CN104873485B - 槲皮素治疗与胃肠道应激失调相关疾病的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天然药物领域,具体涉及黄酮类化合物槲皮素治疗胃肠道促肾上腺皮质素释放激素受体(CRH受体)失调相关的应激性肠易激综合征的用途。药效学试验证实,槲皮素可有效地治疗应激性肠易激综合症,特别是以胃肠道CRH受体表达异常引发的腹胀、腹泻、胃肠道轻度炎症以及伴随的精神应激症等为主要症状的肠易激综合症。故以槲皮素单体作为活性成分与药学上可接受的载体制成具有治疗应激性肠易激综合征的药物。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物领域,具体涉及槲皮素的医药用途,即用于治疗与胃肠道促肾上腺皮质素释放激素受体失调相关的疾病用途。
背景技术
肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome,IBS)是一种常见的功能性胃肠道紊乱疾病,其症状主要表现为腹痛或腹部不适伴排便习惯改变和(或)大便性状异常,该病缺乏可解释症状的形态学改变和生化异常。目前对IBS的病因和发病机制尚未完全阐明,其中涉及胃肠动力异常、内脏感觉敏感性增高、局部炎症免疫反应、心理精神因素等,普遍认为IBS是多种发病机制共同作用的结果。
迄今为止IBS的治疗主要是对症治疗和综合治疗,包括药物治疗、患者教育、心理治疗、饮食调整等。其中药物治疗主要是对症治疗,主要在于改善胃肠道动力(如曲美布汀、吗丁啉、伊托必利)、解除肠管痉挛(如匹维溴铵)、减轻肠管扩张、抗菌消炎以及调节肠道微生态环境(如丽珠长乐双歧杆菌制剂)等。但是上述药物的应用并不能有效地解决IBS的复发和间歇发作。临床上发现IBS患者不仅具有胃肠道症状,还伴有焦虑、抑郁等精神心理异常,说明IBS患者存在精神心理障碍和胃肠道症状的恶性循环,这可能是该病反复发作、药物对症治疗疗效不佳的原因之一。此外,随着生物-心理-社会医学模式的提出和神经胃肠学的建立与发展,脑-肠轴互动调控机制在IBS发病和治疗中的作用逐渐得到证实。其中促肾上腺皮质素释放激素(corticotropinreleasinghormone,CRH)是脑-肠轴对精神应激反应的重要介质。很多研究已证实精神应激刺激导致室旁核释放CRH,CRH通过作用于效应器官细胞膜上的CRH受体发挥作用。CRH受体不仅广泛表达于大脑的许多区域,同时CRH受体也表达于外周器官,如胃肠道。且胃肠道(主要为小肠)存在两种调节胃肠道应激反应的CRH受体:CRH-R1、CRH-R2。有研究报道,应激可致使胃肠道中CRH受体表达失调引发相应的胃肠道功能性紊乱疾病,其中肠道胆碱能神经元上的CRH-R1受体介导了应激时肠运动反应,表现为肠收缩活动增强,传输时间缩短,引起腹痛和腹泻;CRH-R2受体激活与胃排空和小肠传输的延缓相关;并且胃肠道中CRH-R1受体活化可导致炎性反应,而CRH-R2受体的活化与抗炎性反应有关。胃肠道的反应在脑-肠轴互动调控机制中又会影响中枢的情绪状态。这意味着调控胃肠道CRH受体表达在应激性IBS疾病发生和治疗中发挥重要作用。由于CRH受体广泛表达于中枢和外周器官,有些全身调控CRH受体的化合物会有潜在的副作用,如何针对胃肠道CRH受体的表达进行调节,进而改善IBS的相关胃肠道症状以及伴随的精神应激症的临床治疗策略还未见报道。
槲皮素是一种天然的多酚羟基黄酮类单体化合物,常见于洋葱、西兰花、西红柿、苹果、草莓等蔬菜水果中。但槲皮素溶解度低,吸收差致使其入血浓度极低,多个文献报道未在体内检出。发现其主要分布于胃肠道,因吸收差且可在胃肠道局部聚集高浓度。有研究报道槲皮素可对胃粘膜损伤具有明显的保护作用,同时明显抑制小肠的推进功能和腹腔毛细血管的通透性。另外美国专利(No.11/510,152,filed Aug.24,2006)中揭示槲皮素可作为氯离子通道抑制剂治疗腹泻型肠易激综合征,以及美国专利(No.61/598,926,filedFeb.15,2012)中显示槲皮素可用于治疗肠嗜铬细胞增殖诱导胃肠道五羟色胺系统紊乱引起的胃肠相关疾病(包括肠易激综合征)。尽管如此,这些前期的研究或专利仅仅为改善肠易激综合征发病后的某一症状,局限于从胃肠道中肠嗜铬细胞增殖引发相关疾病的角度进行治疗。但槲皮素针对精神应激性的相关胃肠道受体表达失调导致的胃肠道疾病未见报道。
发明内容
本发明公开了槲皮素的一种医药用途,其具有治疗与胃肠道促肾上腺皮质素释放激素(CRH)受体失调相关的疾病,即其通过调节CRH受体表达治疗特定的IBS,尤其治疗对IBS脑-肠轴调控机制中胃肠道CRH受体表达异常引起的腹胀、腹泻、胃肠道粘膜轻度炎症等以及伴随的精神应激症等症状的肠易激综合症。
药效学实验表明,槲皮素可有效缓解慢性应激致肠易激综合征大鼠焦虑/抑郁样的精神症状;显著地协调调节上述肠易激综合征大鼠十二指肠相互作用的CRH-R1和CRH-R2受体表达量;明显地改善上述肠易激综合征大鼠胃和十二指肠的黏膜损伤和炎症细胞浸润;显著地减少上述肠易激综合征大鼠粪便排便次数,减轻排稀便的症状;明显地改善上述肠易激综合征大鼠的胃肠动力紊乱症状。以上结果提示槲皮素单体可通过调节大鼠十二指肠CRH-R1和CRH-R2受体表达进而改善应激性肠易激综合征中腹泻、大便性状异常、胃肠道黏膜低度炎症的症状,同时缓解大鼠焦虑/抑郁样精神症状。
本发明的天然药物槲皮素可以制备成口服制剂,与药学上可以接受的辅料制成药物口服制剂,如胶囊剂、片剂、丸剂、栓剂、散剂、口服液、颗粒剂或蜜丸。在本发明药物中,除了药物活性成分,药学上可接受的载体可以添加一种或多种药学上常规使用的药物制剂辅料如赋形剂,稀释剂,粘合剂,稳定剂等,以及一些化学添加剂如色素,防腐剂,增味剂等。
下面是本发明的部分药效学实验及结果:
1.慢性精神应激致肠易激综合征大鼠模型的建立和药物干预模式
健康的40只雄性Wistar大鼠,适应一周后,随机分组,每组8只,实验分为五组,分别为:空白对照组、慢性应激性肠易激综合征模型组、槲皮素低剂量组(25mg/kg槲皮素)+模型组、槲皮素高剂量(50mg/kg槲皮素)+模型组、阳性对照药(30mg/kg曲美布汀)+模型组。采用慢性不可预见性复合病因法(慢性束缚应激+黑白颠倒+夹尾刺激+饮食失节+潮湿垫料倾斜)造模。①潮湿垫料加倾斜饲养:以倾斜鼠笼后底部浸水设为垫料的标准潮湿程度,将鼠笼倾斜至45°以上,持续24h。②禁食不禁水:24h。③昼夜交替:白昼以黑布罩着鼠笼持续12h,天黑后拿掉并用白炽灯照射并持续12h。④行为束缚:用饮料瓶自制简易束缚管,瓶口凿有小孔,保持通风良好,束缚管底放有衬布,以便吸收动物的排泄物。大鼠在束缚管中有限的空间活动,但不会造成肉眼可见的躯体上的伤害。动物每日束缚3h(8:30–12:00)。禁水不禁食:24h。⑤夹尾刺激:用长尾票夹钳夹大鼠尾尖部,使其与其它大鼠撕打,导致整笼大鼠保持激怒状态,每次刺激30分钟,每隔3h刺激1次,每日2次。空白对照组正常饲养,模型组和给药组按照上述方法造模4周;4周后模型组继续造模,给药组造模同时给予两种不同浓度的槲皮素,大鼠以1ml/100g灌胃给药,连续给药2周。正常组与模型组大鼠灌胃等容量蒸馏水,每天1次,连续给药2周。
2.槲皮素对大鼠精神状态的影响
在1所述实验中,全程密切观察所有动物的精神状态和活动度。通过观察发现:正常组大鼠毛发光泽、整洁,活动度和精神状态良好,给药抓取时显得活泼、灵敏,无焦躁或倦怠现象。模型组大鼠逐渐出现毛发变暗,枯黄,活动减少,紧张,焦虑或喜扎堆,倦卧等表现。槲皮素给药组毛发较模型组整洁,扎堆或倦卧现象减少,给药抓取时显得较为灵敏。而曲美布汀阳性对照组大鼠毛发、扎堆或倦卧现象、活动度等方面与模型组比较均无明显变化。说明槲皮素给药后可改善大鼠应激性造模后的精神应激状态,而曲美布汀对应激性大鼠的焦虑/抑郁样状态无明显改善作用。
3.槲皮素对大鼠十二指肠两种CRH受体表达的影响
实验方法:在1中所述动物处死后,打开腹腔,分离出十二指肠,冰生理盐水冲洗。立即冻存于-80℃冰箱。取50mg十二指肠研磨,采用TRIZOL法提取组织中总RNA,然后运用Takara试剂盒对所提取RNA进行荧光定量PCR试验,其引物设计:GAPDH上游引物:GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG,下游引物:ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA。CRHR1上游引物:CACTACCATGTTGCAGTCATC,下游引物CGAACATCCAGAAGAAGTTGG。CRFR2上游引物:TGGTGCATACCCTGCCCTATCATT,下游引物:ACTAAGTCACCAGGTTCC-TTGCCA。并采用相对定量进行数据统计。
分析:胃肠道小肠中存在两种CRH受体,即CRH-R1、CRH-R2,且研究中以十二指肠报道最多。十二指肠中两种受体表达结果显示:①与空白对照组相比,模型组大鼠十二指肠CRH-R1基因的表达量升高,CRH-R2基因的表达量降低。表明应激性肠易激综合征大鼠肠道CRH受体表达异常。②与模型组相比,槲皮素给药组大鼠十二指肠CRH-R1基因的表达量显著减少,CRH-R2基因的表达量升高,并且呈剂量依赖性降低。表明槲皮素能够调节和平衡应激性肠易激综合征大鼠肠道两种CRH受体的表达。③与模型组相比,曲美布汀阳性对照组大鼠十二指肠CRH受体表达量无明显变化。表明曲美布汀无调节胃肠道CRH受体表达的作用。具体见图1。
4.槲皮素对大鼠胃、十二指肠病理的影响
实验方法:在1中所述实验结束后,进行大鼠麻醉,取血处死,将幽门、贲门部结扎,在两结扎线远侧端切断消化道,摘下整个胃部,沿胃大弯剖开,剪取胃体中1/3段大小约为0.5cm×0.5cm胃壁全层一块,4%多聚甲醛固定作进一步固定,自动脱水机梯度脱水,浸蜡包埋,切片,染色;打开腹腔,分离出十二指肠,冰生理盐水冲洗。取0.5cm×0.5cm×0.5cm的十二指肠用4%多聚甲醛固定作进一步固定,自动脱水机梯度脱水,浸蜡包埋,切片,染色。
分析:①胃粘膜:光镜下观察(×400倍),正常对照组大鼠胃窦组织结构基本正常,粘膜层完整,未见出血和水肿,粘膜固有层有少许淋巴细胞浸润,胃腺体形态规整。模型组大鼠胃窦粘膜完整,中性粒细胞和淋巴细胞浸润明显增多,胃腺体间隙扩张,无充血,水肿和糜烂。高、低不同剂量的槲皮素组,较模型组大鼠亦可见少量淋巴细胞浸润,黏膜固有层内腺体间隙缩小。且槲皮素高剂量组改善更明显。而曲美布汀阳性对照组较模型组大鼠中性粒细胞和淋巴细胞浸润无明显变化。说明曲美布汀对应激引起的胃组织中轻度炎症无明显改善。②十二指肠:光镜下观察(×400倍),空白组大鼠肠壁结构基本正常,肠粘膜上皮微绒毛及上皮细胞间连接结构完整,间质可见极少量淋巴细胞浸润。模型对照组大鼠肠壁结构损伤,粘膜可见轻度糜烂,淋巴细胞和浆细胞浸润。高、低不同剂量的槲皮素组大鼠亦可见淋巴细胞浸润显著减少,肠壁结构基本完整、未见糜烂且槲皮素高剂量组改善更明显。而曲美布汀阳性对照组较模型组大鼠炎性细胞浸润和肠壁结构无明显变化。说明曲美布汀同样地对应激引起的十二指肠组织中轻度炎症也无明显改善。试验结果见图2。
5.槲皮素对大鼠粪便情况的影响
实验方法:对1中所述所有动物,在造模前、造模后和给药2周后,在直径60cm的圆盆中盛满水(水温10±1℃),水中央放置直径10cm的柱形平台,平台面高出水面约1cm,将各组大鼠置于平台上,观察各大鼠2h内排便情况,定形粪便记录粒数,不定形或稀便记录排便次数;并对每粒或每次粪便性状评分,泄泻稀便计0分,软便无定形计1分,软便定形计2分,固体定形计3分,累积记录各大鼠2h内粪便的评分。
分析:与正常组比较,4周造模后各组大鼠2h内排便量明显增多(P<0.01),且各造模组大鼠均出现稀便和无定形软便(P<0.01);给药2周后槲皮素给药组和曲美布汀阳性组大鼠排便量减少(P<0.05),固体粒状粪便增多(P<0.05)。表明槲皮素可调节大鼠应激状态下腹泻症状,调整排便的作用。试验结果见表1和表2。
表1槲皮素对大鼠排便量的变化(mean±SD,n=8)
注:与正常组比较#P<0.05,##P<0.01;与模型组比较*P<0.05,**P<0.01。
表2槲皮素对大鼠粪便性状总评分的变化(mean±SD,n=8)
注:与正常组比较#P<0.05,##P<0.01;与模型组比较*P<0.05,**P<0.01。
6.槲皮素对大鼠胃肠动力的影响
实验方法:胃内残留率和小肠推进率的测定
对1中所述所有动物,实验结束后禁食过夜,次日早晨给予每只大鼠灌服含2%活性炭粉末的营养性半固体糊,灌胃容积按1ml/100g体重计算,30分钟后立即处死动物,打开腹腔,结扎胃贲门、幽门,分离出胃并将自幽门至回肠末端的肠管完整地摘除且不加牵引地平铺于桌面上。沿胃幽门处剪取胃,用滤纸拭干,称全重(Ml),再沿胃大弯处剪开胃,用生理盐水洗净内容物,用滤纸拭干,称胃净重(M2),按如下公式计算胃内残留率:
对于小肠推进率的测定,测量幽门至回盲部的距离作为小肠全长,测量炭末前段至幽门部的距离作为炭末推进距离,以炭末推进率代表小肠推进率,计算公式如下:
分析:与空白对照组相比,模型组大鼠的胃内容物残留率和小肠推进率明显升高,表明慢性应激致肠易激综合征大鼠胃肠蠕动功能异常增强。说明造模处理后会使大鼠胃排空时间延长,小肠推进功能增强,从而引发大鼠腹胀,腹泻的症状。与模型组相比,槲皮素不同剂量组和曲美布汀阳性组大鼠胃内残留率均明显下降,小肠推进率降低。表明槲皮素也具有改善胃肠动力紊乱的作用。试验结果见图3。
7.槲皮素对大鼠体重和摄食量的影响
实验方法:在1所述实验过程中,对大鼠体重和摄食量进行监测。大鼠摄食量在造模前、造模4周时和给药2周时进行测量,以组(笼)为单位当天早上9:00给予400g的饲料,次日早上9:00测量剩余的饲料重量,并称体重,计算24h内摄食量,摄食量=(食物总量-食物余量)/该笼大鼠的只数。
表3槲皮素对大鼠体重的变化(mean±SD,n=8)
注:与空白组比较#P<0.05,##P<0.01;与模型组比较*P<0.05,**P<0.01。
分析:在体重方面,空白组大鼠在整个实验过程中体重明显增长;与正常组比较,4周造模时,模型组和不同给药组大鼠体重明显减轻;而与模型组比较,给药2周后,槲皮素不同剂量组和曲美布汀阳性组体重均有所增加。试验结果见表3。
表4槲皮素对大鼠摄食量的变化(mean±SD,n=8)
注:与正常组比较#P<0.05,##P<0.01;与模型组比较*P<0.05,**P<0.01。
分析:在摄食量方面,空白组大鼠在整个实验过程中摄食量无显著性变化;与空白组比较,模型组和不同给药组大鼠在造模期间摄食量显著减少,说明造模对摄食量有负面影响,使大鼠的体重增长缓慢。给药后,与模型组相比,槲皮素不同剂量组和曲美布汀阳性组摄食量明显增加。试验结果见表4。
附图说明
图1是槲皮素对十二指肠中CRH-R1和CRH-R2表达量的影响(与空白对照组比,##P<0.01,###P<0.001;与模型组比,*P<0.05;**P<0.01)。
图2是槲皮素对胃(×100)和十二指肠(×200)的病理改变(矩形框中为×400)
图3是槲皮素对胃排空率和小肠推进率的影响(A图为胃残留率;B图为小肠推进率。与空白对照组比,##P<0.01,###P<0.001;与模型组比,*P<0.05;**P<0.01)。
Claims (1)
1.槲皮素在制备调节胃肠道促肾上腺皮质素释放激素受体CRH-R基因表达的试剂中的用途,
其中CRH-R是指CRH-R1和CRH-R2,
其中槲皮素使CRH-R1基因的表达量升高,使CRH-R2基因的表达量降低。
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