰＡとＴ５４１及びＴ５４１における各単独成分又は両成分配合群の組み合わせを採用した。それぞれ、ｔＰＡ＋オウギ総サポニン（ｔＰＡ＋ＨＱ）、ｔＰＡ＋タンジンポリフェノール酸（ｔＰＡ＋ＤＳ）、ｔＰＡ＋サンシチ総サポニン（ｔＰＡ＋ＳＱ）、ｔＰＡ＋オウギ総サポニン＋タンジンポリフェノール酸（ｔＰＡ＋ＨＱ＋ＤＳ）、ｔＰＡ＋オウギ総サポニン＋サンシチ総サポニン（ｔＰＡ＋ＨＱ＋ＳＱ）、ｔＰＡ＋タンジンポリフェノール酸＋サンシチ総サポニン（ｔＰＡ＋ＤＳ＋ＳＱ）、及びｔＰＡ＋Ｔ５４１であった。具体的な群分けを表７に示す。生理食塩水は等体積対照であった。各群に使用される数はいずれも６であった。

１．３細胞実験の流れ、群分け及び観測指標
１．３．１細胞実験の流れと群分け
ラット脳内皮細胞酸素欠損・酸素回復モデルを作成した：ラット脳内皮細胞はＡＴＣＣ社から購入し、継代を正常に５代から６代まで培養した後、実験を行った。

以下の群に分けた（１）正常対照群；（２）モデル群：酸素欠損４．５時間、酸素回復３時間、酸素回復開始時にｔＰＡ ２０μｇ／ｍｌを加えて処理した；（３）Ｔ５４１高用量投与群：酸素欠損４．５時間、酸素回復３時間、酸素回復開始時にｔＰＡ ２０μｇ／ｍｌとＴ５４１ ４００μｇ／ｍｌを加えて処理した；（４）Ｔ５４１回高用量投与群：酸素欠損４．５時間、酸素回復３時間、酸素回復開始時にｔＰＡ ２０μｇ／ｍｌとＴ５４１ ４０μｇ／ｍｌを加えて処理した；（５）Ｔ５４１中用量投与群：酸素欠損４．５時間、酸素回復３時間、酸素回復開始時にｔＰＡ ２０μｇ／ｍｌとＴ５４１μｇ／ｍｌを加える処理（６）Ｔ５４１次低用量投与群：酸素欠損４．５時間、酸素回復３時間、酸素回復開始時にｔＰＡ ２０μｇ／ｍｌとＴ５４１ ０．４μｇ／ｍｌを加えて処理した；（７）Ｔ５４１低用量投与群：酸素欠損４．５時間、酸素回復３時間、酸素回復開始時にｔＰＡ ２０μｇ／ｍｌとＴ５４１ ０．０４μｇ／ｍｌを加えて処理した。

Ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８と略称し、ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ、中国）キットを用いて、異なる薬物処理下の細胞活力と正常群細胞の差異を測定した。実験では、以下の群に分けた（１）正常対照群；（２）Ｔ５４１高用量薬物バックグラウンド群：正常細胞にＴ５４１ ４００μｇ／ｍｌを加えて３時間処理した；（３）次の高用量薬物バックグラウンド群：正常細胞にＴ５４１ ４０μｇ／ｍｌを加えて３時間処理した；（４）中用量薬物バックグラウンド群：正常細胞にＴ５４１ ４μｇ／ｍｌを加えて３時間処理した；（５）次低用量薬物バックグラウンド群：正常細胞にＴ５４１ ０．４μｇ／ｍｌを加えて３時間処理した；（６）低用量薬物バックグラウンド群：正常細胞にＴ５４１ ０．０４μｇ／ｍｌを加えて３時間処理した。

１．３．２細胞実験観測指標
Ｃｅｌｌ－Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ ８（ＣＣＫ８）を用いて細胞活性を測定し、異なる濃度の薬物が正常内皮細胞に与える影響を反映した。コネクシンＣｌａｕｄｉｎ－５（密着コネクシン－５）、ＪＡＭ－１（連結粘着分子１型タンパク質）、ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（血管内皮細胞カルシウムコネクシン）の含有量の変化を測定した。一部のコネクシン及び細胞骨格Ｆ－ａｃｔｉｎ免疫蛍光で染色した。タンパクイムノブロット分析でアポトーシス関連タンパク質Ｂａｘ（Ｂ細胞リンパ腫２関連Ｘタンパク質）、Ｂｃｌ－２（Ｂ細胞リンパ腫－２）の含有量の変化を検出した。タンパクイムノブロット分析でマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）－３とその前駆体であるｐｒｏ－ＭＭＰ－３の含有量の変化を検出した。

２．試験方法
２．１マウス頚部血栓観察
正置顕微鏡を用いてマウス頸動脈血栓を動態的に観察した。麻酔マウスは背臥位でマウス板に置き、頸正中切開を行い、総頸動脈を暴露し分離し、大腿静脈にアクリジンレッド蛍光標識血小板を投与し、虚血前（即ち基礎値）、虚血１０分間、虚血４．５時間（即ち再灌流前）、再灌流１時間、再灌流２時間及び再灌流２４時間のマウス頸動脈血栓変化を観察した。虚血前（即ち基礎値）に血栓がなく、虚血１０分間に血栓最大径で血管を閉塞し、虚血１５分間に頸動脈遠心端血流量が基礎値の２０％以下に低下し、かつ虚血４．５時間（即ち再灌流前）で血栓が安定し、血栓面積が頸動脈血管面積の６０％以上を閉塞したことは、頸動脈血栓モデルの成功基準となり、モデル作成の成功率は９０．９％に達した。偽手術群と各バックグラウンド群を除いて、残りの各群は、モデル作成が成功した後にランダムに群分けした。

２．２脳血流量測定
コンピュータに付属したレーザードップラー血流灌流画像撮像装置を用いて左右両側大脳中動脈支配領域の大脳皮質血流量を測定した。麻酔されたマウスは、マウス板の上に腹ばいになり、左右側頭頂骨の皮膚を切って頭頂骨を完全に露出させ、コンピューターに付属した低エネルギーヘリウムネオンレーザープローブを頭頂骨の上１６～１８センチに置き、虚血前（即ち基礎値）、虚血１０分間、虚血４．５時間（即ち再灌流前）、再灌流１時間、再灌流２時間及び再灌流２４時間のマウス左右両側大脳中動脉血液供給区の軟脳膜血流量を測定した。脳血流量分析ソフトＬＤＰＩｗｉｎ ３．１（ＰｅｒｉＳｃａｎ ＰＩＭ３ Ｓｙｓｔｅｍ、ＰＥＲＩＭＥＤ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、スウェーデン）を用いて左右側ＭＣＡが支配する同じ大きさの領域の大脳皮質血流量を計算した。

２．３神経学的評点
再灌流２４時間で、１５点評価基準（Ｇａｒｃｉａ ＪＨ ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｏｋｅ． １９９５；２６：６２７-６３４．）を少し修正し、各群のマウスに対して神経学的評点を行った。

マウスの自主活動能力：マウスを２５×１５ｃｍのかごの中に入れて、その３分間の活動軌迹を記録して、マウスはほとんど活動していないことを０点、活動が極めて少ないかつかごに触れていないことを１点、いずれかの１つ又は２つの壁に触れることを２点、３つの壁以上に触れることを３点として記録した。

マウスの肢体対称性の実験では、マウスの尾を持ち上げて、左右の体の動きの軌迹を観察して、左右が完全非対称を０点、ほとんど非対称を１点、中等程度の非対称を２点、ほぼ対称を３点として記録した。

開野試験測定実験では、マウスの自由運動軌迹を観察して、活動しないのを０点、その場での回転を１点、片側に偏った曲線運動を２点、直線運動を３点として記録した。

平均台実験では、地面から１０ｃｍ離れたところに５０×５×２ｃｍの木の棒を置き、マウスを一端に置き、平均台の上での運動軌迹を観察して、マウスは平均台から落ちることを０点、平均台にぶら下がることを１点、平均台の上に立っているが運動が少ないことを２点、平均台の上で運動することを３点として記録した。

マウス触知実験では、小さな木棒でマウスの左右両側触知を触り、右側と比較して、左側の反応しない者を１点、左側の反応が微弱である者を２点、両側の反応が同じである者を３点として記録した。

マウス神経学的評点は、上記５つの実験単独評点の総和を計算し、１５点は正常マウス、０点はマウス死亡を示した。

もう一つの評価方法を紹介する。改良神経損傷重症度評点（ｍｏｄｉｆｉｅｄｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌｓｅｖｅｒｉｔｙｓｃｏｒｅｓ、ｍＮＳＳ）では、０～１８点である。採点方法は、実験例１中の１．４部を参照した。

２．４脳出血状況及び梗塞面積測定
２４時間再灌流し、４℃で予冷されたＰＢＳ緩衝液で心臓からマウスに灌流し、開頭で脳を取り、脳立体ポジショナーで前から後ろに５枚にスライスし、実体写真顕微鏡で迅速に出血状況を撮影し、－８０で保存し、ヘモグロビン分光光度測定キットでヘモグロビン含有量を測定した。

２４時間再灌流し、４℃で予冷されたＰＢＳ緩衝液で心臓からマウスに灌流し、開頭で脳を取り、脳立体ポジショナーで前から後ろに５枚にスライスし、低温条件下で迅速に写真を撮り、出血状況を記録し、２％塩化トリフェニルテトラゾリド（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＴＴＣ）を入れ、非梗塞区は赤色に染まり、梗塞区は着色しないまま白色のままだった。脳片ＴＴＣ染色画像を撮影し、画像分析ソフトＩｍａｇｅＪ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、米国）を用いてＴＴＣ染色梗塞面積が全脳面積に占める割合の値を計算し、脳梗塞の程度を評価した。

２．５微小循環観察、エバンスブルー滲出測定及び脳組織乾湿重量比測定
血漿アルブミンの漏出：実体顕微鏡下で、マウス大腿静脈の挿管（ＰＥ／０８、外径０．３６ｍｍ、内径０．２０ｍｍ）を行った。マウスは腹臥位でマウスの脳微小循環観察板に固定し、マウスの頭盖頂皮膚を切り取り、右側の頭頂骨を露出させ、実体顕微鏡下で、頭頂骨に柔らかい骨皮質が１層しか残っていなかったまでに、携バンド型頭盖ドリルで頭頂骨全体を薄く削った。ＦＩＴＣ標識の血漿アルブミン（励起波長４２０～４９０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ）を５０ｍｇ／ｋｇの用量で、大腿静脈を経てゆっくりと注射した。１０分間後、超感度蛍光ＣＣＤ付の正立蛍光顕微鏡下で、再灌流２４時間後の小鼠脳表面直径３０～５０μｍの間の毛細血管後微静脈、中大脳動脈支配区域動脈、中大脳前動脈支配区域動脈の蛍光図像を記録し、血漿アルブミンの漏出状況を分析した。画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて細静脈血管内（Ｉｖ）及び血管外（Ｉｉ）の蛍光強度を計算し，血漿アルブミン漏出量をＩｉ／Ｉｖで示した。

エバンスブルー滲出：再灌流２１時間後、生理食塩水に溶解したエバンスブルー染料（２％、４ｍｌ／ｋｇ）を大腿静脈から徐々にマウス体内に注射した。３時間後、心臓に生理食塩水１５～２０ｍｌ（右心耳流出液が無色となる時に灌流を停止させた）を注入し、直ちに脳を取り４％パラホルムアルデヒドにおいて３時間固定し、取り出した後、脳を５枚にスライスし、写真を撮り、左右の脳を分けてそれぞれ秤量した。左右の脳をそれぞれ５０％トリクロロ酢酸を含むＥＰチューブに入れ、ホモジネートし、上清を遠心分離した。エバンスブルー標準品を調製し、多機能マイクロプレートリーダーでエバンスブルー含有量（励起光６２０ｎｍ、発光光６８０ｎｍ）を検出した。１ｇあたりの脳組織に含まれるエバンスブルーμｇ数でエバンスブルー含有量を表した。

脳組織乾湿重量比は、再灌流２４時間後、直ちにマウスを麻酔し、頭を切って脳を取り、左右の脳をそれぞれ秤量した（湿重量とした）。その後、脳を６０℃の乾燥箱に入れ、７２時間放置して乾燥し、秤量した（乾燥重量とした）。マウスの脳乾湿重量比は（湿重量－乾燥重量）／湿重量×１００％で計算した。

２．６電子顕微鏡観察
透過型電子顕微鏡：再灌流２４時間後、麻酔マウスは左心室を介して３ｍｌ／分の速度で３％グルタルアルデヒドを４０分間注入し、脳を取り、マウスの右側皮質を１ｍｍ× １ｍｍ×１ｍｍの小塊にし、３％グルタルアルデヒドで室温で３０分間又は４℃で一晩固定した。蔗糖はシェーパーベッドで３回×１５分間洗浄し、オスミウム酸で室温で２時間固定し、０．２モル／ＬのＰＢＳで３回×５分間洗浄し；３０％、５０％、７０％と９０％のアセトンでそれぞれ１５分間脱水し、１００％のアセトンで３回×５分間脱水し、１００％アセトンと包埋剤とを１：１で混合した予備包埋剤に予備浸漬し、３７℃で一晩置き、純包埋剤で浸潤し、３７℃、２４時間後、６０℃で４８時間硬化し、自然冷却し、包埋剤終了後にブロック取り、切片をし、切片の厚さは６０ｎｍであった。極薄シートを酢酸ウランとクエン酸鉛で染色し、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ １２３０、ＪＥＯＬ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で観察、撮影した。

走査型電子顕微鏡：再灌流２４時間後、麻酔マウスは左心室を介して３ｍｌ／分の速度で３％グルタルアルデヒドを４０分間注入し、脳を取り、右側皮質半影区を切り取り、グルタルアルデヒドに入れてから２時間固定した。ＰＢＳリン酸塩緩衝液で洗浄した後、１％四酸化オスミウム中で２時間ポスト固定し、適当な断面をとって金属ホルダーに固定した。組織ブロックに金メッキを施し、走査顕微鏡（ＪＳＭ－５６００ＬＶ、ＪＥＯＬ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で観察、撮影した。

２．７タンパクイムノブロット分析及び酵素免疫吸着実験
２４時間再灌流し、生理食塩水で動物の心臓を灌流し、右脳皮質梗塞半影区を採取し、タンパクイムノブロット分析を行った。灌流後、マウスの脳組織を取り出し、小脳と前頭葉を切り取り、矢状位に沿って右脳の左右半脳の中に１センチの脳組織を切り取り、残りの組織は４５度の角度に沿って梗塞半影区を切り取り、半影区の大脳皮質を剥ぎ取り、低温保存した。右脳皮質を取り、１×ＲＩＰＡ分解液及びＣｏｃｋｔａｉｌプロテアーゼィンヒビター（１：１００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を加えて十分に分解した後、超音波をかけて、１７０００ｇで３０分間遠心した。上清をとり、体積に従って５×のサンプリング緩衝液を加え、沸水中で２０分間沸騰し、－８０で保存した。余りの上清を採取し、ＢＣＡタンパク質定量液（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）でタンパク質を定量し、マイクロプレートリーダーの５６０ｎｍで吸光度値を測定し、検量線からタンパク質濃度を算出した。ポリアクリルアミドゲルウェルのそれぞれに等量の各組のタンパク質を加え、濃縮ゴム８０Ｖで、分離ゴム１００Ｖで定電圧電気泳動で分離し、分離したタンパク質バンドを電気的にＰＶＤＦフィルム上（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、２２０ミリアンペアで１２０分間転写した。フィルムは５％の脱脂ミルク中で室温で１時間閉鎖し、特異的結合部位を除いた後、５％脱脂粉乳で希釈した抗β－ａｃｔｉｎ、ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＪＡＭ－１、ＭＭＰ－３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国），ｃａｖｅｏｌｉｎ－１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）、ｂｃｌ－２、ｂａｘ、ｌａｍｉｎｉｎの一次抗体を加えて、４℃でインキュベートした。翌日、ＴＢＳＴで１０分間×３回洗浄した後、５％脱脂粉乳で希釈した二次抗体で室温でインキュベート１時間し、発光剤（プリレ、中国）を加えて発色し、暗室で現像した。画像解析ソフトＱｕａｎｔｉｔｙｏｎｅで電気泳動バンドの密度値を解析した。すべてのタンパク質バンドの大きさは、内部標準であるβ－ａｃｔｉｎ又は総目的タンパク質と比較した相対値で表した。

酵素免疫吸着キットを用いて、モデル側脳組織皮質半影区ＭＤＡ（マロンジアルデヒド）、８－ＯＨｄＧ（８－ヒドロキシ－２′－デオキシグアノシン）、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）、ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）を測定した。

各群のデータは少なくとも６つの検体を用いて、少なくとも３回の独立実験を行った。

２．８免疫蛍光染色実験
再灌流２４時間、４℃で予冷したＰＢＳ緩衝液で心臓からマウスを灌流し、開頭して脳を取り出し、その後１２時間固定し、３０％蔗糖で脱水した後、ＯＴＣで包埋し、凍結スライサー（ＣＭ１８００、Ｌｅｉｃａ、Ｂｅｎｓｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて厚さ１０μｍで凍結スライスし、自然乾燥した後、０．１モル／ＬのＰＢＳでシートを５分間洗浄し、６００ワット、９０℃の条件で、電子レンジ内で０．０１モル／Ｌのクエン酸ナトリウムで１０分間抗原修復を行い、室温で２時間自然冷却した。ＰＢＳＴで３７℃で恒温恒湿１時間破膜後、ＰＢＳ緩衝液で５分間×３回洗浄し、ペプシンで１５分間消化し、ＰＢＳ緩衝液で再び５分間×３回洗浄した。羊血清で３０分間閉鎖した後、ＰＢＳ緩衝液で５分間×３回洗浄し、一次抗体であるｖＷＦ（１：１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ｕｓａ）＋ＪＡＭ－１／Ｏｃｃｌｕｄｉｎ／Ｌａｍｉｎｉｎ（１：５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を加えて、４℃で一晩置いた。翌日、取り出して１時間温度回復し、ＰＢＳ緩衝液で５分間×３回洗浄し、二次抗体を加えてから２時間後、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（１：１００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加えて細胞核を標識し、室温で光を避けて１０分間インキュベートした。抗蛍光消光封止剤で封止を行った。レーザースキャン共焦点顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ５，Ｌｅｉｃａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて，６３倍の対物レンズの下で観察と写真撮影を行った。

２．９統計分析
すべてのデータはｍｅａｎ±ＳＥＭで表し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０統計ソフト、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ又はＴｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（脳血流量、神経学的評点）の方法でデータを統計し、群間の両方の比較はＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉで矯正し、ｐ＜０．０５は差異が統計学的に有意であることを示した。

３．実験結果
３．１頸動脈血栓変化
３．１．１各群のマウス頚総動脈内血栓の動態変化：図３を参照した。
図３の結果は、偽手術群と比較して、他の各群の血栓はＦｅＣｌ_３濾紙刺激後１０分間で総頸動脈内の血栓形成が見られ、４．５時間で血栓が安定していたことを示す。ｔＰＡ投与後、血栓は部分的に溶解したが、２４時間後には頸動脈内の血栓が観察された。Ｔ５４１は、ｔＰＡの血栓溶解効果を用量依存的に増加させ、特に大量のＴ５４１とｔＰＡを併用すると血栓溶解効果が明らかに増加し、投与後１時間で頸動脈内の血栓が明らかに溶解した。

３．１．２各時点の血栓面積：表８を参照した。

表８の結果から、血栓群と比較して、ｔＰＡ群は２４時間で血栓面積が明らかに減少していたことが分かった。単純にＴ５４１を投与したが、血栓溶解作用を示さなかった。しかし、ｔＰＡと併用した場合、ｔＰＡの血栓溶解効果は、Ｔ５４１低、中、高の３つの用量群で、１時間から増加した。一方、Ｔ１４１群とＴ５８２群は血栓溶解効果を増加させる作用がよくなかった。

３．２脳血流量灌流
レーザードプラ血流量計によるマウス脳表面血流灌流の検出結果を図４及び表９に示した。

表９の結果から、各群のマウスは初期条件下で脳表面血流量に差がなく、かつ左右半脳血流量分布が均一であったことが分かった。偽手術群を除いて、各群のマウスは頸動脈血栓を１０分間作成した患側脳表面血流量が明らかに低下し、しかも４．５時間脳血流量は回復しなかった。単純に高用量のＴ５４１とｔＰＡを投与したが、脳血流量は明らかに回復しなかった。中用量のＴ５４１とｔＰＡと併用した場合、投与後２４時間でマウスの脳血流量は明らかに回復した。高用量のＴ５４１とｔＰＡを併用した場合、投与後２時間で脳血流量がｔＰＡ群よりも明らかに高くなり、２４時間後の脳血流量が高用量のＴ５４１とｔＰＡを併用する群よりも明らかに高くなった。Ｔ１４１やＴ５８２とｔＰＡと併用する群の脳血流量は明らかに回復しなかった。

３．３生存率、神経学的評点
３．３．１各群のマウス投与後２４時間生存率

表１０の結果から、偽手術群とバックグラウンド群は、観察期間中に死亡しなかった。血栓群の投与後１８時間と２４時間の生存率はいずれも８１．８２％であった。Ｔ５４１高用量血栓溶解群の２４時間生存率は９０％であった。ｔＰＡ投与後の２４時間生存率は５０％であり、ｔＰＡによる２４時間生存率の低下は，Ｔ５４１の低用量と中用量では改善されなかった。Ｔ５４１高用量の２４時間生存率は８１．８２％であり、血栓群と比較して生存率は明らかに向上した（８１．８２％ ｖｓ ５０％）。Ｔ１４１とＴ５８２もｔＰＡによる生存率の低下を改善しなかった。

３．３．２投与後２４時間の神経学的欠陥評点
１８点改良マウス神経学的評点法を採用した（正常マウスの得点は０点、得点が高いほど神経欠損が深刻であることを示す）。１５点評価基準（１５点は正常マウス、０点はマウス死亡を示す）。

表１１の結果から、偽手術群とバックグラウンド群と比較して、血栓群マウスの２４時間の神経学的平均評点は、それぞれ９．８２（１８点改良学評点）と６．２（１５点評点）であった。Ｔ５４１高用量群は４（１８点改良学評点）であった。ｔＰＡは神経学的評点を改善しなかった。Ｔ５４１の低、中、高用量群は神経学的評点を明らかに改善し、高用量の作用は低用量よりも明らかに優れていた。

生存率、神経学的欠陥評点、頚部血栓面積と脳血流量灌流状況から、Ｔ５４１高用量群を最適な薬物使用濃度として選び、更なる分析を行った。

３．４エバンスランド滲出、脳微小循環損傷及び血管周囲浮腫
３．４．１エバンスランド滲出：図５と表１２の結果からわかるように、投与後２１時間でマウス静脈にエバンスブルー全身循環を与え、３時間後に生理食塩水で血管循環中のエバンスブルーを流し、脳組織に浸透したエバンスブルーを後頭部を厚さ１ｍｍ切って観察した。ｔＰＡ血栓溶解群の脳組織には明らかなエバンスブルーの滲出があり、偽手術群と比較して含有量測定も同様の結果があり、滲出したエバンスブルーの含有量は２０ｍｇ／ｋｇのＴ５４１によって抑制された。ｔＰＡ血栓溶解群のエバンスランブルーは明らかな滲出があり、この滲出は高用量Ｔ５４１の併用で減少されることができた。

３．４．２虚血半影区脳表面毛細血管後微静脈の血管透過性状況：
図６と表１２の結果からわかるように、血栓溶解投与後２４時間後に、動態可視化方法でマウスの生体状態における虚血半影区脳表面毛細血管後の微小静脈の血管透過性を観察した。３０分間以内の血管内アルブミンの漏出の様子を観察した。ｔＰＡ血栓溶解群の血漿アルブミンは明らかに滲出し、Ｔ５４１高用量群は血漿アルブミンの滲出を明らかに抑制することができた。

３．４．３投与後２４時間脳血管周囲浮腫、微小血管開放数及び乾湿重量比は、
透過型電子顕微鏡画像で示すように、偽手術群とＴ５４１高用量バックグラウンド群の血管構造は完全であり、血管内皮は滑らかに連続し、周囲の組織と密接につながった。ｔＰＡ血栓溶解群では血管内皮が粗く、周囲組織との間に明らかな浮腫空隙があり、周囲組織はミトコンドリア浮腫があった。Ｔ５４１高用量群は血管内皮が比較的に滑らかで、血管周囲浮腫が明らかに減少し、線粒体構造が致密で、血管周囲組織内に浮腫空隙もなかった。（図７の１、２行目の図を参照した。）

走査型電子顕微鏡で示すように、偽手術群とＴ５４１高用量バックグラウンド群の大脳皮質の全体構造は平坦であり、血栓形成４．５時間後にｔＰＡを投与してから２４時間後、大脳皮質全体の組織構造は表面凹凸が乱れ、Ｔ５４１を併用して全体の組織状態を明らかに改善した。ランダムに５つの視野を選んで異なる群の動物大脳皮質血管開放数をカウントしたところ、ｔＰＡ血栓溶解群は偽手術群とＴ５４１高用量バックグラウンド群と比較して、脳組織血管数が明らかに減少したことがわかった。走査型電子顕微鏡下でマウス１匹につきランダムに５つの５００倍視野を選び、右脳半影区の大脳皮質微小血管開放数をカウントした。Ｎ＝３。（図７の３、４行目の図を参照した。）

表１２と図７のヒストグラムは、投与後２４時間後の脳組織エバンスブルー、血漿アルブミン滲出、乾湿重量比の統計結果を示した。ｔＰＡはエバンスブルーの滲出、血漿アルブミン滲出の増加、脳微小血管開放数の減少、乾湿重量比の増加を引き起こしたことができた。Ｔ５４１は、ｔＰＡによる上記変化を抑制したことができた。この結果から、ｔＰＡ血栓溶解は脳微小血管滲出と脳浮腫を引き起こし、Ｔ５４１はｔＰＡによる脳微小血管滲出と脳浮腫を抑制できることが示唆された。

３．５投与後２４時間の脳微小血管内皮細胞隙間コネクシンの変化
Ｔ５４１は半影区大脳皮質投与後２４時間後の脳微小血管内皮細胞隙間コネクシンの変化を改善できた。透過型電子顕微鏡はｔＰＡ血栓溶解群の半影区の大脳皮質血管の密着連結構造が解かれたことを示して、Ｔ５４１とｔＰＡを併用することは、解かれた内皮細胞の連結構造を閉じて、細胞の正常な連結を回復することができる。（図８参照）

タンパクイムノブロットは右脳皮質半影区のコネクシン含有量の変化を検出し（図８、表１３参照）、密着コネクシンであるＺＯ－１、ｏｃｃｌｕｄｉｎ、ＪＡＭと接着コネクシンであるＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎはｔＰＡ血栓溶解群で有意に低下し、この低下はＴ５４１とｔＰＡの併用で逆転できたことを発見した。

図８と表１３の結果から、血栓形成４．５時間にｔＰＡ血栓溶解を投与してから２４時間後、脳血管内皮間の密着と基底膜との密着連結が有意に低下し、血管構造が不完全であり、後続の血管透過性が増加し、血管外滲出が増加し、さらに潜在的出血リスクが増加する可能性が示唆された。Ｔ５４１はｔＰＡによる脳血管内皮細胞隙間コネクシン損傷を抑制できる。

３．６体外培養内皮細胞の酸素欠損・酸素回復後のコネクシンの変化：図９と表１４を参照した。
ｔＰＡとＴ５４１が血液脳関門、特に血管内皮細胞と基底膜に与える影響を研究するため、体外でラット脳微小血管内皮細胞を培養し、酸素欠損４．５時間処理、酸素回復３時間、体内虚血血栓溶解後の再灌流状態を模擬し、酸素回復同時にｔＰＡとＴ５４１治療を行った。

ＣＣＫ８キットを用いて正常細胞と正常細胞に異なる濃度のＴ５４１を与える活性変化を測定したところ、Ｔ５４１高用量の薬物バックグラウンド群は内皮細胞活性に抑制作用があり、その他のＴ５４１群は内皮細胞活性に正常対照と比較して有意差がなかった。

体外培養した脳内皮細胞では、酸素欠損／酸素回復後にｔＰＡ治療を行ってコネクシンであるＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ－５とＪＡＭ－１の含有量の低下を引き起こし、異なる濃度のＴ５４１（４００、４０、４、０．４０．０４μｇ／ｍｌ）はコネクシンの発現量を異なる程度に回復することができ、その中の４０μｇ／ｍｌ Ｔ５４１はＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ－５、ＪＡＭ－１タンパク質量の低下に回復作用があった。Ｔ５４１とｔＰＡを併用すると細胞コネクシン含有量が低下し、内皮細胞の正常な細胞形態を維持するのに役立った。

Ｔ５４１は体外培養内皮細胞の酸素欠損／酸素回復（Ｈｙｐｏｘｉａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ、Ｈ／Ｒ）後のコネクシンの変化損傷を改善できた。

タンパクイムノブロット検査（図９と表１４）で示すように、体外で脳微小血管内皮細胞を培養し、酸素欠損・酸素回復とｔＰＡ損傷を経った後、細胞密着コネクシンであるＣｌａｕｄｉｎ－５、ＪＡＭ－１と接着コネクシンであるＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎの発現量が低下し、体内実験大脳皮質組織の細胞コネクシン含有量の変化と一致し、この低下した発現はＴ５４１とｔＰＡの併用により、使用する薬物により濃度依存的に改善され、その中、４０μｇ／ｍｌの濃度のＴ５４１は細胞培養で３種類のコネクシンに作用した。以上の結果から、Ｔ５４１は脳血管内皮細胞の密着と接着コネクシンを改善することにより、ｔＰＡによる脳微小血管の損傷、滲出や浮腫リスクを低減できることが示唆された。

３．７脳出血及び基底膜主要タンパク質変化
３．７．１脳組織におけるヘモグロビン含有量及び梗塞面積の変化：図１０及び表１５参照

各群のマウスの脳組織を１ｍｍの厚さの薄切りにすると、ｔＰＡ血栓溶解群のモデル側大脳皮質と実質領域に出血と梗塞が観察され、この現象はＴ５４１とｔＰＡを併用して軽減できた（図１０参照）。各群のマウスの右側半脳組織から出血状況を測定したところ、ｔＰＡ血栓溶解群のヘモグロビン含有量は有意に上昇し、Ｔ５４１高用量群は上昇したヘモグロビン含有量を下げ、偽手術群とバックグラウンド群のレベルに回復できた（図１０と表１５参照）。

３．７．２投与２４時間後の脳虚血皮質基底膜の変化：図１１と表１６参照

図１１と表１６の結果で示すように、タンパクイムノブロットは右脳皮質半影区における基底膜の主成分であるＩＶ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＶ）とラミニン（Ｌａｍｉｎｉｎ）の含有量の変化を検出し、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＶとＬａｍｉｎｉｎの発現量はｔＰＡ血栓溶解群で有意に低下し、この低下はＴ５４１とｔＰＡの併用により逆転することができた（図１１参照）。虚血４．５時間にｔＰＡ血栓溶解を投与してから２４時間後、脳血管の密着と粘着連結が低下するだけでなく、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＶとＬａｍｉｎｉｎの発現が減少し、内皮細胞と基底膜の正常構造に影響を与え、血液脳関門を破壊し、ｔＰＡによる出血リスク増加の重要な原因を引き起こす可能性が示唆された。ｔＰＡとＴ５４１を併用することでＣｏｌｌａｇｅｎ ＩＶとＬａｍｉｎｉｎの発現を維持し、血栓溶解後の出血リスクを低減することができた。

３．８投与後２４時間の脳組織エネルギー変化：図１２と表１７参照

Ｔ５４１の三つの主成分である、オウギ総サポニン、タンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニンの単成分と両成分の組み合わせ群を取り、Ｔ５４１と比較した。酵素免疫吸着実験を用いて投与後２４時間の虚血半影区の大脳皮質のＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ含有量変化を測定し、ＡＤＰ／ＡＴＰとＡＭＰ／ＡＴＰ比を計算した。投与２４時間後、ｔＰＡ血栓溶解群の脳組織ＡＴＰ含有量は有意に減少し、ＡＤＰとＡＭＰ含有量は増加し、Ｔ５４１とｔＰＡの併用は減少したＡＴＰを回復でき、増加したＡＤＰとＡＭＰを低下させた。ＡＤＰ／ＡＴＰとＡＭＰ／ＡＴＰの比はｔＰＡ血栓溶解群で増加し、前者はＴ５４１とｔＰＡの併用で逆転し、後者はｔＰＡ＋オウギ群、ｔＰＡ＋サンシチ群、両成分投与群及びｔＰＡとＴ５４１高用量の併用治療群で好転した。

３．９投与後２４時間の脳組織の酸化ストレス損傷及びアポトーシス
３．９．１投与後２４時間の脳組織におけるＭＤＡ、８－ＯＨｄＧ含有量及び線粒体複合体活性
Ｔ５４１虚血投与後２４時間の脳組織の酸化ストレス損傷を改善した。Ｔ５４１の三つの主成分である、オウギ総サポニン、タンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニンの単成分と両成分の組み合わせ群を取り、Ｔ５４１と比較した。酵素免疫吸着実験により投与後２４時間の虚血半影区の大脳皮質のＭＤＡ、８－ＯＨｄＧ含有量変化及びミトコンドリア複合体（Ｃｏｍｐｌｅｘ）Ｉ、ＩＩ、ＩＶ活性を測定した。

図１３（投与２４時間後の脳組織の酸化ストレス損傷）と表１８の結果で示すように、Ｔ５４１高用量群はｔＰＡ血栓溶解群で増加した大脳皮質半影区のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）含有量を抑制し、ｔＰＡと、オウギ、タンジン、サンシチ又はオウギ＋タンジン、オウギ＋サンシチ、タンジン＋サンシチの単独又は両成分配合との併用による効果は、いずれも三成分配合であるＴ５４１との併用によるものと比較して劣った。同様に、Ｔ５４１高用量群はｔＰＡ血栓溶解群で増加した脳虚血半影区皮質における８ヒドロキシデオキシグアノシン酸（８－ＯＨｄＧ）を有意に抑制できたが、ｔＰＡ＋オウギ＋サンシチ群が治療効果を達成できた以外、その他のｔＰＡとオウギ、タンジン、サンシチの単独又はオウギ＋タンジン、タンジン＋サンシチとの併用はいずれも明らかな効果を達成できなかった。

線粒体複合体の活性検査では、ｔＰＡ血栓溶解後２４時間の線粒体複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＶの活性が低下した。ｔＰＡ＋タンジン＋サンシチ群は血栓溶解後に低下したミトコンドリア複合体Ｉ活性を顕著に回復でき、ｔＰＡ＋オウギ＋サンシチ群はミトコンドリア複合体ＩＩ活性を回復でき、Ｔ５４１高用量組は同時にミトコンドリア複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＶ活性を回復できた。また、Ｔ５４１高用量群はミトコンドリア複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＶ活性を偽手術群レベルまで回復することができ、これは単成分と両成分配合群では達成できなかった効果である。

この実験結果は、Ｔ５４１中の異なる成分が異なる作用を発揮し、特に線粒体複合体活性改善の面で各成分がそれぞれの役割を果たしたことが示唆された。さらに面白いことは、オウギ総サポニン、タンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニンの単味薬を単独で使用しても有意差がなく、Ｔ５４１に配合して使用すると脳組織におけるＭＤＡの増加を減らし、ミトコンドリア複合体Ｉ、ＩＶの活性を回復する作用を発揮できた。複数の薬物を配合して使用した場合、単純に加算した結果だけでなく、相乗効果が生じたことを示した。

３．９．２投与２４時間後の脳組織ＡＴＰ５Ｄ含有量の変化：図１４と表１９を参照

図１４及び表１９の結果から、Ｔ５４１の投与を再開してから２４時間後に脳組織におけるＡＴＰ５Ｄ発現量が低下したことが分かった。

まとめると、マウス右頚総動脈血栓形成４．５時間、ｔＰＡ血栓溶解後２４時間、マウス虚血半影区大脳皮質組織ではミトコンドリア複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＶ活性が低下しただけでなく、ＡＴＰ５Ｄの発現量も低下した。細胞がエネルギー不足になると細胞骨格Ｆ－ａｃｔｉｎが構造を失い、配列が乱れ、内皮細胞間の密着と基底膜との密着コネクシンの断裂、分解を引き起こし、血管周囲の滲出、浮腫を形成した。Ｔ５４１はミトコンドリア複合体Ｉ／ＩＩ／ＩＶの活性低下を抑制できただけでなく、ＡＴＰ５Ｄの低発現を逆転し、ミトコンドリア複合体の回復を加速し、酸化ストレス損傷を改善した。ミトコンドリア機能回復はｔＰＡ投与２４時間後のＡＤＰ／ＡＴＰ、ＡＭＰ／ＡＴＰの増加をさらに低下させ、血管末端のエネルギー供給を改善し、正常な血液脳関門を維持した。

３．９．３投与２４時間後の脳組織細胞アポトーシス染色：図１５と表２０参照

図１５と表２０の結果で示すように、血栓溶解投与後のモデル側大脳皮質では、ｔＰＡ血栓溶解群は有意に大量のＴＵＮＥＬ陽性細胞があり、Ｔ５４１を併用するとＴＵＮＥＬ陽性細胞数が減少し、Ｔ５４１が単純ｔＰＡ血栓溶解後の凋落細胞数を減少できたことを意味した（図１５）。透過型電子顕微鏡に類似した結果を示し、図にｔＰＡ血栓溶解群のニューロン細胞体の皺変形が見られ、細胞質における細胞器の構造が異常であり、密度が有意に増加し、核膜の凹凸が不均一であり、核内に異なる染色質が現れた。Ｔ５４１を使用すると、ニューロンはほぼ正常な細胞体密度に回復し、ミトコンドリアなどの細胞器構造が回復し、核膜が平滑になった。

３．９．４投与２４時間後の脳組織細胞アポトーシス：図１６と表２１参照

図１６及び表２１の結果から、Ｔ５４１は虚血投与後２４時間の脳組織細胞の凋落を改善することが分かった。Ｔ５４１の三つの主成分である、オウギ総サポニン、タンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニンの単成分と両成分の組み合わせ群を取り、Ｔ５４１と比較した。投与後２４時間の虚血半影区の大脳皮質のアポトーシス関連タンパク質Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２の含有量とその比の変化をタンパクイムノブロット法で検出した。ｔＰＡ血栓溶解２４時間後にマウス脳組織を抽出し、タンパク質におけるＢａｘ発現は有意に上昇した。オウギ総サポニン、タンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン、及びその両成分配合と三成分配合はＢａｘの高発現を抑制できた。

３．９．５体外培養内皮細胞の酸素欠損／酸素回復後のアポトーシス状況：図１７と表２２参照

図１７及び表２２の結果から、Ｔ５４１は体外培養内皮細胞の酸素欠損／酸素回復後細胞の凋落の程度を改善できたことがわかった。タンパクイムノブロット法は体外培養脳微小血管内皮細胞の酸素欠損／酸素回復後のＢｃｌ－２、Ｂａｘ発現とその比の変化を検出した。

体内頸動脈血栓溶解実験と体外酸素欠損／酸素回復実験は、いずれも、虚血酸素欠損４．５時間後にｔＰＡを投与し、脳内皮細胞アポトーシス関連タンパク質Ｂａｘ／Ｂｃｌ－２比が顕著に増加し、アポトーシスが増加した。この結果はＴＵＮＥＬ染色及び電子顕微鏡と一致した。Ｔ５４１の併用投与はｔＰＡによるアポトーシス現象を軽減できた。この作用はＴ５４１が細胞ミトコンドリアのエネルギー代謝の回復を促進し、血管内皮細胞コネクシンと基底膜主要タンパク質の発現を保護することと関係がある可能性がある。

Claims (10)

1. 虚血再灌流損傷を予防及び／又は治療する漢方薬組成物であって、漢方薬組成物がタンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン、オウギ総サポニンからなり、その重量比が（１～１６）：（１～１６）：（１～１６）であることを特徴とする漢方薬組成物。
2. 前記漢方薬組成物中のタンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン、オウギ総サポニンの重量比が、（４～１６）：（１～８）：（１～１６）であることを特徴とする請求項１に記載の漢方薬組成物。
3. 前記漢方薬組成物中のタンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン、オウギ総サポニンの重量比が（４～１６）：（１～４）：（１～１６）であることを特徴とする請求項２に記載の漢方薬組成物。
4. 前記漢方薬組成物中のタンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン、オウギ総サポニンの重量比が（４～８）：（１～４）：（１～１６）又は（８～１６）：（１～４）：（１～１６）であることを特徴とする請求項３に記載の漢方薬組成物。
5. 前記漢方薬組成物中のタンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン、オウギ総サポニンの重量比が（４～８）：１：（５～１６）又は（４～８）：（１～２）：（１～５）であることを特徴とする請求項４に記載の漢方薬組成物。
6. 前記漢方薬組成物がタンジンポリフェノール酸、サンシチ総サポニン、オウギ総サポニンを４：１：５の重量比でからなることを特徴とする請求項５に記載の漢方薬組成物。
7. 漢方薬組成物と薬学的に許容する担体とからなることを特徴とする請求項１～６のいずれかに記載の漢方薬組成物を含む製剤。
8. 虚血再灌流損傷を治療及び／又は予防する、又は血栓溶解を促進する医薬の製造における請求項１～６のいずれかに記載の漢方薬組成物の使用。
9. 前記虚血再灌流損傷は、脳虚血再灌流損傷、心筋虚血再灌流損傷、腎虚血再灌流損傷、下肢虚血再灌流損傷、脊髄虚血再灌流損傷、網膜虚血再灌流損傷、皮弁虚血再灌流損傷、又は血栓溶解、動脈バイパス術、経皮腔内冠脈血管形成術、心臓外科体外循環、心肺蘇生、断肢再植と臓器移植などの原因による虚血再灌流を含むが、これらに限定されないことを特徴とする請求項８に記載の使用。
10. 血栓溶解促進時に、前記薬物が請求項１～６のいずれかに記載の漢方薬組成物とｔＰＡとを１０：（５～２０）の配合比で組み合せたものであることを特徴とする請求項８に記載の使用。

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