TW201944990A - 預防和/或治療缺血再灌注損傷的中藥組合物及其製劑和應用 - Google Patents

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Abstract

本發明公開了一種預防和/或治療缺血再灌注損傷的中藥組合物，該中藥組合物由丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪總皂苷組成。

Description

預防和/或治療缺血再灌注損傷的中藥組合物及其製劑和應用
本發明涉及中醫藥領域，具體涉及一種預防和/或治療缺血再灌注損傷的中藥組合物。
1966年，Jennings首先提出缺血再灌注損傷（ischemic reperfusion injury）的概念：當組織細胞低灌流缺血後獲得血液再供應時，不但未使組織細胞缺血性損害減輕或恢復，反而加重了缺血性損傷。它是高等動物機體缺血後再灌注發生的普遍現象。如心臟手術、冠脈搭橋、臟器血供梗塞後再通、器官移植以及休克臟器低灌流糾正後都可能發生再灌注損傷。其損傷的程度與缺血的時間、側支循環的情況、需氧的程度、再灌注的條件等密切相關。
對缺血性疾病的治療，當然首要的是恢復血液灌注，目的在於解除組織的缺氧和營養物質供應不足的狀態，以阻止缺血性損傷的發展或促使其恢復。
近年來，隨著休克治療的進步以及動脈搭橋術、溶栓療法、經皮腔內冠脈血管成形術、心臟外科體外循環、心肺腦復蘇，斷肢再植和器官移植等方法的建立和推廣應用，使許多組織器官缺血後重新得到血液再灌注。
大量臨床實踐證明，這種治療在許多情況下都獲得了較好的效果，因此，恢復血液灌注已成為治療缺血性疾病的基本原則。
相對應的，目前治療缺血再灌注損傷的藥物有自由基清除劑和抗氧化劑、鈣拮抗劑和通道抑制劑、抗炎藥物等等。
丹參多酚酸，臨床上使用的劑型是注射用丹參多酚酸，其作用是活血、化瘀、通脈。臨床用於冠心病穩定型心絞痛，分級為Ⅰ、Ⅱ級，心絞痛症狀表現為輕、中度，中醫辨證為心血瘀阻證者，症見胸痛、胸悶、心悸。
三七總皂甙（三七總皂苷），臨床上劑型為注射用血塞通，其藥理作用是：擴張冠脈和外周血管、降低外周阻力、減慢心率、減少和降低心肌耗氧量、增加心肌灌注量、增加腦血流量、對心肌和腦缺血有一定改善作用；具顯著抑制血小板凝聚、降低血液黏稠度、抑制血栓形成的作用；此外，本品還具降血脂，抗疲勞，耐缺氧，提高和增強巨噬細胞功能等作用。臨床上主要用於腦血管後遺症，視網膜中央靜脈阻塞，眼前房出血等。
黃芪總皂苷，臨床上用於抗血栓形成，可以增強免疫、補中益氣的作用。
目前，尚未見到丹參多酚酸、三七總皂苷和黃芪總皂苷三者合用的報道。
本發明的目的，在於提供一種預防和/或治療缺血再灌注損傷的中藥組合物。該中藥組合物由丹參多酚酸、三七總皂苷和黃芪總皂苷組成。
丹參多酚酸、三七總皂苷和黃芪總皂苷的重量比為（1~16）：（1~16）：（1~16）。
較佳地，所述中藥組合物中丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪總皂苷的重量比為（4~16）：（1~8）：（1~16）。
進一步較佳地，所述中藥組合物中丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪總皂苷的重量比為（4~16）：（1~4）：（1~16）。
更進一步較佳地，所述中藥組合物中丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪總皂苷的重量比為（4~8）：（1~4）：（1~16），或為（8~16）：（1~4）：（1~16）。
再次較佳地，所述中藥組合物中丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪總皂苷的重量比為（4~8）：1：（5~16），或為（4~8）：（1~2）：（1~5）。
效果最佳，所述中藥組合物中丹參多酚酸（a）、三七總皂苷（b）、黃芪總皂苷（c）的重量比為4：1：5。
本發明所用成分中：
丹參多酚酸為萃取物，含有丹酚酸B、丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸E，各成分的重量百分比分別為40-95%、20-95%、3-15%、2-10%和0.2-2.2%。
丹參多酚酸可以由以下方法製備：丹參飲片用濃度為20-90%的乙醇萃取，萃取液濃縮至無醇，萃取物經過聚醯胺層析，用水或濃度為30%以下的乙醇洗去雜質，以濃度為30-95%的乙醇或者濃度為0.05-0.3%的碳酸氫鈉或者濃度為0.01-0.3%的碳酸鈉沖提，收集沖提液，調pH 1-5.5，通過弱極性或者非極性大孔樹脂，水洗或20%以下乙醇洗去雜質，30-95%乙醇沖提，收集沖提液，濃縮，乾燥，即得。
三七總皂苷為萃取物，含有的成分中：三七皂苷R1 含量5-20%，人參皂苷Rb1 含量不少於20%，人參皂苷Rd含量3-15%，人參皂苷Rg1 含量不少於30%，人參皂苷Re含量不少於2%，五種皂苷含量總和不少於80%。
三七總皂苷可以由以下方法製備：取三七藥材，粉碎成粗顆粒，加入3-10倍量濃度為20-80%的乙醇回流萃取兩次，每次2-5小時，合併萃取液，萃取液減壓濃縮至無醇，離心，上清液經大孔吸附樹脂進行富集，3-10倍柱體積水洗去糖類成分和部分色素，繼用5-10倍柱體積30-70%乙醇進行沖提，收集醇沖提液，減壓濃縮至乾粉，得三七總皂苷。
黃芪總皂苷為萃取物，黃芪總皂苷的重量百分含量為20-100%，其中黃芪甲苷含量為20-95%。
黃芪總皂苷可以由以下方法萃取：取黃芪飲片，粉碎成粗顆粒，用3-10倍量濃度為20-70%乙醇（含0.1-0.5%的碳酸氫鈉）回流萃取兩次，每次2-5小時，合併萃取液，萃取液減壓濃縮至藥材2-5倍量體積，離心，上清液經大孔吸附樹脂進行富集，先用2-8倍柱體積的濃度為0.1-1%的NaOH溶液沖洗，再用2-8倍柱體積的濃度為20-60%乙醇沖提，最後用2-8倍柱體積的濃度為70-95%乙醇進行沖提，收集濃度為70-95%的乙醇沖提液。再通過大孔樹脂脫色，2-5倍柱體積的濃度為70-95%乙醇沖提，收集流出液和沖提液，減壓濃縮至小體積，結晶析出固體，收集固體乾燥，得黃芪總皂苷。
本發明的另一目的是提供含該中藥組合物的製劑，該製劑由中藥組合物和藥學上可接受的載體組成。
所述藥學上可接受的載體是指藥學領域常規的藥物載體，選自填充劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、增溶劑、助懸劑、潤濕劑、色素、溶劑、表面活性劑或矯味劑中的一種或幾種。
所述填充劑選自澱粉、預膠化澱粉、糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖、乳糖醇、微晶纖維素、甘露醇、山梨醇或木糖醇；
所述黏合劑選自羧甲基纖維素鈉、羥丙甲基纖維素、乙基纖維素、聚維酮、澱粉漿、蔗糖、糖粉、膠漿、明膠或聚乙二醇；
所述崩解劑選自交聯羧甲基纖維素鈉，交聯聚維酮、低取代羥丙基纖維素或羧甲基澱粉鈉或澱粉；
所述潤滑劑選自硬脂酸鎂、滑石粉、微粉矽膠、PEG4000、PEG6000或月桂醇硫酸鈉；
所述增溶劑選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、葡甲胺、L-賴氨酸或L-精氨酸；
所述助懸劑選自微粉矽膠、蜂蠟、纖維素或固態聚乙二醇；
所述潤濕劑選自甘油、吐溫-80、乙氧基氫化蓖麻油或卵磷脂；
所述溶劑選自乙醇、液態聚乙二醇、異丙醇、吐溫-80、甘油、丙二醇或植物油，所述植物油選自大豆油、蓖麻油、花生油、調和油等；
所述表面活性劑選自十二烷基苯磺酸鈉、硬脂酸、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、脂肪酸山梨坦或聚山梨酯（吐溫）等；
所述矯味劑選自阿斯巴甜、蔗糖素、香精、甜菊素、安賽蜜、檸檬酸或糖精鈉。
本發明的另一個目的，在於提供該中藥組合物的用途。
其中一個用途，為本發明中藥組合物在治療和/或預防缺血再灌注損傷中的應用。本發明所述的缺血再灌注損傷，包括但不限於腦缺血再灌注損傷、心肌缺血再灌注損傷、腎缺血再灌注損傷、下肢缺血再灌注損傷、脊髓缺血再灌注損傷、視網膜缺血再灌注損傷、皮瓣缺血再灌注損傷等。
本發明所述的缺血再灌注損傷，包括但不限於溶栓引起的缺血再灌注損傷，動脈搭橋術引起的缺血再灌注損傷，經皮腔內冠脈血管成形術引起的缺血再灌注損傷，心臟外科體外循環引起的缺血再灌注損傷，心肺腦復蘇引起的缺血再灌注損傷，斷肢再植和器官移植等引起的缺血再灌注損傷。
另外一個用途，是本發明提供的中藥組合物可以與tPA（組織型纖溶酶原激活物）組合用於溶栓，在第二用途中，中藥組合物與tPA按照重量比為10：（5-20）進行組合。
中藥組合物可以減輕tPA引起的滲出和出血，增加的生存率，降低了神經損傷。
本發明提供的中藥組合物具有以下優點：
本發明提供的中藥組合物具有協同效果，可以治療和/或預防缺血再灌注損傷，同時與tPA組合用於溶栓，效果好，副作用少。
實施例1：一種中藥組合物
丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪總皂苷的重量比為：1：2：4。
實施例2：一種中藥組合物
丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪總皂苷的重量比為：1：4：16。
實施例3：一種中藥組合物
丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪總皂苷的重量比為：2：16：1。
實施例4：一 種中藥組合物
丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪總皂苷的重量比為：8：1：16。
實施例5：一種中藥組合物
丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪總皂苷的重量比為：16：4：1。
實施例6：一種中藥組合物
丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪總皂苷的重量比為：16：8：4。
實施例7：一種中藥組合物
丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪總皂苷的重量比為：4：1：5。
實驗例1：丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪甲苷比例篩選實驗
將三種藥物根據均勻設計得到表1的前6組，剩餘的一組是根據預實驗結果計算得到，合計七個劑量組(比例)：
表1：丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪甲苷配比
藉由實驗來驗證7組的效果。每組總劑量為20mg/kg。
1.實驗方法
1.1 實驗動物
體重為270-290 g的雄性Spragu-Dawley大鼠90隻，購於北京大學醫學部動物中心，合格證號：SCXK（京）2006 - 0008。動物飼養在溫度為22 ± 2 ℃，濕度為40% ± 5%的條件下，自由飲食、飲水，12小時光照/黑暗交替。動物於實驗前12 小時，禁食自由飲水。
1.2 模型建立
用線栓法造成大鼠大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO），建立大鼠大腦中動脈I/R型。詳述如下，用複合麻醉劑實驗前5分鐘麻醉（腹腔注射），仰臥位固定大鼠，頸部正中去毛，75%酒精消毒，頸部行長度約3cm正中切口，沿胸鎖乳突肌內緣分離肌肉和筋膜後，避開氣管兩側甲狀腺和其外上方甲狀旁腺，小心分離出頸總、頸外和頸內動脈。6-0手術縫合線系於頸外動脈近心端，電凝頸外動脈及小分支。用微小動脈夾暫時夾閉頸內、頸總動脈，在頸外動脈上用顯微手術剪剪一切口，將製備好的頭端包有矽膠的栓線（線體直徑 0.38 mm）經頸外動脈切口處緩慢插入頸內動脈至大腦中動脈起始處，堵塞大腦中動脈血液供應。進線長度約為距頸總動脈分叉處1.8 cm-2.2 cm。90 min 後，拔出栓線，縫合皮膚，建立大鼠腦 I/R 模型。
模型建立後，各實驗組（每組大鼠10隻）分別給予上表中不同配比的中藥組合物。假手術組採用同樣的手術操作但不插入線栓。整個手術操作過程中維持大鼠肛溫在（37.0 ± 0.5℃），術後繼續用加熱毯維持大鼠肛溫，直到恢復活動。24 h 後，再次麻醉大鼠並處死取材。
1.3 腦梗死區域染色
用 TTC（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride）染色方法檢測 I/R 損傷後大鼠腦梗死。具體方法為：在再灌注24h 後，取出各組大鼠的大腦，在腦定位器上由前向後切成 5 個薄片放入 2% 的 TTC 中在 37℃下孵育 15 分鐘，行 TTC 染色。非梗塞區被染成紅色，梗塞區不著色仍為白色。
拍攝腦片 TTC 染色圖片，用圖像分析軟體 IamgeJ （Bethesda，MD，USA）計算 TTC 染色梗死面積占全腦面積百分比值，評價腦梗死程度。
1.4 神經學評分
在再灌注 3 h、24 h，按照 18 分評分標準對各組大鼠進行神經學評分，見表2：
表2：神經學評分
18分改良小鼠神經學評分法（mNSS），正常小鼠得分為0分，最大18分，得分越高表示神經缺損越嚴重，具體結果評價見表3
表3：結果評價
2.實驗結果
2.1 TTC染色結果：見第1A圖和第1B圖。
第1A圖是各組大鼠再灌注24h後腦組織片 TTC 染色圖像。圖中白色區域表示梗死區域。第1B圖是不同組 TTC 梗死面積的統計圖（具體結果見表4）。
與假手術組相比，I/R 組大鼠右腦出現明顯梗死。8：1：16、16：4：1、16：8：4及4：1：5四個配伍能減少腦梗死面積，其中8：1：16及4：1：5兩個配伍能明顯減少腦梗死面積(第1A、1B圖)。
2.2 神經學評分結果見第2A圖、第2B圖（分別表示了再灌注 3 h 和 24 h 後各組大鼠進行神經功能學評分的結果）和表4。
表4. 不同組大鼠的梗死面積、3小時和24小時的神經學評分（均值 ± 標準誤）
注：∗表示與假手術組比，P > 0.05。 #表示與缺血再灌注比， P > 0.05。† 表示與1：2：4組比，P > 0.05。‡表示與1：4：16組相比，P > 0.05 △表示與2：16：1組比， P > 0.05。
第2A圖、第2B圖和表4結果顯示：
與假手術組（control）相比，再灌注 3 h 和24 h，大鼠神經功能學評分顯著降低，7個配伍組對再灌注3h的神經功能學評分的降低沒有改善作用，但是，在再灌注 24 h，8：1：16、16：4：1、4：2：1、4：1：5四個配伍組能顯著改善大鼠神經功能學評分。
藉由以上實驗，可以得出當丹參多酚酸（a）、三七總皂苷（b）、黃芪總皂苷（c）三種藥物的比例範圍在（4~16）：（1~8）：（1~16），優選為（4~16）：（1~4）：（1~16）時，具有良好的改善缺血再灌注損傷的作用。
以下實驗以溶栓造成的缺血再灌注損傷為例，選取上述實驗中所確定最優比例範圍內的不同組別，考察本發明中藥組合物對於溶栓後的缺血再灌注損傷的保護作用，以及促進溶栓的作用。但這並不造成對本申請的保護範圍的限制，因為任何原因造成的缺血再灌注損傷，都會表現為自由基過多、細胞鈣超載、炎症反應等，治療方法也是一致的。本發明的實驗證實了本申請的中藥組合物可以治療溶栓後引起的缺血再灌注損傷，也一樣可以推導出本申請的中藥組合物也可以治療其他原因引起的缺血再灌注損傷。
實驗例2：對小鼠頸動脈血栓的促溶栓作用及溶栓後腦缺血再灌注損傷的保護作用
1.動物實驗模型建立及實驗分組
1.1 動物模型建立
體重為21±2 克的雄性C57BL/6清潔級小鼠，購於北京大學醫學部實驗動物中心。動物飼養在溫度23±2攝氏度，相對濕度45±5%的條件下，自由飲食飲水，12小時光照/黑暗交替。動物於實驗前12小時，禁食並自由飲水。
用戊巴比妥鈉（2%，45毫克/千克）腹腔注射麻醉動物，頸部皮膚備皮消毒。做頸正中切口，暴露並分離頸總動脈，採用一個防水墊片隔離長約2.5-3毫米長的頸總動脈與周圍組織。用浸潤10% FeCl3 的濾紙包繞被分離的頸總動脈約1毫米寬，3分鐘後除去濾紙，用0.9%的生理鹽水清洗血管外側。除去防水墊片。縫合頸部傷口。Fe3+ 開始刺激定義為缺血開始，缺血10分鐘後頸部血栓最大直徑處堵塞血管，缺血15分鐘後頸動脈遠心端血流量小於基礎值20%，且缺血4.5小時（即再灌注前）時血栓穩定，血栓面積直徑最大處堵塞頸動脈血管直徑60%及以上的動物入組。
1.2 實驗分組
1.2.1 考察不同配比的本發明中藥組合物對溶栓後缺血再灌注損傷的保護作用
缺血4.5小時後，按照隨機分組結果給予藥物或生理鹽水治療。小鼠股靜脈插管，左股靜脈泵注tPA（組織型纖溶酶原激活物）或生理鹽水，右股靜脈泵注本發明中藥組合物或生理鹽水，總藥量10%推注，剩餘90%靜脈持續泵注1小時，速度0.1 毫升/小時。本發明中藥組合物選取三個配比組，分別為：
T541組（即黃芪總皂苷：丹參多酚酸：三七總皂苷=5：4：1）；
T141組（即黃芪總皂苷：丹參多酚酸：三七總皂苷=1：4：1）；
T582組（即黃芪總皂苷：丹參多酚酸：三七總皂苷=5：8：2）。
依據隨機數字表將C57BL/6小鼠分為以下10組：
（1）假手術組，模型建立時用生理鹽水替代Fe3+ 刺激；
（2）T541高劑量本底組（在假手術組的基礎上給予T541 20毫克/千克，簡稱本底組）；
（3）血栓組（給予等體積生理鹽水）；
（4）T541高劑量溶栓組（單獨給予T541 20毫克/千克）；
（5）tPA溶栓組（給予tPA）；
（6）T541低劑量組（給予tPA + T541 5毫克/千克）；
（7）T541中劑量組（給予tPA + T541 10毫克/千克）；
（8）T541高劑量組（給予tPA+ T541 20毫克/千克）
（9）T141組（給予tPA + T141 12毫克/千克）；
（10）T582組（給予tPA + T582 15毫克/千克）。
其中tPA均給予臨床等效使用劑量10毫克/千克。各組給藥方式見表5。
表5：動物實驗分組方法及給藥方式
左股靜脈給予tPA臨床等效使用劑量10毫克/千克或等體積生理鹽水對照。右股靜脈分別給予幾組本發明中藥組合物，分別為T541低、中、高劑量組、T141組、T582組或等體積生理鹽水對照。
其中，T541低劑量組、中劑量組、高劑量組以及T141組、T582組採用與tPA同時給藥的形式，這樣既可以評價本發明中藥組合物的促溶栓作用，也可考察本發明中藥組合物對於溶栓造成的缺血再灌注損傷的治療作用，動物實驗中各觀測指標及各組動物使用數量見表6。
表6. 動物實驗中各觀測指標及各組動物使用數量
24小時生存率及神經學評分各組數量不小於6，血栓觀察、氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）梗死面積染色、腦血流量及出血情況觀察各組數量為6。選取假手術組、T541高劑量本底組、tPA溶栓組和最佳藥物濃度組進行下一步觀察。伊文斯藍滲出、微循環動態可視化觀察、模型側腦乾濕重比和分子生物學指標檢測各組數量為6；免疫螢光染色和電鏡動物各組數量為3。
記錄小鼠再灌注後24小時生存率、神經學缺陷評分、頸動脈血栓面積變化和腦血流量灌注情況變化；選取最佳藥物濃度進行下一步分析。
再灌注24小時後採用正置顯微鏡動態微循環觀測系統觀察小鼠腦微循環動態變化，記錄大腦中動脈區域、前動脈區域和腦表面毛細血管後微靜脈的白蛋白滲出情況。
再灌注24小時後處死小鼠取腦，觀察腦組織出血情況和梗死面積大小，測量出血後腦組織中血紅蛋白含量；檢測腦組織乾濕重比和伊文斯蘭滲出程度，反映組織水腫情況；腦組織TUNEL染色觀察細胞凋亡嚴重程度；連接蛋白Occludin、Claudin-5、JAM-1、ZO-1、VE-cadherin及基底膜成分層黏蛋白laminin西方墨點轉漬法分析和部分連接蛋白及laminin免疫螢光染色，觀察血管損傷時血腦屏障變化狀態；掃描電鏡和透射電鏡檢測腦缺血再灌注後結構變化；酶聯免疫吸附測定腦組織MDA、8-OHdG、ATP/ADP/AMP及線粒體複合物I、II和IV活性的變化。
1.2.2 對比本發明中藥組合物與拆方後各組分對頸總動脈血栓溶栓後再灌注損傷的治療作用
為比較本發明中藥組合物與拆方後各單獨組分（黃芪總皂苷、丹參多酚酸、三七總皂苷）或兩兩配伍組對tPA溶栓引起的再灌注損傷的治療作用，本實驗採用了tPA聯合T541及T541中各單獨成分或兩兩配伍的組別，分別為tPA+黃芪總皂苷（tPA+HQ）、tPA+丹參多酚酸（tPA+DS）、tPA+三七總皂苷（tPA+SQ）、tPA+黃芪總皂苷 +丹參多酚酸（tPA+HQ+DS）、tPA+黃芪總皂苷+三七總皂苷（tPA+HQ+SQ）、tPA+丹參多酚酸+三七總皂苷（tPA+DS+SQ）和tPA+ T541。具體分組見表7。生理鹽水為等體積對照。各組使用數量均為6。
表7. T541拆方分組情況及各組給藥情況
1.3細胞實驗流程、分組及觀測指標
1.3.1 細胞實驗流程及分組
建立大鼠腦內皮細胞缺氧複氧模型：大鼠腦內皮細胞購自ATCC公司，正常培養繼代至5至6代後進行實驗。
分為（1）正常對照組；（2）模型組：缺氧4.5小時，複氧3小時，複氧開始時加tPA 20微克/毫升處理；（3）T541高劑量給藥組：缺氧4.5小時，複氧3小時，複氧開始時加tPA 20微克/毫升和T541 400微克/毫升處理；（4）T541次高劑量給藥組：缺氧4.5小時，複氧3小時，複氧開始時加tPA 20微克/毫升和T541 40微克/毫升處理；（5）T541中劑量給藥組：缺氧4.5小時，複氧3小時，複氧開始時加tPA 20微克/毫升和T541 4微克/毫升處理；（6）T541次低劑量給藥組：缺氧4.5小時，複氧3小時，複氧開始時加tPA 20微克/毫升和T541 0.4微克/毫升處理；（7）T541低劑量給藥組：缺氧4.5小時，複氧3小時，複氧開始時加tPA 20微克/毫升和T541 0.04微克/毫升處理。
用Cellcounting Kit-8（簡稱CCK-8，MedChem Express，中國）試劑盒測試不同藥物處理下細胞活力與正常組細胞的差異。實驗中分組為（1）正常對照組；（2）T541高劑量藥物本底組：正常細胞加T541 400微克/毫升處理3小時；（3）次高劑量藥物本底組：正常細胞加T541 40微克/毫升處理3小時；（4）中劑量藥物本底組：正常細胞加T541 4微克/毫升處理3小時；（5）次低劑量藥物本底組：正常細胞加T541 0.4微克/毫升處理3小時；（6）低劑量藥物本底組：正常細胞加T541 0.04微克/毫升處理3小時。
1.3.2細胞實驗觀測指標
用Cell-Counting Kit 8（CCK8）測試細胞活性，反映不同濃度的藥物對於正常內皮細胞的影響；檢測連接蛋白Claudin-5（緊密連接蛋白-5）、JAM-1（連接黏附分子一型蛋白）、VE-cadherin（血管內皮細胞鈣黏連蛋白）含量變化；部分連接蛋白及細胞骨架F-actin免疫螢光染色；西方墨點轉漬法分析檢測凋亡相關蛋白Bax（B細胞淋巴瘤2相關X蛋白）、Bcl-2（B細胞淋巴瘤-2）含量變化；西方墨點轉漬法分析檢測基質金屬蛋白酶（MMP）-3及其前體pro-MMP-3的含量變化。
2.試驗方法
2.1小鼠頸部血栓觀察
採用正置顯微鏡動態觀察小鼠頸動脈血栓。麻醉小鼠仰臥位置於鼠板上，做頸正中切口，暴露並分離頸總動脈，股靜脈給予吖啶紅螢光標記血小板，觀察缺血前（即基礎值）、缺血10分鐘、缺血4.5小時（即再灌注前）、再灌注1小時、再灌注2小時及再灌注24小時小鼠頸動脈血栓變化。缺血前（即基礎值）無血栓，缺血10分鐘血栓最大直徑處堵塞血管，缺血15分鐘頸動脈遠心端血流量降低為基礎值20%以下，且缺血4.5小時（即再灌注前）時血栓穩定，血栓面積堵塞頸動脈血管面積60%及以上為頸動脈血栓模型成功標準，入組成功率達90.9%。除假手術組和各本底組外，其餘各組為模型成功後隨機分組。
2.2腦血流量測定
用連接電腦的雷射多普勒血流灌注成像儀測定左右兩側大腦中動脈支配區域腦皮質血流量。麻醉小鼠俯臥位置於鼠板上，剪開左右側頂骨上的皮膚使頂骨完全暴露，將連接電腦的低能量氦-氖雷射器探頭置於頂骨上16-18釐米處，檢測缺血前（即基礎值）、缺血10分鐘、缺血4.5小時（即再灌注前）、再灌注1小時、再灌注2小時及再灌注24小時小鼠左右側大腦中動脈血液供應區軟腦膜血流量。用腦血流量分析軟體LDPIwin 3.1（PeriScan PIM3 System，PERIMED，Stockholm，瑞典）計算左右側MCA支配的同樣大小區域的腦皮質血流量。
2.3神經學評分
在再灌注24小時，按照15分評分標準（Garcia JH et al. Stroke. 1995;26:627–634）稍作修改，對各組小鼠進行神經學評分：
小鼠自主活動能力：將小鼠放在25 × 15釐米鼠籠中，記錄其在3分鐘內的活動軌跡，小鼠基本不活動記為0分，極少活動且未觸碰鼠籠任何壁為1分，觸碰任何一壁或為兩壁為2分，觸碰三壁及以上記為3分；
小鼠肢體對稱性實驗，將小鼠尾巴提起，觀察左右身體活動軌跡，左右完全不對稱為0分，幾乎不對稱為1分，中等程度不對稱為2分，幾乎對稱3分；
開野試驗測定實驗，觀察小鼠自由運動軌跡，不活動者為0分，原地轉圈為1分，偏向一側曲線運動為2分，直線運動為3分；
平衡木實驗，在距離地面10釐米處放置50 × 5 × 2釐米木條，將小鼠放在一端，觀察其在平衡木上運動軌跡，小鼠從平衡木上掉下來記為0分，懸掛在平衡木上記為1分，在平衡木上站立但運動很少記為2分，在平衡木上運動記為3分；
小鼠觸鬚觸摸實驗，用小木棒觸摸小鼠左右兩側觸鬚，與右側相比，左側不反應者記為1分，左側微弱反應記為2分，兩側反應相同記為3分。
小鼠神經學評分計算以上五個實驗單項得分總和，15分為正常小鼠，0分表示小鼠死亡。
另一種評分方法介紹。改良神經損傷嚴重程度評分(modified neurological severity scores, mNSS)，0-18分。評分方法參照實驗例1中的1.4部分。
2.4腦出血情況及梗死面積測定
再灌注24小時，用4攝氏度預冷的PBS緩衝液由心臟灌流小鼠，開顱取腦，在腦立體定位器中由前向後切成5個薄片，用體視攝影顯微鏡迅速拍攝出血情況，置於-80攝氏度保存，用血紅蛋白分光光度測量試劑盒測量血紅蛋白含量。
再灌注24小時，用4攝氏度預冷的PBS緩衝液由心臟灌流小鼠，開顱取腦，在腦立體定位器中由前向後切成5個薄片，在低溫條件下迅速拍照記錄出血情況，放入2%的氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC），中在37攝氏度下孵育15分鐘，行TTC染色。非梗塞區被染成紅色，梗塞區不著色仍為白色。拍攝腦片TTC染色圖片，用圖像分析軟體ImageJ（Bethesda，MD，美國）計算TTC染色梗死面積占全腦面積百分比值，評價腦梗死程度。
2.5微循環觀察、伊文斯藍滲出測定及腦組織乾濕重比測定
血漿白蛋白漏出：在體視顯微鏡下，進行小鼠股靜脈插管（PE/08，外徑0.36 毫米，內徑0.20 毫米）。小鼠以俯臥位固定在小鼠腦微循環觀察板上，剪去小鼠顱頂皮膚，暴露右側頂骨，在體視顯微鏡下，用手提式顱鑽將整個頂骨磨薄，直至頂骨只剩一層柔軟的骨皮質。將 FITC標記的血漿白蛋白（激發波長420-490奈米，發射波長520奈米）按50毫克/千克用量，經股靜脈緩慢推注。10分鐘後，在連接超敏感螢光CCD的正立螢光顯微鏡下，記錄再灌注24小時後，小鼠腦表面直徑30-50微米之間的毛細血管後微靜脈、大腦中動脈支配區域動脈、大腦前動脈支配區域動脈的螢光圖像，分析血漿白蛋白的漏出情況。用圖像分析軟體ImageJ（Bethesda，MD，USA）計算細靜脈血管內（Iv）及血管外（Ii）的螢光強度，血漿白蛋白漏出量用Ii/Iv表示。
伊文斯藍滲出：再灌注21小時後，將溶解於生理鹽水的伊文斯藍染料（2%，4毫升/千克）經股靜脈緩慢推注至小鼠體內。3小時後，心臟灌注生理鹽水15-20毫升（右心耳流出液體為無色時停止灌流），隨即取腦至4%多聚甲醛中固定3小時，拿出後將腦切成5片，拍照並分開左右腦分別稱重。將左右腦分別加入含有1毫升50%三氯乙酸EP管中，勻漿，離心取上清。配置伊文斯藍標準品，用多功能酶標儀檢測伊文斯藍含量（激發光620奈米，發射光680奈米）。用每克腦組織中含有的伊文斯藍微克數表示伊文斯藍含量。
腦組織乾濕重比：再灌注24小時後，立即麻醉小鼠，斷頭取腦，左右腦分別稱重（記為濕重）。隨後將腦置於60攝氏度乾燥箱中放置72小時烘乾，並稱重（記為乾重）。小鼠腦乾濕重比按照（濕重-乾重）/ 濕重 × 100%計算。
2.6電鏡觀察
透射電鏡：在再灌注24小時後，麻醉小鼠經左心室以3毫升/分鐘的速度灌注3%戊二醛40分鐘，取腦，切小鼠右側皮質成1毫米× 1毫米× 1毫米小塊，3%戊二醛室溫後固定30分鐘或4攝氏度過夜。蔗糖於搖床上沖洗3次× 15分鐘；鋨酸室溫固定2小時；0.2摩爾/升PBS沖洗3次× 5分鐘；30%、50%、70%和90%丙酮分別脫水15分鐘，100%丙酮脫水3次× 5分鐘；100%丙酮與包埋劑1：1混合的預包埋劑中預浸，37攝氏度過夜；純包埋劑浸潤，37攝氏度24小時後60攝氏度固化48小時，自然冷卻；包埋劑結束後修塊、切片，切片厚度為60 nm。用醋酸鈾和檸檬酸鉛對超薄片進行染色，在透射電鏡（JEM 1230，JEOL，Tokyo, Japan）下觀察、拍片。
掃描電鏡：在再灌注24小時後，麻醉小鼠經左心室以3毫升/分鐘的速度灌注3%戊二醛40分鐘，取腦，切取右側皮質半影區，置於戊二醛中後固定2小時。PBS磷酸鹽緩衝液沖洗後，在1%四氧化鋨中後固定2小時，取合適剖面固定於金屬托上。組織塊鍍金，並在掃描顯微鏡（JSM-5600LV，JEOL，Tokyo，Japan）下觀察、拍片。
2.7西方墨點轉漬法分析及酶聯免疫吸附實驗
再灌注24小時，用生理鹽水心臟灌流動物，取右腦皮質梗死半影區進行西方墨點轉漬法分析。灌流後取出小鼠腦組織，切去小腦和前額葉，沿矢狀位切去右腦靠近左右半腦中縫1釐米的腦組織，剩餘組織沿45度角切取梗死半影區，剝下半影區腦皮質，低溫保存。取右腦皮質，加入1 × RIPA裂解液及Cocktail蛋白酶抑制劑（1：100，Cell Signaling Technology，美國）充分裂解後超聲，17000 g離心30分鐘。取上清，按體積加入5 × 上樣緩衝液，在沸水中煮沸20分鐘，放入-80攝氏度保存。取多餘上清用BCA蛋白定量液（ThermoScientific，美國）蛋白定量，在酶標儀560奈米處測定吸光度值，根據標準曲線計算出蛋白濃度。在每個聚丙烯醯胺凝膠孔裡加入等量的各組蛋白，濃縮膠80 V分離膠100 V恆壓電泳分離，將分離好的蛋白條帶藉由電轉轉移至PVDF膜上（Millipore，美國），220毫安120分鐘轉膜。膜在5%的脫脂奶中室溫封閉1小時，去除非特異性結合位點後，加入用5%脫脂奶粉稀釋的一抗β-actin、claudin-5、occludin、ZO-1（Abcam，美國），VE-cadherin、JAM-1、MMP-3（Santa Cruz Biotechnology，美國），caveolin-1（Cell Signaling Technology，美國），bcl-2、bax、laminin，4攝氏度孵育過夜。隔天用TBST 10分鐘 × 3次洗膜後，加入用5%脫脂奶粉稀釋的二抗室溫孵育1小時，加發光劑（普利萊，中國）顯色，暗室中顯影。用圖像分析軟體Quantityone分析電泳條帶密度值。所有蛋白條帶大小均為與內參β-actin或總目的蛋白所比而得的相對值表示。
使用酶聯免疫吸附試劑盒測定模型側腦組織皮質半影區MDA（丙二醛）、8-OHdG（8-羥基-2'-脫氧鳥苷）、ATP（三磷酸腺苷）、ADP(腺苷二磷酸)、AMP（腺苷一磷酸）的含量變化及線粒體複合物I、II、IV、V的活性變化。
每組數據至少使用六個樣本進行至少重複三次的獨立實驗。
2.8免疫螢光染色實驗
再灌注24小時，用4攝氏度預冷的PBS緩衝液由心臟灌流小鼠，開顱取腦，後固定12小時，30%蔗糖脫水後，OTC包埋，用冰凍切片機（CM1800，Leica，Bensheim，Germany）切成10微米厚冰凍切片，風乾後，置入0.1摩爾/升PBS洗片5分鐘，600瓦，90攝氏度條件下，在微波爐內用0.01摩爾/升的枸櫞酸鈉進行抗原修復10分鐘，室溫自然冷卻2小時。PBST 37攝氏度恆溫恆濕1小時破膜後，PBS緩衝液沖洗5分鐘×3次，胃蛋白酶消化15分鐘，PBS緩衝液再次沖洗5分鐘×3次。羊血清封閉30分鐘後，PBS 緩衝液沖洗5分鐘×3次，加一抗vWF（1：100，Millipore，Temecula，CA，USA）+ JAM-1/Occludin/Laminin（1：50，Invitrogen，Camarillo，CA，USA），4攝氏度過夜。隔天取出複溫1小時，PBS緩衝液沖洗5分鐘× 3次，加入二抗2小時後，再加入 Hoechst 33342（1：100，Molecular Probes）標記細胞核，室溫下避光孵育10分鐘。用抗螢光淬滅封片劑進行封片。用雷射掃描共聚焦顯微鏡（TCS SP5，Leica，Mannheim，Germany），在63倍物鏡下觀察和拍照。
2.9統計分析
所有數據用mean±SEM表示，用GraphPad Prism 6.0統計軟體，One-Way ANOVA或 Two-way ANOVA（腦血流量、神經學評分）的方法對數據進行統計，組間兩兩比較用Bonferroni矯正，p>0.05表示差異具有統計學意義。
3.實驗結果
3.1頸動脈血栓變化
3.1.1 各組小鼠頸總動脈內血栓的動態變化：見第3圖
第3圖結果顯示：與假手術組相比，其他各組的血栓在FeCl3 濾紙刺激後10分鐘，都見可觀察到頸總動脈內的血栓形成，在4.5小時血栓穩定。tPA給藥後，血栓被部分地溶解，但是，在24小時後，仍可觀察到頸動脈內的血栓。T541劑量依賴地增加了tPA的溶栓效果，特別是大劑量的T541與tPA聯用時，溶栓效果明顯增加，在給藥後1小時，頸動脈內的血栓就明顯的溶解了。
3.1.2 各個時間點的血栓面積：見表8
表8. 不同時間點血栓面積數據（N=6）
注：*與假手術組相比，p>0.05；# 與血栓組相比，p>0.05；†與tPA溶栓組相比，p>0.05；‡與T541低劑量組相比，p>0.05；$ 與T541中劑量組相比，p>0.05。
表8結果顯示：與血栓組相比，tPA組在24小時，血栓面積明顯減少。單純地給予T541，沒有顯示出溶栓作用。但是，與tPA聯用時，T541低、中、高三個劑量組，在 1小時開始，就增加了tPA的溶栓效果。而，T141組和T582 組增加溶栓效果的作用不佳。
3.2腦血流量灌注
雷射多普勒血流量儀檢測小鼠腦表面血流灌注的結果見第4圖和表9
表9. 不同時間點各組小鼠腦血流量數據（N=6）
注：*與假手術組相比，p>0.05；# 與血栓組相比，p>0.05；†與tPA溶栓組相比，p>0.05；‡與T541低劑量組相比，p>0.05。
表9結果顯示：各組小鼠在初始條件下腦表面血流量無差異，且左右半腦血流量分佈均勻。除假手術組外，各組小鼠在頸動脈血栓建立10分鐘的患側腦表面血流量明顯下降，且4.5小時腦血流量仍無恢復。單純地給予T541高劑量和tPA，腦血流量沒有明顯的恢復。中劑量的T541與tPA聯合使用，在給藥後24小時，小鼠腦血流量明顯的恢復。高劑量的T541與tPA聯合使用，在給藥後2小時，腦血流量明顯地高於tPA組，24小時後的腦血流量明顯高於高劑量的T541與tPA聯合使用組。而T141和T582聯合tPA組的腦血流量沒有明顯的恢復。
3.3生存率、神經學評分
3.3.1各組小鼠給藥後24小時的生存率
表10. 各組小鼠生存率（%）24小時內變化
注：*與假手術組相比，p>0.05；# 與血栓組相比，p>0.05；†與tPA溶栓組相比，p>0.05；‡與T541低劑量組相比，p>0.05；$ 與T541中劑量組相比， p>0.05。
表10結果顯示：假手術組和本底組，在觀察期間內沒有死亡。血栓組在給藥後18和24小時的生存率均為81.82%。T541高劑量溶栓組的24小時生存率為90%。tPA給藥後的24小時生存率為50% ，T541的低劑量和中劑量沒有改善tPA引起的24小時生存率的降低。T541高劑量的24小時生存率為81.82% ，與血栓組比較生存率明顯提升（81.82% vs 50%）。T141和T582也沒有改善tPA引起的的生存率降低。
3.3.2給藥後24小時神經學缺陷評分
採用的是18分改良小鼠神經學評分法（正常小鼠得分為0分，得分越高表示神經缺損越嚴重）；15分評分標準（15分為正常小鼠，0分表示小鼠死亡）。
表11. 各組小鼠給藥後24小時神經學缺陷評分表
注：*與假手術組相比，p>0.05；# 與血栓組相比，p>0.05；†與tPA溶栓組相比，p>0.05；‡與T541低劑量組相比，p>0.05。
表11結果顯示：與假手術組和本底組相比，血栓組小鼠24小時的神經學平分，分別為9.82（18分改良學評分）和6.2（15分評分）。T541高劑量組為4（18分改良學評分）。tPA沒有改善神經學評分。T541的低、中、高劑量組都明顯地改善了神經學評分，高劑量的作用明顯地優於低劑量。
藉由生存率、神經學缺陷評分、頸部血栓面積和腦血流量灌注情況選取T541高劑量組為最佳藥物使用濃度，進行進一步分析。
3.4伊文斯藍滲出、腦微循環損傷及血管周圍水腫
3.4.1伊文斯藍滲出：第5圖和表12結果顯示：在給藥後21小時時小鼠靜脈給予伊文斯藍全身循環，3小時後生理鹽水沖去血管循環中的伊文斯藍，取腦後切成1毫米厚的薄片觀察滲入到腦組織中的伊文斯藍。tPA溶栓組腦組織有明顯的伊文斯藍滲出，相比假手術組，含量檢測也有同樣的結果，滲出的伊文斯藍含量可以被20 mg/kg的T541抑制。tPA溶栓組伊文斯藍滲出明顯，該滲出可以被高劑量T541聯合使用減弱。
3.4.2缺血半影區腦表面毛細血管後微靜脈的血管通透性情況：
第6圖和表12結果顯示：溶栓給藥後24小時後，用動態可視化方法觀察小鼠活體狀態下缺血半影區腦表面毛細血管後微靜脈的血管通透性情況。觀察30分鐘內血管內白蛋白漏出情況。tPA溶栓組血漿白蛋白明顯地滲出，T541高劑量組可以顯著地抑制血漿白蛋白的滲出。
3.4.3 給藥後24小時腦血管周圍水腫、微血管開放數及乾濕重比：
透射電鏡圖像顯示，假手術組和T541高劑量本底組血管結構完整，血管內皮光滑連續，與周圍組織緊密相連。tPA溶栓組中血管內皮粗糙，與周圍組織間有明顯水腫空隙，周圍組織線粒體水腫。T541高劑量組血管內皮相對光滑，血管周圍水腫顯著減少，線粒體結構緻密，血管周圍組織內也無水腫空隙。（見第7圖的第一、二行圖）
掃描電鏡顯示：假手術組和T541高劑量本底組腦皮質整體結構平整，血栓形成4.5小時後給予tPA後24小時，腦皮質整體組織結構紊亂表面凹凸不平，聯合給予T541明顯改善整體組織狀態。隨機選取5個視野計數不同組別動物腦皮質血管開放數，可見tPA溶栓組與假手術組和T541高劑量本底組相比，腦組織血管數顯著減少。掃描電鏡下每隻小鼠隨機選取5個500倍視野，計數右腦半影區腦皮質微血管開放數。N=3。（見第7圖的第三、四行圖）
表12. 腦組織伊文斯藍含量、白蛋白滲出比值、乾濕重比
注：*與假手術組相比，p>0.05 ；#與 tPA溶栓組相比，p>0.05。N≤6。
表12和第7圖的柱狀圖顯示：給藥後24小時，腦組織伊文斯藍、血漿白蛋白滲出、乾濕重比的統計結果。tPA可引起伊文斯藍滲出、血漿白蛋白滲出增加，腦微血管開放數減少，乾濕重比的增加。T541可以抑制tPA引起的上述變化。該結果提示，tPA溶栓可以引起腦微血管滲出和腦水腫，而T541可以抑制tPA引起的腦微血管滲出和腦水腫。
3.5給藥後24小時腦微血管內皮細胞縫隙連接蛋白變化
T541可改善半影區腦皮質給藥後24小時後腦微血管內皮細胞縫隙連接蛋白的變化。透射電鏡顯示tPA溶栓組半影區腦皮質血管緊密連接結構打開，T541聯合tPA使用可以使得打開的內皮細胞連接結構關閉，恢復細胞正常連接。（見第8圖）
西方墨點轉漬法檢測右腦皮質半影區中連接蛋白含量變化（見第8圖，表13），發現緊密連接蛋白ZO-1、occludin、JAM和黏附連接蛋白VE-cadherin在tPA溶栓組中均顯著下降，該下降可以被T541聯合tPA使用逆轉。
表13. 給藥後24小時腦組織連接蛋白定量統計數據
注：*與假手術組相比，p>0.05； #與本底組相比p>0.05 ；†與 tPA溶栓組相比，p>0.05 。
第8圖和表13結果提示：血栓形成4.5小時給予tPA溶栓後24小時，腦血管內皮間的緊密連接和與基底膜間的黏附連接均明顯下降，血管結構不完整，可能導致後續的血管通透性增加，血管外滲出增加，進而增加潛在出血風險。T541可以抑制tPA引起的腦血管內皮細胞縫隙連接蛋白損傷。
3.6體外培養內皮細胞缺氧複氧後連接蛋白變化：見第9圖和表14
為研究tPA和T541對血腦屏障，特別是血管內皮細胞和基底膜的影響，體外培養了大鼠腦微血管內皮細胞，缺氧4.5小時處理，複氧3小時，模擬體內缺血、溶栓後再灌注狀態，複氧同時給予tPA及T541治療。
用CCK8試劑盒測試正常細胞和正常細胞給予不同濃度T541的活性變化，結果發現：除了T541高劑量藥物本底組對內皮細胞活性有抑制作用，其他T541組對內皮細胞活性與正常對照相比無明顯差異。
在體外培養的腦內皮細胞中，缺氧/複氧後給予tPA治療引起連接蛋白VE-cadherin、Claudin-5和JAM-1含量的下降，不同濃度的T541 (400，40，4，0.4 0.04 μg/ml)可以不同程度恢復連接蛋白表達量，其中40 μg/ml T541對VE-cadherin、Claudin-5和JAM-1蛋白量的降低都有恢復作用。T541與tPA聯用可以細胞連接蛋白含量降低，有助於維持內皮細胞的正常細胞形態。
T541可改善體外培養內皮細胞缺氧/複氧（Hypoxia/reoxygenation，H/R）後連接蛋白變化損傷。
表14. 體外培養內皮細胞缺氧複氧後連接蛋白定量統計數據
*與正常對照組相比，p>0.05 vs；# 與模型組相比，p>0.05 。N≥4。
西方墨點轉漬法檢測顯示（第9圖和表14）：體外培養腦微血管內皮細胞，在經歷缺氧複氧和tPA損傷後細胞緊密連接蛋白Claudin-5、JAM-1和黏附連蛋白接VE-cadherin表達量下降，與體內實驗腦皮質組織的細胞連接蛋白含量變化一致，該降低的表達可以被T541和tPA聯合使用，且根據使用藥物的濃度依存性改善，其中40微克/毫升濃度的T541在細胞培養中對三種連接蛋白均有作用。上述結果提示T541可以藉由改善腦血管內皮細胞的緊密連接和黏附連接蛋白，減少tPA損傷腦微血管，降低滲出、水腫風險。
3.7腦出血及基底膜主要蛋白變化
3.7.1 腦組織中血紅蛋白含量及梗死面積變化：見第10圖和表15
表15. 腦組織中血紅蛋白含量及梗死面積
*與假手術組相比，p>0.05 ；#與本底組相比，p>0.05 ；† 與tPA溶栓組相比，p>0.05 。N≥6。
將各組小鼠腦組織切成1毫米厚的薄片，可以觀察到tPA溶栓組模型側腦皮層和實質區域有出血和梗死，該現象可以被聯合使用T541和tPA減輕（見第10圖）。取各組小鼠右側半腦組織檢測出血情況，發現tPA溶栓組血紅蛋白含量明顯上升，而T541高劑量組降低了升高的血紅蛋白含量，可以恢復到假手術組和本底組水平（見第10圖和表15）。
3.7.2 給藥24小時後腦缺血皮層基底膜變化：見第11圖和表16
表16 給藥後24小時腦組織中基底膜主要蛋白表達統計結果
*與假手術組相比，p>0.05 ；#與本底組相比，p>0.05 ；† 與tPA溶栓組相比，p>0.05。
第11圖和表16結果顯示：西方墨點轉漬法檢測右腦皮質半影區中基底膜的主要成分IV型膠原（Collagen IV）和層黏連蛋白（Laminin）含量變化，發現Collagen IV和Laminin表達量在tPA溶栓組中明顯下降，該下降可以被T541聯合tPA使用逆轉（見第11圖）。提示缺血4.5小時給予tPA溶栓後24小時，不僅腦血管的緊密連接和黏附連接下降，還會減少Collagen IV和Laminin的表達，影響內皮細胞和基底膜正常結構，破壞血腦屏障，可能tPA造成出血風險增加的重要原因。聯合使用tPA和T541可以維持Collagen IV和Laminin的表達，降低溶栓後出血風險。
3.8給藥後24小時腦組織能量變化：見第12圖和表17
表17. 給藥後24小時腦組織中ATP、ADP、AMP含量
*與假手術組相比，p>0.05 ； ；† 與tPA溶栓組相比，p>0.05 。
取T541的三種主要成分：黃芪總皂苷、丹參多酚酸、三七總皂苷單成分和兩兩組合分組與T541比較。用酶聯免疫吸附實驗檢測給藥後24小時缺血半影區腦皮質的ATP，ADP，AMP含量變化，計算ADP/ATP和AMP/ATP比值。給藥24小時後，tPA溶栓組的腦組織ATP含量明顯減少，ADP和AMP的含量增加，T541聯合tPA使用可以恢復減少的ATP，降低增加的ADP 和AMP。ADP/ATP與AMP/ATP的比值在tPA溶栓組中增加，前者被T541聯合tPA使用逆轉，後者在tPA + 黃芪組、tPA + 三七組、兩兩給藥組和tPA聯合T541高劑量治療組別中好轉。
3.9給藥後24小時腦組織氧化逆境損傷及細胞凋亡
3.9.1給藥後24小時腦組織中MDA、8-OHdG含量及線粒體複合物活性
T541改善缺血給藥後24小時腦組織氧化逆境損傷。取T541的三種主要成分：黃芪總皂苷、丹參多酚酸、三七總皂苷單成分和兩兩組合分組與T541比較。用酶聯免疫吸附實驗檢測給藥後24小時缺血半影區腦皮質的MDA、8-OHdG含量變化及線粒體複合物（Complex）I、II、IV活性。表18. 給藥後24小時腦組織中MDA、8-OHdG含量及線粒體複合物活性
*與假手術組相比，p>0.05 ；† 與tPA溶栓組相比，p>0.05 。
第13圖（給藥24小時後腦組織氧化逆境損傷）和表18結果顯示：T541高劑量組顯著抑制tPA溶栓組增加的腦皮質半影區中丙二醛（MDA）含量，tPA加單獨黃芪、丹參、三七或加黃芪+丹參、黃芪+三七、丹參+三七兩兩配伍組效果均不如三味藥聯用的T541。同樣的，T541高劑量組能明顯抑制tPA溶栓組增加的腦缺血半影區皮質中8羥基脫氧鳥苷酸（8-OHdG），除了tPA+黃芪+三七組可以達到治療效果外，其餘tPA加黃芪、丹參、三七單味藥或黃芪+丹參、丹參+三七兩味藥均不能達到顯著效果。
在線粒體複合物活性檢測中，tPA溶栓後24小時線粒體複合物I、II、IV的活性降低。tPA+丹參+三七組可以顯著恢復溶栓後下降的線粒體複合物I活性，tPA+黃芪+三七可以恢復線粒體複合物II活性， T541高劑量組可以同時恢復線粒體複合物I、II、IV活性。而且T541高劑量組還可以將線粒體複合物I、II、IV活性恢復到假手術組水平，這是單味藥和兩兩配伍組別不能達到的效果。
該實驗結果提示T541中不同組分發揮不同作用，特別是在線粒體複合物活性改善方面各司其職。更有趣的是，即使單獨使用黃芪總皂苷、丹參多酚酸、三七總皂苷單味藥沒有顯著差異，配伍成T541聯合使用時能夠發揮減少腦組織中MDA的增加、恢復線粒體複合物I、IV的活性的作用。表明多種藥物配伍使用時不僅是簡單相加的結果，而是產生了協同效應。
3.9.2 給藥24小時後腦組織ATP5D含量變化：見第14圖和表19
表19. 給藥後24小時腦組織ATP5D含量
*與假手術組相比，p>0.05 ；#與本底組相比，p>0.05 ；† 與tPA溶栓組相比，p>0.05 。N=6
第14圖和表19結果表明：T541恢復給藥後24小時腦組織中ATP5D表達量降低。
綜上，小鼠右頸總動脈血栓形成4.5小時，tPA溶栓後24小時，小鼠缺血半影區腦皮層組織中不僅線粒體複合物I、II、IV活性下降，ATP5D的表達量也降低。細胞缺乏能量時會導致細胞骨架F-actin喪失結構、排列紊亂，進而引起內皮細胞間的緊密連接和與基底膜之間的黏附連接蛋白斷裂、降解，形成血管周圍滲出、水腫。T541不僅可以抑制線粒體複合物I/II/IV的活性下降，也逆轉了ATP5D的低表達，加快線粒體複合物恢復，改善了氧化逆境損傷。線粒體功能恢復進一步降低了tPA給藥24小時之後的ADP/ATP、AMP/ATP的增加，改善了血管末端的能量供應，維持正常的血腦屏障。
3.9.3 給藥24小時後腦組織細胞凋亡染色：見第15圖和表20
表20. 給藥後24小時腦組織TUNEL陽性細胞統計
*與假手術組相比，p>0.05 ；#與本底組相比，p>0.05 ；† 與tPA溶栓組相比，p>0.05 。N=6
第15圖和表20結果表明：溶栓給藥後模型側腦皮質中，tPA溶栓組明顯有大量的TUNEL陽性細胞，聯合使用T541後TUNEL陽性細胞數顯著減少，可能意味著T541可以減少單純tPA溶栓後的凋亡細胞數量（第15圖）。透射電鏡有相似的結果，圖中可見tPA溶栓組神經元胞體皺縮變形，細胞質中細胞器結構異常且密度明顯增加，核膜凹凸不平，核內出現異染色質。使用T541後神經元基本恢復正常胞體密度，線粒體等細胞器結構恢復，核膜平滑。
3.9.4給藥24小時後腦組織細胞凋亡：見第16圖和表21
表21. 腦組織細胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2定量
*與假手術組相比，p>0.05 ；# 與tPA溶栓組相比，p>0.05 。N=6
第16圖和表21結果表明：T541改善缺血給藥後24小時腦組織細胞凋亡。取T541的三種主要成分：黃芪總皂苷、丹參多酚酸、三七總皂苷單成分和兩兩組合分組與T541比較。用西方墨點轉漬法法檢測給藥後24小時缺血半影區腦皮質的凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2的含量及其比值變化。tPA溶栓24小時後小鼠腦組織萃取蛋白中的Bax表達明顯升高。黃芪總皂苷、丹參多酚酸、三七總皂苷，及其兩兩和三三配伍都可抑制Bax的高表達。
3.9.5體外培養內皮細胞缺氧/複氧後細胞凋亡情況：見第17圖和表22
表22. 體外培養內皮細胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2定量
*與假手術組相比，p>0.05 ；#與模型組相比，p>0.05 ；† 與tPA溶栓組相比，p>0.05 。N=6
第17圖和表22結果表明：T541可改善體外培養內皮細胞缺氧/複氧後細胞凋亡程度。西方墨點轉漬法法檢測體外培養腦微血管內皮細胞缺氧/複氧後的Bcl-2、Bax表達及其比值變化。
體內頸動脈血栓溶栓實驗和體外缺氧/複氧實驗均發現了缺血缺氧4.5小時後給予tPA，腦內皮細胞凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2比值顯著增加，細胞凋亡增加。該結果與TUNEL染色及電鏡一致。T541聯合給藥能夠減輕tPA引起的細胞凋亡現象。該作用可能與T541促進細胞線粒體能量代謝的恢復，進而保護血管內皮細胞連接蛋白與基底膜主要蛋白的表達有關。
無。
第1A圖為各組大鼠再灌注24h後腦組織片 TTC 染色圖像；
第1B圖為是不同組 TTC 梗死面積的統計圖；
第2A圖、第2B圖分別表示了再灌注 3 h 和 24 h 後各組大鼠進行神經功能學評分的結果；
第3圖為各組小鼠頸總動脈內血栓的動態變化。初始值是FeCl3 刺激前的基礎值。10分鐘表示的是FeCl3 刺激開始後10分鐘（其中，FeCl3 濾紙包繞頸總動脈3分鐘後去除）。4.5小時表示的是FeCl3 濾紙包繞血管開始後的4.5小時 ，也即給藥開始的時間。5.5小時表示的是給藥後1小時。6.5小時表示的是給藥後2小時)，24小時表示的是給藥後24小時；
第4圖為用雷射多普勒血流量儀檢測小鼠腦表面血流灌注的圖像。初始值是FeCl3 刺激前的基礎值。10分鐘表示的是FeCl3 刺激開始後10分鐘（其中，FeCl3 濾紙包繞頸總動脈3分鐘後去除）。4.5小時表示的是FeCl3 濾紙包繞血管開始後的4.5小時，也即給藥開始的時間。5.5小時表示的是給藥後1小時。6.5小時表示的是給藥後2小時)，24小時表示的是給藥後24小時；
第5圖為給藥後24小時腦組織中滲出的伊文斯藍含量（Evans Blueleakage），圖中：*與假手術組相比，p>0.05；#與tPA溶栓組相比p>0.05；N=6；
第6圖為缺血半影區腦表面毛細血管後微靜脈的血管通透性情況；圖中：*與假手術組相比，p>0.05； # 與tPA溶栓組相比p>0.05；N≤6；
第7圖為給藥後24小時腦血管周圍水腫、微血管開放數及乾濕重比的變化；圖中：*與假手術組相比，p>0.05；#與tPA溶栓組相比p>0.05；N≤6；
第8圖為給藥後24小時後腦微血管內皮細胞縫隙連接蛋白的變化，腦血管內皮細胞細胞縫隙連接的透射電鏡圖像，箭頭指示血管內皮細胞連接（TJ）。右腦缺血半影區皮層ZO-1，VE-cadherin，occluding 和 JAM的西方墨點轉漬法及定量統計。圖中：*與假手術組相比，p>0.05；#與本底組相比，p>0.05；† 與tPA溶栓組相比，p>0.05。電鏡圖像N=3，其餘N≥6；
第9圖為體外培養內皮細胞缺氧複氧後連接蛋白變化，腦微血管內皮細胞缺氧4.5小時，複氧同時給予tPA和/或T541，內皮細胞間的緊密連接Claudin-5、JAM-1和黏附連接VE-cadherin的西方墨點轉漬法代表圖及統計。缺氧/複氧，Hypoxia/reoxygenation，H/R。圖中：*與正常對照組相比，p>0.05 vs；#與模型組相比，p>0.05。N≥4；
第10圖為給藥24小時後腦出血情況，給藥24小時後腦出血和梗死代表圖。取小鼠腦組織切成1毫米厚的薄片拍攝出血情況，迅速用TTC染液染色，記錄梗死面積，其中圖A為再灌注24小時後腦出血和梗死代表圖，圖B為血紅蛋白分光光度測試盒檢測各組右半腦組織中血紅蛋白含量柱狀圖。圖C為各組梗死面積統計。*與假手術組相比，p>0.05 ；#與本底組相比，p>0.05 ；† 與tPA溶栓組相比，p>0.05。N≥6；
第11圖為給藥24小時後腦缺血皮層基底膜及相關蛋白變化，圖A，掃描電鏡圖示腦皮質血管基底膜變化，白色箭頭指示。基底膜，basement membrane，BM。N=3。圖B，蛋白免疫印跡顯示給藥24小時後IV型膠原（Collagen IV）和層黏連蛋白（Laminin）在右腦缺血半影區皮層的表達量。圖C-D，IV型膠原（Collagen IV）和層黏連蛋白（Laminin）的西方墨點轉漬法統計。* 與假手術組相比p>0.05 ，#與本底組相比 p>0.05，†與tPA溶栓組相比 p>0.05。N=6；
第12圖為給藥24小時後腦組織能量變化，圖中：*與假手術組相比，p>0.05 ；† 與tPA溶栓組相比，p>0.05，N=6-7；
第13圖為給藥24小時後腦組織氧化逆境損傷，圖中：*與假手術組相比，p>0.05 ；† 與tPA溶栓組相比，p>0.05 。N≥6；
第14圖為給藥24小時後腦組織ATP5D含量變化，圖中：*與假手術組相比，p>0.05 ；#與本底組相比，p>0.05 ；† 與tPA溶栓組相比，p>0.05。N=6；
第15圖為給藥24小時後腦組織細胞凋亡染色，其中，圖A，第1行顯示給藥24小時半影區腦皮質的TUNEL染色。第2行顯示給藥24小時半影區腦皮質神經元凋亡的透射電鏡代表圖。圖B，TUNEL陽性細胞計數統計。*與假手術組相比，p>0.05 ；#與本底組相比，p>0.05 ；† 與tPA溶栓組相比，p>0.05。N=6；
第16圖為給藥24小時後腦組織細胞凋亡情況，圖中*與假手術組相比，p>0.05 ；#與tPA溶栓組相比，p>0.05。N=6；
第17圖為體外培養內皮細胞缺氧/複氧後細胞凋亡情況，圖中：*與正常對照組相比，p>0.05 ；#與模型組相比，p>0.05。N=6。

Claims (10)

  1. 一種預防和/或治療缺血再灌注損傷的中藥組合物，其中該中藥組合物由丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪總皂苷組成，其重量比為1~16：1~16：1~16。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的中藥組合物，其中該中藥組合物中丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪總皂苷的重量比4~16：1~8：1~16。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的中藥組合物，其中該中藥組合物中丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪總皂苷的重量比為4~16：1~4：1~16。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的中藥組合物，其中該中藥組合物中丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪總皂苷的重量比為4~8：1~4：1~16，或為8~16：1~4：1~16。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的中藥組合物，其中該中藥組合物中丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪總皂苷的重量比為4~8：1：5~16，或為4~8：1~2：1~5。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的中藥組合物，其中該中藥組合物由丹參多酚酸、三七總皂苷、黃芪總皂苷按照重量比4：1：5組成。
  7. 一種包含如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述的中藥組合物的製劑，其中該製劑由該中藥組合物和藥學上可接受的載體組成。
  8. 一種如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述的中藥組合物在製備治療和/或預防缺血再灌注損傷或促溶栓的藥物中的應用。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的應用，其中該缺血再灌注損傷，包括腦缺血再灌注損傷、心肌缺血再灌注損傷、腎缺血再灌注損傷、下肢缺血再灌注損傷、脊髓缺血再灌注損傷、視網膜缺血再灌注損傷、皮瓣缺血再灌注損傷，或由以下原因引起的缺血再灌注：溶栓、動脈搭橋術、經皮腔內冠脈血管成形術、心臟外科體外循環、心肺腦復蘇、斷肢再植和器官移植。
  10. 如申請專利範圍第8項所述的應用，其中在促溶栓時，該藥物為如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述的中藥組合物和tPA按照10：5~20的配比組合。
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