CN108464988A

CN108464988A - 预防和治疗脑缺血再灌注损伤的药物组合物及使用方法

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Publication number: CN108464988A
Application number: CN201810641114.2A
Authority: CN
Inventors: 黄小平; 邓常清; 杨筱倩; 丁煌; 刘晓丹; 杨仁义; 唐三
Original assignee: Hunan University of Chinese Medicine
Current assignee: Hunan University of Chinese Medicine
Priority date: 2018-06-21
Filing date: 2018-06-21
Publication date: 2018-08-31

Abstract

本发明涉及医疗领域，公开了一种预防和治疗脑缺血再灌注损伤的药物组合物及使用方法。所述药物组合物包括：8.9％‑80.0％的纯度≥90％的黄芪甲苷，12.5％‑89.4％的纯度≥90％的三七总皂苷和1.7％‑40.0％的冰片。此药物组合物最佳质量配比为：23.5％的纯度≥90％的黄芪甲苷，58.8％的纯度≥90％的三七总皂苷和17.6％的冰片。药物组合物制成不同剂型使用，如片剂、胶囊剂、泡腾剂等。本发明提供的黄芪甲苷、三七总皂苷和冰片的药物组合物对大鼠脑缺血再灌注损伤具有预防和治疗作用，为脑缺血再灌注损伤的治疗提供了理论基础和治疗药物。

Description

预防和治疗脑缺血再灌注损伤的药物组合物及使用方法

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种预防和治疗脑缺血再灌注损伤的药物组合物及使用方法。

背景技术

脑缺血是严重危害人类健康的疾病，近年来中国脑缺血患病率持续增加，且具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高等特点，严重威胁着人类健康。其中缺血性脑中风是脑血管疾病的主要发病类型，发病率约占脑血管疾病中的80％。而缺血性脑中风病因主要是脑组织的血流供应不足，进而出现脑细胞代谢障碍，最终导致脑细胞不可逆的损伤和死亡。中医认为脑卒中基本病机是虚、火、气、血、风、痰，以气虚和血瘀为主，气虚血瘀为缺血性中风的主要病理机制，运用益气活血法治疗常常可以收到良好的疗效。脑组织在缺血再灌注后会发生更严重的损伤。这种损伤常由Ca²⁺超载、脑能量代谢紊乱、氧自由基损伤、炎症反应等一系列变化引起，最终都将导致神经元损伤甚至细胞死亡。

黄芪和三七的主要有效成分能抑制细胞缺氧性损伤后的细胞凋亡，且有效成分配伍后作用增强。药物化学研究表明，黄芪总苷(Astragalosides，AST)是黄芪中具有心脑血管药理作用的主要药效组分，主要含黄芪甲苷(AST IV)；三七总皂苷(Panax notoginsengsaponins，PNS)是三七中具有心脑血管药理作用的主要药效组分，主要含人参皂苷R_b1、R_g1和三七皂苷R₁等。目前对AST和PNS两类有效组分配伍的心脑血管效应研究已有相关报道。

专利授权号为CN 1919238 B，公开了一种由35.0％-75％黄芪皂苷提取物，15.0％-55.0％丹参提取物，2.5％-15.0％三七叶苷提取物，2.5％-15.0％天然冰片或降香油组成的药物组合物，该药物具有明显的抗脑缺血、心肌缺血作用，其疗效优于单独使用丹参提取物或三七叶苷提取物，为临床提供了一种疗效更好、更加方便的中药组合物及其制剂。本发明提供的药物组合物包括黄芪甲苷、三七总皂苷、冰片，能够有效地预防和治疗缺血再灌注的损伤。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中缺少有效预防和治疗缺血再灌注损伤的药物的问题，提供一种由黄芪甲苷、三七总皂苷、冰片配伍而成的药物组合物，该药物组合物具有组分少，用量小，效果佳，无副作用的优点。

为了实现上述目的，本发明提供一种预防和治疗缺血再灌注损伤的药物组合物，包括如下组分：

本发明的药物组合物，包括如下组分：

所述药物组合物可以制成多种剂型如片剂，胶囊剂或泡腾片等使用。

通过上述技术方案，可以获得下列有益效果：

黄芪甲苷、三七总皂苷和冰片的组合物对脑缺血再灌注损伤具有预防和治疗作用，且黄芪甲苷、三七总皂苷和冰片配伍有明显的协同作用，可以增加其作用效果。本发明的药物组合物成分少，用量少，使用方便，为临床提供了更加方便、更加有效、质量更加可控的现代中药药物组合物，为患者带来便益，从而产生巨大的社会效益。

附图说明

图1是伊文思蓝标准曲线图

图2是TTC染色的各组脑组织梗死面积图。

图3是各组大脑皮质区病理形态学图谱。

图4是各组神经功能评分比较图

图5是各组大脑皮质区病理图谱(HE，×400)

图6是各组神经细胞损伤率比较图

图7是各组大脑海马区Nestin染色图(免疫组化法，×400)

图8是各组大脑海马区NeuN染色图(免疫组化法，×400)

图9是各组Nestin和NeuN表达的比较图

附图标记说明

a-假手术组 b-模型组

c-均匀设计实验第一组 d-均匀设计实验第二组

e-均匀设计实验第三组 f-均匀设计实验第四组

g-均匀设计实验第五组 h-均匀设计实验第六组

1-红色 2-苍白色

A-假手术组 B-模型组

C-单用冰片组 D-单用AST IV组

E-单用PNS组 F-AST IV+PNS配伍组

G-三种药物配伍低剂量组 H-三种药物配伍高剂量组

I-依达拉奉组

与假手术组比较^#P＜0.05，^##P＜0.01

与模型组比较^●P＜0.05，^●●P＜0.01

与AST IV+PNS组比较^△P＜0.05，^△△P＜0.01

与三种药物低剂量组比较^★P＜0.05，^★★P＜0.01。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围，这些范围应当理解为包含接近这些范围的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明所示百分数无特殊标明均为质量百分数。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例中描述到的各种材料和试剂的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明材料试剂来源的限制。事实上，所用到的材料试剂的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例1

1实验材料

1.1实验动物

SPF级雄性SD大鼠，体质量为200g-250g，合格证号：SCXK(湘)2016-0002，购买于湖南斯莱克景达实验动物技术有限公司，饲养于湖南中医药大学动物实验中心(场地许可证号：SKY(湘)2013-0005)。实验前适应性喂养饲养5-7d，给药前禁食12h，自由饮水。

1.2实验试剂及药品

冰片购自本校附属医院药剂科；黄芪甲苷(AST IV)，购于成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98％，批号为MUST-15032010；三七总皂苷(PNS)，购于成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98％，批号为MUST-14122912；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium hloride，TTC)，购于美国Sigma公司，批号为T8877-5G；水合氯醛购买于梯希爱化成工业发展有限公司，批号为8MQ20-CC；伊文思蓝(EB)购买于美国Sigma公司，批号为314-13-6；4％多聚甲醛组织固定液，购买于biosharp公司；磷酸缓冲液购买于北京Solarbio科技有限公司，批号为P1010；羧甲基纤维素钠购买于南京森贝伽生物科技有限公司。二甲基甲酰胺购买于天津市恒兴化学试剂制造有限公司。本实验所用水为超纯水。

1.3实验仪器

单极微手术电凝器购买于武汉春光仪器有限公司；电子天平购买于日本岛津SHIMADZU公司；Milli-Q型超纯水器购买于美国Milli-Q公司，型号为Millli-Q AdvantageA10；超低温冰箱购买于美国Thermo公司，型号为902-ULTS。

2实验方法

2.1药物剂量、配备、分组与给药

根据《中国药典》记载，成人每天冰片用量为0.15-0.3g，文献报道在大鼠脑缺血模型，冰片剂量在3-160mg/kg范围内具有抗脑缺血作用，大鼠的等效剂量为15-30mg/kg，故以30mg/kg为本实验的冰片常用剂量。根据前期研究，AST IV在大鼠以40mg/kg剂量单独应用及与PNS配伍时具有抗脑缺血再灌注损伤的作用，故以40mg/kg为本实验AST IV的常用剂量；PNS在大鼠以100-120mg/kg单用及与AST IV配伍时，具有抗脑缺血作用，故以100mg/kg为本实验PNS的常用剂量。以常用剂量为中点，采用基线等比设计方法，每个药物设计6个剂量水平，药物剂量以50％递增或递减(见表1)。

表1冰片、AST IV和PNS配伍剂量水平(mg/kg)

根据均匀设计实验方案，采用U6*(6⁴)均匀设计实验，根据表1设定的6个剂量水平，得到三种药物6个不同的实验方案，见表2。

表2根据均匀设计实验的6个配伍实验组(mg/kg)

表3根据均匀设计实验的6个配伍实验组组分百分比

另设模型组、假手术对照组，共计8组。取上述大鼠，灌胃给药3天，于第3天给药后2h制作局灶性脑缺血(MCAO)模型。缺血2h后进行再灌注，再灌注期间同前给药，两次给药间隔时间12h。于再灌注24h后进行检测。

2.2大鼠MCAO模型

采用改良Longa法制作MCAO模型。用10％水合氯醛按给药量0.35g/kg腹腔注射麻醉。于颈前正中位置备皮、消毒，切开3cm左右切口，钝性分离右侧颈总动脉(CommonCarotid Arteries，CCA)、颈外动脉(External Carotid Artery，ECA)、颈内动脉(InternalCarotid Artery，ICA)，用5-0手术线分别结扎ECA的远心端并于结扎点近侧凝断ECA及其分支，并对ICA远心侧部进行活结结扎；予动脉夹夹闭ICA远侧部与CCA，以直径0.28mm的尼龙线线栓自ECA经CCA与ICA分叉部插入ICA，松开ICA上的动脉夹，并将线栓插入ICA颅内段，插入长度约为(18±2)mm，到达大脑中动脉环，扎住ICA内的线栓以防止出血和线栓的移动。逐层缝合颈部皮肤。阻断2h后，拔出线栓进行再灌注。假手术组仅将CCA，ECA，ICA游离出来，不做结扎、插线处理，其他操作同模型组一致。

2.3神经功能学评分标准

大鼠再灌注24h后，取材前按Longa法对动物进行神经功能评分，标准如下表：

表4神经功能评分标准

0分	实验动物正常，未观察到神经功能缺失症状；
		1分	实验动物不能完全伸展脑缺血对侧前爪(轻度)
2分	实验动物向脑缺血对侧转圈(中度)
		3分	实验动物爬行时向脑缺血对侧倾倒(重度)
4分	实验动物不能自发行走，意识丧失

2.4 TTC染色

于再灌注24h后，于大鼠麻醉后腹主动脉取血，死亡后迅速断颈取脑。置于-20℃冰箱冰冻15min，去除小脑、脑干等，沿冠状面将脑组织连续切5片切片，每片厚2mm，立即将切片放入2％TTC磷酸缓冲液中，置于37℃恒温水浴箱避光染色20min，每5min将脑片轻轻翻动1次。染色成功后将其取出置于4％多聚甲醛溶液中固定。24h后拍照用SONY数码相机将每片脑组织拍照。正常脑组织染色为玫瑰红色，梗死灶为苍白色。

2.5脑梗死体积及脑水肿率计算

经Image-pro plus 6.0图像分析软件测量梗死面积。根据公式V＝t(A₁+A₂……+A_n)算出梗死体积，再进一步计算梗死体积占全脑体积的百分比。其中t为切片厚度，A为梗死面积。计算出梗死体积和总体积后，计算脑水肿率S＝(∑LT-∑RT)/(∑LT+∑RT)×100％，∑LT代表大脑左侧半球总体积，∑RT代表大脑右侧半球总体积。两侧大脑体积也由TTC染色结果可得。

2.6苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色

再灌注24h后，大鼠断头处死迅速取脑，放入4％多聚甲醛中固定2-3天，视交叉平面冠状切脑组织后，经梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切成4μm的切片，用于HE染色。HE染色切片在显微镜(10×40)下随机取缺血侧皮质区的5个非重叠的视野对损伤细胞进行观察，损伤细胞表现为空泡样变性、嗜酸性样变性、核固缩、核溶解等改变。分别计数每个高倍视野中的细胞总数及损伤细胞数，计算细胞损伤率＝(损伤细胞数/细胞总数)×100％。取5个视野的平均值代表该样本的细胞损伤率。

2.7 EB法检测血脑屏障通透性

2.7.1 EB标准曲线测定

取EB 4mg溶于25mL生理盐水中，取0.3mL加入5.7mL二甲基甲酰胺溶液中，混匀作为第1管，从第1管中取3mL加入3mL二甲基甲酰胺溶液中混匀作为第2管，再从第2管中取3mL加入3mL二甲基甲酰胺溶液中混匀作为第3管，以此类推共做7管，其浓度分别为8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL，于60℃避光水浴24h，于酶标仪上设测定波长为632nm进行比色，超纯水作为空白对照，制作出标准曲线。纵坐标为吸光度/光密度值，横坐标为浓度，求得线性回归方程Y＝1.5475X+0.0105(R²＝0.9964)(图1)。

2.7.2脑组织中EB含量测定

以EB作为示踪剂检测血脑屏障通透性。于动物取材前30min用10％水合氯醛麻醉大鼠，经股静脉注入2％EB生理盐水溶液(2mL/kg)，可见注入后大鼠四肢末端很快变蓝。30min后，经腹主动脉取血至大鼠死亡，立即断颈取脑，滤纸吸干大脑表面水分，小心剥取两侧大脑半球，放入试管，分别置于标记好的装有4mL二甲基甲酰胺的离心管中，加盖后置于60℃水浴箱中避光孵育24h，让组织中的EB充分溶解在二甲基甲酰胺溶液中。24h后取出离心管以3000r/min的转数在离心机中离心15min，取200μL上清液，酶标仪在测定波长为632nm的条件下测定其吸光度。根据EB溶液标准曲线，计算EB渗出量(μg/g)。

3结果分析

本发明采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。均匀设计实验的二次回归分析，首先对各个效应指标数据进行多重线性回归分析方法分析，再将各效应指标赋予不同权重，计算其综合效应，同样采用均匀设计实验多重线性回归分析方法分析，明确三种药物配伍抗脑缺血的最佳配伍。

表5三种药物配伍对脑缺血再灌注后相应指标的影响

注：与假手术组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，●P＜0.05，●●P＜0.01

回归方程中设定X₁为冰片，X₂为AST IV，X₃为PNS，Y为各组所得数据。

3.1以脑梗死体积数据做回归分析

如图2所示，假手术组脑组织TTC染色呈均匀红色，未见有苍白梗死区域。模型组出现较大范围的苍白梗死灶，表明脑梗死模型建立成功。与模型组比较，各用药组的脑梗死面积不同程度缩小。将实验药物配比方案及其对应的实验结果输入SPSS软件，对其进行多重线性回归分析，结果得回归方程为Y＝18.039+0.21X₁+0.117X₂+0.044X₃，由于实验中，需要求Y值越小越好，故冰片、AST IV、PNS均应取实验范围内的最小值，即冰片7.5mg/kg，AST IV10mg/kg，PNS 25mg/kg。

3.2以脑水肿率数据做回归分析

与假手术组比较，模型组大鼠脑水肿明显，以右侧损伤大脑水肿明显。与模型组比较，各给药组大鼠脑水肿程度有所减轻。将实验药物配比方案及其对应的实验结果输入SPSS软件，对其进行多重线性回归分析，结果得回归方程为Y＝4.819+0.29X₁+0.45X₂+0.3X₃，由于实验中，需要求Y值越小越好，故冰片、AST IV、PNS均应取实验范围内的最小值，即冰片7.5mg/kg，AST IV 10mg/kg，PNS 25mg/kg。

3.3以HE染色后计算细胞损伤率数据做回归分析

如图3所示，显微镜下可见，假手术组大脑皮质区细胞结构完整，形态规则，神经纤维密集，排列紧密。模型组脑组织细胞周围间隙增大，胞核不规整，间质水肿明显，排列紊乱，细胞核深染固缩或出现嗜酸性样变性，损伤细胞增多，细胞损伤率显著高于假手术组(P＜0.01)。与模型组比较，给药后大鼠细胞间隙增大有所减轻，核固缩与嗜酸性样变性细胞减少，部分给药组细胞损伤程度减轻。将实验药不同程度物配比方案及其对应的实验结果输入SPSS软件，对其进行多重线性回归分析，结果得回归方程为Y＝84.538-0.12X₁+0.026X₂-0.038X₃，由于实验中，需要求Y值越小越好，故冰片、PNS应取实验范围内的最大值，AST IV取最小值，即冰片120mg/kg，AST IV 10mg/kg，PNS 400mg/kg。

3.4以伊文思蓝渗出量数据做回归分析

与假手术组相比，模型组大脑中EB渗出量明显增高。与模型组比较，部分给药组EB渗出量降低，程度不一。将实验药物配比方案及其对应的实验结果输入计算机，对其进行多重线性回归分析，结果得回归方程为Y＝0.72+0.02X₁+0.01X₂，由于实验中，需要求Y值越小越好，故冰片、AST IV、PNS均应取实验范围内的最小值，即冰片7.5mg/kg，AST IV 10mg/kg，PNS 25mg/kg。

3.5以神经功能缺失评分数据做回归分析

假手术组大鼠神经行为功能正常，行为学评分为0分。模型组大鼠出现了对侧前爪不能完全伸展，或向对侧转圈或者倾倒的神经功能障碍，其神经功能缺失评分显著高于假手术组(P＜0.01)。与模型组比较，各药物剂量组神经功能缺失评分均有降低(P＜0.01)。将实验药物配比方案及其对应的实验结果输入SPSS软件，对其进行多重线性回归分析，结果得回归方程为Y＝2.072+0.002X₂，由于实验中，需要求Y值越小越好，故冰片、AST IV、PNS均应取实验范围内的最小值，即冰片7.5mg/kg，AST IV 10mg/kg，PNS25mg/kg。

3.6各指标综合加权评分回归分析

在五个指标单独分析的基础上进行综合分析，即对每个指标赋予不同的权重，总权重为1，予神经功能评分权重0.1，脑梗死体积权重0.3，细胞损伤率权重0.3，脑水肿率0.15，伊文思蓝含量0.15，计算权重总分再进行分析。将实验药物配比方案及其对应的实验结果输入计算机，对其进行多重线性回归分析，结果得回归方程为Y＝4.446+0.007X₂+0.000005X₃，由于实验中，需要求Y值越小越好，故冰片、AST IV、PNS均应取实验范围内的最小值，即冰片7.5mg/kg，AST IV 10mg/kg，PNS 25mg/kg。

4结论

由各实验指标数据分析所得结果，根据均匀设计实验原理，通过多重线性回归所得方程式，可知在所有检测指标中有四个得出相同结论，且综合考虑权重后所得结果也为可得冰片、AST IV、PNS均应取实验范围内的最小值，即冰片7.5mg/kg，AST IV 10mg/kg，PNS25mg/kg。以此药物组合物配伍比例为本实验的实验剂量。

实施例2

1材料

1.1试剂

冰片购自本校附属医院药剂科；AST IV购于成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98％，批号为MUST-15032010；PNS购于成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98％，批号为MUST-14122912；冰片、AST IV、PNS用时以实施例1确定的药物组合物比例用0.5％羧甲基纤维素钠配置成相应浓度混悬液。水合氯醛购于梯希爱化成工业发展有限公司，批号为8MQ20-CC；通用二步发检测试剂盒(小鼠/兔增强聚合物法检测系统)购于中杉金桥公司，批号为PV9000；DAB购于中杉金桥公司，批号为ZLI9018；Anti-NeuN抗体购于武汉博士德生物，批号为BM4354；Anti-Nestin抗体购于武汉博士德生物，批号为BA1289。

1.2动物

SPF级雄性SD大鼠，体质量为200-250g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号为SCXK(湘)2016-0002。饲养于湖南中医药大学动物实验中心，场地许可证号为SKY(湘)2013-0005。实验前适应性喂养饲养5-7d，给药前禁食12h，自由饮水。

2方法

2.1大鼠MCAO模型制作

方法同实施例1。

2.2给药、取材

45只SD大鼠，实验前适应性喂养2天。根据实施例1实验结果，我们按照三种药物最佳配伍进行实验设计，将动物分为：假手术组、模型组、单用冰片组(冰片7.5mg/kg)、单用AST IV组(AST IV 10mg/kg)、单用PNS组(PNS 25mg/kg)、AST IV+PNS配伍组(AST IV 10mg/kg+PNS 25mg/kg)、冰片+AST IV+PNS配伍低剂量组(冰片7.5mg/kg+AST IV 10mg/kg+PNS25mg/kg)、冰片+AST IV+PNS配伍高剂量组(冰片15mg/kg+AST IV 20mg/kg+PNS 50mg/kg)、阳性药物组(依达拉奉4mg/kg)，每组6只大鼠。各中药组于造模前2天开始灌胃，每天两次间隔12h。依达拉奉阳性药物进行腹腔注射，每天一次。于给药第3天灌胃后2h进行缺血2h后再灌注，术后继续给药。再灌后72h放尽大鼠血液，取脑组织，于视交叉点平面冠状切开脑组织，迅速置于4％多聚甲醛溶液固定。大鼠脑缺血再灌注模型制作前12h禁食、禁水。

2.3神经功能学评分

方法同实施例1。

2.4 HE染色

方法同实施例1。

2.5免疫组织化学染色

(1)包埋好的蜡块于切片机上进行切片，切片厚度4μm，黏附在防脱玻片上，在56℃的温度下烤片2小时；

(2)脱蜡和水化

石蜡切片于二甲苯Ⅰ溶液中浸泡15min；去除多余的液体后，于二甲苯Ⅱ溶液中浸泡15min；去除多余的液体后，于无水乙醇中浸泡3分钟；去除多余的液体后，于95％乙醇中浸泡3分钟；去除多余的液体后，于95％乙醇中浸泡3分钟；去除多余的液体后，于75％乙醇中浸泡3分钟；蒸馏水冲洗1次。

(3)将上述样品置于3％过氧化氢中浸泡8min，先用蒸馏水冲洗1次，再用PBS冲洗2次，每次2min。

(4)抗原修复1次：把切片浸泡在PBS中，微波炉加热沸腾即可。

(5)隔水冷却至常温，PBS冲洗2次，每次2min。

(6)湿盒中进行Anti-Nestin多克隆抗体(1：500)，Anti-NeuN单克隆抗体(1：500)孵育，实验条件：室温2h或37℃1-2h。

(7)PBS冲洗3次，每次2min。

(8)使用二抗试剂盒：滴加试剂1，室温20min后用PBS冲洗3次，每次2min；滴加试剂2，室温30min后用PBS冲洗3次，每次2min。

(9)加DAB显色，显微镜下观察显色结果，自来水终止反应。

(10)苏木素复染3min后水洗。

(11)样本用盐酸乙醇分色，在自来水中促蓝。

(12)脱水：于75％乙醇中浸泡2分钟；去除多余的液体后，于85％乙醇中浸泡2分钟；去除多余的液体后，于95％乙醇中浸泡2分钟；去除多余的液体后，于无水乙醇中浸泡2分钟。

(13)透明：二甲苯中浸泡5min，中性树胶封片，在常温下保存。

(14)阅片：细胞内有棕色颗粒表达的细胞为阳性细胞，其中，Nestin主要在胞浆内表达，NeuN抗原主要在神经元胞核和胞浆表达。

2.5图像分析

每只大鼠的切片在显微镜(10×40)下，随机选取5个连续视野，分别计算皮质区每个视野下HE染色后的细胞损伤率，免疫组织化学染色切片统计计算海马区每个视野下阳性表达细胞，以阳性表达细胞数/细胞总数计算细胞阳性表达率(％)。

2.6统计分析

数据采用SPSS20.0统计软件进行统计分析，实验数据用表示。各组计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐者用LSD检验，方差不齐者用DunnetT3检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3.结果讨论

3.1对神经功能学评分的影响

于再灌注72h取材前进行神经功能评分。假手术组大鼠神经行为功能正常，行为学评分为0分；模型组大鼠出现了对侧(即左侧)前爪不能完全伸展，或向对侧转圈或者倾倒的神经功能障碍，其神经功能评分与假手术组比较显著升高(P＜0.01)。

如图4所示，与模型组比较，AST IV+PNS组、三种药物配伍高、低剂量组、依达拉奉组神经功能评分显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)，各药物单用组神经功能评分无显著降低(P＞0.05)。AST IV+PNS组降低神经功能评分的效应显著高于单用AST IV组和单用PNS组(P＜0.01)，三种药物配伍低剂量组降低神经功能评分的效应显著高于单用冰片、单用AST IV组和单用PNS组(P＜0.01)。三种药物高剂量配伍组与低剂量配伍组比较，神经功能评分差异无统计学意义(P＞0.05)。

3.2对脑组织形态学的影响

如图5所示，假手术组大鼠大脑皮质区脑组织细胞结构完整，形态规则，连接紧密，核仁清晰可见，神经纤维密集，排列紧密，偶见细胞损伤改变。模型组大鼠脑缺血后脑组织细胞周围间隙增大，胞核不规整，间质水肿明显，排列紊乱，细胞核深染固缩或出现嗜酸性样变性，损伤细胞增多。与假手术组比较，模型组细胞损伤率显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

如图6所示，与模型组比较，各给药组细胞损伤程度减轻，损伤率下降(P＜0.01)。其中，AST IV+PNS组减轻细胞损伤的效应显著高于单用AST IV组和单用PNS组(P＜0.05或P＜0.01)，三种药物配伍低剂量组减轻细胞损伤的效应显著优于各药物单用组及AST IV+PNS组(P＜0.05或P＜0.01)。三种药物配伍高剂量组与低剂量组比较，细胞损伤差异率差异无统计学意义(P＞0.05)。

3.3 Nestin免疫组化染色

如图7所示，观察脑组织海马CA2/CA3区，假手术组Nestin阳性细胞表达较少，阳性细胞呈椭圆形，胞浆着色。脑缺血再灌注后，Nestin阳性细胞表达明显增多。如图9所示，脑缺血再灌注后与假手术组比较，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，AST IV+PNS组、三种药物配伍高、低剂量组及依达拉奉组Nestin阳性细胞进一步增多(P＜0.01)，单用AST IV组、单用PNS组及单用冰片组Nestin阳性细胞增加不明显(P＞0.05)。且AST IV+PNS组Nestin阳性细胞增多的效应显著强于单用AST IV组与单用PNS组(P＜0.01)，三种药物配伍低剂量组的效应显著强于单用冰片、单用AST IV、单用PNS组及AST IV+PNS组(P＜0.05，P＜0.01)。三种药物配伍高剂量组与配伍低剂量组比较，Nestin阳性细胞差异无统计学意义(P＞0.05)。

3.4 NeuN免疫组化染色

如图8所示，观察脑组织的海马区，假手术组的NeuN免疫阳性细胞较多，阳性细胞多呈圆形或椭圆形，胞浆着色较明显。脑缺血后再灌注后可见阳性细胞表达显著减少，如图9所示，脑缺血后再灌注后与假手术组比较，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组相比，AST IV+PNS组、三种药物配伍高、低剂量组及依达拉奉组NeuN阳性细胞表达率显著增高(P＜0.01)，单用AST IV组、单用PNS组及单用冰片组NeuN阳性细胞无显著增加(P＞0.05)。AST IV+PNS组与单用AST IV组比较，NeuN阳性细胞增多显著(P＜0.01)；三种药物配伍低剂量组与单用AST IV组、单用冰片组比较，NeuN阳性细胞表达增多显著(P＜0.01)，与AST IV+PNS组及单用PNS组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。三种药物高剂量组与低剂量配伍组比较，NeuN阳性细胞表达差异不明显(P＞0.05)。

3.5讨论

本研究结果显示，脑缺血再灌注后，大鼠神经功能障碍明显，神经功能学评分显著增高，细胞存活率显著下降。与模型组比较，AST IV+PNS组、三种药物配伍高、低剂量组的神经功能学评分显著降低，且药物合用组降低神经功能评分的效应均显著高于各药物单用组，表明AST IV与PNS配伍或冰片与AST IV、PNS配伍均能较好地改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能障碍。各药物组神经细胞存活率显著增加，且AST IV+PNS组、三种药物低剂量配伍的效应均显著高于各药物单用组，三种药物配伍低剂量组效应显著高于AST IV+PNS组，表明冰片配伍AST IV和PNS相比AST IV与PNS配伍能更好地减轻脑缺血再灌注后神经细胞的损伤，从而更好地发挥对脑神经细胞的保护作用。

本研究中，脑缺血再灌注后，海马区Nestin阳性细胞表达显著增多，说明缺血再灌注促进了神经细胞的增殖与修复，与上述文献报道一致。AST IV+PNS组、三种药物配伍高、低剂量组海马区Nestin表达都有所增加，且AST IV+PNS配伍组相较于AST IV、PNS单用组的作用更明显，三种药物配伍低剂量组较三种药物单用组及AST IV+PNS配伍组的作用更明显。提示冰片配伍AST IV、PNS具有促进脑缺血再灌注后神经细胞的增殖与修复作用，且其效果强于AST IV与PNS合用。

本研究结果显示，脑缺血2h再灌注72h后，大鼠海马区的NeuN表达显著减少，说明缺血再灌注抑制了神经细胞分化，导致成熟的神经细胞减少。AST IV+PNS组与三种药物配伍高、低剂量组能显著增加NeuN的表达，与单用AST IV组、单用冰片组比较差异显著，与单用PNS组及AST IV+PNS比较，变化不明显。表明AST IV与PNS合用或者冰片与AST IV、PNS合用，均能促进神经元的分化与成熟；但三种药物配伍组与AST IV+PNS配伍组比较差异不明显，说明冰片与AST IV、PNS配伍后，可能更多地促进了AST IV+PNS对神经细胞的增殖作用，而不能十分有效地促进神经细胞的成熟。神经细胞的分化、迁移、成熟还受到很多因素限制，各种神经因子、细胞因子、细胞内的微环境都会对其产生影响，是否是因为三种药物合用不能十分有效地促进对细胞微环境的改善，从而增加神经细胞的分化、成熟，还需要进一步验证。

4.结论

此部分实验结果表明，脑缺血2h再灌注72h后，神经细胞出现损伤和功能障碍，缺血区神经细胞增殖、修复活动增强。AST IV和PNS配伍或者冰片与AST IV、PNS配伍均能减轻缺血再灌注后神经细胞的损伤和功能障碍，促进细胞的增殖，增加神经细胞的成熟，且在抗神经细胞损伤和促神经细胞增殖与修复作用方面，冰片配伍AST IV、PNS与AST IV和PNS配伍相比较，作用更加显著。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种预防和治疗脑缺血再灌注损伤的药物组合物，其特征在于，包括如下组分：

2.根据权利要求1所述的预防和治疗脑缺血再灌注损伤的药物组合物，其特征在于，包括如下组分：

3.根据权利要求2所述的预防和治疗脑缺血再灌注损伤的药物组合物，其特征在于，包括如下组分：

4.一种预防和治疗脑缺血再灌注损伤的药物组合物的使用方法，其特征在于，将权利要求1-3任一项所述的药物组合物制成片剂使用。

5.一种预防和治疗脑缺血再灌注损伤的药物组合物的使用方法，其特征在于，将权利要求1-3任一项所述的药物组合物制成胶囊剂使用。

6.一种预防和治疗脑缺血再灌注损伤的药物组合物的使用方法，其特征在于，将权利要求1-3任一项所述的药物组合物制成泡腾剂使用。