CN104873524A - 一类具有治疗的应激性肠易激综合征的鞣质的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然药物领域，具体涉及一类含有没食子酰基的鞣质单体在制备具有治疗应激性肠易激综合征作用药物的用途。药效学试验证明：含有没食子酰基基团的鞣质能够通过降低肠道5-HT含量，达到改善应激性肠易激综合征腹泻、大便性状异常、胃肠道黏膜低度炎症的症状。

Description

一类具有治疗的应激性肠易激综合征的鞣质的用途

技术领域

本发明涉及天然药物领域，具体涉及一组含有没食子酰基的鞣质单体在制备具有治疗应激性肠易激综合征作用药物的用途。

背景技术

肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome,IBS)是一种常见的功能性胃肠道紊乱疾病，其症状主要表现为腹痛或腹部不适伴排便习惯改变和(或)大便性状异常。在中医学上无肠易激综合征之名，多将本病归属于“腹痛”“泄泻”“郁证”等范畴。目前对IBS的病因和发病机制尚未完全阐明，其中涉及胃肠动力异常、内脏感觉敏感性增高、局部炎症免疫反应、心理精神因素等。在临床上IBS的药物治疗主要是对症治疗，包括改善胃肠道动力(如替加色罗、阿洛司琼、吗丁啉、伊托必利)、解除肠管痉挛(如匹维溴铵)、减轻肠管扩张、抗菌消炎以及调节肠道微生态环境(如丽珠长乐双歧杆菌制剂)等。但是上述药物干预并不能有效地解决IBS的复发和间歇发作。除药物治疗之外，IBS的治疗还包括患者教育、心理治疗等用以改善患者焦虑、抑郁等精神应激状态，并且发现患者精神应激状态改善时可诱导胃肠症状的缓解，在一定程度上加强药物干预的效果。这种脑-肠轴互动调控机制在IBS发病和治疗中的作用日益受到重视。

现代研究表明位于肠黏膜上皮的肠噬铬细胞(enterochromaffin cells,EC，一种肠内分泌细胞)能够灵敏地感知肠腔内环境的变化，机械刺激、副交感神经激活、化学物质(酸或碱)、营养物质如脂肪酸、肽、葡萄糖等均能引起肠嗜铬细胞释放5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)。5-HT从EC细胞的释放是启动肠道感觉传导、蠕动和分泌等功能的关键步骤，并且5-HT是脑-肠轴的重要神经递质。具体而言是：EC细胞从底部释放5-HT至粘膜固有层，经疏松结缔组织与深入到粘膜的神经末梢作用。这些神经末梢包括外源性神经和固有主传入神经元(intrinsic primary afferent neurons,IPANs)，外源性神经将恶心和不适感传入到中枢神经系统，粘膜下丛的IPANs起始蠕动和分泌反射，肌间神经丛的IPANs起始巨大移动波(giant migratingcontractions)。其他刺激如细菌内毒素、细胞毒性抗癌药物会增加EC细胞合成5-HT并促进5-HT从EC细胞的释放，导致肠道5-HT含量高于正常生理水平；高水平的肠道5-HT含量是化/放疗致恶心呕吐、溃疡性结肠炎和餐后消化不良致水样腹泻的重要原因。临床研究发现溃疡性结肠炎、腹泻型和便秘型IBS患者其肠道5-HT含量高于正常健康者。动物研究表明肠道5-HT含量过高与腹痛、腹泻、内脏感觉异常、胃肠道黏膜低度炎症等IBS相关症状紧密相关。综上所述，EC源性的5-HT在调控胃肠道动力、感觉传导和免疫炎症反应中处于中心的地位，也意味着调控肠道5-HT含量在治疗慢性肠道疾病如炎性肠病、IBS中具有重要意义。

鞣质又称单宁(tannin)，是存在于自然界的一类结构比较复杂的多元酚类化合物，味涩，具有收敛作用。根据化学结构和性质鞣质分为两大类：可水解鞣质和缩合鞣质。其中可水解鞣质依水解后所得酚酸类的不同又可分为没食子酸鞣质和逆没食子酸鞣质(又称鞣花酸鞣质)，典型的鞣花酸鞣质结构内还是以没食子酰基单元为主。现代研究表明鞣质具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗病毒、抗龋、局部止血等作用，可用于治疗胃肠道出血、溃疡、水泻、创伤、灼伤等，没食子酰基是可水解鞣质重要的生理/药理活性基团。鞣质对胃肠道系统主要是抑制作用，抑制肠道蠕动，阻碍胃内容物向肠道移行，具有止泻止吐等作用。由于鞣质不易吸收，因此主要聚集在肠道。但对5-HT介导的应激性肠易激综合征未见研究。

发明内容

本发明公开了一类含有没食子酰基的鞣质对IBS脑-肠轴互动调控机制中精神应激症状、肠道5-HT含量过高的影响。说明含有没食子酰基单元的鞣质可用于治疗与肠道5-HT失调相关的疾病，更具体的是含有没食子酰基单元的鞣质可用于治疗肠道5-HT过高引起的疾病。所述的与肠道5-HT失调相关的疾病优选应激性肠易激综合征。

含有没食子酰基基团的鞣质优选金缕梅鞣质、诃子酸或仙鹤草因。结构式如下：

本发明以金缕梅鞣质、诃子酸和仙鹤草因作为含有没食子酰基基团的鞣质进行药效学试验，结果表明含有没食子酰基基团的鞣质能够有效缓解慢性应激致肠易激综合征大鼠焦虑/抑郁样的精神症状；显著地抑制上述肠易激综合征大鼠十二指肠色氨酸羟化酶1(trytophanhydroxylase 1,TpH1，5-HT合成的限速酶)和TpH1上游关键的负性调控基因LRP5(LDL-receptor related protein 5,LRP5)mRNA的表达，并显著降低十二指肠5-HT含量；明显地改善上述肠易激综合征大鼠胃和十二指肠的黏膜损伤和炎症细胞浸润；显著地减少上述肠易激综合征大鼠粪便排便次数，减轻排稀便的症状；明显地改善上述肠易激综合征大鼠的胃肠动力紊乱症状。以上结果说明这些鞣质单体通过降低肠道5-HT含量，达到改善应激性肠易激综合征腹泻、大便性状异常、胃肠道黏膜低度炎症的症状。与此同时上述各鞣质单体对慢性应激致肠易激综合征大鼠的症状改善效果：仙鹤草因＞诃子酸＞金缕梅鞣质，提示没食子酰基是这些鞣质治疗肠易激综合征的活性基团，并且逆没食子酰基活性＞没食子酰基活性。综上所述，以没食子酰基单元为主的鞣质单体可以用于制备治疗肠易激综合征的药物。

下面是本发明的部分药效学试验和结果：

1.慢性应激致肠易激综合征大鼠模型的建立与药物干预模式

48只健康的雄性SD大鼠，适应一周后，随机分成6组，每组8只，实验分组为：空白对照组、肠易激综合征模型组、金缕梅鞣质(10mg/kg)+模型组、诃子酸(10mg/kg)+模型组、仙鹤草因(10mg/kg)+模型组、伊托必利阳性对照药(12.5mg/kg伊托必利)+模型组。采用慢性不可预见性复合病因法(慢性束缚应激+黑白颠倒+夹尾刺激+饮食失节+潮湿垫料倾斜)造模。①潮湿垫料加倾斜饲养：以倾斜鼠笼后底部浸水设为垫料的标准潮湿程度，将鼠笼倾斜至45°以上,持续24h。②禁食不禁水：24h。③昼夜交替：白昼以黑布罩着鼠笼持续12h，天黑后拿掉并用白炽灯照射并持续12h。④行为束缚：用饮料瓶自制简易束缚管，瓶口凿有小孔，保持通风良好，束缚管底放有衬布，以便吸收动物的排泄物。大鼠在束缚管中有限的空间活动，但不会造成肉眼可见的躯体上的伤害。动物每日束缚3h(8：30–12：00)。禁水不禁食：24h。⑤夹尾刺激：用长尾票夹钳夹大鼠尾尖部，使其与其它大鼠撕打，导致整笼大鼠保持激怒状态，每次刺激30分钟，每隔3h刺激1次，每日2次。若有大鼠被抓伤，用碘伏涂擦受伤部位，以控制感染。空白对照组大鼠正常饲养，模型组和给药组大鼠按照上述方法造模4周。4周后模型组继续造模，给药组造模同时给予上述各药物，灌胃给药容积按1ml/100g体重计算，正常组与模型组大鼠灌胃等容量蒸馏水，每天1次，连续2周。

2.以没食子酰基单元为主的鞣质单体对大鼠精神状态的影响

在1所述实验中，全程密切观察所有动物的精神状态和活动度。结果发现，正常组大鼠毛发光泽、整洁，活动度和精神状态良好，给药抓取时显得活泼、灵敏，无焦躁或倦怠现象。造模大鼠的毛发逐渐晦涩、枯槁，一开始出现应激样行为，抓取时抵抗性较强，有攻击倾向；随着造模的继续大鼠活动度减少，出现扎堆和倦卧的现象，抓取时几乎无抵抗行为。给药后各鞣质单体给药组大鼠的毛发较模型组整洁，扎堆或倦卧现象减少，给药抓取时显得较为灵敏但无攻击倾向，而伊托必利组大鼠的精神状态与模型组相近。

3.以没食子酰基单元为主的鞣质单体对大鼠十二指肠5-HT含量的影响

实验方法：1中所述动物处死后，将分离得到的十二指肠一部分用于提取总RNA(Trizol法)以检测十二指肠中TpH1和LRP5的基因表达情况，另一部分浸泡于4％多聚甲醛中，过夜后自动脱水机梯度脱水，石蜡包埋，切片，做5-HT免疫染色(5-HT抗体品牌Abcam，货号ab16007)，得到的5-HT免疫组化的病理切片在显微镜下观察并拍照。

在荧光定量PCR实验中，按照RNA提取试剂(Trizol，品牌：Invitrogen)、逆转录试剂盒(品牌：Thermo Fisher Scientific,货号：K1622)和荧光定量PCR试剂盒(品牌：Thermo FisherScientific,货号：K0392)的操作说明进行操作，以GAPDH为内参基因。引物由上海捷瑞生物工程有限公司提供，引物序列如下：TpH1-Sense:5’-CTT ATT GGC TTT TTA ATT GGT TGTG-3’，TpH1-Antisense:5’-CCT TCG CTT ATT TTT TCT ATC CTG A-3’，LRP5-Sense：5’-CTATCC CAC TCA CGG GTG TCA AA-3’，LRP5-Antisense:5’-AGG CTC GGC TGA TCG TCTTG-3’，GAPDH-Sense:5’-AGA AGG TGG TGA AGC AGG CAT C-3’，GAPDH-Antisense:5’-CGA AGG TGG AAG AGT GGG AGT TG-3’。

结果分析：在肠道内分泌细胞中，EC细胞是唯一合成并分泌5-HT的。EC细胞分散分布于整个胃肠道并在十二指肠处最为富集，是整个肠道和外周5-HT的主要来源。色氨酸羟化酶1(trytophan hydroxylase 1,TpH1)是EC细胞合成的5-HT的限速酶，LRP5是调控TpH1表达的关键负性调节基因。

1)十二指肠荧光定量PCR的结果显示：与空白对照组相比，模型组TpH1基因表达显著上调，LRP5基因表达显著下调，意味着模型组EC细胞5-HT合成显著增加。与模型组相比，各鞣质单体给药组大鼠十二指肠TpH1基因表达显著下调，LRP5基因表达显著上调，意味着各鞣质单体显著抑制EC细胞5-HT的合成。见图1.

2)十二指肠5-HT免疫组化结果显示：①与空白对照组相比，模型组大鼠十二指肠5-HT免疫阳性细胞数量显著增多，表明应激性肠易激综合征大鼠肠道5-HT含量显著增高。②与模型组相比，各鞣质单体给药组大鼠十二指肠5-HT免疫阳性细胞数量显著减少，并且5-HT免疫阳性细胞数量仙鹤草因＜诃子酸＜金缕梅鞣质，表明这些鞣质单体能够降显著低应激性肠易激综合征大鼠肠道5-HT含量。③与模型组相比，伊托必利阳性对照组大鼠十二指肠5-HT免疫阳性细胞数量亦有所减少。见图2。

4.以没食子酰基单元为主的鞣质单体对大鼠胃和十二指肠形态结构的影响

实验方法：1中所述动物处死后，将分离得到的胃和十二指肠肠段浸泡于4％多聚甲醛中，过夜后自动脱水机梯度脱水，石蜡包埋，切片，做苏木素-伊红染色，得到的苏木素-伊红染色的病理切片在显微镜下观察并拍照。

结果分析：①胃：显微镜下观察空白对照组大鼠胃黏膜固有层内管状的胃底腺排列紧密、形态规整，可清晰辨认主细胞和壁细胞；黏膜表面腺上皮与胃小凹相连续并形成严密的保护屏障；胃底腺有少许炎性淋巴细胞浸润。模型组大鼠胃黏膜表面破损、残缺，胃底腺炎性淋巴细胞浸润明显增多，固有层内胃腺体间隙扩张。与模型组相比，金缕梅鞣质、诃子酸、仙鹤草因和伊托必利阳性对照组胃底腺炎性淋巴细胞浸润减少，黏膜固有层内腺体间隙缩小。②十二指肠：显微镜下空白对照组大鼠肠壁结构基本正常，肠黏膜上皮微绒毛及上皮细胞间连接结构完整，间质可见极少量淋巴细胞浸润。模型组大鼠肠壁结构损伤，粘膜可见轻度糜烂，炎性淋巴细胞浸润显著增多。与模型组相比，金缕梅鞣质、诃子酸、仙鹤草因和阳性对照组肠壁结构基本完整、未见糜烂，炎性淋巴细胞浸润显著减少。见图3。

5.以没食子酰基单元为主的鞣质单体对大鼠胃肠动力的影响

实验方法：胃排空率和小肠推进率的测定

对1中所述所有动物禁食过夜，次日早晨给予每只大鼠灌服含2％活性炭粉末的营养性半固体糊，灌胃容积按1ml/100g体重计算，30分钟后立即处死动物，打开腹腔，结扎胃贲门、幽门，分离出胃并将自幽门至回肠末端的肠管完整地摘除且不加牵引地平铺于桌面上。沿胃幽门处剪取胃，用滤纸拭干，称全重(Ml)，再沿胃大弯处剪开胃，用生理盐水洗净内容物，用滤纸拭干，称胃净重(M2)，计算胃内残留率。

对于小肠推进率的测定，测量幽门至回盲部的距离作为小肠全长，测量炭末前段至幽门部的距离作为炭末推进距离，以炭末推进率代表小肠推进率。

结果分析：与空白对照组相比，模型组大鼠的胃内残留率和小肠推进率明显降低，表明慢性应激致肠易激综合征大鼠胃肠动力紊乱，这是模型组大鼠排便次数和形状异常的重要原因。与模型组相比，阳性对照组大鼠胃内残留率降低、小肠推进率升高；金缕梅鞣质、诃子酸和仙鹤草因能够升高胃内残留率、对小肠推进作用无明显影响，其中升高胃内残留率的效应仙鹤草因＞诃子酸＞金缕梅鞣质。这表明上述各鞣质单体能够改善肠易激综合征大鼠胃肠动力紊乱的症状，意味着具有调整排便的作用。见图4。

6.以没食子酰基单元为主的鞣质单体对大鼠粪便情况的影响

实验方法：对1中所述所有动物，在造模前、造模4周时和给药2周时三个时间点且在3中所述实验结束后，在直径60cm的圆盆中盛满水(水温22±3℃)，水中央放置直径10cm的柱形平台，平台面高出水面约1cm，将各组大鼠置于平台上，观察每只大鼠2h内排便情况，记录排便次数，并对每只大鼠每次排便的粪便性状评分，泄泻稀便计0分，软便无定形计1分，软便定形计2分，固体定形计3分，记录各组内每只大鼠2h内粪便的累积性状评分。

结果分析：与空白对照组比较，模型组大鼠2h内排便次数明显增多，出现稀便和无定形便，粪便综合评分显著降低。与模型组相比，金缕梅鞣质、诃子酸、仙鹤草因和阳性对照组大鼠排便次数均显著减少，粪便性状得以改善，粪便2h内累积评分显著提高。上述症状的改善仙鹤草因＞诃子酸＞金缕梅鞣质。具体结果见表1和表2。

表1 以没食子酰基单元为主的鞣质单体对大鼠排便情况的影响(mean±SD,n＝8)

注：与正常组比较,^**P＜0.01；与模型组比较,^#P＜0.05，^##P＜0.01。

表2 以没食子酰基单元为主的鞣质单体对大鼠粪便性状的影响(mean±SD,n＝8)

注：与空白对照组比较,^**P＜0.01；与模型组比较,^#P＜0.05,^##P＜0.01。

7.以没食子酰基单元为主的鞣质单体对大鼠体重和摄食量的影响

实验方法：在1所述实验过程中，对大鼠体重和摄食量进行监测。大鼠体重每周称重一次，于每周最后一天的早晨称重，并详细记录。大鼠摄食量在造模前、造模4周时和给药2周时进行测量，以组(笼)为单位测量当天早上9:00给予的食物重量和次日早上9:00剩余的食物重量，连续测量72h。

结果分析：空白对照组大鼠在整个实验过程中体重持续、明显增长，摄食量正常。模型组和给药组大鼠造模期间体重增重缓慢、摄食量显著减少，给药后各给药组大鼠摄食量较模型组显著增多、体重有所增加。具体结果见表3和表4。

表3 以没食子酰基单元为主的鞣质单体对大鼠体重的影响(mean±SD,n＝8)

注：与空白对照组比较,^*P＜0.05。

表4 以没食子酰基单元为主的鞣质单体对大鼠摄食的影响(mean±SD,n＝8)

注：与空白对照组比较,^*P＜0.05；与模型组比较,^#P＜0.05。

附图说明

图1是含没食子酰基的鞣质单体对十二指肠TpH1、LRP5基因表达的影响。(其中A是TpH1，B是LRP5。与空白对照组比,^***P＜0.001；与模型组比,^####P＜0.001。)

图2是含没食子酰基的鞣质单体对十二指肠5-HT免疫组化的影响(×100)(其中A是空白对照，B是模型，C是阳性对照，D是金缕梅鞣质，E是诃子酸，F是仙鹤草因组，箭头所指为5-HT免疫阳性)

图3是含没食子酰基的鞣质单体对胃和十二指肠形态结构的影响

图4是含没食子酰基的鞣质对大鼠胃内容物残留率和小肠推进率的影响。(其中A是胃内残留率，B是小肠推进率。与空白对照组比,^***P＜0.001；与模型组比,^#P＜0.05；^##P＜0.01；^###P＜0.001)。

Claims (3)

1.含有没食子酰基基团的鞣质用于制备治疗与肠道5-HT失调相关的疾病的药物的用途。

2.权利要求1的用途，其中与肠道5-HT失调相关的疾病是应激性肠易激综合征。

3.权利要求1的用途，其中所述的含有没食子酰基基团的鞣质是金缕梅鞣质、诃子酸或仙鹤草因。