CN106334055A - 一种治疗脑缺血再灌注损伤的中药组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种治疗脑缺血再灌注损伤的中药组合物及其应用，所述的中药组合物由下列重量份的原料药制成：生蒲黄7‑10份、通天草8‑10份、水蛭2‑4份、葛根7‑10份、石菖蒲7‑10份、海藻8‑10份。本发明的中药组合物诸药合用，祛痰化瘀，疏通脉道，痰瘀同治，则痰化血行，血行痰清，气血流通，以达到清除病理产物，疏通脑络，恢复肢体功能的作用，对痰瘀交阻型效果尤为显著。动物试验和临床试验均表明其疗效确切。此外，本发明的中药组合物药味数少，无毒副作用，因此适于普遍推广应用。

Description

一种治疗脑缺血再灌注损伤的中药组合物及其应用

技术领域

本发明涉及中药组合物技术领域，具体地说，涉及一种治疗脑缺血再灌注损伤的中药组合物及其应用。

背景技术

中风，中医病名，有外风和内风之分，外风因感受外邪(风邪)所致，在《伤寒论》名曰中风(亦称桂枝汤证)；内风属内伤病证，又称脑卒中，卒中等。现代一般称中风，多指内伤病证的类中风，多因气血逆乱、脑脉痹阻或血溢于脑所致，以突然昏仆、半身不遂、肢体麻木、舌蹇不语，口舌歪斜、偏身麻木等为主要表现的脑神疾病，并具有起病急、变化快，如风邪善行数变之特点的疾病。

脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia reperfusion injury)是指脑缺血致脑细胞损伤，恢复血液再灌注后，其缺血性损伤反而进一步加重的现象。

有关中风的记载，始见于《内经》，如《灵枢·刺节真邪篇》云：“虚邪偏客于身半，其入深，内居营卫，营卫稍衰，则真气去，邪气独留，发为偏枯”，东汉张仲景在《金匮要略·中风历节病》也有论述：“寸口脉浮而紧，紧则为寒，浮则为虚，寒虚相搏，邪在皮肤；浮者血虚，络脉空虚；贼邪不泻，或左或右；邪气反缓，正气即急，正气引邪，僻不遂。邪在于络，肌肤不仁；邪在于经，即重不胜；邪入于腑，即不识人；邪入于脏，舌即难言，口吐涎”。

此后对中风的发病原因认识逐步深入，唐宋以前，主张“外风”学说，多以“内虚邪中”立论，《诸病源候论·中风候》曰：“三阳之筋，并络于颌颊，夹于口，诸阳为风寒所客则筋急，故口噤不开也”，“血气偏虚，为风所乘故也”，治疗以祛除外风为主，代表方剂为小续命汤。

唐宋之后，主张“内风”学说，则以“内生之风”为据，如刘河间主“心火暴盛”，《素问玄机原病式·六气为病》曰：“或心火暴盛而肾水衰弱，不能制之，热气怫郁，心神昏冒，则筋骨不用，卒倒而无所知”；李东垣主“正气自虚”，《医学发明》曰：“中风者，非外来风邪，乃本气自病也”；朱丹溪主“湿热生痰”，《丹溪心法》曰：“东南之人，多是湿土生痰，痰生热，热生风也”；张景岳主“内伤积损”，《景岳全书》曰：“本皆内伤积损颓败而然，原非外感风寒所致”；治疗以平熄内风为主，代表方剂为镇肝熄风汤。

晚清以来，主张“瘀血”学说，专以“瘀阻脑络”为证，王清任主“气虚血瘀”，《医林改错》曰：“元气既虚，气必不能达于血管，血管无气，必停而为瘀”；张锡纯在《医学衷中参西录》曰：“气血亏损，流通于周身者，必然迟缓，血即因之而瘀”；治疗以补气活血为主，代表方剂为补阳还五汤。

可见中风病机复杂，涉及脏腑、经络、血脉等，治疗也由外到内，从气至血，接近疾病的本质。

现代名中医颜德馨教授认为，中风是人体衰老的病理表现，人体衰老主要体现在血管衰老，而血管衰老的根源在于气血失调，气血失调导致瘀血停留于脑窍，致使诸多病理产物如风、火、痰、瘀相兼为患，从而发病。其中，正虚为本，邪实为标。他以“气血理论”为指导，治疗宗《内经》“以平为期”之训，创立了使气血复归于常的治疗大法“衡法”。针对中风的不同时期，提出了“先兆期当益气活血，发作期宜疏通脉道，恢复期重醒脑复智”的治疗方针，取得了良好的疗效。

传统观点认为，脑梗死的发生多由忧思恼怒、饮食不节、恣酒纵欲等，导致阴阳失调，脏腑气偏，气血错乱而成。

目前针对中风已有大量的中药组方，此外，针对脑缺血再灌注损伤也报道了一些中药组合物，如：中国专利文献CN 201210461219.2公开了一种用于预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的中药组合物及其制备方法，该中药组合物由下述质量份的中药材制成：益母草5-30份、水蛭1-6份、三七2-10份、川牛膝3-20份、白茅根4-30份、石菖蒲4-20份、连翘3-15份和大黄1-6份；中国专利文献CN201010027208.4，公开了一种防治心肌缺血再灌注损伤的中药组合物及其制备方法，该中药组合物是由下述重量份的原料药制备而成：黄芪15-30份、益母草12-30份、薤白6-15份、山楂12-30份、全栝楼20-45份、丹参9-18份、制半夏9-18份、葛根9-18份；中国期刊文献(复方蒲黄颗粒对大鼠脑缺血再灌注后GFAP表达的影响.同济大学学报(医学版).2008；10:45-50.)公开了由生蒲黄、水蛭、海藻、石菖蒲、通天草、葛根组成的复方蒲黄颗粒，水蛭粉每袋1.5g，其他中药颗粒每袋装15g，但未公开该组方的配伍关系。虽然用于治疗中风或脑缺血再灌注损伤的中药组方已较多，然而，寻找切中病机、疗效显著、成本低、适于推广的中药组合物仍然是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种治疗脑缺血再灌注损伤的中药组合物。

本发明的再一的目的是，提供所述的中药组合物的用途。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种治疗脑缺血再灌注损伤的中药组合物，它由下列重量份的原料药制成：生蒲黄7-10份、通天草8-10份、水蛭2-4份、葛根7-10份、石菖蒲7-10份、海藻8-10份。

优选地，所述的中药组合物由下列重量份的原料药制成：生蒲黄8-9份、通天草8-9份、水蛭2-3份、葛根8-9份、石菖蒲8-9份、海藻8-9份。

更优选地，所述的中药组合物由下列重量份的原料药制成：生蒲黄9份、通天草9份、水蛭3份、葛根9份、石菖蒲9份、海藻9份。

所述的中药组合物的剂型为汤剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂或合剂，但不仅限于此。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

如上任一所述的中药组合物在制备治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的应用。

如上任一所述的中药组合物在制备治疗中风的药物中的应用。

作为本发明的一种具体实施方式，所述的中风为缺血性中风。

如上任一所述的中药组合物在制备治疗脑梗死的药物中的应用。

本文中，生蒲黄是将原药蒲黄揉碎结块，过筛得到；海藻是马尾藻科植物羊栖菜及海蒿子的藻体。

本发明优点在于：

1、本申请发明人认为中风、脑梗死或脑缺血再灌注损伤的病机主要为瘀血阻络，脑络受损，清灵之气不能与脏气相接，故强调疏通脉道、祛瘀生新是治疗脑梗死的主要手段，并应贯穿于整个治疗过程，在此基础上得到本发明的中药组合物。本发明的中药组合物诸药合用，祛痰化瘀，疏通脉道，痰瘀同治，则痰化血行，血行痰清，气血流通，以达到清除病理产物，疏通脑络，恢复肢体功能的作用，对痰瘀交阻型效果尤为显著。动物试验和临床试验均表明其疗效确切。相比于现有技术中的复方蒲黄颗粒药物配比更加合理，疗效更显著。

2、本发明的中药组合物药味数少，原料药丰富易得，价格便宜，成本低。

3、本发明的中药组合物无毒副作用。

附图说明

图1.神经元组织形态学变化(Nissl×400)。A-A3分别为Sham组缺血2h再灌注6-72h，海马锥体细胞(图片A)3-4层排列整齐，神经元形态结构完整，细胞密度大；B-B3为I/R组缺血2h再灌注6-72h，海马锥体细胞(图片B)减少，排列散乱，皮层神经元皱缩，与周围组织脱离，胞核固缩深染，有核分裂及核溶解，具有凋亡的特征，海马CA1区细胞排列散乱，无层次感，细胞密度小，有明显的神经元丢失；C、D、E分别为PHL、PHM、PHH组缺血2h再灌注6-72h，可见少量神经元皱缩、胞核固缩深染，细胞密度较大，与模型组比较神经元损伤减轻、丢失减少。

图2.神经元凋亡(TUNEL×400)。A-A3为Sham组缺血2h再灌注6-72h，仅见少量凋亡信号；B-B3为I/R组缺血2h再灌注6-72h，缺血再灌注6h即可见较多较强的凋亡信号，缺血再灌注24-72h内凋亡信号持续增多；C、D、E分别为PHL、PHM、PHH组缺血2h再灌注6-72h，神经元凋亡信号明显减少，信号强度减弱。

图3.各组NSE的表达(免疫组化×100)。阳性为胞浆棕黄色颗粒，A-A3为Sham组缺血2h再灌注6-72h；B-B3为I/R组缺血2h再灌注6-72h；C、D、E分别为PHL、PHM、PHH组缺血2h再灌注6-72h，神经元凋亡信号明显减少，信号强度减弱。A-A3为Sham组缺血2h再灌注6-72h，仅见少量凋亡信号；B-B3为I/R组缺血2h再灌注6-72h，缺血再灌注6h即可见较多较强的凋亡信号，缺血再灌注24-72h内凋亡信号持续增多；C、D、E分别为PHL、PHM、PHH组缺血2h再灌注6-72h，神经元凋亡信号明显减少，信号强度减弱。

图4.各组GFAP的表达(免疫组化×100)。阳性染色为胞浆棕黄色颗粒，A-A3为Sham组缺血2h再灌注6-72h；B-B3为I/R组缺血2h再灌注6-72h；C、D、E分别为PHL、PHM、PHH组缺血2h再灌注6-72h。

图5.各组Caspase-3mRNA的表达(原位杂交×400)。阳性染色为胞浆或胞核棕黄色颗粒，A-A3为Sham组缺血2h再灌注6-72h；B-B3为I/R组缺血2h再灌注6-72h；C、D、E分别为PHL、PHM、PHH组缺血2h再灌注6-72h。

图6.各组HSP70mRNA的表达(原位杂交×400)。阳性染色为胞浆或胞核棕黄色颗粒，A-A3为Sham组缺血2h再灌注6-72h；B-B3为I/R组缺血2h再灌注6-72h；C、D、E分别为PHL、PHM、PHH组缺血2h再灌注6-72h。

图7.各组HSP70蛋白的表达(免疫组化×400)。阳性染色为胞浆棕黄色，A-A3为Sham组缺血2h再灌注6-72h，未见明显蛋白表达；B-B3为I/R组缺血2h再灌注6-72h，可见少量增多的阳性信号；C、D、E分别为PHL、PHM、PHH组缺血2h再灌注6-72h。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1本发明中药组合物的制备(一)

生蒲黄9份、通天草9份、水蛭3份、葛根9份、石菖蒲9份、海藻9份，常规方法煎煮。

实施例2本发明中药组合物的制备(二)

生蒲黄7份、通天草10份、水蛭2份、葛根10份、石菖蒲7份、海藻10份，常规方法煎煮。

实施例3本发明中药组合物的制备(三)

生蒲黄10份、通天草8份、水蛭4份、葛根7份、石菖蒲10份、海藻8份，常规方法煎煮。

实施例4本发明中药组合物的制备(四)

生蒲黄8份、通天草9份、水蛭2份、葛根9份、石菖蒲8份、海藻9份，常规方法煎煮。

实施例5本发明中药组合物的制备(五)

生蒲黄9份、通天草8份、水蛭3份、葛根8份、石菖蒲9份、海藻8份，常规方法煎煮。

实施例6本发明中药组合物的制备(六)

生蒲黄10份、通天草10份、水蛭2份、葛根7份、石菖蒲10份、海藻10份，常规方法煎煮。

实施例7本发明中药组合物的制备(七)

生蒲黄7份、通天草8份、水蛭4份、葛根10份、石菖蒲7份、海藻8份，常规方法煎煮。

实施例8本发明中药组合物的制备(八)

生蒲黄7份、通天草8份、水蛭2份、葛根10份、石菖蒲10份、海藻10份，常规方法煎煮。

实施例9本发明中药组合物的制备(九)

生蒲黄10份、通天草10份、水蛭4份、葛根7份、石菖蒲7份、海藻8份，常规方法煎煮。

实施例10本发明中药组合物的制备(十)

生蒲黄10份、通天草9份、水蛭3份、葛根9份、石菖蒲9份、海藻9份，常规方法煎煮。

需要说明的是，所述的常规方法煎煮即将原料药材粉碎后加水煎煮。

实施例11本发明中药组合物片剂/胶囊剂的制备

取实施例1-10任一所述的中药组合物原材料，加8-12倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁。再加10倍量水，煎煮1.5-2.5小时，滤出药汁，合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2.5倍量酒精，搅拌沉淀过夜。取上清液，浓缩至稠浸膏；加入制药辅料，真空干燥，粉碎制粒，压制成片剂或填充装胶囊。

实施例12本发明中药组合物颗粒剂的制备

取实施例1-10任一所述的中药组合物原材料，加8-10倍量水，煎煮2.5-3.5小时，滤出药汁。再加10倍量水，煎煮2小时，滤出药汁，合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2倍量酒精，搅拌沉淀过夜。取上清液，浓缩至稠浸膏；加适当制药辅料，制粒，干燥，整粒，得20g颗粒，分装10g/袋。

实施例13本发明中药组合物合剂的制备

取实施例1-10任一所述的中药组合物原材料，加8-10倍量水，煎煮3小时，滤出药汁。再加8倍量水，煎煮2小时，滤出药汁，合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2倍量酒精，搅拌沉淀过夜。取上清液，浓缩至稠浸膏；加适当制药辅料，制成合剂。

实施例14本发明中药组合物对脑缺血再灌注损伤保护作用的实验研究

1实验材料

1.1实验动物

采用健康清洁级SD大鼠75只，雄性，体重180-220克，由中国科学院上海实验动物中心提供，许可证号：SCXK(沪)2002-0010。SD大鼠在12小时照明与12小时黑暗交替，清洁条件下喂养，允许动物自由接触标准饲料和清水。

1.2实验试剂

1.2.1实验试剂

NSE单抗：英国Serotec公司；

GFAP单抗：美国Lab Vision公司；

HSP70单抗：武汉博士德生物科技公司；

辣根酶标记羊抗鼠IgG：北京鼎国生物技术公司；

Caspase-3mRNA原位杂交检测试剂盒：武汉博士德生物科技公司；

HSP70mRNA原位杂交检测试剂盒：武汉博士德生物科技公司；

TUNEL(FITC标记POD法)试剂盒：南京凯基生物工程公司；

焦油紫：美国Electron Microscopy Sciences公司；

DAB显色试剂盒：华美生物技术公司；

焦碳酸二乙酯(DEPC)：美国Sigma公司；

三苯基四唑氯化物(TTC)：上海国药集团化学试剂有限公司；

苏木素染液：上海国药集团化学试剂有限公司；

伊红Y染料：上海国药集团化学试剂有限公司；

戊巴比妥：上海国药集团化学试剂有限公司；

APES：北京鼎国生物技术公司。

1.2.2常用试剂配制方法

1mol/L氢氧化钠溶液：氢氧化钠4.0g溶于双蒸水，定容至100ml，常温保存；

1mol/L盐酸溶液：35％盐酸10ml滴入双蒸水中，定容至100ml，常温保存；

PBS(pH 7.2-7.6)：NaCl 8g，KCl 0.2g，KH₂PO₄0.24g，NaPO₄·12H₂O 0.88g溶解于500ml双蒸水中，定容至1L，1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调节pH值在7.2至7.6之间，4℃保存；

原位杂交用PBS(0.02mol/L PBS)：NaCl 8.5g，Na₂HPO₄2.8g，NaH₂PO₄0.4g溶解于500ml双蒸水中，定容至1L，室温保存备用；

4％多聚甲醛：40g多聚甲醛溶于500ml PBS中，定容到1L，存放在密闭容器中，65℃水浴中溶解，4℃保存；

20×SSC缓冲液：NaCl 175.2g，柠檬酸钠·2H₂O 88.2g溶解于800ml双蒸水中，加入数滴10mol/L NaOH调节pH值至7.0，定容至1L，室温保存备用；

0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g溶解于500ml双蒸水中，定容至1L，室温保存备用；

3％柠檬酸溶液：柠檬酸3g，溶解于100ml双蒸水中，室温保存备用；

蛋白酶K工作溶液：2μl 50×Proteinase K至98μl PBS中，临用前配制；

DAB工作液：20×DAB5μl，30％H₂O₂1μl至94μl PBS中，临用前配制；

3％戊巴比妥：戊巴比妥3g溶于100ml生理盐水中，4℃保存。

1.3实验药物

由实施例1制备的汤剂，生药含量为0.12g/ml。

1.4实验仪器

普通手术器械(上海医疗器械厂)；

恒温水浴箱(上海东联电子技术开发公司)；

NUAIRE NU-5500E恒温培养箱(美国NUAIRE公司)；

Nikon TE2000-U倒置显微镜(日本Nikon公司)；

HM325轮转式石蜡切片机(德国MICROM公司)；

TOMY SS325高压蒸汽消毒锅(日本TOMY公司)。

2实验方法

2.1动物分组与给药

75只SD大鼠随机分为5组：假手术(Sham)组、模型(I/R)组、中药大剂量(PHH)组、中药中剂量(PHM)组、中药小剂量(PHL)组，每组15只。中药大剂量组给药剂量为1.2g生药·kg^-1·d^-1，中药中剂量组给药剂量为0.6g生药·kg^-1·d^-1，中药小剂量组给药剂量为0.3g生药·kg^-1·d^-1，术前连续灌胃14天，假手术组和模型组给予等量生理盐水灌胃。

2.2局灶性脑缺血再灌注模型的建立

采用线栓法，参照Zea-Longa等(Zea-Longa E,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke,1989,20(1):84-191)的方法并改良。以3％戊巴比妥0.1ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎左颈总动脉近心端、颈外动脉远心端，颈总动脉远心端备线，颈内动脉放置微动脉夹。于颈总动脉近分叉处做切口，向颈内动脉方向插入头端蘸有石蜡的尼龙线(直径0.26mm)，以颈总动脉分叉处计算进线深度(18-20mm)，阻塞大脑中动脉起始部。2h后轻提栓线至有阻力。动物苏醒后出现手术同侧Horner征和对侧肢体运动障碍即为模型成功。假手术组仅分离颈总动脉不插线栓。

2.3神经功能缺陷评分

参考Bederson(1、Smith ML,Bendek G,Dahlgren et al.Model for studingling-term recovery following forebrain ischemia in gteh rat:A2-vessel occulusionmodel.Acta Neural Scand,1984,69(5):385；2、Shiraishi K,Simon RP.A model ofpeoximal middle cerebrat artery occlusion in rat.J Neuroscience Methods,1989,30(1):169-174)修正的方法，分别于缺血再灌注6h，24h，72h进行神经功能缺陷评分，分为6个等级，0分：无明显神经功能障碍；1分：提鼠尾，左前肢不能完全伸直；2分：左前肢阻力减小；3分：左侧旋转行走；4分：原地左旋；5分：完全性右瘫，术后1分以上者为造模成功。

2.4取材与石蜡切片的制备

各组大鼠分别于脑缺血2h再灌注6h、24h、72h后再次麻醉，打开胸腔，剪开右心室，插入针头至体主动脉，体主动脉处穿线扎牢针头，防止滑脱，剪开左心耳，迅速灌入生理盐水约500ml，将血液冲净。待生理盐水将灌完时，及时倒入含0.1％DEPC的4％多聚甲醛约1L，进行心脏灌注预固定，后断头取脑，浸入含0.1％DEPC的4％多聚甲醛溶液固定2h，以鼠脑洁白完整较硬，无肉眼可见的血管为度，以视交叉和其后4mm处两点冠状切片，片厚4mm，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切成6μm厚的连续冠状石蜡切片。

2.5 TTC染色检测脑梗死体积百分比

参考Lundy(Lundy Ef,Solik BS,Frank RS,et al.Morphometric evaluation ofbrain infarcts in rats and gerbils.J Pharmacol Methods,1986,16:201-214)方法，在造模手术后6h，24h，72h分别行TTC染色。动物处死后，迅速取脑，去除嗅脑、小脑、低位脑干，置-20℃冰箱中冷冻20min，在距额极2mm处向后连续等距离切取5个脑片，每片厚2mm，放入2％TTC染色，37℃水浴30min后，转入4％多聚甲醛中6h后观察。经染色后正常脑组织呈红色，而梗死组织呈白色。摄片，计算机图像分析(Axioplan 2Imaging)，计算梗死坏死组织体积占总体积的百分比。

2.6 Nissl染色检测神经元组织形态学变化

主要步骤为：

1.石蜡切片脱蜡至水：

(1)将石蜡组织切片置于染色缸中，二甲苯浸洗2次，每次5min；

(2)100％乙醇浸洗2次，依次用95％、85％、70％和50％乙醇各浸洗1次，每次3min，PBS浸洗5min；

2.0.5％焦油紫染色(5g焦油紫溶于100ml双蒸水)37℃30min；

3.充分水洗，95％盐酸酒精分色；

4.100％乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，高倍镜(×400)下观察。

2.7 TUNEL检测凋亡神经元

采用TUNEL(FITC标记POD法)试剂盒，检测方法参照试剂盒说明书进行。主要步骤为：

1.石蜡切片预处理：

(1)将石蜡组织切片置于染色缸中，二甲苯浸洗2次，每次5min；

(2)100％乙醇浸洗2次，依次用95％、85％、70％和50％乙醇各浸洗1次，每次3min，PBS浸洗5min；

(3)置于4％多聚甲醛溶液中固定15min，PBS浸洗2次，每次5min；

(4)将载玻片取出置于一水平表面，用滤纸吸去载玻片上的多余液体，滴加100μl新配制的蛋白酶K工作溶液覆盖在样本区域上，室温下放置15min，后PBS浸洗5min；

(5)置于4％多聚甲醛溶液中固定5min，用PBS浸洗2次，每次5min；

2.上述处理好的组织切片，用滤纸吸去载玻片上的多余液体，滴加100μl的Equilibration Buffer于样本区域上，室温平衡10min；

3.载玻片平衡时，将Biotin-11-dUTP置冰上解冻，同时配制TdT酶反应液(45μl标记缓冲液+1μl FITC-12-dUTP+4μl TDT酶)，于冰上保存待用；

4.用滤纸吸去样本区域周围的多余液体，滴加50μl的TdT酶反应液于样本区域上；

5.在反应区域盖上盖玻片以确保反应液分布均匀，于37℃湿盒内反应60min；

6.去除盖玻片，加入50μl 2×SSC溶液(10μl 20×SSC+90μl双蒸水)终止反应，室温放置15min，PBS浸洗3次，每次5min；

7.用0.3％的H₂O₂(1ml 30％H₂O₂+99ml双蒸水)浸洗5min，PBS浸洗3次，每次5min；

8.滴加100μl稀释的Streptavidin-HRP溶液(0.5μl Streptavidin-HRP+39.5μlPBS+10μl anti-fluorescein antibody)于样本区域上，室温反应3-5min；

9.PBS浸洗3次，每次5min，于载玻片的样本区域滴加100μl DAB工作液(5μl20×DAB+1μl 30％H₂O₂+94μl PBS)，直到呈现浅棕色背景；

10.充分水洗，70％、90％、100％乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，荧光显微镜下观察。

阴性对照：组织样本在蛋白酶K处理后加入100μl Dnase I反应液，室温处理15min，与余步同上；阳性对照：制备TDT酶反应液时不添加TDT酶，余步同上。荧光显微镜下(×100)观察，随机选取不重叠的5个视野，进行阳性细胞计数，取其平均值。

2.8免疫组化检测NSE、GFAP的表达

采用免疫组化试剂盒，检测方法参照说明书进行。主要步骤如下：

1.石蜡切片预处理：

(1)将石蜡组织切片置于染色缸中，二甲苯浸洗2次，每次5min；

(2)100％乙醇浸洗2次，依次用95％、85％、70％和50％乙醇各浸洗1次，每次3min，PBS浸洗5min；

(3)置于4％多聚甲醛溶液中室温固定15min，PBS浸洗2次，每次5min；

(4)3％的H₂O₂(30％H₂O₂1份+双蒸水9份)室温5min灭活内源性酶，蒸馏水洗3次；

2.抗原修复：将切片浸入0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液，高压锅内110KPa5-10min，反复2次，冷却后PBS洗涤2次，每次3min；

3.滴加5％BSA封闭液，室温20min，甩去多余液体，不洗；

4.滴加1:50稀释的一抗(小鼠IgG)4℃过夜，PBS洗3次，每次2min；

5.滴加生物素化山羊抗小鼠IgG 37℃20min，PBS洗3次，每次2min；

6.滴加试剂SABC，37℃20min，PBS洗4次，每次洗5min；

7.DAB显色：DAB工作液(1ml双蒸水加显色剂A、B、C各一滴，混匀)，加至标本上，5-30min直至背景出现，蒸馏水洗2次；

8.苏木素轻度复染，充分水洗，70％、90％、100％乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察；

9.光镜下观察，神经元细胞浆出现棕黄色颗粒者为阳性细胞(NSE)，星形胶质细胞胞浆出现棕黄色颗粒者为阳性细胞(GFAP)，取部分切片不加I抗，以0.1M PBS代替，不出现阳性细胞，说明I抗特异性强；

10.图像分析采用Axioplan 2Imaging显微图象分析系统(ZEISS，德国)免疫组化染色结果进行图像分析，每张切片随机选择不重叠6个视野进行阳性率分析，通过染色强弱对比进行相对评价。

2.9原位杂交检测Caspase-3mRNA、HSP70mRNA的表达

采原位杂交试剂盒，检测方法参照试剂盒说明书进行。主要步骤如下：

1.石蜡切片预处理：

(1)将石蜡组织切片置于染色缸中，二甲苯浸洗2次，每次5min；

(2)100％乙醇浸洗2次，依次用95％、85％、70％和50％乙醇各浸洗1次，每次3min，PBS浸洗5min；

(3)置于4％多聚甲醛溶液中固定15min，PBS浸洗2次，每次5min；

(4)3％的H₂O₂(30％H₂O₂1份+双蒸水9份)室温5min灭活内源性酶，蒸馏水洗3次；

2.暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3％柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶混匀)，室温消化20min，原位杂交用PBS洗3次，每次5min，蒸馏水洗1次；

3.含有0.1％DEPC的1％多聚甲醛/0.1M PBS固定液室温固定10min，蒸馏水洗涤3次；

4.预杂交：每张切片加20μl预杂交液，置于甘油湿盒内，恒温箱内38℃4h，吸取多余液体，不洗；

5.杂交：每张切片20μl杂交液，将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后盖在切片上，恒温箱38℃杂交过夜；

6.杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5min×2次；37℃0.5×SSC洗涤15min×1次；37℃0.2×SSC洗涤15min×1次；

7.滴加封闭液：37℃30min，甩去多余液体，不洗；

8.滴加生物素化鼠抗地高辛37℃60min，原位杂交用PBS洗4次，每次5min；

9.滴加SABC37℃20min，原位杂交用PBS洗3次，每次5min；

10.滴加生物素化过氧化物酶37℃20min，原位杂交用PBS洗4次，每次5min；

11.DAB显色：DAB工作液(1ml双蒸水加显色剂A、B、C各一滴，混匀)，加至标本上，5-30min直至背景出现；

12.充分水洗，70％、90％、100％乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

阳性染色为胞浆或胞核棕黄色颗粒。阴性对照以PBS代替核酸探针，余步同上。高倍镜下(×400)观察，随机选取不重叠的5个视野，进行阳性细胞计数，取其平均值。

2.10免疫组化检测HSP70蛋白的表达

采用免疫组化试剂盒，检测方法参照说明书进行。主要步骤如下：

1.石蜡切片预处理：

(1)将石蜡组织切片置于染色缸中，二甲苯浸洗2次，每次5min；

(2)100％乙醇浸洗2次，依次用95％、85％、70％和50％乙醇各浸洗1次，每次3min，PBS浸洗5min；

(3)置于4％多聚甲醛溶液中室温固定15min，PBS浸洗2次，每次5min；

(4)3％的H₂O₂(30％H₂O₂1份+双蒸水9份)室温5min灭活内源性酶，蒸馏水洗3次；

2.抗原修复：将切片浸入0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液，高压锅内110KPa5-10min，反复2次，冷却后PBS洗涤2次，每次3min；

3.滴加5％BSA封闭液，室温20min，甩去多余液体，不洗；

4.滴加1:50稀释的一抗(小鼠IgG)4℃过夜，PBS洗3次，每次2min；

5.滴加生物素化山羊抗小鼠IgG37℃20min，PBS洗3次，每次2min；

6.滴加试剂SABC，37℃20min，PBS洗4次，每次洗5min；

7.DAB显色：DAB工作液(1ml双蒸水加显色剂A、B、C各一滴，混匀)，加至标本上，5-30min直至背景出现，蒸馏水洗2次；

8.苏木素轻度复染，充分水洗，70％、90％、100％乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察，阳性染色为胞浆棕黄色，阴性对照以PBS代替一抗，余步同上。

9.图像分析，高倍镜下(×400)观察，随机选取不重叠的5个视野，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件计算光密度值(OD)，取其平均值。

2.11统计分析

采用统计软件SPSS13.0进行统计学分析，所得数据以均数±标准差 表示，方差齐性资料采用参数检验，多组实验数据的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组数据之间的比较采用非配对t检验；方差非齐性资料采用秩和检验，P＜0.05认为有统计学意义。

3实验结果

3.1神经功能缺陷评分

Sham组大鼠在再灌注6h，24h，72h神经功能缺陷评分均为0，神经行为学正常；I/R组分别为3.81，2.43，1.80；PHL组分别3.06，1.91，0.88；PHM组分别为2.96，1.45，0.41；PHH组分别为2.87，1.26，0.25。可以看出除Sham组外，其余各组神经功能评分呈现出6h>24h>72h，随着脑缺血再灌注时间的延长，神经行为学在改善；但与I/R组在同时间点的神经功能评分相比较，PHL组(P＞0.05)，PHM组、PHH组则有显著改善(P＜0.05)，提示PHH、PHM在改善大鼠脑缺血再灌注后神经行为学方面效果显著。

表1 各组神经功能缺陷评分比较(n＝5，)

^*与Sham组比较，P＜0.05；^△与I/R组比较，P＜0.05。

3.2脑梗死体积百分比

TTC染色显示，Sham组无梗死；I/R组梗死体积百分比平均为21.55％；PHL组为15.01％；PHM组为13.68％；PHH组为12.87％。除Sham组外，其余各组在术后6h，24h，72h梗死体积变化不大；与I/R组相比较，PHL组、PHM组、PHH组的梗死体积显著缩小(P＜0.05)，而以上三组之间梗死体积相比较，则无显著差异，提示药物治疗各组均能缩小梗死面积，而药物剂量与缩小梗死体积无相关，见表2。

表2 各组梗死体积百分比(n＝15，)

^*与Sham组比较，P＜0.05；^△与I/R组比较，P＜0.05。

3.3神经元组织形态学变化

Nissl染色图片见图1。Nissl染色结果显示，假手术组脑组织无水肿、充血，脑组织呈均匀一致的紫蓝色，细胞密度大，神经元形态结构完整，为三角形、长条形或多边形，胞浆染色清晰，尼氏体着蓝色，胞核淡染，海马CA1区锥体细胞3-4层，形态规则排列整齐，未见明显神经元丢失；模型组大脑皮层可见较明显的充血，血管周围间隙增宽，细胞间质水肿，神经元皱缩体积缩小，与周围组织脱离，胞核固缩深染，有核分裂及核溶解，具有凋亡的特征，部分神经元肿胀，胞浆程空泡状，海马CA1区细胞排列散乱，无层次感，尼氏体减少，大量神经元丢失，细胞密度小；本发明中药组合物各剂量组可见较多神经元肿胀，少量神经元皱缩、胞核固缩深染，细胞密度较大，与模型组比较神经元损伤减轻、丢失减少，提示本发明中药组合物对脑缺血再灌注后神经元损伤具有一定的保护作用。

3.4神经元凋亡

TUNEL检测结果表明，假手术组未见或仅见极少量的神经元凋亡信号，与模型组及本发明中药组合物各剂量组比较，各时间点的差异均具有显著性(P＜0.01)；模型组缺血再灌注6h即可见较多较强的凋亡信号，缺血再灌注24-72h内凋亡信号持续增多；而本发明中药组合物各剂量组缺血再灌注6h的神经元凋亡信号即明显减少，信号强度减弱，缺血再灌注24-72h凋亡信号保持在较低水平，与模型组比较本发明中药组合物各剂量组各时间点的神经元凋亡数量均减少(P＜0.05)，提示本发明中药组合物对脑缺血再灌注后神经元凋亡具有抑制作用。具体数据见表3。荧光显微镜图片见图2。

表3 各组TUNEL阳性细胞计数比较(n＝5，细胞/视野)

^*与Sham组比较，P＜0.01；^△与I/R组比较，P＜0.05。

3.5本发明中药组合物对NSE表达的影响

Sham组在术后6h，24h，72h均呈高表达；I/R组在术后6h极低表达，术后24h至72h略有升高，仍较低；PHL组、PHM组、PHH组在术后6h表达较低，术后24h有所升高，其中PHL组术后72h表达中等，PHM组、PHH组术后72h表达较高，但低于Sham组。Sham组在术后6h，24h，72h NSE阳性细胞率分别为39.68％，40.58％，41.13％；I/R组分别为6.38％，10.14％，15.16％；PHL组分别为10.06％，15.78％，22.73％；PHM组分别为12.50％，22.01％，31.51％；PHH组分别为13.21％，25.12％，36.88％。NSE阳性细胞率术后6h，24h各组与Sham组比较明显偏低，术后72h PHM组、PHH组与Sham组比较无明显差异，提示PHH、PHM在改善大鼠脑缺血再灌注后NSE的下降趋势作用显著，见表4。免疫组化染色图片见图3。

表4 各组NSE阳性细胞率比较(n＝5，)

^*与Sham组比较，P＜0.05；^△与I/R组比较，P＜0.05。

3.6本发明中药组合物对GFAP表达的影响

Sham组在术后6h，24h，72h均呈极低表达；I/R组在术后6h中度表达，术后24h至72h极强表达；PHL组在术后6h低表达，术后24h，72h中度表达；PHM组、PHH组、在术后6h低表达，术后24h中度表达，术后72h表达减弱，与同时间点I/R组比较有显著性差异(P＜0.05)，提示PHH、PHM可下调大鼠脑缺血再灌注后GFAP的表达，Sham组在术后6h，24h，72h GFAP阳性细胞率分别为2.81％，5.16％，9.36％；I/R组分别为20.33％，40.48％，42.66％；PHL组分别为11.46％，23.80％，27.15％；PHM组分别为10.08％，22.21％，19.18％；PHH组分别为8.87％，20.16％，16.35％，见表5。免疫组化染色图片见图4。

表5 各组GFAP阳性细胞率(n＝5，)

^*与Sham组比较，P＜0.05；^△与I/R组比较，P＜0.05。

3.7 Caspase-3mRNA的表达

Caspase-3mRNA原位杂交阳性染色为胞浆或胞核棕黄色颗粒。杂交结果显示，假手术组仅可见极少量Caspase-3mRNA阳性细胞，分散于大脑皮层区，与模型组及本发明中药组合物各组比较差异有显著性(P＜0.01)；而模型组缺血再灌注6h即可见Caspase-3mRNA广泛的表达，Caspase-3mRNA阳性细胞广泛的弥漫性分布于缺血侧脑组织内，缺血再灌注24h阳性细胞计数达到峰值，72h仍保持在较高的水平；与模型组比较本发明中药组合物大、中剂量组各时间点的Caspase-3mRNA阳性细胞数明显减少(P＜0.01)，且表达范围缩小，阳性细胞主要局限于缺血侧背外侧皮层和海马区，但小剂量组与模型组比较差异则不具有显著性(P＞0.05)。提示本发明中药组合物大中剂量对Caspase-3mRNA的表达具有明显的抑制作用。具体数据见表6。显微镜图片见图5。

表6 各组Caspase-3mRNA阳性细胞计数比较(n＝5，细胞/视野)

^*与Sham组比较，P＜0.01；^△与I/R组比较，P＜0.01。

3.8 HSP70mRNA的表达

HSP70mRNA原位杂交阳性染色为胞浆或胞核棕黄色颗粒。杂交结果显示，假手术组仅可见少量的HSP70mRNA阳性细胞，与模型组及本发明中药组合物各组比较差异有显著性(P＜0.01)；模型组缺血再灌注6h可见较多的阳性细胞，主要分布于缺血侧背外侧皮层，再灌注24h阳性细胞增多，在海马区出现不同强度的阳性信号，再灌注72h阳性细胞开始减少，信号强度减弱。本发明中药组合物各组在脑缺血2h再灌注6h即出现较强的杂交信号，再灌注24h时杂交信号最强，波及整个缺血侧大脑，再灌注72h仍处于较高的表达水平。与模型组比较，本发明中药组合物各剂量组HSP70mRNA的表达均增强，且表达时间延长(P＜0.05)。具体数据见表7。显微镜图片见图6。

表7 各组HSP70mRNA阳性细胞计数比较(n＝5，细胞/视野)

^*与Sham组比较，P＜0.01；^△与I/R组比较，P＜0.05。

3.9 HSP70蛋白的表达

阳性染色为胞浆棕黄色，假手术组未见或仅见少量表达的HSP70蛋白阳性信号，与模型组及本发明中药组合物各组比较差异有显著性(P＜0.01)；模型组在缺血2h再灌注6h可见蛋白表达增多，信号增强，再灌注24h蛋白的表达波及整个皮质，再灌注72h开始减弱；本发明中药组合物各组在脑缺血2h再灌注6h出现较强的HSP70蛋白阳性信号，再灌注后24h显著增强，波及整个皮层，并扩散到海马区，再灌注72h仍处于较高水平，本发明中药组合物各组各时间点HSP70蛋白的表达均高于模型组(P＜0.05)。具体数据见表8。免疫组化染色图片见图7。

表8 各组HSP70蛋白表达OD值比较(n＝5，)

^*与Sham组比较，P＜0.01；^△与I/R组比较，P＜0.05。

实施例15本发明中药组合物治疗缺血性中风的临床评价研究

1研究对象与方法

1.1病例选择

病人来自上海市第十人民医院中医科病房，全部为住院病例。三组各60例病人，其性别、年龄、病程、病情经统计学处理无显著意义(P>0.05)，具可比性。具体情况见表9、表10。

表9 各组患者性别、年龄、病程、病情比较

表10 各组组患者的病情比较

1.2诊断标准

西医：参照1995年中华医学会第四届全国脑血管病学术会议通过的《各类脑血管疾病诊断要点》。

中医：分类、量化、证型标准均参照国家中医药管理局2002年颁布的《中药新药治疗缺血性中风临床研究指导原则》与1995年国家中医药管理局全国中医脑病急症科研协作组制定的《中风病诊断疗效评定标准》、《中风病辨证诊断标准》(1994年)。

1.3纳入标准

符合中医缺血性中风病诊断；

符合缺血性中风之痰瘀证的诊断；

符合西医急性脑梗死诊断；

符合OCSP分型中的部分前循环梗塞(PACI)或后循环梗塞(POCI)；

发病72小时以内；年龄在35岁以上，80岁以下者；

发病后未经治疗者；

签署知情同意书。

1.4排除标准

短暂性脑缺血发作(TIA)；

OCSP分型中的全前循环梗塞(TACI)、腔隙性梗塞(LACI)；

脑出血；

发病超过72小时；

经检查证实由脑肿瘤、脑外伤、血液病等引起的卒中患者；

因风湿性心脏病、冠心病及其他心脏病合并房颤，引起脑栓塞者；

80岁以上，35岁以下，妊娠期或哺乳期妇女，过敏体质者；

合并有肝、肾、造血系统、内分泌系统等严重疾病及骨关节病、精神病者；

卒中病史且遗留后遗症者。

1.5病例剔除与脱落标准

不符合纳入标准而被误入的病例予以剔除；

未按规定用药或资料不全等影响疗效判定者予以剔除；

疗程中患者自行退出者，疗程中发生严重不良反应或不良事件不宜继续治疗的病例均视为脱落；

发生不良反应者应计入不良反应的统计；超过1/2疗程因无效而自行退出者应计入疗效分析。

1.6中止试验标准

1)临床试验中出现严重不良反应者应中止试验；

2)出现严重并发症或病情迅速恶化者应中止试验。

1.7治疗方法与分组

1.7.1受试药物

由实施例1制备得到的汤剂，生药含量为0.12g/ml。

消栓通络胶囊：由川芎、丹参、黄芪、泽泻、三七、槐花、桂枝、郁金、木香、冰片、山楂组成。每粒装0.37g(相当于原药材料1.8g)。由敦化市东北亚制药有限责任公司生产。

1.7.2分组方法

采取三种治疗方案平行比较研究。进行前瞻性、随机、对照的临床研究，设计随机化方案，制作随机信封，进行随机方案隐藏，将纳入研究的患者随机分为三组，每组各60例，共180例。

1.7.3治疗方法

本发明中药组合物组：选取痰瘀证患者，在神经内科基础治疗和规范护理康复的基础上，给予汤剂口服，一日2次，早晚各200ml。

消栓通络对照组：在神经内科基础治疗和规范护理康复的基础上，给予口服消栓通络胶囊治疗。

基础对照组：在神经内科基础治疗、规范护理康复的基础上参照2000年广州全国脑血管病专题研讨会通过的“脑卒中的分型分期治疗(建议草案)”进行治疗。

疗程：28天。

随访：发病后3个月随访一次。

1.8疗效评价

(1)疗效评价指标

神经功能的缺损程度(NIHSS积分)；

日常生活能力(ADL积分)；

中医证候学的观察(包括痰瘀证积分、舌脉象的观察)；

血液流变学检查；

安全性评价指标；

不良事件。

(2)实验室检测

禁食12小时以上，于次日清晨7时取静脉血13ml，2小时内分离血清。标本即送本院实验室由专人进行生化测定。尿便标本亦由专人检验。

实验仪器及试剂：本院实验室相应的专用仪器及试剂(同一仪器及同一批次试剂)。

(3)疗效判定标准

参照国家药品监督管理局2002年制定的《中药新药临床研究指导原则》，1995年第四届全国脑血管病学术会议通过的关于卒中患者神经功能缺损程度的疗效评价方法，根据治疗前后NIHSS量表分值的变化，评价疗效。计算方法：[(疗前－疗后)÷疗前]×100％。

临床疗效判定：

①基本痊愈：功能缺损评分减少90％～100％，病残程度0级。

②显著进步：功能缺损评分减少46％～89％，病残程度1～3级。

③进步：功能缺损评分减少18％～45％。

④无变化：功能缺损评分减少或增加在18％以内。

中医证候疗效判定：

①临床痊愈：中医临床症状、体征消失或基本消失，证候积分减少≥95％。

②显效：中医临床症状、体征明显改善，证候积分减少≥70％。

③有效：中医临床症状、体征均有好转，证候积分减少≥30％。

④无效：中医临床症状、体征均无明显改善，甚或加重，证候积分减少不足30％。

疗效判定采用尼莫地平法：[(治疗前积分－治疗后积分)÷治疗前积分]×100％，以百分数表示。

1.9统计方法

采用SPSS12.0统计分析软件包进行编程统计，定量指标描述例数、均数、标准差、最小值、最大值和中位数，主要采用t检验、方差分析或秩和检验。定性指标描述各类的例数及百分数，主要采用卡方检验或秩和检验。所有的统计检验均采用双侧检验，P值小于0.05将被认为所检验的差别有统计意义。

2治疗结果

2.1临床总疗效比较

本发明中药组的总有效率为83％，高于消栓通络胶囊组(65％)及基础治疗组(61％)，有显著性差异(P<0.05)。见表11。

表11 各组临床总疗效的比较

注：*与对照组相比，P<0.05，Ridit分析。

2.2治疗前后临床症状改善情况

本发明中药与其它对照组相比，对于辨证属于痰瘀证的缺血性中风患者，可明显改善其NHISS评分及痰瘀证积分(P<0.05)，见表12。

表12 本发明中药对缺血性中风患者的临床症状积分的影响(n＝60)

注：##用药前后症状相比，P<0.01；**与其它对照组症状相比，P<0.01。

2.3本发明中药对缺血性中风患者的血液流变学影响

本发明中药与消栓通络胶囊用药后均可明显的改善血液流变学的各项指标，与对照组基础治疗组相比较，均具有明显的优势(P<0.05)。而在本发明中药与消栓通络胶囊组间比较中，两组对于本部分指标的效用无明显差异(P>0.05)。见表13。

表13 本发明中药对缺血性中风患者的血液流变学影响(n＝60)

注：与消栓通络胶囊用药后比较*P>0.05，T t检验T’t’检验；与基础治疗组用药后比较#P>0.05，##P<0.05，tt检验t’t’检验。

2.4本发明中药对缺血性中风患者的颈动脉血流参数的影响

颈内动脉尤其是收缩期的血流参数，在脑卒中患者中，随不同的颈动脉分支其速度有所改变，尤其是老年人脑血管病人，由于颈动脉斑块普遍存在，因此其主要颈内外动脉的血流速度普遍减缓趋势。而本发明中药组合物则可以起到良好的血液流速调整作用，与其祛痰散瘀的功能有密切关系。见表14。

表14 本发明中药对缺血性中风患者的颈动脉血流参数的影响(cm/s，n＝60)

注：与消栓通络胶囊用药后比较*P>0.05，**P<0.05，T t检验T’t’检验；与基础治疗组用药后比较#P>0.05，##P<0.05，t t检验t’t’检验。

2.5本发明中药对缺血性中风患者的凝血功能的影响

凝血常规指标与急性脑梗塞的病情轻重、预后及并发症等方面有一定关联，因此，我们也对本发明中药对凝血功能的影响进行了初步观察。结果发现几项指标在不同的程度脑梗塞差异情况下却并无明显的差异规律表现。而且个体差异变化大，用药后的也没有发现显著的差异(P>0.05)，可能与本类指标的特异性差有关，也可能与本药用药时间有关，具体原因尚待进一步分析。见表15。

表15 本发明中药对缺血性中风患者的凝血功能的影响(n＝60)

注：与消栓通络胶囊用药后比较*P>0.05，Tt检验T’t’检验；与基础治疗组用药后比较，#P>0.05，t t检验t’t’检验。

2.6本发明中药对缺血性中风患者的血脂的影响

在本组辨证属于痰瘀证的患者中，普遍存在脂质代谢紊乱的现象。而本发明中药对血脂各项，尤其是LDL及HDL均有较好的良性化调节作用，可在治疗后使得过高或者过低的指标逐渐趋于正常，见表16。

表16 本发明中药对缺血性中风患者血脂的影响(mmol/L，n＝60)

2.7本发明中药对缺血性中风患者的安全性项目的影响

通过安全性项目(包括血尿粪常规、肝肾功能)用药期间监测，未发现本发明中药组合物存在明显的不良反应及毒性反应，表略。

以上临床研究根据各种公认的诊疗规范及通用量表，通过同期对照观察本发明中药组合物治疗前后神经功能的缺损程度、中医证候积分、颈动脉血流参数、血液流变学、血脂、凝血功能、安全性检测项目的变化，显示：本发明中药组合物可显著调节改善缺血性中风患者的神经功能缺损程度；针对痰瘀证患者具有明显的优势；并能够一定程度双向调整改善颈动脉血流参数；改善凝血功能；改善血液流变学各项指标；调节脂质代谢，降低该类患者TC、TG、LDL-C水平。在治疗期间未发现因服用本药而出现的明显的不良反应及毒性反应，进一步客观评价了本发明中药组合物治疗缺血性中风的临床疗效优势及其安全性。

实施例16本发明中药组合物与相近中药组合物的比较

在临床试验的同时，将本发明中药组合物与相近的两个中药组方的疗效进行了比较。

对照中药组合物一：生蒲黄9份、通天草9份、水蛭3份、葛根9份、柴胡9份、海藻9份。常规方法煎煮为汤剂，生药含量为0.12g/ml。

对照中药组合物二：生蒲黄9份、通天草9份、水蛭5份、葛根9份、石菖蒲9份、海藻9份。常规方法煎煮为汤剂，生药含量为0.12g/ml。

病例选择和治疗方法同实施例15。

治疗结果如下：

1临床总疗效比较

本发明中药组的总有效率为83％，高于对照一组(63.3％)及对照二组(61.7％)，有显著性差异(P<0.05)。见表17。

表17 各组临床总疗效的比较

注：*与对照组一相比，P<0.05，Ridit分析。

2.2治疗前后临床症状改善情况

本发明中药组与其它对照组相比，对于辨证属于痰瘀证的缺血性中风患者，可明显改善其NHISS评分及痰瘀证积分(P<0.05)，见表18。

表18 各组对缺血性中风患者的临床症状积分的影响(n＝60)

注：##用药前后症状相比，P<0.01；**与其它对照组症状相比，P<0.01。

2.3各组对缺血性中风患者的血液流变学影响

本发明中药与对照组一、对照组二用药后均可明显的改善血液流变学的各项指标。而在本发明中药与对照组一或对照组二组间比较中，两组对于本部分指标的效用无明显差异(P>0.05)。见表19。

表19 各组对缺血性中风患者的血液流变学影响(n＝60)

2.4各组对缺血性中风患者的颈动脉血流参数的影响

本发明中药则可以起到良好的血液流速调整作用，与其祛痰散瘀的功能有密切关系，且显著优于对照一和对照二。见表20。

表20 各组对缺血性中风患者的颈动脉血流参数的影响(cm/s，n＝60)

注：与对照一用药后比较*P>0.05，**P<0.05；T t检验T’t’检验；与对照二用药后比较#P>0.05，##P<0.05，t t检验t’t’检验。

2.5各组对缺血性中风患者的凝血功能的影响

结果表明用药后各组未发现显著的差异(P>0.05)，可能与本类指标的特异性差有关，也可能与本药用药时间有关，具体原因尚待进一步分析。见表21。

表21 各组对缺血性中风患者的凝血功能的影响(n＝60)

2.6各组对缺血性中风患者的血脂的影响

本发明中药对血脂各项，尤其是LDL及HDL均有较好的良性化调节作用，可在治疗后使得过高或者过低的指标逐渐趋于正常，但与对照组一和对照二相比未见显著差异。见表22。

表22 各组对缺血性中风患者血脂的影响(mmol/L，n＝60)

2.7各组对缺血性中风患者的安全性项目的影响

通过安全性项目(包括血尿粪常规、肝肾功能)用药期间监测，各组均未发现存在明显的不良反应及毒性反应，表略。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种治疗脑缺血再灌注损伤的中药组合物，其特征在于，它由下列重量份的原料药制成：生蒲黄7-10份、通天草8-10份、水蛭2-4份、葛根7-10份、石菖蒲7-10份、海藻8-10份。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，它由下列重量份的原料药制成：生蒲黄8-9份、通天草8-9份、水蛭2-3份、葛根8-9份、石菖蒲8-9份、海藻8-9份。

3.根据权利要求2所述的中药组合物，其特征在于，它由下列重量份的原料药制成：生蒲黄9份、通天草9份、水蛭3份、葛根9份、石菖蒲9份、海藻9份。

4.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物的剂型为汤剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂或合剂。

5.权利要求1-4任一所述的中药组合物在制备治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的应用。

6.权利要求1-4任一所述的中药组合物在制备治疗中风的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的中风为缺血性中风。

8.权利要求1-4任一所述的中药组合物在制备治疗脑梗死的药物中的应用。