CN103385920A - 芪参益气滴丸新用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了芪参益气滴丸在制备预防和/或治疗心肌损伤或心脏微循环障碍药物中的应用，本发明发现芪参益气滴丸预给药可以逆转缺血再灌注引起的心脏血流下降，减少缺血再灌注引起的心肌梗死面积，调控心肌能量代谢，抑制缺血再灌注引起的ATP 5D蛋白表达的降低，抑制ADP/ATP和/或AMP/ATP比值的升高。

Description

芪参益气滴丸新用途

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其是涉及芪参益气滴丸在制备预防和/或治疗心肌损伤或心脏微循环障碍药物中的应用。

背景技术

介入治疗已经成为急性冠脉综合征的主要治疗方法，但是，由于缺血再灌注损伤，介入治疗并没有降低严重心脏事件的发生率（Kawano H等人，International heartjournal.2005;46:327-332），所以，抑制缺血再灌注损伤对于减少介入后心肌再损伤有重要的临床意义。缺血再灌注损伤由血管阻塞期的缺血缺氧和血管再通后的再灌注损伤共同构成。缺血引起的ATP降解，不仅是再灌注后过氧化物产生的基础，也可引起心肌和血管内皮细胞损伤。以往的研究多关注过氧化物产生、粘附分子表达、炎性因子释放、细胞凋亡等环节，虽然取得了一些研究进展，但是，在临床上尚没有获得满意的疗效。

缺血再灌注引起的心肌ATP的降解，可引起心肌细肌丝的F-actin降解，及粗肌丝的MLC磷酸化（Han YS等人，PloS one.2010;5:e9528）。有报道称肌丝细胞骨架的变化能降低ATP合酶的水平，并最终造成心功能损伤。ATP合成酶α、δ是ATP合成酶的两个亚基，可以增加ATP含量。但是，缺血再灌注后心肌ATP合成酶α、δ发生了哪些变化，尚不清楚。因此，通过调控能量代谢，增加心肌的ATP含量，可能成为维护心肌结构，进而改善心功能的新的靶点。

另一方面，ATP的降解引起的F-actin解聚，可以导致微血管内皮细胞紧密连接蛋白Occludins、Claudins、JAMs、ZO-1的解聚，从而增加微血管通透性。另外，心脏血管内皮细胞的AQP-1、Caveolae也影响血管内皮细胞通透性。Src激酶活化细胞质膜微囊上的白蛋白受体gp60、Caveolin-1，使白蛋白与gp60其结合，通过跨膜转运途径引起白蛋白漏出。AQP-1是一种水通道蛋白，能引起微血管周围水肿，加重缺血再灌注引起的心肌损伤。

芪参益气制剂为黄芪、丹参、三七、降香成分制成的中药制剂，芪参益气滴丸能够显著改善心肌损伤、心功能减退的各种症状，具有剂量小、服用方便、溶出速度快、可直接经粘膜吸收入血、生物利用度高、疗效高及无胃肠刺激、无明显毒副作用的特点。用于：慢性心功能不全、心肌炎及后遗症、心肌梗塞恢复期、心肌纤维化。

临床前药效学试验表明，本品可以使心肌梗塞犬的梗塞范围缩小，缺血性心电图改善，血清酶CK和LDH活性降低，血浆ET和TXB2水平降低，6-Keto-PGF1α活性和6-Keto-PGF1α/TXB2比值升高；可使心肌缺血再灌注损伤大鼠的梗塞范围缩小，SOD活性增加。本品可使大鼠体外血栓长度缩短，重量减轻，并可使血浆及全血粘度降低；可使高脂血症家兔的TC、TG、LDL-C、VLDL-C水平降低，HDL-C水平升高，使主动脉TC含量和肝脏TG及MDA含量降低；并可使花生四烯酸和胶原诱导的血小板聚集率降低；犬血流动力学试验表明，本品可通过扩张冠脉血管使冠脉流量增加，使心肌耗氧指数降低；在不增加左室做功情况下，使心搏出量和心输出量增加等。

药物代谢动力学研究结果显示口服芪参益气滴丸后1h内达到最高血药浓度。研究显示芪参益气滴丸能减轻主动脉弓缩窄压力超负荷诱导的心肌肥大和炎症性心肌纤维化。

但是芪参益气滴丸是否能够预防或治疗心脏缺血再灌注，包括缺血再灌注引起的心肌损伤或心脏微循环障碍尚不清楚；芪参益气滴丸能否改善心肌能量，其改善心肌能量是否与改善ATP合成酶；芪参益气滴丸能否改善心肌功能：芪参益气滴丸能否改善缺血再灌注引起的心脏冠状血管细静脉通透性的变化，能否调整与微血管通透性有关的血管内皮细胞缝隙连接蛋白和脂膜微囊蛋白等尚未见报道。

为解决上述技术问题，本发明对芪参益气滴丸进行了研究，发现其具有预防和/或治疗心肌损伤或心脏微循环障碍作用。

发明内容

本发明的目的在于提供芪参益气滴丸在制备预防和/或治疗心肌损伤或心脏微循环障碍的药物中的应用。

本发明所述应用，其中芪参益气滴丸可以逆转缺血再灌注引起的心脏血流下降。

本发明所述应用，其中芪参益气滴丸可以减少缺血再灌注引起的心肌梗死面积。

本发明所述应用，其中芪参益气滴丸可以调控心肌能量代谢，抑制缺血再灌注引起的ATP 5D蛋白表达的降低，抑制ADP/ATP和/或AMP/ATP比值的升高。

本发明所述应用，其中芪参益气滴丸可以调节心脏功能，抑制缺血再灌注引起的心室收缩压和左心室内压最大上升速率的降低，抑制缺血再灌注引起的左心室舒张压、左心室舒张末期压和左心室内压最大下降速率的上升。

本发明所述应用，其中芪参益气滴丸可以抑制缺血再灌注引起的心脏细静脉血浆白蛋白的漏出。

本发明所述应用，其中芪参益气滴丸可以保护心脏微血管内皮细胞间连接的完整性，减少血管内皮细胞中质膜微囊，抑制心脏细静脉内皮细胞紧密连接蛋白表达的降低。

本发明所述应用，其中芪参益气滴丸可以改善缺血再灌注引起的心肌间质水肿和心脏纤维断裂，抑制缺血再灌注引起的心肌F-肌动蛋白减少。

本发明试验例中大鼠中有效剂量为0.6g/kg，根据动物剂量与人体剂量的换算公式：

D_b=D_a*R_ab（其中为D_b人体剂量，D_a为动物剂量，R_ab为人与动物的剂量换算系数，人与大鼠的换算系数为0.17），可计算得到人的服药剂量为100mg/kg。

本发明所述芪参益气滴丸，属于现有技术，在市场上可以购买得到。也可按照现有技术制备得到，本发明所述芪参益气滴丸，其中药材各组分的重量百分比如下：

黄芪22.2%-66.8%，

丹参11.6%-33.4%，

三七2.5%-13.5%，

降香14.5%-44.3%。

优选地，所述组分的含量：黄芪44.7%、丹参26.7%、三七6.3%、降香22.3%。

或

黄芪41.2%、丹参23.8%、三七4.5%、降香30.5%。

本发明的芪参益气滴丸制备方法为：取丹参、三七药材，用水煎煮，滤过，滤液浓缩后用乙醇沉淀，上清液回收乙醇，浓缩成浸膏，即丹参三七浸膏；另取黄芪，水煎煮，滤过，滤液浓缩后用乙醇沉淀，上清液回收乙醇，浓缩成浸膏，即黄芪浸膏；取降香，加水回流提取，收集降香挥发油；将以上丹参三七浸膏，黄芪浸膏，及降香挥发油和滴丸辅料混合均匀后，按照制剂学常规技术，制成滴丸剂。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

试验例一

材料与方法

动物

雄性SD大鼠，体重240-260g，购于北京大学医学部动物中心，合格证号：SCXK（京）2006－0008。动物饲养在温度为22±2℃，湿度为40±5%的条件下，自由饮食、饮水，12h光照/黑暗交替。实验前动物禁食12h，但自由饮水。实验操作规程按欧委会指南（2010/63/EU）、北京大学动物研究委员会指南执行。实验草案获北京大学医学部实验动物伦理委员会批准（LA2010-001）。

药物和试剂

芪参益气滴丸(QSYQ)（批号：20091005）由天津天士力制药股份有限公司提供（天津，中国），并严格按照药品生产质量管理规范和药品安全性试验规范的要求生产，其主要成分的含量用HPLC指纹图谱测定。实验前用生理盐水配成30mg/ml和150mg/ml浓度的液体。

FITC标记白蛋白购于Sigma公司，用生理盐水配成10mg/ml的溶液，4℃保存。Evans Blue购于Sigma公司，用生理盐水配成0.35%的溶液，现用现配。氯化三苯四唑（TTC）购自AMRESCO公司，用磷酸盐缓冲液配成0.375%的溶液，室温保存。戊巴比妥钠购于北京化学试剂公司，用生理盐水配成2%的溶液，室温保存。ATP、ADP、AMP ELISA检测试剂盒购于北京环亚泰克生物医学技术有限公司。P-MLC、P-Src、P-Cav-1一抗购于CST公司。ATP synthaseα一抗购于BD公司。Occludin、AQP-1一抗购于Abcam公司。ATP5D、Claudin-5、JAM-1、ZO-1一抗购于Santa Cruz Biotechnology公司。

大鼠心脏缺血再灌注模型的建立和给药方法

240-260g雄性SD大鼠用2%戊巴比妥钠（60mg/kg）腹腔注射麻醉。仰卧位固定大鼠，经口行气管插管，插管另端与小动物呼吸机相连，行加压呼吸（呼吸比为1∶1，呼吸频率75/min，潮气量12ml/kg）。胸部去毛、消毒，沿胸骨左侧开胸，剪断第3肋骨，暴露心脏。剪开心包膜，用穿有5-0缝合线的3/8弯针穿过肺动脉圆锥与左心耳交界稍下(1～2)mm处，在缝合线与心肌组织间放一根棉线，结扎缝合线造成缺血。结扎30min后，解开缝合线即发生再灌注。假手术组只穿线不结扎。

给药组，于缺血前90min，用QSYQ 30mg/ml和150mg/ml的生理盐水溶液，按0.12g/kg，0.6g/kg的给药量，一次性灌胃给药。Sham组和I/R，于缺血前90min，按4ml/kg的量灌胃给予生理盐水。

心脏表面血流量的测定

开胸暴露心脏，用连接计算机的激光多普勒血流灌注成像仪PeriScanPIM3(PeriScan PIM3System;PERIMED,Stockholm,Sweden)记录在缺血前（Baseline），缺血30min以及再灌注30min、60min、90min时心脏表面血流量。用LDPIwin3.1(PeriScan PIM3System;PERIMED,Stockholm,Sweden)对图像进行测量和数据评估。以缺血再灌注前的左心室灌注量为基础值，计算左心室灌注量的变化率。

心功能检则

经右侧颈动脉插管至左心室，导管与生物机能实验系统（BL-420F，成都泰盟科技有限公司，成都，中国）连接，监测左心室缺血前，缺血30min以及再灌注30min、60min、90min时心率（HR）、左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张压（LVDP）、左心室舒张末期压（LVEDP）、左室内压最大上升速率（+dp/dtmax)、左室内压最大下降速率（-dp/dtmax）。LVSP、LVDP、LVEDP用于评价心肌收缩射血效能；+dp/dtmax用于评价心脏收缩性能；-dp/dtmax用于评价心脏舒张性能。

血浆白蛋白的漏出

再灌注90min后，将FITC标记的血浆白蛋白(Sigma-Aldrich,St Louis,USA)按50mg/kg的剂量，经股静脉缓慢推入。荧光图像通过与正立荧光显微镜(DM-LFS,Leica,Solms,Germany)相连的SIT摄像机(EB-CCD Camera C7190;Hamamatsu,Shizuoka,Japan)记录，以455nm激发光，汞灯作为发射光源（100W）。用Image-Pro Plus 6.0软件(Media Cybernetic,Bethesda,MD,USA)测定细静脉血管内（Iv）、外（Ii）的FITC荧光强度，用Ii/Iv表示漏出血管外的白蛋白的强度。

心肌梗死面积的测定

再灌注90min后，重新结扎冠状动脉左前降支，由股静脉快速推注0.35%EvansBlue 2ml；打开胸腔，取出心脏，从心尖部向结扎线的方向，将心脏横切成1mm厚的5个薄片，放入0.375%的TTC染液中，37℃孵育15min，用连有Digital sight(DS-5M-U1，NIKON，Nanjing，China)的解剖镜拍摄心脏薄片，其中，梗死区被染成白色，缺血区为白色+红色，非梗死区呈蓝色。用Image-Pro plus 6.0(Media Cybernetic,Bethesda,MD,USA)图像分析软件测量每个薄片中梗死区面积（Infarct area）、缺血区面积（AAR）和左心室面积（LV）。计算5个薄片缺血区面积与左心室面积百分比的均值AAR/LV(%)；计算5个薄片梗死区面积与缺血区面积百分比的均值Infarct area/AAR(%)，用来表示心肌梗死的程度。

组织形态学染色

再灌注90min后，打开胸腔，取出心脏，置于4%的多聚甲醛溶液固定48h，用于制备石蜡切片。石蜡切片（5μm）用于苏木精伊红染色（HE染色），用生物显微镜，在20倍物镜下观察和拍照。

心肌细胞凋亡的检测

各组分别于再灌注90min，用生理盐水冲净组织中的血液，再用4%的多聚甲醛灌流固定心脏48h后制备石蜡切片（5μm）。用TUNEL（脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法）染色法来检测凋亡细胞，实验选用原位凋亡检测试剂盒(Roche)，实验过程参照厂家说明。在左室梗死区域边缘随即选取5个视野，用激光扫描共聚焦显微镜系统(Radiance2100,Axiovert 200,Zeiss,Germany），在63倍物镜下，进行观察和拍照。

免疫荧光组织化学染色和F-actin染色

再灌注90min后，用生理盐水灌流后，切取心尖到结扎线的中间1/3心脏，置于4%多聚甲醛溶液，组织用OTC包埋，制作成冰冻切片（10μm）。当切片完全吹干后，用0.01M的枸橼酸钠进行抗原修复，PBS缓冲液冲洗3次，3%山羊血清封闭0.5h后，加PBS稀释的一抗，4℃，孵育过夜。所用一抗如下：小鼠来源的Claudin-5（1:100，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）和兔来源的vWF（1:100,Millipore,Temecula,CA,USA）。PBS冲洗后，孵育二抗：549抗小鼠二抗（红色）和488抗兔二抗（绿色）(KPL，Gaithersburg，MD，USA)37℃恒温恒湿箱中避光孵育2h，PBS洗，用Hoechst 33342（1:100，MolecularProbes）标记细胞核，室温孵育10min，PBS洗，封片。用罗丹明鬼笔环肽（R415，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）标记心肌F-actin，激光扫描共聚焦显微镜（TCS SP5,Leica,Mannheim,Germany），在40倍物镜下观察和拍照。

心脏超微结构的观察

再灌注90min后，打开胸腔，切断心脏。在左心室缺血梗死区周围，切取两块1mm³的新鲜组织，迅速用3%戊二醛固定液固定，4℃过夜，冲洗液洗3次后，再用1%锇酸固定液后固定2h，继用50%、70%、90%、100%、100%丙酮逐级脱水，每步10-15min，用100%丙酮与包埋剂按1∶1配制的混合液浸透1h，再换成全包埋剂覆盖。用Epon 812包埋剂包埋，待包埋剂固化后进行修块、切片，切片厚度为60nm。用醋酸铀和柠檬酸铅对超薄切片进行染色，在透射电镜(JEM 1230,JEOL,Tokyo,Japan)下观察、拍片。

能量测定

再灌注90min后，用生理盐水灌流后，取出心脏。取左心室（结扎线下约2mm）组织，迅速置于液氮中速冻，保存于-80℃冰箱，一周内用于检测心肌组织中ATP、ADP、AMP的含量。用蛋白提取试剂盒提取全蛋白，按厂家试剂盒说明进行。

全蛋白提取如下：取-80℃保存的心脏组织80-100mg，切碎加入RIPA 1ml(含蛋白酶抑制剂5μg/ml Leupeptin,5μg/ml Aprotinin,5μg/ml Pepstain,5mM PMSF)，电动匀浆，冰上孵育30min，高速离心(12000g，4℃，10min)取上清为全蛋白。

心肌组织中的ATP、ADP和AMP含量用酶标仪(MULTISKAN MK3，Thermo，USA)检测，操作步骤按照ELISA检测试剂盒的使用说明进行。

蛋白质印迹分析

再灌注90min后，取梗死区周围的左心室组织200mg，并放到-80℃冰箱中保存。

用蛋白提取试剂盒提出全蛋白，实验方法同能量测定中的全蛋白的提取。按BCAProtein Assay Kit说明操作测量蛋白浓度(测两次取平均值)。按照测量结果用最低浓度统一全部蛋白，-80℃保存。

取样品加等体积的2×电泳样品缓冲液混合，经10%SDS-PAGE电泳后，电转至PVDF膜。5%脱脂奶粉或5%血清封闭1h，TBS-Tween漂洗3次×5min,切取目的蛋白区域孵育一抗：P-MLC、P-Src、P-Cav-1(1:1000,Cell Signaling Technology,USA)，ATPsynthaseα(1:1000,BD,USA)，Occludin、AQP-1(1:1000,Abcam,Cambridge,UK)，ATP5D、Claudin-5、JAM-1、ZO-1(1:200,Santa Cruz Biotechnology,California,USA)，4℃，孵育过夜，TBS-Tween冲洗3次×5min，孵育二抗，室温1h，TBS-Tween冲洗3次×10min。ECL显色5min,暗盒曝光。X光片上的显色条带进行光密度扫描，用图像分析软件(Image-Pro plus 6.0,Media Cybernetic,Bethesda,MD,USA)进行半定量分析。以每次实验的Sham组大鼠的值为基础值，计算其他各组值与基础值比较的变化率。

统计分析

所有数据用mean±SE表示，应用SPSS13.0统计软件，One-Way ANOVA方法对数据进行统计，P﹤0.05表示差异具有统计学意义。

结果

心脏表面血流量的变化

图1A显示的是5组在不同时间点激光扫描多普勒测定的大鼠心脏表面血流量经时变化图。在缺血前，各组心脏表面血流量没有显著性差异（a1-e1）；QSYQ 0.6对照组(b1-b5)与Sham组(a1-a5)的各时间点心脏表面血流量没有明显变化。I/R组，在缺血30min结束(c2)时心脏表面血流量显著降低，再灌注30min(c3)、60min(c4)、90min(c5)时血流量持续降低。QSYQ 0.12预给药没有显著地恢复I/R引起的心脏表面血流量的降低(d1-d5)。QSYQ 0.6预给药组在再灌注期心脏表面血流量得到了显著性的恢复(e3-e5)。

图1B是QSYQ预给药对I/R后大鼠心脏血流量影响的统计结果。显然Sham组和QSYQ 0.6对照组在各时间点大鼠心脏表面血流量均没有明显的变化。I/R组缺血30min后大鼠心脏表面血流量降低了约40%，再灌注后也没有恢复。QSYQ预给药组缺血期心脏表面血流量的变化与I/R组一致，但QSYQ 0.6g/kg预给药组明显的恢复了再灌注后的大鼠心脏表面血流量。

心肌梗死面积的变化

图2A显示的是心脏切片Evans blue-TTC染色的经典图。红+白色区域表示心肌缺血区，白色区域表示心肌梗死区。很明显在Sham组（a）、QSYQ对照组（b）没有观察到缺血和梗死区域。相反，I/R组（c）可以观察到大鼠心脏左室前壁有明显的梗死区和缺血区；QSYQ 0.12预给药组（d）、QSYQ 0.6预给药组（e）缺血区与I/R组相比无明显变化，但梗死区明显减少。

图2B显示的是再灌注之后心肌缺血区面积（AAR）/左心室面积（LV）百分比的统计结果。与Sham组相比，I/R组再灌注后，AAR/LV显著增加，而QSYQ预给药组并没有引起AAR/LV的显著变化。图2C显示心肌梗死区面积（Infarct area）/心肌缺血区面积（AAR）百分比的统计学结果。Sham组、QSYQ 0.6组、I/R组、QSYQ 0.12+I/R组、QSYQ 0.6+I/R组Infarct area/AAR的百分比分别为0、0、（51.83±1.91）%、（39.94±2.96）%、和（32.19±2.93）%。这一结果证实了上面的结论，提示QSYQ预给药的对于心肌缺血再灌注诱导的心肌梗死的疗效呈浓度依存性。

能量代谢的变化

图3A、B分别显示了QSYQ预给药对I/R后大鼠心肌ADP/ATP（3A）、AMP/ATP（3B）的影响。与Sham组相比，I/R后大鼠心肌ADP/ATP(3A)、AMP/ATP(3B)的比值显著增加。QSYQ 0.6预给药没有引起Sham组大鼠ADP/ATP、AMP/ATP的明显变化，但是，可以显著地抑制缺血再灌注引起的大鼠心脏ADP/ATP（3A）、AMP/ATP（3B）比值的增加。

ATP 5D、ATP synthase α在ATP的合成中发挥着重要作用，因此，我们检测了各组心肌ATP 5D、ATP synthase α蛋白的表达。如图3C所示，与Sham组相比，I/R组ATP 5D蛋白的表达明显减少。QSYQ 0.6g/kg预给药可以抑制I/R引起的ATP 5D的显著降低。各组中ATP synthase α蛋白的表达没有显著地变化。

图3D显示了芪参益气滴丸对I/R后大鼠心肌P-MLC影响。发现芪参益气滴丸对I/R后大鼠心肌P-MLC影响与其对ATP5D的影响一致。

心肌形态学、心肌F-actin、心肌细胞凋亡、心肌超微结构的变化

图4A显示各组心脏HE染色的结果。与Sham组相比，I/R组心肌梗死区周围出现了明显改变，可见心肌间质水肿、心肌纤维断裂、炎症细胞浸润；然而，QSYQ 0.6预给药使I/R大鼠的心肌间质水肿和心肌纤维断裂得到了改善。

图4B显示的各组心脏罗丹明鬼笔环肽（rhodamine phalloidin）标记的F-actin的图片证实了上面的结果。显然，QSYQ 0.6给药组显著性地抑制了I/R诱导的F-actin减少、心肌断裂。

图4C显示各组心脏左心室梗死区周围TUNEL染色的图片。在Sham组仅可见少量TUNEL阳性细胞存在；而I/R组可见大量的TUNEL阳性细胞存在,QSYQ 0.6预给药可明显减少I/R诱导的TUNEL阳性细胞数增加。

图4D显示各组大鼠心肌超微结构变化的典型图。从图中可以看出，Sham组心肌纤维排列整齐、肌节清晰可见；线粒体嵴密集、包膜完整。I/R组心肌超微结构破坏明显，表现为心肌纤维紊乱、线粒体肿胀、细胞水肿；这些病理变化在QSYQ 0.6+I/R组得到明显减轻。

心功能的变化

图5A显示各组大鼠心率（HR）经时变化。与Sham组相比，I/R没有引起大鼠心率的显著变化，QSYQ 0.6预给药也没有引起Sham组和I/R大鼠心率的显著变化。

图5B、C显示各组大鼠心室收缩压（LVSP）和左室内压最大上升速率（+dp/dtmax)的经时变化。与Sham组相比，在缺血30min、再灌注30min、60min、90min时，I/R组的LVSP(5B)和+dp/dtmax(5C）显著降低；但是值得注意的是QSYQ 0.6g/kg预给药能够显著地抑制I/R诱导的大鼠的LVSP和+dp/dtmax的降低。

图5D、E、F显示各组大鼠左心室舒张压（LVDP）、左心室舒张末期压（LVEDP）和左室内压最大下降速率（-dp/dtmax)经时变化。与Sham组相比，在缺血30min、再灌注30min、60min、90min时，I/R组的LVDP(5D)、LVEDP(5E)和-dp/dtmax(5F)显著上升；相反，QSYQ 0.6g/kg预给药能够显著地抑制I/R诱导的大鼠的LVDP、LVEDP和-dp/dtmax显著上升。

心脏细静脉血浆白蛋白漏出

图6A显示再灌注90min时各组大鼠心脏细静脉血浆白蛋白的漏出的图像。Sham组（a1）、QSYQ 0.6对照组（a2）没有观察到FITC标记的血浆白蛋白经由大鼠心脏细静脉的漏出；而I/R组（a3）可以明显地观察到FITC标记的血浆白蛋白经由大鼠心脏细静脉的漏出，QSYQ 0.6预给药（a4）能明显缓解这一现象。

图6B显示再灌注90min时各组FITC标记的血浆白蛋白经由大鼠心脏细静脉漏出的统计结果。Sham组，在再灌注90min时，大鼠心脏细静脉外与细静脉内的FITC标记的血浆白蛋白荧光强度百分比（Ii/Iv）为39.21±3.32%；I/R组在再灌注90min时Ii/Iv增加到70.74±2.50%；QSYQ 0.6预给药可以抑制I/R引起的Ii/Iv比值的增加。

血管内皮细胞间连接的变化

图7显示的是各组大鼠心脏微血管内皮细胞间连接的透射电子显微镜图像。Sham组（a）、QSYQ 0.6组（b）大鼠心脏微血管内皮细胞间连接完好；很明显，I/R组（c）大鼠心脏微血管内皮细胞间连接缝隙增大，血管内皮细胞中质膜微囊增多；这些变化在QSYQ 0.6预给药（d）的到了改善，提示QSYQ 0.6预给药可以保护大鼠心脏微血管内皮细胞间连接的完整性，减少血管内皮细胞中质膜微囊。

大鼠心肌细静脉内皮细胞紧密连接蛋白Claudin-5的表达

图8A是用激光扫描共焦显微镜拍摄的各组大鼠心脏细静脉血管内皮细胞紧密连接蛋白Claudin-5（红色）的免疫荧光染色图像，vWF（绿色）为内参。Sham组大鼠心脏细静脉血管内皮细胞紧密连接蛋白Claudin-5紧密；而I/R组可看到Claudin-5的断裂，减少；这些可以通过QSYQ 0.6预给药来改善。

通过蛋白质印迹分析可以更加清晰的评价Claudin-5的表达情况，图8B显示与Sham组相比，I/R组大鼠心肌组织中Claudin-5蛋白表达明显降低；相对的，QSYQ 0.6预给药可以抑制I/R大鼠心肌组织中Claudin-5蛋白表达的异常下调。

图8C是各组大鼠心肌组织中Claudin-5蛋白定量分析的统计结果，显示QSYQ 0.6预给药可以抑制I/R诱导的大鼠心肌组织中Claudin-5蛋白表达的降低。

大鼠心肌组织Occludin、JAM-1、ZO-1、P-Cav-1、P-Src、AQP-1蛋白的表达

图9A显示各组大鼠心肌组织中Occludin、JAM-1、ZO-1蛋白表达的蛋白质印迹分析图像和统计结果。与Sham相比，I/R组Occludin、ZO-1蛋白表达明显降低；QSYQ

0.6预给药可以抑制I/R诱导的大鼠心肌组织中Occludin、ZO-1蛋白表达的降低。然而，大鼠心肌组织中JAM-1蛋白表达在各组中没有明显变化。

图9B显示各组大鼠心肌组织P-Cav-1、P-Src蛋白表达的蛋白质印迹分析图像和统计结果。在Sham组的大鼠心肌组织中很少检测到P-Cav-1、P-Src蛋白表达，但在缺血灌注后则明显升高；对P-Cav-1、P-Src蛋白进行定量分析显示QSYQ 0.6预给药可以抑制I/R组大鼠心肌组织中P-Cav-1、P-Src蛋白表达的升高。

图9C显示各组大鼠心肌组织AQP-1蛋白表达的蛋白质印迹分析图像和统计结果。与Sham相比，I/R组大鼠心肌组织中AQP-1蛋白表达明显升高。QSYQ 0.6预给药可以抑制I/R组大鼠心肌组织中AQP-1蛋白表达的升高。光密度定量分析统计结果也证实了这一结果。

本试验表明QSYQ预给药可以抑制缺血再灌注引起的心肌ATP合成酶亚基ATP5D的蛋白表达的降低，抑制心肌F-actin的解聚，抑制心肌MLC的磷酸化，减轻心肌纤维的断裂。本试验还证实了QSYQ预给药还可以抑制缺血再灌注引起的心脏细静脉血浆白蛋白的漏出，通过保护血管内皮细胞间连接的完整性，抑制Cavoelae的增加；抑制血管内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1,Claudin-5,Occludin的表达降低，抑制Src和Cavoelin-1的磷酸化，抑制心脏血管内皮细胞AQP-1的过表达。

本试验证实了QSYQ可以抑制缺血再灌注引起的大鼠心脏缺血区域心肌组织中ATP5D的表达降低，及ADP/ATP，AMP/ATP的比值升高。本试验发现，缺血再灌注后ATP合成酶α亚基的蛋白没有发生变化，而伴随ATP含量的减少，δ亚基编码的ATP 5D蛋白明显减少。QSYQ预给药可以抑制缺血再灌注引起的ATP 5D蛋白表达的降低，抑制ADP/ATP，AMP/ATP比值的升高。

在此基础上，本试验还发现QSYQ预给药可以抑制缺血再灌注引起的大鼠心肌F-actin的解聚和MLC磷酸化，从而改善心肌收缩能力。F-actin是构成心肌细肌丝的蛋白之一，是细胞重要的骨架蛋白，MLC是粗肌丝的成分，两者参与粗肌丝与细肌丝相互滑动引起心肌细胞收缩的过程。缺血再灌注后，由于ATP含量的降低，发生F-actin的解聚和MLC的磷酸化，出现心肌纤维断裂和心肌收缩能力的降低。QSYQ预给药通过抑制ATP合成酶δ亚基的降低，抑制了ATP含量的降低，进而，维持了心肌结构和心功能。心肌的收缩功能是心脏灌流的动力，本试验还证实QSYQ可以抑制缺血再灌注引起的心脏灌流量的降低。

本试验还发现QSYQ预给药可以抑制缺血再灌注引起的血浆白蛋白经由心脏细静脉的漏出。血浆白蛋白漏出的主要途径是细胞旁途径和Cavoelae介导的跨细胞膜途径。紧密连接位于细胞膜外侧的最上部，形成一个几乎不透水的屏障，其至少包括三类跨膜蛋白：Claudins、Occludin、JAM-1，和一种细胞外膜蛋白ZO-1；其中，Claudin-5是内皮细胞特有的紧密连接蛋白ccludin直接与ZO-1相连接。此外，有报道称ZO-1、F-actin和肌球蛋白在JAMs蛋白的胞浆区附近形成小半鞘翅以促进连接的稳定。因此，缺血再灌注诱导的F-actin解聚使得ZO-1减少，继而引起其他的紧密连接蛋白减少。

Cavoelin-1是Cavoelae的结构蛋白之一，缺血再灌注后Src的磷酸化可以引起Cavoelin-1的磷酸化，使血管内皮细胞的Cavoelae增加和移位，加剧血浆白蛋白的漏出。本试验的透射电镜结果显示缺血再灌注后大鼠心脏的微血管连接缝隙明显扩大，血管内皮细胞中Cavoelae增加。此外，本试验还观察到缺血再灌注后心脏细静脉血管内皮细胞上Claudin-5明显不连续，除JAM-1外，ZO-1,Claudin-5,Occludin的蛋白表达显著降低。而QSYQ预给药可以抑制缺血再灌注引起的ZO-1,Claudin-5,Occludin蛋白表达的变化。本研究还证实QSYQ预给药可以抑制I/R引起的AQP-1表达的增加，减少水的外流。

综上所述，QSYQ预给药可以通过调控心肌ATP含量，保护心肌结构和功能，维持心脏微血管的通透性，从而可以预防和/或治疗缺血再灌注引起的心肌损伤和心脏微循环障碍。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1.芪参益气预给药对I/R后大鼠心脏表面血流量（MBF）的影响。A：Sham（假手术组）(a)、QSYQ 0.6(b)、I/R(c)、QSYQ 0.12+I/R(d)、QSYQ 0.6+I/R(e)5组在Baseline（基线）(1),缺血30min(2)，再灌注30min(3)、60min(4)、90min(5)时激光扫描多普勒测定的大鼠心脏表面血流量经时变化图。B：各组大鼠心脏表面血流量经时变化统计结果。值用means±SEM（平均值±标准差）表示(n=6)。^*P<0.05vs.Sham组，^#P<0.05vs.I/R组。

图2.芪参益气预给药对I/R引起的大鼠心肌梗死面积的影响。A：再灌注90min后Sham(a)、QSYQ 0.6(b)、I/R(c)、QSYQ 0.12+I/R(d)、QSYQ 0.6+I/R(e)5组的心脏切片Evans blue-TTC（伊文氏蓝-氯化三苯基四氮唑）染色的经典图。B和C：各组AAR（缺血区面积）/LV（左心室面积）和infarct area（梗死区面积）/AAR的结果统计图。值用means±SEM表示(n=6)。^*P<0.05vs.Sham组，^#P<0.05vs.I/R组。

图3.芪参益气预给药对I/R后大鼠心肌能量代谢的影响。

A、B：分别为Sham组、QSYQ 0.6组、I/R组、QSYQ 0.6+I/R组的ADP/ATP、AMP/ATP的统计图.值用means±SEM表示(n=6)。^*P<0.05vs.Sham组，^#P<0.05vs.I/R组。

C：各组ATP 5D、ATP synthase（ATP合成酶）α蛋白印迹条带和统计结果。值用means±SEM表示(n=6)。^*P<0.05vs.Sham组，^#P<0.05vs.I/R组。D：各组P-MLC蛋白印迹条带和统计结果。值用means±SEM表示(n=6)。^*P<0.05vs.Sham组，^#P<0.05vs.I/R组。

图4.芪参益气预给药对I/R引起的心肌形态学、心肌F-actin（F-肌动蛋白）、心肌细胞凋亡、心肌超微结构的影响。A：各组心肌HE（苏木精伊红）染色的典型图。Bar（标尺）=50μm；a:断裂的心肌纤维；b：水肿；c：白细胞浸润。B：各组罗丹明鬼笔环肽标记的F-actin的典型图。Bar=10μm；d：肌纤维断裂.C：各组TUNEL（脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法）染色的典型图。箭头所指为TUNEL阳性细胞.Bar=25μm.D:各组透射电镜观察的典型图e：肌纤维；f：线粒体；g：肌纤维断裂；h：肿大的线粒体.Sham组(1)，QSYQ 0.6组(2)，I/R组(3)，QSYQ 0.6+I/R组(4)。(n=3)

图5.芪参益气预给药对I/R后大鼠心功能的影响。A、B、C、D、E、F：分别是各组缺血再灌注期间HR（心率）,LVSP（心室收缩压）,+dp/dtmax（左室内压最大上升速率）,LVDP（左心室舒张压）,LVEDP（左心室舒张末期压）和-dp/dtmax（左室内压最大下降速率）的经时变化图。值用means±SEM表示(n=6)。^*P<0.05vs.Sham组，^#P<0.05vs.I/R组。

图6.芪参益气预给药对I/R后大鼠心脏细静脉血浆白蛋白漏出的影响。A：白蛋白从大鼠心脏细静脉漏出的荧光图像。Bar=50μm。a1:Sham组；a2:QSYQ 0.6组；a3:I/R组；a4:QSYQ 0.6+I/R组。B：白蛋白从大鼠心脏细静脉漏出的定量统计分析图。值用means±SEM表示(n=6)。^*P<0.05vs.Sham组，^#P<0.05vs.I/R组。

图7.各组心肌微静脉的透射电镜典型图。cav：质膜微囊；G：内皮细胞间连接。a：Sham组；b：QSYQ 0.6组；c：I/R组；d：QSYQ 0.6+I/R组(n=3)。

图8.芪参益气预给药对I/R后大鼠细静脉内皮细胞紧密连接蛋白Claudin-5的影响。A：各组Claudin-5免疫激光检测的典型图。a(1,2)：Sham组；b(1,2)：QSYQ 0.6组；c(1,2)：I/R组；d(1,2)：QSYQ 0.6+I/R组。Bar:a1-d1=10μm.Bar:a2-d2=5μm.B：各组Claudin-5蛋白印迹分析的典型图和统计图。值用means±SEM表示(n=3)。^*P<0.05vs.Sham组，^#P<0.05vs.I/R组。

图9.芪参益气预给药对I/R后大鼠心肌组织Occludin、JAM-1、ZO-1、P-Cav-1、P-Src、AQP-1蛋白表达的影响。A：各组Occludin、JAM-1、ZO-1蛋白印迹的典型图和统计分析结果；B：各组P-Cav-1、P-Src蛋白印迹的典型图和统计分析结果；C：各组AQP-1蛋白印迹的典型图和统计分析结果。值用means±SEM表示(n=3)。^*P<0.05vs.Sham组，^#P<0.05vs.I/R组。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。

实施例一

取黄芪86.5g、丹参21.3g、三七3.5g、降香20.6g、辅料聚乙二醇-600030g。将经粉碎的丹参、三七，水煎煮2次，每次加7倍量水，每次2小时，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至900ml，加入95%乙醇，使醇浓度达到70%，静置12～24小时，滤过，回收乙醇，浓缩成相对密度为1.32～1.38(50～60℃)的浸膏；将经粉碎的黄芪，加水煎煮2次，每次加6倍量水，依次提取2小时、1小时，合并滤液，浓缩至1500ml左右时，加95%乙醇使醇浓度为60%，静置12～24小时，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至400ml左右时，加95%乙醇使醇浓度为80%，静置12～24小时，滤过，滤液回收乙醇，浓缩成相对密度为1.32～1.38(50～60℃)的浸膏；取降香，加5倍量水，回流提取5小时，收集挥发油；取上述丹参三七浸膏、黄芪浸膏及聚乙二醇-6000，水浴溶化，化匀后，加入降香挥发油，混匀，移至滴丸机中，制成1000粒滴丸。

实施例二

取黄芪40.6g、丹参44.8g、三七11.2g、降香38.6g，辅料聚乙二醇-6000 30g，按实施例1的制备工艺制成本发明的中药制剂。

实施例三

取黄芪77.3g、丹参22.8g、三七4.8g、降香30.5g、辅料聚乙二醇-600028g，按实施例1的制备工艺制成本发明的中药制剂。

实施例四

取黄芪42.3g、丹参39.2g、三七8.2g、降香46.8g、辅料聚乙二醇-600025g，按实施例1的制备工艺制成本发明的中药制剂。

实施例五

取黄芪65.2g、丹参38.9g、三七9.3g、降香32.5g、辅料聚乙二醇-600040g，按实施例1的制备工艺制成本发明的中药制剂。

实施例六

取黄芪56.2g、丹参32.5g、三七6.2g、降香41.6g、辅料聚乙二醇-600022g，按实施例1的制备工艺制成本发明的中药制剂。

实施例七

取黄芪36.5g、丹参32.4g、三七6.2g、降香41.7g、辅料聚乙二醇-600022g，按实施例1的制备工艺制成本发明的中药制剂。

实施例八

取黄芪65.6g、丹参25.8g、三七9.5g、降香46.4g，辅料聚乙二醇-600035g，按实施例1的制备工艺制成本发明的中药制剂。

实施例九

取黄芪35.5g、丹参50.8g、三七16.3g、降香52.3g、辅料聚乙二醇-600035g，按实施例1的制备工艺制成本发明的中药制剂。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.芪参益气滴丸在制备预防和/或治疗心肌损伤或心脏微循环障碍药物中的应用。

2.如权利要求1所述应用，其中芪参益气滴丸逆转缺血再灌注引起的心脏血流下降。

3.如权利要求1所述应用，其中芪参益气滴丸减少缺血再灌注引起的心肌梗死面积。

4.如权利要求1所述应用，其中芪参益气滴丸调控心肌能量代谢，抑制缺血再灌注引起的ATP 5D蛋白表达的降低，抑制ADP/ATP和/或AMP/ATP比值的升高。

5.如权利要求1所述应用，其中芪参益气滴丸调节心脏功能，抑制缺血再灌注引起的心室收缩压和左心室内压最大上升速率的降低，抑制缺血再灌注引起的左心室舒张压、左心室舒张末期压和左心室内压最大下降速率的上升。

6.如权利要求1所述应用，其中芪参益气滴丸抑制缺血再灌注引起的心脏细静脉血浆白蛋白的漏出。

7.如权利要求1所述应用，其中芪参益气滴丸保护心脏微血管内皮细胞间连接的完整性，减少血管内皮细胞中质膜微囊，抑制心脏细静脉内皮细胞紧密连接蛋白表达的降低。

8.如权利要求1所述应用，其中芪参益气滴丸改善缺血再灌注引起的心肌间质水肿和心脏纤维断裂，抑制缺血再灌注引起的心肌F-肌动蛋白减少。

9.如权利要求1所述应用，其特征在于所述芪参益气滴丸由以下重量配比的中药原料药制备而成

黄芪22.2%-66.8%，

丹参11.6%-33.4%，

三七2.5%-13.5%，

降香14.5%-44.3%。

10.如权利要求1所述应用，其特征在于所述芪参益气滴丸由以下重量配比的中药原料药制备而成，黄芪41.2%、丹参23.8%、三七4.5%、降香30.5%；芪参益气滴丸制备方法为：取丹参、三七药材，用水煎煮，滤过，滤液浓缩后用乙醇沉淀，上清液回收乙醇，浓缩成浸膏，即丹参三七浸膏；另取黄芪，水煎煮，滤过，滤液浓缩后用乙醇沉淀，上清液回收乙醇，浓缩成浸膏，即黄芪浸膏；取降香，加水回流提取，收集降香挥发油；将以上丹参三七浸膏，黄芪浸膏，及降香挥发油和滴丸辅料混合均匀后，按照制剂学常规技术，制成滴丸剂。

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