JP7088943B2 - 咳のための組成物 - Google Patents
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Description
・粘液溶解薬:粘液タンパク質複合体および核酸の解重合の機序により粘液流動性を高める。
・去痰薬:気管支分泌物を増やし、間接的に粘液の粘性を下げる
・鎮静剤:咳中枢を阻害し、症状を取り除く。
I.炎症(咳を誘発する因子である)に対して、保護層の形成を通じて行われる間接的な作用により、一方では外部刺激剤とのさらなる接触を妨げ、粘膜の水和を維持し、他方では、抗酸化物質の介入により、感染によって生成されるフリーラジカルの有害な作用が緩和され;
II.粘液に対し、水を引きつける親水性物質による水和により、粘液をより流動性にし、生理的クリアランス機序により容易に除去することができる。
本発明の目的のために、「オオバコ」とは、ヘラオオバコ(Plantago lanceolata)を意味し、「キンミズヒキ」とはセイヨウキンミズヒキ(Agrimonia eupatoria)を意味し、「ウスベニタチアオイ」とは、ビロードアオイ(Althaea officinalis)を意味する。
a)実際の物理的バリアを表し、下にある組織を外部と接触させることから保護し;
b)繊毛細胞が存在することにより、同調した一方向の動きで、粘液が閉じ込めた異物を食道に向けて押し出し;
c)分泌物および粘液を生成し;
d)免疫学的機能を実施し、ウイルスの存在下で、抗ウイルス応答において重要な一連の有効な防御機構を実行する。
1.喉頭および気管の直接的関与であって、その近接性ならびに口、咽頭および鼻との密接な連通関係に起因し;
2.血流を介して感染部位で産生された炎症メディエーターの下部気道への輸送であって、そこでそれらが炎症応答を開始し;モルモットおよびヒトに関する研究は、鼻または食道からの求心性である化学タイプの感覚刺激が、中枢神経経路の咳に対する感受性を増大させ、気道、鼻および食道の炎症性疾患を伴う「高咳性」状態に寄与し得ることを実証した。
3.後鼻漏では、しばしば鼻咽頭から放出することが困難な粘性フィラメントの形態で粘液の連続的存在が生じ、咽頭に沿って下降することによって咽頭を刺激する。この刺激は、気管および食道の神経と筋肉との間の協調の喪失を引き起こし、その結果、過剰な分泌物の一部が喉頭に流れ込み、その機械的刺激を引き起こし、それは小児において非常に頻繁に、持続的で、連続的かつ刺激性の咳につながる。
・感染性事象の場合には、多量の粘性粘液の嚥下を繰り返し試みることによる緊張機械受容器の刺激;
・下咽頭と食道の間に停滞している粘液フィラメントによって引き起こされる軽い圧力刺激に敏感な粘膜受容体の刺激;
・局所的に産生され、粘液によって他の部位に運ばれる炎症メディエーターによる侵害受容器の刺激(同様の刺激機序は、モルモットにおいて、酸性化学的刺激を用いても示されている)
生成物の粘膜付着率=(1-absサンプル/abs対照)×100
フォールドオーバー(C-)=[測定されたIL-6]/[C-IL-6]
100-[(IL-6サンプル)/IL-6C+)×100]
以下の実験例は、本発明の組成物に対して行われたアッセイのいくつかを説明することを目的としている。
粘膜上への保護フィルムの形成に寄与する生成物の粘膜付着性効果は、適切なインビトロモデルによって評価することができる。
生成物の粘膜付着率=(1-absサンプル/abs対照)×100
化学的進行性酸化ストレスに曝露されたヒト細胞に対するサンプルの抗酸化活性の評価。
ウシ胎児血清 FCS
ドデシル硫酸ナトリウム SDS
培養液:グルタミン(2mM)、ペニシリン(2000UI/ml)-ストレプトマイシン(1000UI/ml)-ファンギゾン(2μg/ml)およびウシ胎児血清(10%)などの抗生物質、ヒドロコルチゾン0.5ng/ml、インスリン5μg/ml、上皮増殖因子0.01μg/mlで完成されたダルベッコ高グルコース(D-MEM) DMEM
接種培地:グルタミン(2mM)、ペニシリン(2000UI/ml)-ストレプトマイシン(1000UI/ml)-ファンギゾン(2μg/ml)およびウシ胎児血清(5%)などの抗生物質、ヒドロコルチゾン0.5ng/ml、インスリン5μg/ml、上皮増殖因子0.01μg/mlで完成されたダルベッコ高グルコース(D-MEM) DMEMi
リン酸緩衝液 PBS
ニュートラルレッド希釈標準溶液:0.4%ストック溶液を最小必須培地(MEM)で希釈し、使用直前に紙上で濾過する。使用濃度は0.04%である NRw
ニュートラルレッド抽出液:使用の数分前に調製され、49%蒸留水-50%エタノール-1%氷酢酸からなる ExB
2,7ジクロロフルオレセインジアセタート:4μm DCA
サンプルの5塩基2希釈液:0.5-0.25-0.125-0.0625および0.0313mg/mlの2つの系列(H2O2の存在下および非存在下)を設定した。同じ手順を実施して、生理食塩水中の500μMのH2O2溶液中で同じ5つの希釈液を得た。各希釈液当たり150μl(生理食塩水中およびH2O2中)を、2つの異なるプレート上の4つのウェルに分配した。
細胞播種
培養細胞を増殖培地から酵素的に分離し、電子セルカウンター(Scepter)で計数し;細胞懸濁液を300,000細胞/mlの密度で調製し(接種培地中)、次いで、96ウェルプレートに分配し:1ウェルあたり100μl、1ウェルあたり30,000細胞の播種密度を得た。最後に、プレートを37℃および5%CO2富化湿潤雰囲気で、培養するためにインキュベーター内に戻し、続いて24時間培養した。
DCAプローブへの曝露
接種培地を除去し、細胞をPBSで1回洗浄し、次いでPBSを捨て、150μlのDCA(4μM)を両方のプレートに分配した。次に、プレートを37℃および5%CO2富化雰囲気で、インキュベーターに15分間戻した。
生存率の検出
生存%=[(O.D.サンプル±H2O2/O.D.対照Pos/Neg)x100]
生存抑制%=(100-生存%)
O.D.:光学密度
O.D.サンプル±H2O2:H2O2有りおよび無しでサンプルに曝露された細胞から得られた光学密度平均
O.D.ポジティブ/ネガティブコントロール:H2O2溶液または生理食塩水(100%生存)単独に曝露された細胞から得られた光学密度中央値
F.U.:蛍光単位
F.U.ポジティブコントロール:H2O2溶液に曝露された細胞から放出されるF.U.の平均(フリーラジカルの最大生成量)
F.U.ネガティブコントロール:酸化ストレスに曝露されていない細胞から放出されるF.U.の平均
1)標準化
サンプルに曝露された細胞から放出されるF.U.と酸化ストレスのないビタミンCに曝露された細胞から放出されるF.U.との平均は、サンプルに曝露された細胞から放出されるF.U.の平均から、ビタミンCおよび酸化ストレスに曝露された細胞から放出されるF.U.の平均が引かれる。言い換えれば、ストレスを受けていないプレートから放出される蛍光の平均値は、ストレスを受けたプレートから放出される蛍光の平均値から差し引かれた。
FR阻害%=
[100-(F.U.サンプルpos-F.U.サンプルneg)/(U.F.対照pos-U.F.対照neg)*100]
F.U.サンプルpos:サンプルおよび酸化ストレスに曝露された細胞
F.U.サンプルneg:サンプル単独に曝された細胞
F.U.対照pos:酸化ストレス単独に曝された細胞
F.U.対照neg:酸化ストレスなしで生理食塩水に曝された細胞
サンプル-ポジティブコントロールおよびネガティブコントロール:変動係数は20%未満でなければならない。
変動係数
VC=((sd/OD平均)×100)
p値(タイプ2両側t検定)は、0.05%未満でなければならない。
タンニンに関する本発明の組成物の流体形態(シロップ、2での上記例による)の安定性は、キンミズヒキについて、欧州薬局方(EP9.2,2.8.14)に記載された分光光度法を用いて、ピロガロールとして表される総タンニン含量を測定することによって評価した。
バリア効果アッセイのために、半透膜(0.4μm孔)によって物理的に分離した2つのチャンバーを使用した。ヒト線維芽細胞を下部チャンバーに播種し、一方、炎症剤LPS(精製大腸菌リポ多糖)を上部チャンバーに導入し;2つのチャンバーを分離する半透膜上に、本発明に記載の組成物の薄膜を層状化した。
各アッセイサンプル(上記2.による)について、HuDe系細胞を細胞培養プレートのウェルに、10%ウシ血清(FBS)を添加したMEM培地中に40,000細胞/mlの密度で播種し、一方はバリアアッセイ(T.B.)(BA)であり、もう一方は内部標準であり;1ウェルあたり1mlの細胞懸濁液である。
複合細胞を培養するための細胞培養インサート(ベクトン・ディッキンソン社)を他のプレート上に配置し、それらのそれぞれの上に0.1mg/mlの一定量のコラーゲンを供給した。プレートを37℃で一晩(22~24時間)インキュベートした。
以下の工程は、BA用培養プレートで行った。
サンプルの半透膜上に、0.5%アルギン酸塩をベースとする組成物100μlを接種し、20分間層状化させ、C+およびC-のインサートには何も添加しなかった。20分が経過したら、過剰のサンプルを除去し、プロトコルで指定した手順に従って膜をPBSで洗浄した。
上記の例2のように、サンプル層が乾燥したら、最初の3つのCAMインサートおよび3つのC+インサートでは、300μlのLPS(膜リポ多糖)溶液を1μg/mlの濃度で接種し、残りの3つのC-では、5%FBSを含む300μlのMEM培地を添加した。インサートを細胞と共にそれらのそれぞれのウェルに挿入し、プレートを37℃で1時間インキュベートし、5%CO2富化雰囲気下で一晩(22~24時間)インキュベートした。
内部標準アッセイをBAと同時に実施した。
乾燥した後、最初の6つのICのインサートでは、分析すべきサンプル、CAMについては3つ、C+については3つ、300μlのLPSを接種し、残りの3つのC-では、300μlの培地を添加した。
1時間のインキュベーションが完了したら、細胞を含むウェルからインサートを除去して空のプレートに移し、細胞を含むプレートをインキュベーターに配置した。
サンプル用の3つのインサートの半透膜上に、0.5%アルギン酸塩をベースとする組成物100μlを接種し、20分間層状化させ、C+およびC-のインサートには何も添加しなかった。20分が経過したら、過剰のサンプルを除去し、プロトコルで指定した手順に従って膜をPBSで洗浄した。
サンプルを含むインサートの準備が整ったら、300μlの培地をすべてのインサート(CAM、C+、C-)に添加した。インサートを細胞と共にそれらのそれぞれのウェルに挿入し、プレートを37℃で1時間インキュベートした。
22~24時間が経過したら、IL-6のELISAアッセイおよび半定量的用量を実施するために、BAおよびICプレートから上清を回収した。
物質または化合物のBEは、LPSに曝露された細胞によるIL-6サイトカイン放出の減少%として表され、サンプルは、細胞がLPSにのみ曝露されるポジティブコントロール(C+)と比較して、アッセイされる。
BE=IL-6サイトカイン放出の減少%=100-[(サンプルから放出されたサイトカイン(pg/μL)/C+から放出されたサイトカイン(pg/μL))×100]
1.ウスベニタチアオイの多糖(粘液)画分の調製例
乾燥して砕いたウスベニタチアオイの根を、濾過消化による静的抽出器中で、植物を溶媒に浸し、溶媒を機械式ポンプにより底部から上部へと再循環させることで、水により抽出する。
乾燥して粉砕したオオバコの葉を、濾過消化による静的抽出器中で、植物を溶媒に浸し、溶媒を機械式ポンプにより底部から上部へと再循環させることで、50%エタノール(エタノール:水50:50v/v)により抽出する。
乾燥して粉砕したキンミズヒキの先端部分を、濾過消化による静的抽出器中で、植物を溶媒に浸し、溶媒を機械式ポンプにより底部から上部へと再循環させることで、水により抽出する。
本発明に包含され得る諸態様は、以下のとおり要約される。
[態様1]
咳の治療に使用するための組成物であって、オオバコの1種または複数種の多糖類画分、ウスベニタチアオイの1種または複数種の多糖類画分、タンニンを含む1種または複数種のキンミズヒキのポリフェノール画分、ブラウンシュガー、ハチミツ、ならびに1種または複数種の薬学的に許容される担体および/または賦形剤を含む、咳の治療に使用するための組成物。
[態様2]
オオバコの前記1種または複数種の多糖類画分が、3%以上の重量パーセントで20000ダルトンを超える分子量を有する多糖類を含む、上記態様1に記載の使用のための組成物。
[態様3]
ウスベニタチアオイの前記1種または複数種の多糖類画分が、5%以上の重量パーセントで20000ダルトンを超える分子量を有する多糖類を含む、上記態様1または2に記載の使用のための組成物。
[態様4]
タンニンを含むキンミズヒキの前記1種または複数種のポリフェノール画分が、3%以上の重量パーセントでポリフェノール類を含む、上記態様1~3のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
[態様5]
前記賦形剤が、天然香味料、防腐剤、増粘剤から選択される、上記態様1~4のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
[態様6]
前記1種または複数種の天然香味料、防腐剤、増粘剤が、レモンジュース、ブラックベリージュース、天然オレンジフレーバー、天然レモンフレーバー、天然ギンバイカフレーバー、キサンタンガムから選択される、上記態様5に記載の使用のための組成物。
[態様7]
前記抽出物が、凍結乾燥形態または噴霧乾燥形態である、上記態様1~6のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
[態様8]
錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、エリキシル剤、硬質ゼラチン、軟質ゼラチン、懸濁剤、噴霧剤、乳剤、溶液剤の形態である、上記態様1~7のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
[態様9]
非希釈または最大1:5まで希釈した場合に、85%~50%のレクチン結合阻害で測定される粘膜付着の割合を特徴とする、上記態様1~8のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
[態様10]
前記治療が、乾性咳、湿性咳、URTI(上気道感染症)に伴う咳、後鼻漏からの咳嗽の治療である、上記態様1~9のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
[態様11]
オオバコの多糖類画分(1種または複数種)、ウスベニタチアオイの多糖類画分(1種または複数種)、タンニンを含むキンミズヒキのポリフェノール画分(1種または複数種)が、ハチミツ、ブラウンシュガー、ならびに1種または複数種の薬学的に許容される担体および賦形剤と混合される、オオバコの多糖類画分(1種または複数種)、ウスベニタチアオイの多糖類画分(1種または複数種)、タンニンを含むキンミズヒキのポリフェノール画分(1種または複数種)、ブラウンシュガー、ハチミツ、ならびに1種または複数種の薬学的に許容される担体および賦形剤からなる組成物の製造方法。
Claims (10)
- 咳の治療に使用するための組成物であって、オオバコの1種または複数種の多糖類画分であって、オオバコの抽出物である多糖類画分、ウスベニタチアオイの1種または複数種の多糖類画分であって、ウスベニタチアオイの抽出物である多糖類画分、タンニンを含む1種または複数種のキンミズヒキのポリフェノール画分であって、キンミズヒキの抽出物であるポリフェノール画分、ブラウンシュガー、ハチミツ、ならびに1種または複数種の薬学的に許容される担体および/または賦形剤を含み、前記のタンニンを含む1種または複数種のキンミズヒキのポリフェノール画分が、3%以上の重量パーセントでポリフェノールを含む、咳の治療に使用するための組成物。
- オオバコの前記1種または複数種の多糖類画分が、3%以上の重量パーセントで20000ダルトンを超える分子量を有する多糖類を含む、請求項1に記載の使用のための組成物。
- ウスベニタチアオイの前記1種または複数種の多糖類画分が、5%以上の重量パーセントで20000ダルトンを超える分子量を有する多糖類を含む、請求項1または2に記載の使用のための組成物。
- 前記賦形剤が、天然香味料、防腐剤、増粘剤から選択される、請求項1~3のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記1種または複数種の天然香味料、防腐剤、増粘剤が、レモンジュース、ブラックベリージュース、天然オレンジフレーバー、天然レモンフレーバー、天然ギンバイカフレーバー、キサンタンガムから選択される、請求項4に記載の使用のための組成物。
- 前記抽出物が、凍結乾燥形態または噴霧乾燥形態である、請求項1~5のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、エリキシル剤、硬質ゼラチン、軟質ゼラチン、懸濁剤、噴霧剤、乳剤、溶液剤の形態である、請求項1~6のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 非希釈または最大1:5まで希釈した場合に、85%~50%のレクチン結合阻害で測定される粘膜付着の割合を特徴とする、請求項1~7のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記治療が、乾性咳、湿性咳、URTI(上気道感染症)に伴う咳、後鼻漏からの咳嗽の治療である、請求項1~8のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- オオバコの多糖類画分(1種または複数種)であって、オオバコの抽出物である多糖類画分、ウスベニタチアオイの多糖類画分(1種または複数種)であって、ウスベニタチアオイの抽出物である多糖類画分、タンニンを含むキンミズヒキのポリフェノール画分(1種または複数種)であって、キンミズヒキの抽出物であるポリフェノール画分が、ハチミツ、ブラウンシュガー、ならびに1種または複数種の薬学的に許容される担体および賦形剤と混合される、オオバコの多糖類画分(1種または複数種)、ウスベニタチアオイの多糖類画分(1種または複数種)、タンニンを含むキンミズヒキのポリフェノール画分(1種または複数種)、ブラウンシュガー、ハチミツ、ならびに1種または複数種の薬学的に許容される担体および賦形剤からなり、前記のタンニンを含む1種または複数種のキンミズヒキのポリフェノール画分が、3%以上の重量パーセントでポリフェノールを含む組成物の製造方法。
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