JP7068172B2 - インドリノン化合物および線維性疾患の処置におけるそれらの使用 - Google Patents

インドリノン化合物および線維性疾患の処置におけるそれらの使用 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、とりわけ、プロテインキナーゼを阻害する新規化合物と、特に線維性疾患または間質性肺疾患、特に特発性肺線維症および呼吸器疾患の処置のための治療におけるそれらの使用とに関する。本発明はまた、前記化合物を含む医薬組成物に及ぶ。
発明の背景
間質性肺疾患（ＩＬＤ）は、肺機能不全につながる肺の瘢痕を特徴とし、最終的には呼吸器不全につながり得る。特発性と称される原因不明の多くのＩＬＤがある。特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、最も一般的なタイプのＩＬＤである。ＩＰＦは、欧州では約１７０，０００人および米国では１３０，０００人が罹患しており、米国のみで毎年約４８，０００件の新たな症例が診断されており、米国では毎年４０，０００人が死亡している。ＩＰＦの死亡率は非常に高く、診断からの中央生存期間は３～５年間であり、５年生存率は３０％未満であると報告されており、最も致命的ながんと同等である。最近まで、有効であることが示された肺移植以外の処置選択肢はほとんどなく、ほとんどの患者の処置は症候管理および緩和ケアであった。
ＩＰＦは、肺組織の瘢痕化によって引き起こされる肺機能の進行性低下を主に特徴とする慢性致死的疾患であり、呼吸困難の悪化をもたらす。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、線維化が起こると肺の正常組織に取って代わる線維芽細胞の公知の強力なマイトジェンである。ＩＬＤでは、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦおよびＦＧＦの病因的役割の証拠が臨床的に立証されている。主な罹患部位は間質（肺の空気嚢間の組織）であるが、気道、末梢気道および血管も罹患する。疾患プロセスは、肺の肺胞上皮に対する一連の微小傷害によって開始されると考えられる。傷害後、血管透過性の増加は血栓形成をもたらし、傷害の結果として死亡した細胞に取って代わろうとして常在上皮細胞が増殖する。このプロセスは、上皮細胞の異常活性化、異常な血管リモデリングならびに最も顕著には線維芽細胞の増殖およびその肺への遊走をもたらす様々な成長因子（例えば、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦおよび形質転換成長因子β（ＴＧＦβ））の放出をトリガーする。成長因子はまた、筋線維芽細胞（これは、線維芽細胞と一緒に病巣に組織化する）への常在細胞の変換を誘導する（Ｋｉｎｇ ＴＥ Ｊｒら、Ｌａｎｃｅｔ，２０１１，３；３７８（９８０７）：１９４９－６１；Ｓｅｌｍａｎ Ｍら、Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．，２００１，１６；１３４（２）：１３６－５１）。これらの細胞変化は、基底膜の破壊および間質腔における細胞外マトリックスタンパク質の過剰な蓄積をもたらす。結果は、肺胞毛細血管ユニットの正常構造の最終的な破壊および肺瘢痕化である。ＩＰＦに特徴的な線維症の通常の間質パターン（ＵＩＰ）を定義する病状は、特に肺の胸膜下領域における正常な肺、間質性炎症、高密度線維症、線維芽細胞性病巣および蜂巣肺が交互になった領域の異種パターンである（Ｄｕ Ｂｏｉｓ ＲＭ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，２０１０，９（２）：１２９－４０；Ｓｅｌｍａｎ Ｍら、Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．，２００１，１６；１３４（２）：１３６－５１；Ｋｉｎｇ ＴＥ Ｊｒら、Ｌａｎｃｅｔ，２０１１，３；３７８（９８０７）：１９４９－６１）。正常構造の喪失および間質腔の瘢痕化は、ガス交換能力の有意な低下をもたらし、疾患の古典的症候、すなわち呼吸困難、慢性咳、聴診時の吸気性クラックルおよび異常な肺活量測定をもたらす（Ｃａｓｔｒｉｏｔｔａ ＲＪら、Ｃｈｅｓｔ，２０１０，１３８（３）：６９３－７０３）。疾患経過は異種性であるが、中央生存期間は約３～５年間であり、最も一般的な死因は、正常な肺機能およびガス交換を破壊する進行性病状による呼吸器不全である。
肺障害の処置においてより良好な忍容性およびより良好な有効性を達成するために、薬物を肺内の作用部位に直接送達することが有利であり得る。これは、作用部位においてより高い薬物濃度を達成することを可能にして全体用量を減少させ、その結果として全身性副作用を減少させる。
ニンテダニブ（プロテインキナーゼ阻害剤）は、経口投与によるＩＰＦの処置について２０１４年にＦＤＡによって承認された。しかしながら、それは、腹痛、嘔吐および下痢を含む重大な全身性有害事象に関連する。国際公開第２００６／０６７１６５号には、ＶＥＧＦＲ、ＦＧＦＲおよびＰＤＧＦＲの阻害剤、例えばニンテダニブは、線維性疾患、例えばＩＰＦの処置において有用であると予想され得ることが教示されている。Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈ．Ｈら、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．，１９９９，４３５（１）：２０－３１には、ＶＥＧＦＲは肺線維症の原因に関連することが開示されている。Ｌｉｎｄｒｏｏｓ．Ｐ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００１，２８０：Ｌ３５４－Ｌ３６２には、ＰＤＧＦ受容体のアップレギュレーションは、肺線維症中の筋線維芽細胞過形成の機構であることが教示されている。国際公開第０１／２７０８１号には、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲおよびＦＧＦＲを含むキナーゼに対する阻害効果を有する化合物は、線維性疾患の処置に適切であることが示されており、一連の６位置換インドリノンが開示されている。同様に、国際公開第２００６／０６７１６５号および国際公開第２００６／０６７１６８号にも、線維性疾患の処置または予防のための医薬として使用するための６位置換インドリノンが開示されている。
線維性疾患および間質性肺疾患、例えばＩＰＦを処置するために、当技術分野では、さらなる化合物、特に、ニンテダニブよりも良好な忍容性の化合物を開発する必要性が依然として存在する。望ましくは、このような化合物は、低用量と、１日１回、２回または３回の投与に適切な長期作用時間と、肺に局所送達される場合に良好な有効性および忍容性とを有する。本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物は、この問題に対処する。
国際公開第２００６／０６７１６５号 国際公開第０１／２７０８１号 国際公開第２００６／０６７１６８号
Ｋｉｎｇ ＴＥ Ｊｒら、Ｌａｎｃｅｔ，２０１１，３；３７８（９８０７）：１９４９－６１ Ｓｅｌｍａｎ Ｍら、Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．，２００１，１６；１３４（２）：１３６－５１ Ｄｕ Ｂｏｉｓ ＲＭ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，２０１０，９（２）：１２９－４０ Ｃａｓｔｒｉｏｔｔａ ＲＪら、Ｃｈｅｓｔ，２０１０，１３８（３）：６９３－７０３ Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈ．Ｈら、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．，１９９９，４３５（１）：２０－３１ Ｌｉｎｄｒｏｏｓ．Ｐ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００１，２８０：Ｌ３５４－Ｌ３６２
発明の要旨
本発明によれば、式（Ｉ）の化合物：
Figure 0007068172000001
 （式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、ＣＨ＝ＣＨ２、Ｃ≡Ｃ－ＨまたはＣ≡Ｃ－Ｍｅを表し；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、－ＣＨ２－（Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル）、ハロゲンまたはシアノを表し；
Ｒ３は、式（ｉ）
Figure 0007068172000002
 または式（ｉｉ）
Figure 0007068172000003
 または式（ｉｉｉ）
Figure 0007068172000004
 を表し；
Ｑは、Ｏ、ＮおよびＳから選択されるヘテロ原子を表し、Ｎの場合には、Ｃ１－４アルキルで場合により置換されていてもよく；
Ｚは、ＣＯまたはＳＯ２を表し；
Ｙ１は、（ＣＨ２）ｎを表し、ｎが０を表す場合を除いて、Ｍｅで場合により置換されていてもよく；
Ｘ１は、（ＣＨ２）ｍを表し、ｍが０を表す場合を除いて、Ｍｅで場合により置換されていてもよく；
ｎおよびｍは独立して、０、１、２、３、４または５を表し；
Ｙ２は、（ＣＨ２）ｓを表し、Ｍｅで場合により置換されていてもよく；
ｓは、２、３、４、５または６を表し；
Ｙ３は、（ＣＨ２）ｔを表し、Ｍｅで場合により置換されていてもよく；
Ｘ２は、（ＣＨ２）ｖを表し、Ｍｅで場合により置換されていてもよく；
ｔおよびｖは独立して、２または３を表していて、ｔ＋ｖ＝４または５であり；
Ｒ ４は、Ｈ、ＯＨ、ＮＲ６Ｒ７、またはＯ、ＮおよびＳから選択される１個もしくはそれを超えるヘテロ原子を含有する脂肪族４～８員複素環を表していて、Ｒ ４ がＯＨまたはＮＲ ６ Ｒ ７ であるときｍは２、３、４または５であり；
Ｒ ５は、Ｈ、ＯＨ、ＮＲ８Ｒ９、またはＯ、ＮおよびＳから選択される１個もしくはそれを超えるヘテロ原子を含有する脂肪族４～８員複素環を表していて、Ｒ ５ がＯＨまたはＮＲ ８ Ｒ ９ であるときｎは２、３、４または５であり；
ここで、Ｒ４およびＲ５が表し得る前記４～８員脂肪族複素環基は、カルボニルまたはスルホン基を場合により含有していてもよく、－Ｃ１－Ｃ４アルキル、Ｃ１－Ｃ４ヒドロキシアルキル－、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル－、－Ｃ１－Ｃ４アルキレンＣＯＮＲ１０Ｒ１１、ＣＮ、ＯＨおよびＮＲ１２Ｒ１３から選択される１つまたはそれを超える基で場合により置換されていてもよく；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は独立して、Ｈを表すか、またはＯＨ、オキソ、ＮＲ１４Ｒ１５もしくは－Ｃ１－Ｃ４アルコキシで場合により置換されているＣ１－Ｃ４アルキルを表し；ならびに
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ４アルキルを表す）またはその薬学的に許容され得る塩（以下、「本発明の化合物（単数または複数）」）が提供される。
図１は、本発明の代表的な実施例およびニンテダニブの人工膜透過性を示す（ＰＡＭＰＡ透過性アッセイの結果および表８を参照のこと：実験を繰り返した化合物については、平均値を使用した）
図２は、ラットにおける本発明の実施例またはニンテダニブの静脈内投与および気管内投与後の総肺曝露を示す（齧歯類における薬物動態測定の結果を参照のこと）
図３は、ラットにおける本発明の実施例またはニンテダニブの静脈内投与および気管内投与後の総肺曝露を示す（齧歯類における薬物動態測定の結果を参照のこと）
図４は、マウスにおける本発明の実施例またはニンテダニブの静脈内投与および鼻腔内投与後の総肺曝露を示す（齧歯類における薬物動態測定の結果を参照のこと）
発明の詳細な説明
アルキル基は、分枝鎖または直鎖であり得る。Ｃ１－８アルキル基は、例えば、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－４アルキルまたはＣ１－３アルキルを表し得る。例示的なアルキル基としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチルおよびＣＨ２ＣＨＭｅ２が挙げられる。一実施形態では、アルキルは、直鎖アルキルを指す。アルキレンは、それが二価基であること以外は、アルキルと同様に解釈されるべきである。
本明細書で使用される場合、アルコキシは－Ｏアルキルを意味し、直鎖または分枝鎖アルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシを含む。
ヒドロキシアルキルは、任意の位置においてヒドロキシル置換基を有するアルキルを意味する。例としては、ヒドロキシメチル、２－ヒドロキシエチル、３－ヒドロキシ－ｎ－プロピルおよび４－ヒドロキシ－ｎ－ブチルが挙げられる。
ハロゲンは、適切には、Ｂｒ、ＣｌまたはＦ、特にＣｌまたはＦ、特にＦであり得る。
Ｏ、ＳおよびＮから選択される１個またはそれを超えるヘテロ原子を含有する脂肪族４～８員複素環の例としては、アゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ジオキサン、テトラヒドロフランおよびチオモルホリンが挙げられる。適切には、複素環は、１個または２個、特に１個のヘテロ原子を含む。このような環は、カルボニルまたはスルホン基を含有し得、例としては、ピロリジノンまたはピペリジノンが挙げられる。
Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルは、場合により分枝状の典型的には３～８個の環員を含有する脂肪族炭素環であって、合計３～８個の炭素原子を含有する脂肪族炭素環を指す。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、メチルシクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルが挙げられる。
脂肪族４～８員複素環は、場合により置換されていてもよい。一実施形態では、環は、置換されていない。別の実施形態では、環は、１個の置換基を有する。置換基は、炭素または窒素原子上にあり得る。置換複素環の例としては、Ｎ－メチル－ピペラジン、Ｎ－メチル－ピペリジン、Ｎ－エチル－ピペラジン、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミン）－ピロリジン、Ｎ－（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）－ピペラジン、４－ヒドロキシ－ピペリジン、４－シアノ－ピペリジン、２，６－ジメチル－ピペリジン、Ｎ－メトキシエチル－ピペラジン、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミン）－ピペリジンおよび４－メトキシ－ピペリジンが挙げられる。
一実施形態では、本発明の化合物の薬学的に許容され得る塩が提供される。
本開示の化合物は、特定の原子が天然に存在する同位体または天然に存在しない同位体であるものを含む。一実施形態では、同位体は、安定同位体である。したがって、本開示の化合物は、例えば、水素原子などに代えて１個またはそれを超える重水素原子を含有するものを含む。
本開示はまた、本明細書で定義される化合物のすべての多形形態（その塩を含む）に及ぶ。
本開示はまた、本明細書で定義される化合物のすべての溶媒和物に及ぶ。溶媒和物の例としては、水和物が挙げられる。
適切には、Ｒ１は、ＭｅまたはＨ、特にＭｅを表す。
適切には、Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、ハロゲンまたはシアノ、より適切にはＨ、Ｃ１－Ｃ４アルキルまたはハロゲン、さらにより適切にはＨ、Ｍｅまたはハロゲン、最も適切にはＨ、ＭｅまたはＦ、特にＨを表す。
好ましい実施形態では、Ｚは、ＣＯを表す。別の実施形態では、Ｚは、ＳＯ２である。
好ましい一実施形態では、Ｒ３は、式（ｉ）である。
適切には、Ｒ ４は、ＮＲ６Ｒ７、またはＯ、ＮおよびＳから選択される１個もしくはそれを超えるヘテロ原子を含有する脂肪族４～８員複素環を表していて、Ｒ ４ がＮＲ ６ Ｒ ７ であるときｍは２、３、４または５であり、そしてＲ ５は、ＨまたはＯＨを表していて、Ｒ ５ がＯＨであるときｎは２、３、４または５である；または
Ｒ ５は、ＮＲ８Ｒ９、またはＯ、ＮおよびＳから選択される１個もしくはそれを超えるヘテロ原子を含有する脂肪族４～８員複素環を表していて、Ｒ ５ がＮＲ ８ Ｒ ９ であるときｎは２、３、４または５であり、Ｒ ４は、ＨまたはＯＨを表していて、Ｒ ４ がＯＨであるときｍは２、３、４または５である。
適切には、Ｘ１は、（ＣＨ２）ｍを表す。
適切には、Ｘ１は、（ＣＨ２）０、ＣＨ２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２または（ＣＨ２）２、特に（ＣＨ２）０またはＣＨ２、好ましくは（ＣＨ２）０を表す。
適切には、Ｒ４は、Ｈ、Ｎ－メチル－ピペリジンまたはジメチルアミン、特にＨを表す。
適切には、部分－Ｘ１－Ｒ４は、Ｈ、Ｍｅ、ＣＨ２ＣＨ３、イソプロピル、１－メチル－ピペリジン－４－イルまたはＮ，Ｎ－ジメチルアミン、特にＨまたはＭｅ、好ましくはＨを表す。
適切には、Ｙ１は、（ＣＨ２）ｎを表す。
適切には、Ｙ１は、（ＣＨ２）０、ＣＨ２、（ＣＨ２）２または（ＣＨ２）３、特に（ＣＨ２）２を表す。
適切には、Ｒ５は、Ｈ、ジメチルアミン、Ｎ－メチルエタノールアミン、Ｎ－メチル－ピペラジン、Ｎ－メチル－ピペリジン、１，２，６－トリメチルピペラジン、Ｎ－エチル－ピペラジン、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミン）－ピロリジン、Ｎ－（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）－ピペラジン、ピペリジン、モルホリン、４－ヒドロキシ－ピペリジン、４－シアノ－ピペリジン、２，６－ジメチル－ピペリジン、Ｎ－メトキシエチル－ピペラジン、２－メチル－ピペラジン、Ｎ－メチル－２－（Ｎ－ピペラジニル）アセトアミド、４－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミン）－ピペリジン、４－メトキシ－ピペリジン、Ｓ－ジオキシ－チオモルホリン、Ｎ－ピペラジン－３－オン、２，５－ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタンまたは３，８－ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン、３，６－ジアザビシクロ［３．１．１］ヘプタニル、特にジメチルアミンまたはＮ－メチル－ピペラジン、好ましくはジメチルアミンを表す。
適切には、ｎが０を表す場合、Ｒ５はＨを表さない。
適切には、部分－Ｙ１－Ｒ５は、Ｍｅ、－（ＣＨ２）２－ジメチルアミノ、－（ＣＨ２）３－ジメチルアミノ、－（ＣＨ２）２－（Ｎ－メチル）－エタノールアミノ、－（ＣＨ２）２－ピペラジン－１－イル、－（ＣＨ２）２－（４－メチル）－ピペラジン－１－イル、－（ＣＨ２）２－（３－メチル）－ピペラジン－１－イル、－（ＣＨ２）３－（４－メチル）－ピペラジン－１－イル、－（ＣＨ２）２－（１－メチル）－ピペリジン－４－イル、Ｎ－メチル－ピペリジン－４－イル、－（ＣＨ２）２－（４－エチル）－ピペラジン－１－イル、－（ＣＨ２）２－３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）－ピロリジン－１－イル、－（ＣＨ２）２－（４－（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）－ピペラジン－１－イル）、－（ＣＨ２）２－３，４，５－トリメチルピペラジン－１－イル、－（ＣＨ２）２－ピペリジン－１－イル、－（ＣＨ２）３－ピペリジン－１－イル、－（ＣＨ２）２－モルホリン－４－イル、－（ＣＨ２）２－（４－ヒドロキシ－ピペリジン－１－イル）、－（ＣＨ２）２－（４－シアノ－ピペリジン－１－イル）、－（ＣＨ２）２－（２，６－ジメチル－ピペリジン－１－イル）、－（ＣＨ２）２－（４－メトキシエチル－ピペラジン－１－イル）、－（ＣＨ２）２－４－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ－ピペリジン－１－イル）、－（ＣＨ２）２－（４－メトキシ－ピペリジン－１－イル）、－（ＣＨ２）３－（４－メトキシ－ピペリジン－１－イル）、－（ＣＨ２）２－４－（Ｎ－メチルアセトアミド）－ピペラジン－１－イル））、－（ＣＨ２）２－（４－ジオキシ－チオモルホリン－１－イル）、－（ＣＨ２）２－（３－オキソピペラジン－１－イル）、－（ＣＨ２）２－（２，５－ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）、－（ＣＨ２）２－（３，８－ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン－８－イル）、（ＣＨ２）２－（３，８－ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン－３－イル）、（ＣＨ２）２－３，６－ジアザビシクロ［３．１．１］ヘプタン－３－イル、特に－（ＣＨ２）２－ジメチルアミンまたは－（ＣＨ２）２－（４－メチル－ピペラジン－１－イル）、より好ましくは－（ＣＨ２）２－ジメチルアミノを表す。
適切には、式（ｉ）は、（ａ）－Ｘ１－Ｒ４がＨを表し、－Ｙ１－Ｒ５が－（ＣＨ２）２－ジメチルアミノ、－（ＣＨ２）３－ジメチルアミノ、－（ＣＨ２）２－（Ｎ－メチル）－エタノールアミノ、－（ＣＨ２）２－４－メチル－ピペラジン－１－イル、－（ＣＨ２）３－（４－メチル）－ピペラジン－１－イル、Ｎ－メチル－ピペリジン－４－イル、－（ＣＨ２）２－３，４，５－トリメチルピペラジン－１－イル、－（ＣＨ２）２－４－エチル－ピペラジン－Ｎ－イル、－（ＣＨ２）２－３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）－ピロリジン－１－イル、－（ＣＨ２）２－（４－（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）－ピペラジン－１－イル）、－（ＣＨ２）２－ピペリジン－１－イル、－（ＣＨ２）３－ピペリジン－１－イル、－（ＣＨ２）２－モルホリン－４－イル、－（ＣＨ２）２－（４－ヒドロキシ－ピペリジン－１－イル）、－（ＣＨ２）２－４－シアノ－ピペリジン－１－イル、－（ＣＨ２）２－（２，６－ジメチル－ピペリジン－１－イル）、－（ＣＨ２）２－４－メトキシエチル－ピペラジン－１－イル、－（ＣＨ２）２－４－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）－ピペリジン－１－イル、－（ＣＨ２）２－４－メトキシ－ピペリジン－１－イル、－（ＣＨ２）３－４－メトキシ－ピペリジン－１－イル、－（ＣＨ２）２－４－ジオキシ－チオモルホリン－１－イル、－（ＣＨ２）２－（３－オキソピペラジン－１－イル）を表し、特に－Ｘ１－Ｒ４がＨを表し、－Ｙ１－Ｒ５が－（ＣＨ２）２－ジメチルアミノまたは－（ＣＨ２）２－４－メチル－ピペラジン－１－イルを表し、より好ましくは－Ｘ１－Ｒ４がＨを表し、－Ｙ１－Ｒ５が－（ＣＨ２）２－ジメチルアミノを表し；または（ｂ）－Ｘ１－Ｒ４がＭｅを表し、－Ｙ１－Ｒ５がＭｅ、－（ＣＨ２）２－ジメチルアミノ、－（ＣＨ２）２－（Ｎ－メチル）－エタノールアミノ、－（ＣＨ２）２－ピペラジン－１－イル、－（ＣＨ２）２－４－メチル－ピペラジン－１－イル、－（ＣＨ２）２－（３－メチル）－ピペラジン－１－イル、－（ＣＨ２）２－（４－（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）－ピペラジン－１－イル）、－（ＣＨ２）２－（４－（Ｎ－メチルアセトアミド）－ピペラジン－１－イル））、－（ＣＨ２）２－（２，５－ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル）、－（ＣＨ２）２－（３，８－ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン－８－イル）、（ＣＨ２）２－（３，８－ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン－３－イル）、（ＣＨ２）２－３，６－ジアザビシクロ［３．１．１］ヘプタン－３－イルを表し、特に－Ｘ１－Ｒ４がＭｅを表し、－Ｙ１－Ｒ５が（ＣＨ２）２－ジメチルアミノまたは－（ＣＨ２）２－４－メチル－ピペラジン－１－イルを表し、より好ましくは－Ｘ１－Ｒ４がＭｅを表し、－Ｙ１－Ｒ５が－（ＣＨ２）２－４－メチル－ピペラジン－１－イルを表し；または（ｃ）－Ｘ１－Ｒ４が１－メチル－ピペリジン－４－イルを表し、－Ｙ１－Ｒ５がＭｅを表し；または（ｄ）－Ｘ１－Ｒ４がＮ，Ｎ－ジメチルアミノを表し、－Ｙ１－Ｒ５がＭｅを表し；または（ｅ）－Ｘ１－Ｒ４がＣＨ２ＣＨ３を表し、－Ｙ１－Ｒ５が（ＣＨ２）２－ピペラジン－１－イルを表し、または（ｆ）－Ｘ１－Ｒ４がイソプロピルを表し、－Ｙ１－Ｒ５が（ＣＨ２）２－ピペラジン－１－イルを表す部分を表す。式（ｉ）の部分は、好ましくは、（ａ）によって表される。
一実施形態では、Ｒ３は、式（ｉｉ）である。
適切には、Ｙ２は、（ＣＨ２）ｓを表す。
適切には、ｓは、２、３または４、より適切には２または３、特に２である。
適切には、式（ｉｉ）は、１，２－オキサゼチジンを表す。
一実施形態では、Ｒ３は、式（ｉｉｉ）である。
適切には、Ｙ３は、（ＣＨ２）ｔを表す。
適切には、Ｘ２は、（ＣＨ２）ｖを表す。
適切には、ｔは２であり、ｖは２である。
適切には、Ｑは、ＮまたはＯ、特にＮである。ＱがＮを表す場合、それは、適切には、メチルで置換されていてもよい。
一実施形態では、式（ｉｉｉ）は、５－メチル－［１，２，５］－オキサジアゼパンを表す。
適切には、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は独立して、Ｈを表すか、またはＯＨ、オキソ、ＮＲ１４Ｒ１５もしくは－ＯＭｅで場合により置換されているＣ１－Ｃ４アルキルを表す。
適切には、Ｒ６およびＲ７は独立して、Ｍｅを表す。
適切には、Ｒ８はＭｅを表し、Ｒ９は、ＭｅまたはＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、特にＭｅを表す。
適切には、Ｒ１０はＨを表し、Ｒ１１はＭｅを表す。
適切には、Ｒ１２およびＲ１３は独立して、Ｍｅを表す。
適切には、Ｒ１４およびＲ１５は、ＨおよびＭｅから独立して選択される。
式（Ｉ）の化合物は、好都合には、式（ＩＩ）の化合物（式中、Ｌは、脱離基、例えば－ＯＣ１－Ｃ４アルキル、例えばＯエチルである）：
Figure 0007068172000005
 またはその保護誘導体を式（ＩＩＩ）の化合物：
Figure 0007068172000006
 と反応させることを含むプロセスによって調製され得る。
典型的には、溶媒、例えばＤＭＦの存在下で、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の化合物を反応させ、約１８時間かけて約８０℃に加熱し得る。この工程の後、脱保護工程を実施して、保護基アセチルを除去する。これを達成するために、反応混合物を室温に冷却し、求核試薬、例えばピペリジンを追加し、１～２４時間撹拌し得る。
式（ＩＩ）の化合物（式中、Ｌは、－Ｏエチルを表す）は、式（ＩＶ）の化合物：
Figure 0007068172000007
 またはその保護誘導体を式（Ｖ）の化合物：
Figure 0007068172000008
 と反応させることによって調製され得る。
典型的には、無水酢酸の存在下で、式（ＩＶ）および（Ｖ）の化合物を約１１０℃の温度で約４時間反応させ得る。式（ＩＩ）の他の化合物は、類似の方法で調製され得る。
式（ＩＶ）の化合物は、式（ＶＩ）の化合物：
Figure 0007068172000009
 を無水酢酸と反応させることによって調製され得る。典型的には、反応は、約１１０℃で実施される。あるいは、式（ＩＩ）の化合物（式中、Ｌは、－Ｏエチルを表す）は、無水酢酸の存在下、式（Ｖ）の化合物によって約１１０℃の温度で約４時間処理することによって、式（ＶＩ）の化合物から直接調製され得る。
式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ）の化合物の－ＮＯ２基を－ＮＨ２基に還元し：
Figure 0007068172000010
 続いて、アミド形成環化することによって調製され得る（これは、当技術分野で周知の手順である）。
還元条件は、典型的には、溶媒、例えば酢酸中で、Ｈ２－Ｐｄ／Ｃを室温、５ｂａｒの圧力で約３６時間使用することを含み得る（これは、当技術分野で周知の手順である）。
式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩＩ）の化合物：
Figure 0007068172000011
 をメチルクロロアセテートと反応させることによって調製され得る。典型的には、この反応は、極性有機溶媒、例えばＤＭＦおよび塩基、例えばＫＯｔＢｕの存在下、窒素雰囲気下、約－２０～－１０℃で行われる。
あるいは、式（Ｉａ）の化合物（これは、ＺがＣＯであり、Ｒ３が式（ｉ）または（ｉｉｉ）である式（Ｉ）の化合物）は、式（ＩＸ）の化合物：
Figure 0007068172000012
 またはその保護誘導体を式（Ｘ）の化合物：
Figure 0007068172000013
 （式中、Ｒ’は、Ｙ１－Ｒ５を表し得、Ｒ’’は、Ｘ１－Ｒ４もしくはその保護誘導体を表し得るか、またはＲ’およびＲ’’はＮおよびＯ原子と一緒に結合して、列挙されている例からの選択の複素環を作る）と反応させることによって調製され得る。典型的には、極性有機溶媒、例えばＤＭＦ中、カップリング剤、例えばＨＡＴＵおよび塩基、例えばヒューニッヒ塩基（ＤＩＰＥＡ）の存在下で、化合物を室温で約２～１８時間反応させ得るが、他の極性有機溶媒を使用し得る。このプロセスの後、適切な場合には、脱保護を行い得る。
式（ＩＸ）の化合物は、式（ＸＩ）の化合物：
Figure 0007068172000014
 の脱保護によって調製され得る。
当技術分野における標準的な試薬、例えばＴＦＡを使用して脱保護を達成し得、典型的には、溶媒、例えばＤＣＭ中で、化合物を室温で約１６時間撹拌する。
式（ＸＩ）の化合物は、式（ＩＩ）の化合物を式（ＸＩＩ）の化合物：
Figure 0007068172000015
 と反応させることによって調製され得る。
ＤＭＦの存在下で、化合物を１００℃で約１８時間反応させ得る。
あるいは、式（Ｉｂ）の化合物（これは、Ｒ３が式（ｉ）であり、Ｘ１－Ｒ４がＨを表し、ＮＲ８Ｒ９が、先に定義されるＮＲ８Ｒ９、または先に定義されるＯ、ＮおよびＳから選択される１個もしくはそれを超えるヘテロ原子を含有する脂肪族４～８員複素環を表す式（Ｉ）の化合物である）：
Figure 0007068172000016
 は、式（ＸＩＩＩ）の化合物：
Figure 0007068172000017
 を式（ＸＩＶ）の化合物：
Figure 0007068172000018
 （または、ＮＲ８Ｒ９は、先に定義されるＯ、ＮおよびＳから選択される１個またはそれを超えるヘテロ原子を含有する脂肪族４～８員複素環を表す）と反応させることによって調製され得る。典型的な反応条件は、混合物を室温で約１６時間撹拌することであり得る。このプロセスの後、適切な場合には、脱保護を行い得る。
式（ＸＩＩＩ）の化合物は、式（ＩＸ）の化合物を式（ＸＶ）の化合物：
Figure 0007068172000019
 と反応させることによって調製され得る。
典型的には、ＨＡＴＵ、ヒューニッヒ塩基（ＤＩＰＥＡ）およびＤＭＦまたは別の極性有機溶媒の存在下で、化合物を反応させ得る。
あるいは、式（Ｉｃ）の化合物（これは、ＺがＣＯまたはＳＯ２を表し、Ｒ３が式（ｉ）を表し、Ｘ１－Ｒ４がＭｅを表し、ＮＲ８Ｒ９が、先に定義されるＮＲ８Ｒ９、または先に定義されるＯ、ＮおよびＳから選択される１個もしくはそれを超えるヘテロ原子を含有する脂肪族４～８員複素環を表す式（Ｉ）の化合物である）：
Figure 0007068172000020
 は、式（ＸＶＩ）の化合物：
Figure 0007068172000021
 を式（ＸＩＶ）の化合物と反応させることによって調製され得る。典型的な反応条件は、溶媒、例えばＤＭＦ中、場合により塩基、例えばヒューニッヒ塩基（ＤＩＰＥＡ）の存在下で、混合物を約６０℃で約５時間撹拌し、続いて、脱保護工程、例えば溶媒、例えばＤＭＦ中で求核試薬、例えばピペリジンによって約６０℃で約１８時間処理することであり得る。
式（ＸＶＩ）の化合物は、式（ＸＶＩＩ）の化合物：
Figure 0007068172000022
 を穏やかな条件下で、ＣＢｒ４およびＰＰｈ３と反応させることによって調製され得る（アッペル反応として当技術分野で公知の一般的な反応）。典型的には、溶媒、例えばＤＣＭ中で、反応物を室温で２～１６時間撹拌し得る。
式（ＸＶＩＩ）の化合物（式中、Ｚは、ＣＯを表す）は、式（ＩＸ）の化合物を式（ＸＶＩＩＩ）の化合物：
Figure 0007068172000023
 と反応させることによって調製され得る。
典型的には、ＨＡＴＵ、ヒューニッヒ塩基（ＤＩＰＥＡ）およびＤＭＦまたは別の極性有機溶媒の存在下で、化合物を反応させ得る。典型的には、反応物を室温で約２時間撹拌し得る。
式（ＸＶＩＩ）の化合物（式中、Ｚは、ＳＯ２を表す）は、式（ＩＩ）の化合物を式（ＩＩＩ）の化合物（式中、Ｚは、ＳＯ２を表し、Ｒ３は、式（ｉ）（式中、Ｘ１－Ｒ４は、Ｍｅを表し、Ｙ１－Ｒ５は、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨを表す）である）と反応させることによって調製され得る。典型的には、ヒューニッヒ塩基（ＤＩＰＥＡ）およびＤＭＦまたは別の極性有機溶媒の存在下で、化合物を８０℃などの温度で約１８時間反応させ得る。
式（ＩＩＩ）の化合物の合成は、式（Ｘ）の化合物を式（ＸＩＸ）の化合物：
Figure 0007068172000024
 と反応させることによって調製され得る。
典型的には、ヒューニッヒ塩基（ＤＩＰＥＡ）およびＤＭＦの存在下で、化合物を室温で約１６時間反応させ、続いて、当技術分野における標準的な試薬、例えばＴＦＡを使用して脱保護工程を行い得る。
式（ＩＩＩ）の化合物（式中、Ｒ３は、式（ｉｉ）および（ｉｉｉ）である）は、式（Ｘ）の化合物（式中、Ｒ’およびＲ’’はＮおよびＯ原子と一緒に結合して、列挙されている例からの選択の複素環を作る）を式（ＸＩＸ）の化合物と反応させることによって調製され得る。これらの複素環およびそれらの調製方法は、当技術分野における一般的な知識である。
式（Ｘ）の化合物（式中、Ｒ’’は、Ｈである）は、溶媒、典型的にはメタノールおよびＤＣＭの存在下で、式（ＸＸ）の化合物：
Figure 0007068172000025
 を典型的にはヒドラジン水和物と室温で約１８時間反応させることによって調製され得る。
式（ＸＸ）の化合物は、ＨＯＲ’の化合物を２－ヒドロキシイソインドリン－１，３－ジオンの化合物と反応させることによって調製され得る。典型的には、トリフェニルホスフィン、アゾジカルボキシレート、例えばＤＩＡＤおよび極性溶媒、例えばＴＨＦの存在下で、化合物を反応させ得る。典型的には、反応物を０℃で１時間撹拌し、次いで、室温に加温し、約１６時間撹拌する。
式（Ｘ）の化合物（式中、Ｒ’’は、Ｍｅである）は、当技術分野における標準的な方法を使用して、例えば、還元剤、例えば式（ＸＸＩＩ）の化合物：
Figure 0007068172000026
 を使用することによって、式（ＸＸＩ）の化合物：
Figure 0007068172000027
 を還元することによって調製され得る。
反応は、典型的には、極性溶媒、例えばＴＨＦ、酸、例えば塩酸および非プロトン性溶媒、例えばジオキサンの存在下で行われ得る。
式（ＸＸＩ）の化合物は、例えば、ホルムアルデヒドを用いて式（ＸＸＩＩＩ）の化合物：
Figure 0007068172000028
 を縮合することによって調製され得る。典型的には、溶媒、例えばエタノールの存在下で、ホルムアルデヒドの供給源としてパラホルムアルデヒドを使用することによって縮合を行い、還流下で約１８時間加熱し得る。
式（ＩＩ）、（ＶＩＩ）、（ＩＸ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＶＩ）および（ＸＶＩＩ）（式中、Ｒ１は、Ｍｅ、Ｅｔ、ＣＨ＝ＣＨ２、Ｃ≡Ｃ－ＨまたはＣ≡Ｃ－Ｍｅである）ならびに式（ＶＩ）（式中、Ｒ１は、Ｅｔ、ＣＨ＝ＣＨ２、Ｃ≡Ｃ－ＨまたはＣ≡Ｃ－Ｍｅである）の化合物を含む新規中間体ならびにそれらの塩は、本発明の態様として特許請求の範囲に記載されている。
式（Ｖ）、（ＶＩＩＩ）、（Ｘ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（ＸＶＩＩＩ）、（ＸＩＸ）、（ＸＸＩＩ）および（ＸＸＩＩＩ）の化合物は、公知の方法または本明細書に記載されるものと類似の方法によって調製され得る。
式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ）の化合物が形成することができる治療的に活性な非毒性酸付加塩を含む薬学的に許容され得る塩の形態で調製または利用され得る。これらの薬学的に許容され得る酸付加塩は、好都合には、適切な溶媒または溶媒の混合物中で、このような適切な酸で遊離塩基形態を処理することによって得られ得る。適切な酸は、例えば、エタンスルホン酸、マレイン酸、マロン酸、Ｌ－酒石酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、トリフェニル酢酸、塩酸、硫酸、リン酸、１－ヒドロキシ－２－ナフトエ酸、臭化水素酸、メタンスルホン酸、酒石酸、パルミチン酸、イセチオン酸、パモン酸、ギ酸、桂皮酸 安息香酸、アスコルビン酸、ガラクタル酸、乳酸、リンゴ酸、シュウ酸、パラ－トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、プロピオン酸、フロ酸、ホスホン酸およびグルタル酸を含む。反対に、前記塩形態は、適切な塩基による処理によって、遊離塩基形態に変換され得る。
本発明は、医薬品として使用するための本発明の化合物を提供する。
さらに、本発明は、場合により１つまたはそれを超える薬学的に許容され得る希釈剤または担体と組み合わせて本発明の化合物を含む医薬組成物を提供する。
希釈剤および担体としては、非経口、経口、局所（口から肺を介した吸入または鼻を介した吸入によるものを含む）、粘膜および直腸投与に適切なものが挙げられ得、投与経路によって異なり得る。
一実施形態では、組成物は、例えば、非経口投与、例えば特に液体液剤または懸濁剤の形態による皮下、筋肉内、静脈内、皮内、関節内または関節周囲投与のために；特に錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、固体分散剤の形態による、または液体液剤もしくは懸濁剤（ナノ懸濁剤を含む）の形態による経口投与のために；肺または鼻への吸入、例えば特に乾燥散剤、液剤、噴霧のための懸濁剤（ナノ懸濁剤を含む）、溶液もしくは懸濁液を含む鼻腔用スプレーもしくは点鼻薬、または懸濁液もしくは溶液加圧もしくは非加圧エアロゾルの形態による肺または鼻腔内投与のために；局所または経皮投与のために、例えばクリーム剤、スプレー剤、泡、ゲル剤、軟膏剤、液体、貼付剤として；例えば口腔、舌下または膣粘膜への粘膜投与のために、および例えば泡または坐薬の形態による直腸投与のために調製され得る。
好都合には、組成物は単位剤形で投与され得、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ．，（１９８５）に記載されている製薬分野で周知の方法のいずれかによって調製され得る。組成物はまた、好都合には、複数の単位剤形で投与され得る。
非経口投与のための製剤は、賦形剤として滅菌水または生理食塩水、緩衝液、張性調整剤、保存剤、抗酸化剤、粘度調整剤、アルキレングリコール、例えばプロピレングリコール、ポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、植物起源の油、水素化ナフタレンなどを含有し得る。
経口投与に適切な組成物は、１つまたはそれを超える生理学的に適合性の担体および／または賦形剤を含み得、固体または液体形態であり得る。錠剤およびカプセルは、結合剤、例えばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、セルロースまたはポリビニルピロリドン；充填剤、例えばラクトース、スクロース、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールまたはシリカ；および界面活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムを用いて調製され得る。液体組成物は、従来の添加剤、例えば懸濁化剤、例えばソルビトールシロップ、メチルセルロース、シュガーシロップ、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、または食用油脂；乳化剤および界面活性剤、例えばレシチンまたはアカシア；植物油、例えばアーモンド油、ココナッツ油、タラ肝油またはピーナッツ油；保存剤、例えばブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）およびブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を含有し得る。単位剤形を提供するために、液体組成物は、例えば、ゼラチンにカプセル化され得る。
固体経口剤形としては、錠剤、ツーピース硬シェルカプセルおよび軟弾性ゼラチン（ＳＥＧ）カプセルが挙げられる。このようなツーピース硬シェルカプセルは、例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）から作られ得る。
乾燥シェル製剤は、典型的には、約４０％～６０％濃度のゼラチン、約２０％～３０％濃度の可塑剤（例えば、グリセリン、ソルビトールまたはプロピレングリコール）および約３０％～４０％濃度の水を含む。保存剤、色素、乳白剤および香味料などの他の材料も存在し得る。液体充填材料は、（懸濁化剤、例えばミツロウ、硬化ヒマシ油またはポリエチレングリコール４０００で）溶解、可溶化もしくは分散された固体薬物またはビヒクルもしくはビヒクルの組み合わせ、例えば鉱油、植物油、トリグリセリド、グリコール、ポリオールおよび界面活性剤中の液体薬物を含む。
鼻腔内投与のための製剤は散剤であり得、賦形剤、例えばラクトースもしくはデキストランを含有し得るか、または点鼻薬もしくは計量スプレーの形態で使用するための水性もしくは油性液剤であり得る。鼻腔内投与のための製剤はまた、水性懸濁剤または加圧非水性液剤もしくは懸濁剤の形態であり得る。口腔投与の場合、典型的な賦形剤としては、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、アルファ化デンプンなどが挙げられる。
適切には、式（Ｉ）の化合物は、肺に局所投与される。したがって、一実施形態では、場合により１つまたはそれを超える局所的に許容され得る希釈剤または担体と組み合わせて本開示の化合物を含む医薬組成物が提供される。
肺への局所投与は、非加圧製剤、例えば水性液剤または懸濁剤の使用によって達成され得る。これらの製剤は、噴霧器、例えば手持ち用および携帯用または家庭もしくは病院用（すなわち、非携帯用）であり得るものによって投与され得る。製剤は、賦形剤、例えば水、緩衝液、張性調整剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、保存剤、懸濁化剤、増量剤および共溶媒を含み得る。懸濁液体およびエアロゾル製剤（加圧式または非加圧式にかかわらず）は、典型的には、例えば０．５～１０μｍ、例えば約１～５μｍのＤ５０を有する肺への堆積に適切な微細形態の本発明の化合物を含有する。微細形態の散剤は、微粉化もしくは粉砕プロセスによって、噴霧乾燥によって、噴霧凍結によって、または湿式粉砕とそれに続く噴霧乾燥によって調製され得る。微粉化は、ジェットミル、例えばＨｏｓｏｋａｗａ Ａｌｐｉｎｅによって製造されたものを使用して実施され得る。得られた粒径分布は、レーザー回折を使用して（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００ＳまたはＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ３０００機器を用いて）測定され得る。粒径分布は、Ｄ１０、Ｄ５０およびＤ９０値を使用して表され得る。粒径分布のＤ５０中央値は、分布を半分に分割する粒径として定義される。レーザー回折から得られた測定結果は、体積分布としてより正確に記述され、その結果として、この手順を使用して得られたＤ５０値は、Ｄｖ５０値（体積分布の中央値）とより有意義に称される。本明細書で使用される場合、Ｄｖ値は、レーザー回折を使用して測定された粒径分布を指す。同様に、レーザー回折との関連で使用されるＤ１０およびＤ９０値は、Ｄｖ１０およびＤｖ９０値を意味するとされ、それぞれ、分布の１０％がＤ１０値未満にあり、分布の９０％がＤ９０値未満にある粒径を指す。別の実施形態では、懸濁剤製剤の噴霧において使用するための本開示の化合物と賦形剤との複合粒子は、化合物および賦形剤を一緒に共粉砕および／または共噴霧乾燥することによって形成され得、活性物質および賦形剤の両方を含む複合粒子は、１～１０μｍのＤ５０を有する。肺への送達のための水性懸濁剤製剤はまた、ナノ粒子を含有する複合粒子のナノ懸濁液または懸濁液を含み得る。
肺への局所投与はまた、加圧エアロゾル製剤の使用によって達成され得る。エアロゾル製剤は、典型的には、適切なエアロゾル噴射剤、例えばクロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）またはハイドロフルオロカーボン（ＨＦＣ）に懸濁または溶解された有効成分を含む。適切なＣＦＣ噴射剤としては、トリクロロモノフルオロメタン（噴射剤１１）、ジクロロテトラフルオロメタン（噴射剤１１４）およびジクロロジフルオロメタン（噴射剤１２）が挙げられる。適切なＨＦＣ噴射剤としては、テトラフルオロエタン（ＨＦＣ－１３４ａ）およびヘプタフルオロプロパン（ＨＦＣ－２２７）が挙げられる。噴射剤は、典型的には、全吸入組成物の４０重量％～９９．５重量％、例えば４０重量％～９０重量％を含む。製剤は、共溶媒（例えば、エタノール）および界面活性剤または安定剤（例えば、レシチン、トリオレイン酸ソルビタンなど）を含む賦形剤を含み得る。他の可能な賦形剤としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、グリセリンなどが挙げられる。エアロゾル製剤はキャニスターにパッケージングされ、計量バルブ（例えば、Ｂｅｓｐａｋ、Ａｐｔａｒまたは３Ｍによって、あるいはＣｏｓｔｅｒまたはＶａｒｉによって供給される）によって、適切な用量が送達される。肺への送達のための加圧懸濁剤製剤はまた、ナノ粒子を含有する複合粒子のナノ懸濁液または懸濁液を含み得る。
肺への局所投与はまた、乾燥散剤製剤の使用によって達成され得る。乾燥散剤製剤は、典型的には０．５～１０μｍ、例えば約１～５μｍのＤ５０を有する微細形態の本開示の化合物を含有する。微細形態の散剤は、微粉化もしくは粉砕プロセスによって、噴霧乾燥によって、噴霧凍結によって、または湿式粉砕とそれに続く噴霧乾燥によって調製され得る。微粉化は、ジェットミル、例えばＨｏｓｏｋａｗａ Ａｌｐｉｎｅによって製造されたものを使用して実施され得る。得られた粒径分布は、レーザー回折を使用して（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００ＳまたはＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ３０００機器を用いて）測定され得る。典型的には、製剤は、通常は比較的大きい粒径、例えば１５～２５０μｍのＤ５０の１つまたはそれを超える局所的に許容され得る希釈剤、例えばラクトース、グルコース、トレハロースまたはマンニトール（好ましくは、ラクトース）を含有する。別の実施形態では、本発明の化合物と賦形剤との複合粒子はまた、化合物および賦形剤を一緒に共粉砕および／または共噴霧乾燥することによって形成され得、活性物質および賦形剤の両方を含む複合粒子は、１～１０μｍのＤ５０を有する。本明細書で使用される場合、「ラクトース」という用語は、α－ラクトース一水和物、β－ラクトース一水和物、α－ラクトース無水物、β－ラクトース無水物および非晶質ラクトースを含むラクトース含有成分を指す。ラクトース成分は、微粉化、ふるい分け、粉砕、圧縮、凝集または噴霧乾燥によってプロセシングされ得る。例えば、Ｌａｃｔｏｈａｌｅ（登録商標）（ＤＦＥ Ｐｈａｒｍａ）、ＩｎｈａＬａｃ（登録商標）（Ｍｅｇｇｌｅ）、Ｐｈａｒｍａｔｏｓｅ（登録商標）（ＤＦＥ Ｐｈａｒｍａ）およびＲｅｓｐｉｔｏｓｅ（登録商標）（ＤＦＥ Ｐｈａｒｍａ）製品などの様々な形態の市販型ラクトースも包含される。一実施形態では、ラクトース成分は、α－ラクトース一水和物、α－ラクトース無水物および非晶質ラクトースからなる群より選択される。好ましくは、ラクトースは、α－ラクトース一水和物である。
乾燥散剤製剤はまた、他の賦形剤、例えばロイシン、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムまたはステアリン酸マグネシウムを含有し得る。乾燥散剤粒子は複合粒子であり得、複合マトリックス中のナノ粒子から構成され得る。
乾燥散剤製剤は、典型的には、乾燥散剤吸入器（ＤＰＩ）デバイスを使用して送達される。これは、カプセルもしくはブリスターのいずれかとして製剤が個々の単位で提示される単位用量デバイスであり得るか、または１つを超える用量の製剤がデバイス、バルクリザーバーもしくはデバイス内の複数の容器（例えば、複数のブリスターまたはポケット）のいずれかに含まれる複数用量デバイスであり得る。例示的な乾燥散剤吸入器としては、ＳＰＩＮＨＡＬＥＲ、ＤＩＳＫＨＡＬＥＲ、ＴＵＲＢＯＨＡＬＥＲ、ＤＩＳＫＵＳ、ＥＬＬＩＰＴＡ、ＣＬＩＣＫＨＡＬＥＲ、ＥＣＬＩＰＳＥ、ＲＯＴＡＨＡＬＥＲ、ＨＡＮＤＩＨＡＬＥＲ、ＡＥＲＯＬＩＳＥＲ、ＣＹＣＬＯＨＡＬＥＲ、ＭＯＮＯＤＯＳＥ、ＢＲＥＥＺＨＡＬＥＲ／ＮＥＯＨＡＬＥＲ、ＦＬＯＷＣＡＰＳ、ＴＷＩＮＣＡＰＳ、Ｘ－ＣＡＰＳ、ＴＷＩＳＴＥＲ、ＴＵＲＢＯＳＰＩＮ、ＥＬＰＥＮＨＡＬＥＲ、ＴＵＲＢＵＨＡＬＥＲ、ＭＩＡＴＨＡＬＥＲ、ＮＥＸＴＨａｌｅｒ、ＴＷＩＳＴＨＡＬＥＲ、ＮＯＶＯＬＩＺＥＲ、ＧＥＮＵＡＩＲ、ＳＫＹＥＨＡＬＥＲ、ＯＲＩＥＬ乾燥散剤吸入器、ＭＩＣＲＯＤＯＳＥ、ＡＣＣＵＨＡＬＥＲ、ＰＵＬＶＩＮＡＬ、ＥＡＳＹＨＡＬＥＲ、ＵＬＴＲＡＨＡＬＥＲ、ＴＡＩＦＵＮ、ＰＵＬＭＯＪＥＴ、ＯＭＮＩＨＡＬＥＲ、ＧＹＲＯＨＡＬＥＲ、ＴＡＰＥＲ、ＣＯＮＩＸ、ＸＣＥＬＯＶＡＩＲおよびＰＲＯＨＡＬＥＲが挙げられる。
本発明の化合物は、例えばＩＰＦ、巨細胞間質性肺炎、サルコイドーシス、嚢胞性線維症、呼吸窮迫症候群、薬物誘導性肺線維症、肉芽腫症、珪肺症、石綿症、全身性強皮症から選択される線維性疾患、例えば肺線維症および線維性成分を有する肺疾患、Ｃ型肝炎誘導性肝硬変から選択されるウイルス誘導性肝硬変、または例えば強皮症、サルコイドーシスおよび全身性エリテマトーデスから選択される線維性成分を有する皮膚の疾患、特にＩＰＦの処置において有用であると予想される。より一般には、本発明の化合物は、間質性肺疾患の処置において有用であると予想される。加えて、本発明の化合物は、細胞の過剰増殖を特徴とする疾患、例えばがん、および吸入によって化合物が送達される場合には特に肺がんの処置において有用であると予想される。さらに、本発明の化合物はまた、ＣＯＰＤ（慢性気管支炎および気腫を含む）、喘息、小児喘息、アレルギー性鼻炎、鼻炎、副鼻腔炎、特に喘息、慢性気管支炎およびＣＯＰＤを含む呼吸器障害の処置において有用であり得る。
本発明の化合物はまた、他の線維性疾患、例えば関節リウマチに関連する肺線維症、呼吸窮迫症候群（急性呼吸窮迫症候群を含む）、急性肺傷害、放射線誘導性肺線維症または肺炎、慢性過敏性肺炎、全身性硬化症、シェーグレン症候群、間質性肺疾患、肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）（ＰＡＨの血管成分を含む）、または例えば肥厚性瘢痕およびケロイドから選択される線維性成分を有する皮膚の疾患、または線維症が構成要素である眼疾患（緑内障、加齢性黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫、ドライアイ疾患および糖尿病性網膜症を含む）、または例えば炎症性腸疾患に関連する腸の線維症の処置において有用であると予想される。
加えて、本発明の化合物は、細胞の過剰増殖を特徴とする疾患、例えばがん、例えば、吸入によって化合物が送達される場合には特に肺がんの予防において有用であると予想される。
本発明は、上記疾患の１つまたはそれよりも多くの処置において使用するための本発明の化合物を提供する。本発明はまた、上記疾患の１つまたはそれよりも多くの処置のための医薬の製造における本発明の化合物の使用を提供する。
本発明はまた、上記疾患の１つを処置する方法であって、治療有効量の本発明の化合物を、それを必要とする被験体（特に、ヒト被験体）に投与することを含む方法を提供する。
「処置」という語は、予防的および治療的処置を包含することを意図する。
本発明の化合物は、１日１回、２回または３回、特に１日１回または２回投与され得る。適切な投与量は、疾患の重症度および被験体のサイズを参照することによって決定され得る。典型的な投与量は、１日１回、２回または３回、特に１日１回または２回送達すべきヒト用量当たり０．０１ｍｇ～１００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ～１０ｍｇ、例えば０．２５ｍｇ～５ｍｇの範囲内である。
本開示の化合物はまた、１つまたはそれを超える他の有効成分、例えば上記症状を処置するために適切な有効成分と組み合わせて投与され得る。例えば、可能な有効成分としては、ニンテダニブまたはピルフェニドン（これらは、ＩＰＦの処置について公知である）が挙げられる。組み合わせて使用され得る他の有効成分としては、分泌溶解活性、気管支溶解活性および／または抗炎症活性を有する物質、例えば抗コリン作用薬、ベータ－２模倣物、ステロイド、ＰＤＥ－ＩＶ阻害剤、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＭＫ２阻害剤、ガレクチン阻害剤、ＮＫ１アンタゴニスト、ＬＴＤ４アンタゴニスト、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＰＤＧＦ阻害剤、ＦＧＦ阻害剤、ＴＧＦベータ阻害剤、ＬＰＡ１アンタゴニスト、ＬＯＸＬ２阻害剤、ＣＴＧＦ阻害剤、ペントキシフィリン、Ｎ－アセチルシステイン、抗ＩＬ１３剤、抗ＩＬ４剤、アルファｖβ６インテグリン阻害剤、ＩＧＦ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ペントラキシン２およびエンドセリンアンタゴニストが挙げられる。
組み合わせて使用すべき他の有効成分としては、抗線維化活性を有する物質、例えばＰＤＥ－ＩＩＩ阻害剤、抗ＩＬ４／１３剤の組み合わせ、ＰＩ３ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤の組み合わせ、オートタキシン阻害剤、Ｐ２Ｘ３アンタゴニスト、ＣＴＧＦアンタゴニスト、５－ＬＯアンタゴニスト、ロイコトリエンアンタゴニストおよびＲＯＣＫ阻害剤が挙げられる。
一実施形態では、有効成分の組み合わせは共製剤化される。
一実施形態では、有効成分の組み合わせは、連続的にまたは同時に共投与される。
一実施形態では、本発明の化合物は吸入によって送達され、他の可能な有効成分は、経口送達または非経口送達される。
一実施形態では、
（Ａ）本発明の化合物；および
（Ｂ）（上記）さらなる有効成分
を含む組み合わせ製品であって、
成分（Ａ）および（Ｂ）がそれぞれ、薬学的に許容され得る希釈剤（単数または複数）または担体（単数または複数）と混合して製剤化されている組み合わせ製品が提供される。組み合わせは、場合により、さらなる関連賦形剤を含み得る。
一実施形態では、１つまたはそれを超える（上記）さらなる有効成分と組み合わせて投与すべき医薬として使用するための本発明の化合物が提供される。
本発明の化合物は、以下の有利な特性の１つまたはそれよりも多くを有すると予想される：
－ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２）、ＦＧＦＲおよびＰＤＧＦＲから選択されるキナーゼの優れた阻害活性；
－例えば肺に局所送達される場合、インビボモデル（例えば、ブレオマイシン線維症モデル）において決定した場合に、優れた抗線維症活性；
－医薬品、特に肺への局所送達を目的とするものについては、適切な物理的および化学的特性ならびに低用量；
－肺に局所投与される場合、優れた肺内滞留時間または作用持続時間；
－ＰＡＭＰＡ透過性アッセイにおける低い透過性；
－例えば、ヒト胎児肺線維芽細胞におけるＢＤＧＦＲβのＰＤＧＦ－ＢＢ誘導性リン酸化の阻害によって測定した場合に、優れた作用持続時間；
－肺に局所投与される場合、優れた安全性および忍容性；
－低い経口バイオアベイラビリティ。
実験セクション
本明細書で使用される略語は、以下で定義されている（表１）。定義されていないいかなる略語は、一般に認められている意味を伝えることが意図される。
Figure 0007068172000029
Figure 0007068172000030
化学反応の実施例
一般的な手順
すべての出発物質および溶媒は、商業的供給源から入手したか、または文献引用にしたがって調製した。特に指定がない限り、すべての反応物を撹拌した。有機溶液を無水硫酸マグネシウムで通常通り乾燥させた。記載されている条件下で、またはガスオートクレーブ（ボンベ）内の加圧下で、Ｔｈａｌｅｓ Ｈ－ｃｕｂｅフロー反応器によって水素化を実施した。
示されている量を使用して、プレパックシリカ（２３０～４００メッシュ、４０～６３μｍ）カートリッジによって、カラムクロマトグラフィーを実施した。ＳｕｐｅｌｃｏからＳＣＸを購入し、使用前に１Ｍ塩酸で処理した。特に指定がない限り、最初に、精製すべき反応混合物をＭｅＯＨで希釈し、数滴のＡｃＯＨで酸性化した。この溶液をＳＣＸ上に直接ロードし、ＭｅＯＨで洗浄した。次いで、ＭｅＯＨ中１％ＮＨ３で洗浄することによって、所望の物質を溶出させた。
分取逆相高速液体クロマトグラフィー
１０分間かけて０．１％ｖ／ｖギ酸を含有するＨ２Ｏ－ＭｅＣＮ勾配で溶出するＷａｔｅｒｓ Ｘ－Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｅｐ－Ｃ１８、５μｍ、１９×５０ｍｍカラム（方法Ａ）、または１０分間かけて０．１％重炭酸アンモニウムを含有するＨ２Ｏ－ＭｅＣＮ勾配で溶出するＷａｔｅｒｓ Ｘ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ－Ｃ１８、５μｍ、１９×５０ｍｍカラム（方法Ｂ）のいずれかを用いて、２１５および２５４ｎｍでＵＶ検出を使用して実施した。
分析方法
逆相高速液体クロマトグラフィー
方法１：Ｗａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８ ２．５μｍ（４．６×３０ｍｍ）、４０℃；流速２．５～４．５ｍＬ分－１、４分間かけて０．１％ｖ／ｖギ酸を含有するＨ２Ｏ－ＭｅＣＮ勾配で溶出し、２５４および２１５ｎｍでＵＶ検出を用いる。勾配情報：０～３．００分、９５％Ｈ２Ｏ－５％ＭｅＣＮから５％Ｈ２Ｏ－９５％ＭｅＣＮに勾配させる；３．００～３．０１分、５％Ｈ２Ｏ－９５％ＭｅＣＮで保持し、流速を４．５ｍＬ分－１に増加させる；３．０１～３．５０分、５％Ｈ２Ｏ－９５％ＭｅＣＮで保持する；３．５０～３．６０分、９５％Ｈ２Ｏ－５％ＭｅＣＮに戻し、流速を３．５０ｍＬ分－１に減少させる；３．６０～３．９０分、９５％Ｈ２Ｏ－５％ＭｅＣＮで保持する；３．９０～４．００分、９５％Ｈ２Ｏ－５％ＭｅＣＮで保持し、流速を２．５ｍＬ分－１に減少させる。
方法２：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８、２．５μｍ（４．６×３０ｍｍ）、４０℃；流速２．５～４．５ｍＬ分－１、４分間かけて１０ｍＭ重炭酸アンモニウムを含有するＨ２Ｏ－ＭｅＣＮ勾配で溶出し、２５４ｎｍでＵＶ検出を用いる。勾配情報：０～３．００分、９５％Ｈ２Ｏ－５％ＭｅＣＮから５％Ｈ２Ｏ－９５％ＭｅＣＮに勾配させる；３．００～３．０１分、５％Ｈ２Ｏ－９５％ＭｅＣＮで保持し、流速を４．５ｍＬ分－１に増加させる；３．０１～３．５０分、５％Ｈ２Ｏ－９５％ＭｅＣＮで保持する；３．５０～３．６０分、９５％Ｈ２Ｏ－５％ＭｅＣＮに戻し、流速を３．５０ｍＬ分－１に減少させる；３．６０～３．９０分、９５％Ｈ２Ｏ－５％ＭｅＣＮで保持する；３．９０～４．００分、９５％Ｈ２Ｏ－５％ＭｅＣＮで保持し、流速を２．５ｍＬ分－１に減少させる。
１Ｈ ＮＭＲ分光法
基準として残存非重水素化溶媒を使用して４００ＭＨｚでＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ分光計によって、１Ｈ ＮＭＲスペクトルを取得し、特に指定がない限り、ＤＭＳＯ－ｄ６で行った。
ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ ＥＮｏｔｅｂｏｏｋ １２．０を使用して、すべての化学名を作成した。
実施例１：（Ｚ）－メチル３－（（（４－（メトキシ（メチル）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
中間体Ａ：（Ｅ）－メチル１－アセチル－３－（エトキシ（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
Figure 0007068172000031
メチル２－オキソインドリン－６－カルボキシレート（１．００ｇ、５．２３ｍｍｏｌ）の無水酢酸（１０．９ｍＬ、１１５ｍｍｏｌ）撹拌溶液に、（トリエトキシメチル）ベンゼン（３．５５ｍＬ、１５．７ｍｍｏｌ）を追加し、混合物を１１０℃で４時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、得られた沈殿物をろ過によって収集した。沈殿物をヘキサン（１００ｍＬ）で洗浄し、真空中で乾燥させて、副題化合物（Ｅ）－メチル１－アセチル－３－（エトキシ（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレートをベージュ色の固体（１．６６ｇ、８２％）として得た；
Rt 2.61 min (方法１); m/z 366 (M+H)+ (ES+).
（Ｚ）－メチル３－（（（４－（メトキシ（メチル）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
Figure 0007068172000032
４－アミノ－Ｎ－メトキシ－Ｎ－メチルベンズアミド（３２．６ｍｇ、０．１８１ｍｍｏｌ）および（Ｅ）－メチル１－アセチル－３－（エトキシ（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート（中間体Ａ）（６０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）混合物を１８時間かけて８０℃に加熱し、次いで、室温に冷却した。ピペリジン（４５．０μＬ、０．４５５ｍｍｏｌ）を追加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（２５ｍＬ）と飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２５ｍＬ）との間で分割し、層を分離した。有機層をブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、次いで、減圧下で濃縮した。このようにして得られた粗生成物を分取ＨＰＬＣ（方法Ａ、３０～５０％ＭｅＣＮ水溶液）によって精製して、表題化合物（Ｚ）－メチル３－（（（４－（メトキシ（メチル）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレートを黄色の固体（２１ｍｇ、２８％）として得た；
Rt 2.14 min (方法１); m/z 458 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 3.19 (3H, s), 3.48 (3H, s), 3.77 (3H, s), 5.87 (1H, d), 6.86 (2H, m), 7.21 (1H, dd), 7.36-7.45 (3H, overlapping m), 7.53 (2H, m), 7.56-7.68 (3H, overlapping m), 11.01 (1H, s), 12.29 (1H, s).
実施例２：（Ｚ）－メチル５－メチル－３－（（（４－（Ｎ－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エトキシ）スルファモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート，ホルメート
中間体Ｂ：メチル４－（２－メトキシ－２－オキソエチル）－２－メチル－５－ニトロベンゾエート
Figure 0007068172000033
カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（３５．９ｇ、３２０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３５０ｍＬ）撹拌溶液に、窒素雰囲気下、－２０℃で、メチル２－メチル－５－ニトロベンゾエート（２５．０ｇ、１２８ｍｍｏｌ）およびメチル２－クロロアセテート（１６．９ｍＬ、１９２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３００ｍＬ）溶液を４０分間かけて滴下して加えた。反応混合物を２時間かけて－１０℃に加温し、次いで、氷－ＨＣｌスラリー（９００ｇの氷、５００ｍＬ ３５ｗｔ％ＨＣｌ）に注いだ。混合物をＤＣＭ（２×６００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をブライン（２×４００ｍＬ）で洗浄し、次いで、減圧下で蒸発させた。このようにして得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、３３０ｇ、ＤＣＭ中０～１０％ＥｔＯＡｃ、勾配溶出）によって精製して、副題化合物メチル４－（２－メトキシ－２－オキソエチル）－２－メチル－５－ニトロベンゾエートを橙色のシロップ（３１．０ｇ、８９％）として得た；
Rt 2.06 min (方法１); m/z 266 (M-H)- (ES-); 1H NMR δ: 2.61 (3H, s), 3.62 (3H, s), 3.88 (3H, s), 4.12 (2H, s), 7.59 (1H, s), 8.51 (1H, s).
中間体Ｃ：メチル５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
Figure 0007068172000034
メチル４－（２－メトキシ－２－オキソエチル）－２－メチル－５－ニトロベンゾエート（中間体Ｂ）（２３．０ｇ、８６．０ｍｍｏｌ）の酢酸（３０１ｍＬ、５．２５ｍｏｌ）溶液に、パラジウム炭素［５ｗｔ％、５８％水、８７Ｌ型］（３．３０ｇ、１．５５ｍｍｏｌ）を追加した。混合物をＨ２（５ｂａｒ）の雰囲気下、室温で３６時間水素化し、次いで、セライトパッドでろ過した。フィルタケーキをＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）で洗浄し、ろ液を減圧下で濃縮した。粗残留物を熱還流ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）に溶解し、混合物を室温に冷却した。得られた固体をろ過し、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）でリンスし、真空中で乾燥させて、副題化合物メチル５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレートを褐色の粉末（７．００ｇ、３９％）として得た；
Rt 1.48 min (方法１); m/z 206 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.45 (3H, s), 3.32 (2H, s), 3.81 (3H, s), 7.17 (1H, s), 7.22 (1H, s), 10.43 (1H, s).
中間体Ｄ：（Ｅ）－メチル１－アセチル－３－（エトキシ（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
Figure 0007068172000035
メチル５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート（中間体Ｃ）（５．００ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）の無水酢酸（５０．６ｍＬ、５３６ｍｍｏｌ）撹拌溶液に、（トリエトキシメチル）ベンゼン（２２．１ｍＬ、９７．０ｍｍｏｌ）を追加し、混合物を１１０℃で３時間撹拌した。その後、撹拌を室温で１８時間継続した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残留物をＭｅＯＨ（５０ｍＬ）でトリチュレートした。得られた固体をろ過し、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）でリンスし、真空中で乾燥させて、副題化合物（Ｅ）－メチル１－アセチル－３－（エトキシ（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレートを黄色の粉末（４．５０ｇ、４８％）として得た；
Rt 2.70 min (方法１); m/z 380 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 1.35 (3H, t), 2.42 (3H, s), 2.58 (3H, s), 3.84 (3H, s), 4.01 (2H, q), 7.45-7.62 (5H, overlapping m), 7.90 (1H, s), 8.64 (1H, s).
中間体Ｅ：２－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エトキシ）イソインドリン－１，３－ジオン
Figure 0007068172000036
０℃の２－ヒドロキシイソインドリン－１，３－ジオン（２．０４ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（３．２７ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４０ｍＬ）溶液に、２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エタノール（１．５０ｍＬ、１０．４ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。次いで、混合物を０℃で３０分間撹拌した後、ＤＩＡＤ（２．４３ｍＬ、１２．５ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応物を０℃でさらに３０分間撹拌した後、室温に加温し、１６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をＥｔＯＡｃ（７５ｍＬ）に再溶解した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２×５０ｍＬ）で洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で約３０ｍＬに濃縮した。有機層を０℃に冷却し、冷１Ｍ ＨＣｌ水溶液（３０ｍＬ）を追加した。追加が完了したら、混合物を室温に加温し、２０分間撹拌した。層を分離し、水層をＥｔ２Ｏ（２×３０ｍＬ）で洗浄した。０℃に冷却した後、飽和ＮａＨＣＯ３溶液を徐々に追加することによって水層を塩基性化してから、ＣＨＣｌ３（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、次いで、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して、副題化合物２－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エトキシ）イソインドリン－１，３－ジオンをベージュ色の固体（１．９６ｇ、６３％）として得た；
1H NMR δ: 1.84-2.47 (8H, overlapping m), 1.98 (3H, s), 2.65 (2H, t), 4.24 (2H, t), 7.85-7.87 (4H, overlapping m).
中間体Ｆ：Ｏ－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エチル）ヒドロキシルアミン
Figure 0007068172000037
２－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エトキシ）イソインドリン－１，３－ジオン（中間体Ｅ）（１．８８ｇ、６．５０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ／ＤＣＭ（２：１、１５ｍＬ）溶液に、２５％ヒドラジン水溶液（２．４５ｍＬ、１９．５ｍｍｏｌ）を追加した。混合物を室温で１８時間撹拌し、次いで、Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ）で希釈した。沈殿物をろ過によって除去し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をＤＣＭ（３０ｍＬ）に再溶解し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去して、副題化合物Ｏ－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エチル）ヒドロキシルアミンを淡黄色の油状物（０．９０２ｇ、８３％）として得た；
1H NMR δ: 2.13 (3H, s), 2.18-2.47 (8H, overlapping m), 2.43 (2H, t), 3.60 (2H, t), 5.96 (2H, s).
中間体Ｇ：ｔｅｒｔ－ブチル（４－（Ｎ－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エトキシ）スルファモイル）フェニル）カルバメート
Figure 0007068172000038
Ｏ－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エチル）ヒドロキシルアミン（中間体Ｆ）（４６４ｍｇ、２．９１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１５ｍＬ）懸濁液に、ヒューニッヒ塩基（１．０５ｍＬ、６．００ｍｍｏｌ）を追加し、続いて、ｔｅｒｔ－ブチル（４－（クロロスルホニル）フェニル）カルバメート（５００ｍｇ、１．７１ｍｍｏｌ）を追加した。混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒の大部分を減圧下で除去した。残留物をＭｅＯＨ（５０ｍＬ）に再溶解し、ＳＣＸカラム（５ｇ）でろ過し、ＭｅＯＨ（７５ｍＬ）で洗浄した。ろ液を廃棄した後、カラムをＭｅＯＨ中１％ＮＨ３（７５ｍＬ）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去して、副題化合物ｔｅｒｔ－ブチル（４－（Ｎ－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エトキシ）スルファモイル）フェニル）カルバメートを淡無色のゴム状物（５５２ｍｇ、７０％）として得た；
Rt 1.77 min (方法１); m/z 415 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 1.49 (9H, s), 2.12 (3H, s), 2.16-2.46 (10H, overlapping m), 3.93 (2H, t), 7.64 (2H, m), 7.74 (2H, m), 9.87 (1H, s), 10.19 (1H, br s).
中間体Ｈ：４－アミノ－Ｎ－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エトキシ）ベンゼンスルホンアミド，ジ－トリフルオロ酢酸塩
Figure 0007068172000039
ｔｅｒｔ－ブチル（４－（Ｎ－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エトキシ）スルファモイル）フェニル）カルバメート（中間体Ｇ）（３３４ｍｇ、０．８０６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５ｍＬ）溶液に、ＴＦＡ（１ｍＬ）を追加した。混合物を室温で４時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去して、４－アミノ－Ｎ－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エトキシ）ベンゼンスルホンアミド，ジ－トリフルオロ酢酸塩を透明な油状物（３３４ｍｇ、６７％）として得た；
Rt 1.01 min (方法２); m/z 315 (M+H)+ (ES+).
（Ｚ）－メチル５－メチル－３－（（（４－（Ｎ－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エトキシ）スルファモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート，ホルメート
Figure 0007068172000040
（Ｅ）－メチル１－アセチル－３－（エトキシ（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート（中間体Ｄ）（１００ｍｇ、０．２６４ｍｍｏｌ）および４－アミノ－Ｎ－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エトキシ）ベンゼンスルホンアミド，ジ－トリフルオロ酢酸塩（中間体Ｈ）（１７２ｍｇ、０．３１６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３ｍＬ）中で合わせた。混合物を８０℃で２４時間加熱した。さらに４－アミノ－Ｎ－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エトキシ）ベンゼンスルホンアミド，ジ－トリフルオロ酢酸塩（５０ｍｇ）を追加し、反応混合物を２４時間かけて８０℃でに再加熱した。ピペリジン（２６１μＬ、２．６４ｍｍｏｌ）を追加し、混合物を１．５時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。物質をＤＣＭ溶液中１０％ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）に溶解し、水（２０ｍＬ）で洗浄した。相分離器カートリッジを使用して、相を分離した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、４０ｇ、ＤＣＭ中０～１０％ＭｅＯＨ、勾配溶出）によって精製した。カラム通過生成物を分取ＨＰＬＣ（方法Ａ、２０～５０％ＭｅＣＮ水溶液）によって精製して、表題化合物（Ｚ）－メチル５－メチル－３－（（（４－（Ｎ－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エトキシ）スルファモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート，ホルメートを淡黄色の固体（１７．４ｍｇ、１０％）として得た；
Rt 1.64 min (方法１); m/z 606 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.13 (3H, s), 2.15 (3H, s), 2.18-2.36 (8H, overlapping m), 2.42 (2H, t), 3.76 (3H, s), 3.91 (2H, t), 5.63 (1H, s), 6.95 (2H, m), 7.36 (1H, s), 7.53-7.60 (2H, overlapping m), 7.60-7.73 (5H, overlapping m), 8.20 (1H, s), 10.27 (1H, br s), 10.94 (1H, s), 12.28 (1H, s).
実施例３：（Ｚ）－メチル３－（（（４－（（２－（ジメチルアミノ）エトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
中間体Ｉ：（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
Figure 0007068172000041
（Ｅ）－メチル１－アセチル－３－（エトキシ（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート（中間体Ａ）（４．００ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ－ブチル４－アミノベンゾエート（２．１２ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）混合物を１００℃で１６時間加熱した。室温に冷却した後、沈殿物をろ過によって収集し、Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、副題化合物（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレートを黄色の固体（３．６８ｇ、５９％）として得た；
Rt 3.17 min (方法１); m/z 513 (M+H)+ (ES+).
中間体Ｊ：（Ｚ）－４－（（（１－アセチル－６－（メトキシカルボニル）－２－オキソインドリン－３－イリデン）（フェニル）メチル）アミノ）安息香酸，トリフルオロ酢酸付加物
Figure 0007068172000042
（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート（中間体Ｉ）（３．６７ｇ、７．１６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（７５ｍＬ）溶液に、ＴＦＡ（５．５２ｍＬ、７１．６ｍｍｏｌ）を追加し、混合物を室温で１６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去して、副題化合物（Ｚ）－４－（（（１－アセチル－６－（メトキシカルボニル）－２－オキソインドリン－３－イリデン）（フェニル）メチル）アミノ）安息香酸，トリフルオロ酢酸付加物を黄色の固体（３．６３ｇ、８４％）として得た；
Rt 2.59 min (方法１); m/z 457 (M+H)+ (ES+).
中間体Ｋ：２－（２－（ジメチルアミノ）エトキシ）イソインドリン－１，３－ジオン
Figure 0007068172000043
０℃の２－ヒドロキシイソインドリン－１，３－ジオン（２．３４ｇ、１４．３ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（３．７５ｇ、１４．３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４０ｍＬ）溶液に、２－（ジメチルアミノ）エタノール（１．２０ｍＬ、１１．９ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。次いで、混合物を０℃で３０分間撹拌した後、ＤＩＡＤ（２．７８ｍＬ、１４．３ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応物を０℃でさらに３０分間撹拌した後、室温に加温し、１６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をＥｔＯＡｃ（７５ｍＬ）に再溶解した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２×５０ｍＬ）で洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で約３０ｍＬに濃縮した。有機層を０℃に冷却し、冷１Ｍ ＨＣｌ水溶液（２０ｍＬ）を追加した。追加が完了したら、混合物を室温に加温し、２０分間撹拌した。層を分離し、水性部分をＥｔ２Ｏ（２×３０ｍＬ）で洗浄した。次いで、水層を０℃に冷却し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液を徐々に追加することによって塩基性化した後、ＣＨＣｌ３（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、次いで、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して、副題化合物２－（２－（ジメチルアミノ）エトキシ）イソインドリン－１，３－ジオンを黄色の油状物（２．２９ｇ、７８％）として得た；
1H NMR (CDCl3) δ: 2.34 (6H, s), 2.76 (2H, t), 4.31 (2H, t), 7.71-7.77 (2H, overlapping m), 7.80-7.86 (2H, overlapping m).
中間体Ｌ：２－（アミノオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン，２ＨＣｌ
Figure 0007068172000044
２－（２－（ジメチルアミノ）エトキシ）イソインドリン－１，３－ジオン（中間体Ｋ）（２．２９ｇ、９．７８ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ／ＤＣＭ（２：１、３０ｍＬ）溶液に、２５％ヒドラジン水溶液（３．６８ｍＬ、２９．３ｍｍｏｌ）を追加した。混合物を室温で１８時間撹拌した。混合物をＥｔ２Ｏ（１００ｍＬ）で希釈し、相分離器でろ過した。ろ液を脱気した後、ジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（１０ｍＬ）を追加した。混合物を室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をＥｔ２Ｏ（２×５０ｍＬ）でトリチュレートして、副題化合物２－（アミノオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン，２ＨＣｌを白色の固体（８９１ｍｇ、５０％）として得た；
1H NMR δ: 2.79 (6H, s), 3.42 (2H, m), 4.45 (2H, m), 11.13 (4H, br s).
（Ｚ）－メチル３－（（（４－（（２－（ジメチルアミノ）エトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
Figure 0007068172000045
（Ｚ）－４－（（（１－アセチル－６－（メトキシカルボニル）－２－オキソインドリン－３－イリデン）（フェニル）メチル）アミノ）安息香酸，トリフルオロ酢酸付加物（中間体Ｊ）（０．０５０ｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）、２－（アミノオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン，２ＨＣｌ（中間体Ｌ）（０．０３１ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０６７ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に、ヒューニッヒ塩基（０．０７７ｍＬ、０．４４ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。混合物を室温で２時間撹拌した後、ピペリジン（０．０８７ｍＬ、０．８７６ｍｍｏｌ）を追加した。混合物を室温で２時間撹拌した後、溶媒を減圧下で除去した。残留物をＭｅＯＨ（５ｍＬ）に再溶解し、ＳＣＸカラムでろ過し、ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）で洗浄した。ろ液を廃棄した後、カラムをＭｅＯＨ中１％ＮＨ３（１００ｍＬ）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（方法Ｂ、３５～６５％ＭｅＣＮ水溶液）によって精製して、表題化合物（Ｚ）－メチル３－（（（４－（（２－（ジメチルアミノ）エトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレートを黄色の固体（１３ｍｇ、２８％）として得た；
Rt 1.80 min (方法２); m/z 501 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.20 (6H, s), 2.54 (2H, m), 3.79 (3H, s), 3.94 (2H, t), 5.90 (1H, d), 6.86 (2H, m), 7.20 (1H, dd), 7.45 (1H, d), 7.48-7.68 (7H, overlapping m), 9.41 (1H, s), 10.73 (1H, s), 12.28 (1H, s).
実施例４：（Ｚ）－メチル３－（（（４－（（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
Figure 0007068172000046
（Ｚ）－４－（（（１－アセチル－６－（メトキシカルボニル）－２－オキソインドリン－３－イリデン）（フェニル）メチル）アミノ）安息香酸，トリフルオロ酢酸付加物（中間体Ｊ）（１００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、Ｏ－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エチル）ヒドロキシルアミン（中間体Ｆ）（２８ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（７３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、ヒューニッヒ塩基（０．０９２ｍＬ、０．５３ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。混合物を室温で１８時間撹拌した。ピペリジン（０．１７ｍＬ、１．７５ｍｍｏｌ）を追加した。混合物を室温で１．５時間撹拌した後、溶媒の大部分を減圧下で除去した。残留物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）と水／飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１：１、１０ｍＬ）との間で分割した。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、次いで、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。残留物をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）に再溶解し、ＳＣＸカラムでろ過し、ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）で洗浄した。ろ液を廃棄した後、カラムをＭｅＯＨ（１００ｍＬ）中１％ＮＨ３で洗浄した。溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、２４ｇ、ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ、次いでＭｅＯＨ中１％ＮＨ３）によって精製して、表題化合物（Ｚ）－メチル３－（（（４－（（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレートを黄色の固体（６４ｍｇ、６４％）として得た；
Rt 1.45 min (方法１); m/z 556 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.13 (3H, s), 2.20-2.47 (8H, overlapping m), 2.54 (2H, t), 3.77 (3H, s), 3.92 (2H, t), 5.87 (1H, d), 6.86 (2H, m), 7.21 (1H, dd), 7.42 (1H, d), 7.49-7.56 (4H, overlapping m), 7.57-7.68 (3H, overlapping m), 11.03 (1H, s), 12.28 (1H, s).
実施例５：（Ｚ）－メチル３－（（（４－（（２－（ジメチルアミノ）エトキシ）カルバモイル）－３－メチルフェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
中間体Ｍ：（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－３－メチルフェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
Figure 0007068172000047
（Ｅ）－メチル１－アセチル－３－（エトキシ（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート（中間体Ｄ）（１．１１ｇ、２．９１ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ－ブチル４－アミノ－２－メチルベンゾエート（６０４ｍｇ、２．９１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（９ｍＬ）混合物を１００℃で１８時間加熱した。室温に冷却した後、沈殿物をろ過によって収集し、Ｅｔ２Ｏ（１０ｍＬ）で洗浄し、真空中で乾燥させて、副題化合物（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－３－メチルフェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレートを黄色の固体（１．０５ｇ、６５％）として得た；
Rt 3.28 min (方法１); m/z 541 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 1.49 (9H, s), 2.13 (3H, s), 2.33 (3H, s), 2.73 (3H, s), 3.77 (3H, s), 5.53 (1H, s), 6.74 (1H, dd), 6.92 (1H, m), 7.43-7.56 (3H, overlapping m), 7.57-7.71 (3H, overlapping m), 8.67 (1H, s), 11.87 (1H, s).
中間体Ｎ：（Ｚ）－４－（（（１－アセチル－６－（メトキシカルボニル）－５－メチル－２－オキソインドリン－３－イリデン）（フェニル）メチル）アミノ）－２－メチル安息香酸，トリフルオロ酢酸付加物
Figure 0007068172000048
（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－３－メチルフェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート（中間体Ｍ）（１．０ｇ、１．８５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１４ｍＬ）溶液に、ＴＦＡ（１．４２ｍＬ、１８．５ｍｍｏｌ）を追加し、混合物を室温で１６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去して、副題化合物（Ｚ）－４－（（（１－アセチル－６－（メトキシカルボニル）－５－メチル－２－オキソインドリン－３－イリデン）（フェニル）メチル）アミノ）－２－メチル安息香酸，トリフルオロ酢酸付加物を黄色の固体（１．１ｇ、９７％）として得た；
Rt 2.85 min (方法１); m/z 485 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.13 (3H, s), 2.36 (3H, s), 2.73 (3H, s), 3.77 (3H, s), 5.53 (1H, s), 6.74 (1H, dd), 6.91 (1H, m), 7.48-7.56 (2H, overlapping m), 7.55-7.73 (4H, overlapping m), 8.68 (1H, s), 11.89 (1H, s).
（Ｚ）－メチル３－（（（４－（（２－（ジメチルアミノ）エトキシ）カルバモイル）－３－メチルフェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
Figure 0007068172000049
（Ｚ）－４－（（（１－アセチル－６－（メトキシカルボニル）－５－メチル－２－オキソインドリン－３－イリデン）（フェニル）メチル）アミノ）－２－メチル安息香酸，トリフルオロ酢酸付加物（中間体Ｎ）（４００ｍｇ、０．６６８ｍｍｏｌ）、２－（アミノオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン，２ＨＣｌ（１６６ｍｇ、０．９３６ｍｍｏｌ）（中間体Ｌ）およびＨＡＴＵ（３０５ｍｇ、０．８０２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液に、ヒューニッヒ塩基（０．５８４ｍＬ、３．３４ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。ピペリジン（０．６６２ｍＬ、６．６８ｍｍｏｌ）を追加した。混合物を室温で１６時間撹拌した後、溶媒の大部分を減圧下で除去した。残留物をＤＣＭ溶液中１０％ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）と水／飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１：１、１０ｍＬ）との間で分割した。層を分離し、水性部分をＤＣＭ溶液中１０％ＭｅＯＨ（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、次いで、ＳＣＸカラムでろ過し、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）で洗浄した。ろ液を廃棄した後、カラムをＭｅＯＨ中１％ＮＨ３（５０ｍＬ）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、２４ｇ、ＤＣＭ中０～１０％ＭｅＯＨ、次いでＭｅＯＨ中１％ＮＨ３）によって精製して、表題化合物（Ｚ）－メチル３－（（（４－（（２－（ジメチルアミノ）エトキシ）カルバモイル）－３－メチルフェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレートを黄色の固体（１００ｍｇ、２８％）として得た；
Rt 1.66 min (方法１); m/z 529 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.13 (3H, s), 2.17 (9H, s), 2.44-2.48 (2H, overlapping m), 3.75 (3H, s), 3.91 (2H, t), 5.58 (1H, s), 6.59 (1H, dd), 6.78 (1H, m), 7.08 (1H, d), 7.36 (1H, s), 7.53 (2H, m), 7.57-7.71 (3H, overlapping m), 10.86 (1H, s), 12.18 (1H, s).
実施例６：（Ｚ）－メチル５－メチル－３－（（（４－（（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
中間体Ｏ：（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
Figure 0007068172000050
（Ｅ）－メチル１－アセチル－３－（エトキシ（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート（中間体Ｄ）（１．００ｇ、２．６４ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ－ブチル４－アミノベンゾエート（５０９ｍｇ、２．６４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（９ｍＬ）混合物を１００℃で１８時間加熱した。室温に冷却した後、沈殿物をろ過によって収集し、Ｅｔ２Ｏ（１０ｍＬ）で洗浄し、真空中で乾燥させて、副題化合物（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレートを黄色の固体（１．２０ｇ、８６％）として得た；
Rt 3.23 min (方法１); m/z 527 (M+H)+ (ES+).
中間体Ｐ：（Ｚ）－４－（（（１－アセチル－６－（メトキシカルボニル）－５－メチル－２－オキソインドリン－３－イリデン）（フェニル）メチル）アミノ）安息香酸，トリフルオロ酢酸付加物
Figure 0007068172000051
（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート（中間体Ｏ）（１．２０ｇ、２．２８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１４ｍＬ）溶液に、ＴＦＡ（１．７６ｍＬ、２２．８ｍｍｏｌ）を追加し、混合物を室温で７２時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去して、副題化合物（Ｚ）－４－（（（１－アセチル－６－（メトキシカルボニル）－５－メチル－２－オキソインドリン－３－イリデン）（フェニル）メチル）アミノ）安息香酸，トリフルオロ酢酸付加物を黄色の固体（１．００ｇ、７２％）として得た；
Rt 2.72 min (方法１); m/z 471 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.13 (3H, s), 2.73 (3H, s), 3.78 (3H, s), 5.54 (1H, s), 7.04 (2H, m), 7.50 (2H, m), 7.57-7.76 (5H, overlapping m), 8.68 (1H, s), 11.89 (1H, s), 12.89 (1H, s).
（Ｚ）－メチル５－メチル－３－（（（４－（（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
Figure 0007068172000052
 （Ｚ）－４－（（（１－アセチル－６－（メトキシカルボニル）－５－メチル－２－オキソインドリン－３－イリデン）（フェニル）メチル）アミノ）安息香酸，トリフルオロ酢酸付加物（中間体Ｐ）（５７ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）、Ｏ－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エチル）ヒドロキシルアミン（中間体Ｆ）（１６ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（４１ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、ヒューニッヒ塩基（０．０５１ｍＬ、０．２９３ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。ピペリジン（０．０９７ｍＬ、０．９７５ｍｍｏｌ）を追加した。混合物を室温で２時間撹拌した後、溶媒の大部分を減圧下で除去した。残留物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）と水／飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１：１、１０ｍＬ）との間で分割した。層を分離し、水性部分をＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、次いで、ＳＣＸカラムでろ過し、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）で洗浄した。ろ液を廃棄した後、カラムをＭｅＯＨ中１％ＮＨ３（５０ｍＬ）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、１２ｇ、ＤＣＭ中０～１０％ＭｅＯＨ、次いでＭｅＯＨ中１％ＮＨ３）によって精製して、表題化合物（Ｚ）－メチル５－メチル－３－（（（４－（（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレートを黄色の固体（３６ｍｇ、６４％）として得た；
Rt 1.49 min (方法１); m/z 570 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.13 (3H, s), 2.13 (3H, s), 2.17-2.35 (4H, overlapping m), 2.34-2.47 (4H, overlapping m), 2.54 (2H, t), 3.75 (3H, s), 3.92 (2H, t), 5.61 (1H, s), 6.87 (2H, m), 7.36 (1H, s), 7.47-7.56 (4H, overlapping m), 7.57-7.71 (3H, overlapping m), 10.88 (1H, s), 11.52 (1H, s), 12.22 (1H, s).
実施例７：（Ｚ）－メチル３－（（（４－（（２－（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル）エトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート，ホルメート
中間体Ｑ：２－（２－ブロモエトキシ）イソインドリン－１，３－ジオン
Figure 0007068172000053
２－ヒドロキシイソインドリン－１，３－ジオン（５．００ｇ、３０．７ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（９．４０ｍＬ、６７．４ｍｍｏｌ）および１，２－ジブロモエタン（１２．４ｍＬ、１４４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３２ｍＬ）中で合わせ、室温で１６時間撹拌した。沈殿物をろ過によって除去し、ＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄し、固体を廃棄した。ろ液を水（２５０ｍＬ）で希釈し、生成物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を１Ｍ ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して、副題化合物２－（２－ブロモエトキシ）イソインドリン－１，３－ジオンをクリーム色の固体（６．２８ｇ、６８％）として得た；
1H NMR δ: 3.75 (2H, t), 4.45 (2H, t), 7.82-7.91 (4H, overlapping m).
中間体Ｒ：Ｏ－（２－ブロモエチル）ヒドロキシルアミン，ＨＢｒ
Figure 0007068172000054
２－（２－ブロモエトキシ）イソインドリン－１，３－ジオン（中間体Ｑ）（１．００ｇ、３．７０ｍｍｏｌ）を濃ＨＢｒ（水中４８ｗｔ％、４．５ｍＬ）および酢酸（３ｍＬ、５２．４ｍｍｏｌ）と合わせた。混合物を１２０℃で１５分間加熱した。反応混合物を冷却し、沈殿物をろ過によって除去し、ろ液を減圧下で濃縮して、副題化合物Ｏ－（２－ブロモエチル）ヒドロキシルアミン，ＨＢｒを黄褐色の固体（５５０ｍｇ、７４％）として得た；
1H NMR δ: 3.72 (2H, m), 4.28 (2H, m), 10.70 (3H, br s).
中間体Ｓ：（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（（２－ブロモエトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
Figure 0007068172000055
（Ｚ）－４－（（（１－アセチル－６－（メトキシカルボニル）－５－メチル－２－オキソインドリン－３－イリデン）（フェニル）メチル）アミノ）安息香酸，トリフルオロ酢酸付加物（中間体Ｐ）（３００ｍｇ、０．６３８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２９１ｍｇ、０．７６５ｍｍｏｌ）およびヒューニッヒ塩基（３３４μＬ、１．９１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に、Ｏ－（２－ブロモエチル）ヒドロキシルアミン，ＨＢｒ（中間体Ｒ）（２１１ｍｇ、０．９５６ｍｍｏｌ）を追加した。混合物を室温で１０分間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨで希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させて、（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（（２－ブロモエトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレートを得た；
Rt 2.67 min (方法１); m/z 592/594 (M+H)+ (ES+).
定量的収率を前提として、粗物質を次の工程で直接使用した。
（Ｚ）－メチル３－（（（４－（（２－（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル）エトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート，ホルメート
Figure 0007068172000056
 （Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（（２－ブロモエトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート（中間体Ｓ）（１００ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を２－（ピペラジン－１－イル）エタノール（６５９ｍｇ、５．０６ｍｍｏｌ）と合わせ、混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ１０％ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）で希釈し、水（５ｍＬ）で洗浄した。水層をＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）でさらに抽出し、合わせた有機層を減圧下で濃縮した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（方法Ａ、２０～５０％ＭｅＣＮ水溶液）によって精製して、表題化合物（Ｚ）－メチル３－（（（４－（（２－（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル）エトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート，ホルメートを黄色の固体（２５ｍｇ、２３％）として得た；
Rt 1.86 min (方法２); m/z 600 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.13 (3H, s), 2.30-2.50 (8H, overlapping m), 2.36 (2H, t), 2.54 (2H, m), 3.47 (2H, t), 3.75 (3H, s), 3.92 (2H, t), 5.61 (1H, s), 6.87 (2H, m), 7.36 (1H, s), 7.50-7.56 (4H, overlapping m), 7.57-7.70 (4H, overlapping m), 8.17 (1H, s), 10.89 (1H, s), 12.21 (1H, s).
実施例８：（Ｚ）－メチル２－オキソ－３－（フェニル（（４－（（２－（ピペリジン－１－イル）エトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）メチレン）インドリン－６－カルボキシレート，０．７ギ酸
Figure 0007068172000057
（Ｚ）－４－（（（１－アセチル－６－（メトキシカルボニル）－２－オキソインドリン－３－イリデン）（フェニル）メチル）アミノ）安息香酸，トリフルオロ酢酸付加物（中間体Ｊ）（１００ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（８０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）およびヒューニッヒ塩基（０．０９２ｍｌ、０．５２６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、Ｏ－（２－ブロモエチル）ヒドロキシルアミン，ＨＢｒ（中間体Ｒ）（２７ｍｇ、０．１２３ｍｍｏｌ）を追加した。混合物を室温で１時間撹拌した。さらにＯ－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エチル）ヒドロキシルアミン，ＨＢｒ（２０ｍｇ）を追加した。反応混合物をさらに１時間撹拌した。反応混合物の半分を取り出し、０．３５ｍＬのピペリジンに追加し、反応混合物を１６時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物を分取ＨＰＬＣ（方法Ａ、１５～７０％ＭｅＣＮ水溶液）によって精製して、表題化合物（Ｚ）－メチル２－オキソ－３－（フェニル（（４－（（２－（ピペリジン－１－イル）エトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）メチレン）インドリン－６－カルボキシレート，０．７ギ酸（１．６ｍｇ、２％）を得た。
Rt 1.66 min (方法１); m/z 541 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ 1.33-1.42 (2H, overlapping m), 1.45-1.52 (4H, overlapping m), 2.40-2.47 (4H, overlapping m), 2.57 (2H, t), 3.77 (3H, s), 3.94 (2H, t), 5.87 (1H, d), 6.86 (2H, m), 7.21 (1H, dd), 7.42 (1H, d), 7.50-7.56 (4H, overlapping m), 7.57-7.69 (3H, overlapping m), 8.19 (0.7 H, s), 11.04 (1H, s), 12.27 (1H, s).
実施例９：（Ｚ）－メチル５－メチル－３－（（（４－（メチル（２－（４－（２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル）ピペラジン－１－イル）エトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
中間体Ｔ：ホルムアルデヒドＯ－（２－ヒドロキシエチル）オキシム
Figure 0007068172000058
２－（アミノオキシ）エタノール（３．１６ｇ、４１．０ｍｍｏｌ）およびパラホルムアルデヒド（１．２３ｇ、４１．０ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（５０ｍＬ）混合物を還流下で１８時間加熱した。溶媒を減圧下で除去して、副題化合物ホルムアルデヒドＯ－（２－ヒドロキシエチル）オキシムを無色の油状物（３．５６ｇ、９７％）として得た；
1H NMR δ: 3.57 (2H, q), 4.05-3.96 (2H, m), 4.67 (1H, t), 6.57 (1H, d), 7.05 (1H, d).
中間体Ｕ：２－（（メチルアミノ）オキシ）エタノール
Figure 0007068172000059
０℃のホルムアルデヒドＯ－（２－ヒドロキシエチル）オキシム（中間体Ｔ）（３．５６ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２５ｍＬ）溶液に、Ｐｙ－ＢＨ３（６．０５ｍｌ、５９．９ｍｍｏｌ）を追加した。ジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（１５ｍＬ）を１時間かけて追加した。混合物を室温に加温し、２４時間撹拌し、次いで、ＭｅＯＨ（３０ｍＬ）で徐々に希釈し、ＳＣＸカラムでろ過し、ＭｅＯＨ（２５０ｍＬ）で洗浄した。ろ液を廃棄した後、カラムをＭｅＯＨ中１％ＮＨ３（２５０ｍＬ）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去して、副題化合物２－（（メチルアミノ）オキシ）エタノールを無色の油状物（０．８３３ｇ、１８％）として得た；
1H NMR δ: 2.51 (3H, m), 3.50 (2H, m), 3.57 (2H, m), 4.53 (1H, s), 6.45 (1H, m).
中間体Ｖ：（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（（２－ヒドロキシエトキシ）（メチル）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
Figure 0007068172000060
 （Ｚ）－４－（（（１－アセチル－６－（メトキシカルボニル）－５－メチル－２－オキソインドリン－３－イリデン）（フェニル）メチル）アミノ）安息香酸，トリフルオロ酢酸付加物（中間体Ｐ）（０．５２８ｇ、０．９０３ｍｍｏｌ）、２－（（メチルアミノ）オキシ）エタノール（中間体Ｕ）（０．１５８ｇ、１．３６ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．３７８ｇ、０．９９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、ヒューニッヒ塩基（０．４７ｍｌ、２．７１ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をＥｔＯＡｃ中１０％ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）と水（１０ｍＬ）との間で分割した。層を分離し、水性部分をＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、次いで、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、２４ｇ、ＤＣＭ中０～５％ＭｅＯＨ、勾配溶出）によって精製して、副題化合物（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（（２－ヒドロキシエトキシ）（メチル）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレートを黄色の固体（０．４８２ｇ、８８％）として得た；
Rt 2.38 min (方法１); m/z 544 (M+H)+ (ES+).
中間体Ｗ：（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（（２－ブロモエトキシ）（メチル）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
Figure 0007068172000061
 ０℃の（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（（２－ヒドロキシエトキシ）（メチル）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート（中間体Ｖ）（０．４８２ｇ、０．８８７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１０ｍＬ）溶液に、トリフェニルホスフィン（０．２５６ｇ、０．９７５ｍｍｏｌ）およびＣＢｒ４（０．３２３ｇ、０．９７５ｍｍｏｌ）を追加した。混合物を室温に加温し、２時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、２４ｇ、ＤＣＭ中０～２％ＭｅＯＨ、勾配溶出）によって精製して、副題化合物（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（（２－ブロモエトキシ）（メチル）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレートを橙色の固体（６８１ｍｇ、定量）として得た；
Rt 2.80 min (方法２); m/z 606/608 (M+H)+ (ES+).
（Ｚ）－メチル５－メチル－３－（（（４－（メチル（２－（４－（２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル）ピペラジン－１－イル）エトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
Figure 0007068172000062
（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（（２－ブロモエトキシ）（メチル）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート（中間体Ｗ）（７５ｍｇ、０．１２４ｍｍｏｌ）およびＮ－メチル－２－（ピペラジン－１－イル）アセトアミド，２ＨＣｌ（１４２ｍｇ、０．６１８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）混合物に、ヒューニッヒ塩基（０．２５９ｍｌ、１．４８ｍｍｏｌ）を追加した。混合物を６０℃で５時間加熱した。室温に冷却した後、ピペリジン（０．２４５ｍｌ、２．４７ｍｍｏｌ）を追加し、混合物を６０℃で１６時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）と水／飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１：１、１０ｍＬ）との間で分割した。層を分離し、水相をＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、ＳＣＸカラムで直接ろ過し、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）で洗浄した。ろ液を廃棄した後、カラムをＭｅＯＨ中１％ＮＨ３（５０ｍＬ）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、１２ｇ、ＤＣＭ中ＭｅＯＨ中０～１０％０．７Ｍアンモニア、勾配溶出）で精製して、表題化合物（Ｚ）－メチル５－メチル－３－（（（４－（メチル（２－（４－（２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル）ピペラジン－１－イル）エトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレートを黄色の固体（１１ｍｇ、１３％）として得た；
Rt 1.58 min (方法１); m/z 641 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.14 (3H, s), 2.23-2.36 (8H, overlapping m), 2.59 (3H, d), 2.87 (2H, m), 3.21 (3H, s), 3.31 (2H, s), 3.75 (3H, s), 3.78 (2H, t), 5.62 (1H, s), 6.86 (2H, m), 7.36 (1H, s), 7.42 (2H, m), 7.53 (2H, m), 7.58-7.66 (3H, overlapping m), 10.89 (1H, s), 12.22 (1H, s).
実施例１０：（Ｚ）－メチル５－メチル－３－（（（４－（メチル（２－（４－（２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル）ピペラジン－１－イル）エトキシ）カルバモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
中間体Ｘ：ｔｅｒｔ－ブチル（４－（Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－Ｎ－メチルスルファモイル）フェニル）カルバメート
Figure 0007068172000063
２－（（メチルアミノ）オキシ）エタノール（中間体Ｕ）（０．１１６ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、ヒューニッヒ塩基（０．４４５ｍｌ、２．５５ｍｍｏｌ）を追加し、続いて、ｔｅｒｔ－ブチル（４－（クロロスルホニル）フェニル）カルバメート（０．３７１ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）を追加した。混合物を室温で１６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をＤＣＭ（１０ｍＬ）と１Ｍ ＨＣｌ水溶液（１０ｍＬ）との間で分割した。層を分離し、水性部分をＤＣＭ（２×１０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、相分離器でろ過した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、２４ｇ、ヘキサン中０～７０％ＥｔＯＡｃ、勾配溶出）によって精製して、副題化合物ｔｅｒｔ－ブチル（４－（Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－Ｎ－メチルスルファモイル）フェニル）カルバメートを桃色のゴム状物として得、これは一晩放置すると固化した（２４６ｍｇ、４１％）；
Rt 1.97 min (方法２); m/z 347 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 1.49 (9H, s), 2.71 (3H, s), 3.54 (2H, q), 3.93 (2H, dd), 4.68 (1H, t), 7.69-7.76 (4H, overlapping m), 9.97 (1H, s).
中間体Ｙ：４－アミノ－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－Ｎ－メチルベンゼンスルホンアミド，トリフルオロ酢酸塩
Figure 0007068172000064
ｔｅｒｔ－ブチル（４－（Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－Ｎ－メチルスルファモイル）フェニル）カルバメート（中間体Ｘ）（２０２ｍｇ、０．５８３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３ｍＬ）溶液に、ＴＦＡ（０．４４９ｍｌ、５．８３ｍｍｏｌ）を追加した。混合物を室温で４時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をＭｅＯＨ（３ｍＬ）に再溶解し、ＳＡＸカラムでろ過し、ＭｅＯＨ（７５ｍＬ）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去して、副題化合物４－アミノ－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－Ｎ－メチルベンゼンスルホンアミド，Ｔトリフルオロ酢酸塩を橙色のゴム状物（０．２３ｇ、９５％）として得た；
Rt 1.13 min (方法２); m/z 247 (M+H)+ (ES+).
中間体Ｚ：（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－Ｎ－メチルスルファモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
Figure 0007068172000065
（Ｅ）－メチル１－アセチル－３－（エトキシ（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート（中間体Ｄ）（０．２３１ｇ、０．６１ｍｍｏｌ）および４－アミノ－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－Ｎ－メチルベンゼンスルホンアミド，トリフルオロ酢酸塩（中間体Ｙ）（０．２１９ｇ、０．６０８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）混合物をヒューニッヒ塩基（０．１０６ｍｌ、０．６０８ｍｍｏｌ）で処理し、８０℃で１８時間加熱した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、２４ｇ、ＤＣＭ中０～２％ＭｅＯＨ、勾配溶出）によって精製して、副題化合物（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－Ｎ－メチルスルファモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレートを橙色のゴム状物（２２６ｍｇ、６３％）として得た；
Rt 2.58 min (方法２); m/z 580 (M+H)+ (ES+).
中間体ＡＡ：（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（Ｎ－（２－ブロモエトキシ）－Ｎ－メチルスルファモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
Figure 0007068172000066
（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－Ｎ－メチルスルファモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート（０．２２６ｇ、０．３９０ｍｍｏｌ）（中間体Ｚ）のＤＣＭ（４ｍＬ）溶液に、トリフェニルホスフィン（０．１１２ｇ、０．４２９ｍｍｏｌ）およびＣＢｒ４（４１μＬ、０．４２９ｍｍｏｌ）を追加した。混合物を室温で１６時間撹拌した。さらなるＰＰｈ３（０．１１２ｇ、０．４２９ｍｍｏｌ）およびＣＢｒ４（４１μＬ、０．４２９ｍｍｏｌ）を追加し、混合物を室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、１２ｇ、ＤＣＭ中０～２％ＭｅＯＨ、勾配溶出）で精製して、副題化合物（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（Ｎ－（２－ブロモエトキシ）－Ｎ－メチルスルファモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレートを黄色の固体（１６１ｍｇ、６４％）として得た；
Rt 3.01 min (方法２); m/z 642/644 (M+H)+ (ES+).
（Ｚ）－メチル３－（（（４－（Ｎ－（２－（（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アミノ）エトキシ）－Ｎ－メチルスルファモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート
Figure 0007068172000067
（Ｚ）－メチル１－アセチル－３－（（（４－（Ｎ－（２－ブロモエトキシ）－Ｎ－メチルスルファモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレート（中間体ＡＡ）（７７ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ）および２－（メチルアミノ）エタノール（０．０９６ｍｌ、１．２０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液を６０℃で１６時間加熱した。室温に冷却した後、溶媒を減圧下で除去し、残留物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）と水／飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１：１、１０ｍＬ）との間で分割した。層を分離し、水性部分をＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、ＳＣＸカラムでろ過し、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）で洗浄した。ろ液を廃棄した後、カラムをＭｅＯＨ中１％ＮＨ３（５０ｍＬ）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、１２ｇ、ＤＣＭ中ＭｅＯＨ中０～１０％０．７Ｍアンモニア）によって精製して、表題化合物（Ｚ）－メチル３－（（（４－（Ｎ－（２－（（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アミノ）エトキシ）－Ｎ－メチルスルファモイル）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）－５－メチル－２－オキソインドリン－６－カルボキシレートを黄色の固体（４１ｍｇ、５５％）として得た；
Rt 1.72 min (方法１); m/z 595 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.14 (3H, s), 2.17-2.30 (4H, overlapping m), 2.68 (3H, s), 3.43-3.54 (2H, overlapping m), 3.76 (3H, s), 3.96-4.08 (2H, overlapping m), 4.40 (1H, m), 5.65 (1H, s), 6.96 (2H, m), 7.36 (1H, s), 7.53-7.75 (7H, overlapping m), 10.96 (1H, s), 12.29 (1H, s), (見当たらない推定される3Hは溶媒と重なっている).
以下の化合物実施例（表２）は、上記実施例と同様の合成方法によって、または本明細書の他の箇所に記載されている方法によって調製され得る。
表２：本発明のさらなる化合物実施例
＊経路コードインデックス：
経路１Ａ：実施例１または実施例２を参照のこと
経路１Ｂ：実施例３、実施例４、実施例５または実施例６を参照のこと
経路１Ｃ：実施例７または実施例８を参照のこと
経路１Ｄ：実施例９を参照のこと
経路１Ｅ：実施例１０を参照のこと
実施例番号、構造、名称、経路コード、ＬＣ－ＭＳ分析および１Ｈ ＮＭＲスペクトルデータ
Figure 0007068172000068
Figure 0007068172000069
Figure 0007068172000070
Figure 0007068172000071
Figure 0007068172000072
Figure 0007068172000073
Figure 0007068172000074
Figure 0007068172000075
Figure 0007068172000076
Figure 0007068172000077
Figure 0007068172000078
Figure 0007068172000079
Figure 0007068172000080
Figure 0007068172000081
Figure 0007068172000082
Figure 0007068172000083
Figure 0007068172000084
Figure 0007068172000085
Figure 0007068172000086
Figure 0007068172000087
Figure 0007068172000088
Figure 0007068172000089
Figure 0007068172000090
Figure 0007068172000091
Figure 0007068172000092
Figure 0007068172000093
生物学的試験：実験方法
酵素阻害アッセイ
ＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＫ）を使用して、本明細書に開示される化合物の酵素阻害活性を測定した。４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡおよび１ｍＭ ＤＴＴを含有する緩衝液中で、ＦＧＦＲ１、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβおよびＶＥＧＦＲ２のアッセイを実施した；一方、２ｍＭ ＭｎＣｌ２を補充した上記緩衝液中で、ＦＧＦＲ３およびＶＥＧＦＲ１のアッセイを実施した。
ＦＧＦＲ１酵素阻害
ＦＧＦＲ１タンパク質（３．１２ｎｇ／ｍＬ、２μＬ）、基質（ポリ（４：１ Ｇｌｕ４、Ｔｙｒ１）、１００ｎｇ／ｍＬ、２μＬ）を試験化合物（３μＭ、０．６７μＭ、０．１５μＭ、０．０３３μＭ、０．００７３μＭ、０．００１６μＭ、０．００３６μＭまたは０．００００８μＭのいずれかで２μＬ）と２５℃で９０分間混合することによって、ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１キナーゼ酵素システム：Ｐｒｏｍｅｇａ）に対する本発明の化合物の阻害活性を評価した。次いで、ＡＴＰ（５０μＭ、２μＬ）を追加することによってキナーゼ反応を開始させ、混合物を２５℃で１時間インキュベートした。ＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）試薬を４０分間かけて追加し（８μＬ）、次いで、現像試薬（１６μＬ）を４０分間かけて追加した後、マイクロプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で検出した。
ＦＧＦＲ３酵素阻害
ＦＧＦＲ３タンパク質（１２．５ｎｇ／ｍＬ、２μＬ）、基質（ポリ（Ａｌａ６、Ｇｌｕ２、Ｌｙｓ５、Ｔｙｒ１）、１００ｎｇ／ｍＬ、２μＬ）を試験化合物（３μＭ、０．６７μＭ、０．１５μＭ、０．０３３μＭ、０．００７３μＭ、０．００１６μＭ、０．００３６μＭまたは０．００００８μＭのいずれかで２μＬ）と２５℃で９０分間混合することによって、ＦＧＦＲ３（ＦＧＦＲ３キナーゼ酵素システム：Ｐｒｏｍｅｇａ）に対する本発明の化合物の阻害活性を評価した。ＡＴＰ（５０μＭ、２μＬ）を追加することによってキナーゼ反応を開始させ、混合物を２５℃で９０分間インキュベートした。ＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）試薬を４０分間かけて追加し（８μＬ）、次いで、現像試薬（１６μＬ）を４０分間かけて追加した後、マイクロプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で検出した。
ＰＤＧＦＲα酵素阻害
ＰＤＧＦＲαタンパク質（１２．５ｎｇ／ｍＬ、２μＬ）、基質（ポリ（４：１ Ｇｌｕ４、Ｔｙｒ１）、１００ｎｇ／ｍＬ、２μＬ）を試験化合物（３μＭ、０．６７μＭ、０．１５μＭ、０．０３３μＭ、０．００７３μＭ、０．００１６μＭ、０．００３６μＭまたは０．００００８μＭのいずれかで２μＬ）と２５℃で９０分間混合することによって、ＰＤＧＦＲα（ＰＤＧＦＲαキナーゼ酵素システム：Ｐｒｏｍｅｇａ）に対する本発明の化合物の阻害活性を評価した。ＡＴＰ（２５μＭ、２μＬ）を追加することによってキナーゼ反応を開始させ、混合物を２５℃で１時間インキュベートした。ＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）試薬を４０分間かけて追加し（８μＬ）、次いで、現像試薬（１６μＬ）を４０分間かけて追加した後、マイクロプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で検出した。
ＰＤＧＦＲβ酵素阻害
ＰＤＧＦＲβタンパク質（６．２５ｎｇ／ｍＬ、２μＬ）、基質（ポリ（４：１ Ｇｌｕ４、Ｔｙｒ１）、１００ｎｇ／ｍＬ、２μＬ）を試験化合物（３μＭ、０．６７μＭ、０．１５μＭ、０．０３３μＭ、０．００７３μＭ、０．００１６μＭ、０．００３６μＭまたは０．００００８μＭのいずれかで２μＬ）と２５℃で９０分間混合することによって、ＰＤＧＦＲβ（ＰＤＧＦＲβキナーゼ酵素システム：Ｐｒｏｍｅｇａ）に対する本発明の化合物の阻害活性を評価した。ＡＴＰ（２５μＭ、２μＬ）を追加することによってキナーゼ反応を開始させ、混合物を２５℃で１時間インキュベートした。ＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）試薬を４０分間かけて追加し（８μＬ）、次いで、現像試薬（１６μＬ）を４０分間かけて追加した後、マイクロプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で検出した。
ＶＥＧＦＲ１酵素阻害
ＶＥＧＦＲ１タンパク質（１２．５ｎｇ／ｍＬ、２μＬ）、基質（ＩＧＦＲ１Ｒｔｉｄｅ、１００ｎｇ／ｍＬ、２μＬ）を試験化合物（３μＭ、０．６７μＭ、０．１５μＭ、０．０３３μＭ、０．００７３μＭ、０．００１６μＭ、０．００３６μＭまたは０．００００８μＭのいずれかで２μＬ）と２５℃で９０分間混合することによって、ＶＥＧＦＲ１（ＶＥＧＦＲ１キナーゼ酵素システム：Ｐｒｏｍｅｇａ）に対する本発明の化合物の阻害活性を評価した。ＡＴＰ（５０μＭ、２μＬ）を追加することによってキナーゼ反応を開始させ、混合物を２５℃で９０分間インキュベートした。ＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）試薬を４０分間かけて追加し（８μＬ）、次いで、現像試薬（１６μＬ）を４０分間かけて追加した後、マイクロプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で検出した。
ＶＥＧＦＲ２酵素阻害
ＶＥＧＦＲ２タンパク質（１．５６ｎｇ／ｍＬ、２μＬ）、基質（ポリ（４：１ Ｇｌｕ４、Ｔｙｒ１）、１００ｎｇ／ｍＬ、２μＬ）を試験化合物（３μＭ、０．６７μＭ、０．１５μＭ、０．０３３μＭ、０．００７３μＭ、０．００１６μＭ、０．００３６μＭまたは０．００００８μＭのいずれかで２μＬ）と２５℃で９０分間混合することによって、ＶＥＧＦＲ２（ＶＥＧＦＲ２キナーゼ酵素システム：Ｐｒｏｍｅｇａ）に対する本発明の化合物の阻害活性を評価した。ＡＴＰ（５０μＭ、２μＬ）を追加することによってキナーゼ反応を開始させ、混合物を２５℃で１時間インキュベートした。ＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）試薬を４０分間かけて追加し（８μＬ）、次いで、現像試薬（１６μＬ）を４０分間かけて追加した後、マイクロプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で検出した。
すべての場合において、キナーゼがＡＴＰをＡＤＰに変換すると、ＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）試薬は残存ＡＴＰを枯渇させる。検出試薬は、産生されたＡＤＰをＡＴＰに再変換し、発光として検出され得るルシフェラーゼを生成する。したがって、発光シグナルは、酵素反応によって産生されるＡＤＰの量に正比例し、化合物処理後のこのシグナルの減少は阻害を実証する。以下に示されている式を使用して、各濃度の化合物によってもたらされる阻害率を計算した：
Figure 0007068172000094
次いで、化合物濃度に対して阻害率をプロットし、得られた濃度－応答曲線から相対５０％阻害濃度（ＲＩＣ５０）を決定した。これを決定したら、以下の式を使用してＫｉを計算した：
Figure 0007068172000095
細胞アッセイおよび他のインビトロアッセイ
ＰＤＧＦ－ＢＢは、正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）増殖を誘導した
２％ＦＢＳ（ｐｌｕｓ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ（商標）成長因子；Ｌｏｎｚａ）を補充したＦＧＭ－２成長培地中で、ＮＨＬＦ（Ｌｏｎｚａ ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ）を９０％コンフルエントまで増殖させる。線維芽細胞を採取し（トリプシン／ＥＤＴＡ）、２５×１０３個／ｍｌ成長培地で懸濁し、９６ウェル組織培養プレートの１ウェル当たり２００μｌ（細胞５×１０３個／ウェル）を追加する。２４時間のインキュベーション（３７Ｃ／５％ＣＯ２／９５％Ｏ２）後、培養培地中のＦＢＳ濃度を０．１％に減少させることによって、細胞を（２４時間）血清飢餓状態にする。細胞を試験化合物と共に１時間プレインキュベートし、次いで、ｒｈｕＰＤＧＦ－ＢＢ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で４８時間刺激する。ＢｒｄＵ取り込み（細胞増殖比色ＥＬＩＳＡ、Ｒｏｃｈｅ）によって、細胞増殖を評価する。各濃度の試験化合物によるｒｈｕＰＤＧＦ－ＢＢ誘導性ＮＨＬＦ増殖の阻害率を、ビヒクル対照（基本増殖）に対する比較によって、各試験化合物濃度でｒｈｕＰＤＧＦ－ＢＢによって達成されたものに対する割合として計算する。得られた濃度－応答曲線から、相対５０％阻害濃度（ＲＩＣ５０）を決定する。
ＰＤＧＦ－ＢＢ／塩基性ＦＧＦは、ＭＲＣ－５胎児ヒト肺線維芽細胞）増殖を誘導した
１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地中で、ＭＲＣ－５線維芽細胞（ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）を９０％コンフルエントまで増殖させる。細胞を採取し（トリプシン／ＥＤＴＡ）、２５×１０３個／ｍｌ成長培地で懸濁し、９６ウェル組織培養プレートの１ウェル当たり２００μｌ（細胞５×１０３個／ウェル）を追加する。２４時間のインキュベーション（３７Ｃ／５％ＣＯ２／９５％Ｏ２）後、培養培地を０．１％ＦＢＳ含有培地と交換することによって、細胞を（３時間）血清飢餓状態にする。次いで、細胞を試験化合物と共に１時間プレインキュベートし、続いて、ｒｈｕＰＤＧＦ－ＢＢ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）または塩基性ｒｈｕＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で４８時間刺激する。ＢｒｄＵ取り込み（細胞増殖比色ＥＬＩＳＡ、Ｒｏｃｈｅ）によって、細胞増殖を評価する。各濃度の試験化合物によるｒｈｕＰＤＧＦ－ＢＢ／ｒｈｕＦＧＦ誘導性ＭＲＣ－５増殖の阻害率を、ビヒクル対照（基本増殖）に対する比較によって、各試験化合物濃度でｒｈｕＰＤＧＦ－ＢＢ／塩基性ＦＧＦによって達成されたものに対する割合として計算する。得られた濃度－応答曲線から、相対５０％阻害濃度（ＲＩＣ５０）を決定する。
ＶＥＧＦ１６５／塩基性ＦＧＦは、内皮細胞増殖を誘導した
内皮細胞飢餓培地（０．５％ＦＢＳ。ＦＧＦおよびＶＥＧＦ成長因子を含まない）中で、ＴｅｌｏＨＡＥＣ（テロメラーゼ不死化ヒト大動脈内皮細胞；ＡＴＣＣ）を細胞４０００個／ウェルの細胞密度（１００μｌ）で９６ウェル組織培養プレートに播種し、３時間培養した（３７Ｃ／５％ＣＯ２／９５％Ｏ２）。細胞を試験化合物と共に１時間プレインキュベートし、続いて、ｒｈｕＶＥＧＦ１６５（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）または塩基性ｒｈｕＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で４８時間刺激する。ＢｒｄＵ取り込み（細胞増殖比色ＥＬＩＳＡ、Ｒｏｃｈｅ）によって、細胞増殖を評価する。各濃度の試験化合物によるｒｈｕＶＥＧＦ１６５／塩基性ｒｈｕＦＧＦ誘導性ＴｅｌｏＨＡＥＣ増殖の阻害率を、ビヒクル対照（基本増殖）に対する比較によって、各試験化合物濃度でｒｈｕＶＥＧＦ１６５／塩基性ＦＧＦによって達成されたものに対する割合として計算する。得られた濃度－応答曲線から、相対５０％阻害濃度（ＲＩＣ５０）を決定する。
ＰＤＧＦ－ＢＢは、線維芽細胞におけるＰＤＧＦＲβのリン酸化を誘導した
ＨＴＲＦ（均一時間分解蛍光）ホスホ－ＰＤＧＦＲβ（Ｔｙｒ７５１）細胞アッセイキット（Ｃｉｓｂｉｏ）を使用して、ＰＤＧＦＲβリン酸化に対する試験化合物の阻害効果を評価するために、ＭＲＣ－５／ＮＨＬＦ／ＮＩＨ－３Ｔ３（マウス胚線維芽細胞、ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）を使用した。それぞれＤＭＥＭ成長培地（１０％ＦＢＳ）またはＦＧＭ－２成長培地（２％ＦＢＳ）中で、ＭＲＣ－５／ＮＨＬＦを細胞１００００個／ウェルの細胞密度で９６ウェル組織培養プレートに播種し、４８時間培養した（３７Ｃ／５％ＣＯ２／９５％Ｏ２）。ＤＭＥＭ成長培地（１０％ＦＢＳ）中で、ＮＩＨ－３Ｔ３を細胞７０００個／ウェルの細胞密度で９６ウェル組織培養プレートに播種し、４８時間培養した（３７Ｃ／５％ＣＯ２／９５％Ｏ２）。細胞培地を各０．１％ＦＢＳ含有飢餓培地と交換し、プレートを、ＭＲＣ－５／ＮＨＬＦの場合には２４時間（３７Ｃ／５％ＣＯ２／９５％Ｏ２）およびＮＩＨ－３Ｔ３の場合には３時間さらにインキュベートした。細胞を試験化合物と共に１時間プレインキュベートし、次いで、ｒｈｕＰＤＧＦ－ＢＢ（２５～５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で５分間刺激し、ＮＩＨ－３Ｔ３の場合にはｒｍＰＤＧＦ－ＢＢ（２５ｎｇ／ｍｌ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で刺激した。培地を吸引除去し、ＨＴＲＦアッセイキットで提供されている５０μｌの溶解緩衝液を追加することによって、細胞を直ぐに溶解させた。各ウェルの１６μｌの細胞溶解物をホワイト低容量３８４ウェルプレートに移し、キットの説明書にしたがって適切なキット試薬をこれに追加した。６６５ｎｍおよび６２０ｎｍで読み取った蛍光の比を計算することによって、ＰＤＧＦＲβのリン酸化を定量した。試験化合物によるｒＰＤＧＦ－ＢＢ誘導性ＰＤＧＦＲβリン酸化の阻害率を、ビヒクル対照に対する比較によって、各試験化合物濃度でｒＰＤＧＦ－ＢＢによって達成されたものに対する割合として計算した。得られた濃度－応答曲線から、相対５０％阻害濃度（ＲＩＣ５０）を決定した。
ＶＥＧＦ１６５は、内皮細胞におけるＶＥＧＦＲ２のリン酸化を誘導した
ＨＴＲＦ（均一時間分解蛍光）ホスホ－ＶＥＧＦＲ２（Ｔｙｒ１１７５）細胞アッセイキット（Ｃｉｓｂｉｏ）を使用して、ＶＥＧＦＲ２リン酸化に対する試験化合物の阻害効果を評価するために、ＴｅｌｏＨＡＥＣ（テロメラーゼ不死化ヒト大動脈内皮細胞；ＡＴＣＣ）を使用した。内皮成長培地（ＡＴＣＣ；２％ＦＢＳ）中で、ＴｅｌｏＨＡＥＣを細胞１２０００個／ウェルの細胞密度で９６ウェル組織培養プレートに播種し、４８時間培養した（３７Ｃ／５％ＣＯ２／９５％Ｏ２）。細胞培地を（ＶＥＧＦおよびＦＧＦ成長因子を含まない）０．５％ＦＢＳ含有飢餓培地と交換し、プレートをさらに２４時間インキュベートした（３７Ｃ／５％ＣＯ２／９５％Ｏ２）。細胞を試験化合物と共に１時間プレインキュベートし、続いて、ｒｈｕＶＥＧＦ１６５（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で５分間刺激した。培地を吸引除去し、ＨＴＲＦアッセイキットで提供されている５０μｌの溶解緩衝液を追加することによって、細胞を直ぐに溶解させた。各ウェルの１６μｌの細胞溶解物をホワイト低容量３８４ウェルプレートに移し、キットの説明書にしたがって適切なキット試薬をこれに追加した。６６５ｎｍおよび６２０ｎｍで読み取った蛍光の比を計算することによって、ＶＥＧＦＲ２のリン酸化を定量した。試験化合物によるｒｈｕＶＥＧＦ１６５誘導性ＶＥＧＦＲ２リン酸化の阻害率を、ビヒクル対照に対する比較によって、各試験化合物濃度でｒｈｕＶＥＧＦ１６５によって達成されたものに対する割合として計算した。得られた濃度－応答曲線から、相対５０％阻害濃度（ＲＩＣ５０）を決定した。
線維芽細胞ゲル収縮アッセイ
２％ＦＢＳ（ｐｌｕｓ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ（商標）成長因子）を補充したＦＧＭ－２成長培地（Ｌｏｎｚａ）中で、ＮＨＬＦを９０％コンフルエントまで増殖させる。線維芽細胞を採取し（トリプシン／ＥＤＴＡ）、１×１０６個／ｍｌ無血清培地で懸濁する。細胞収縮アッセイキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）に基づいて、キット説明書にしたがって１部の細胞懸濁液＋４部のコラーゲンゲル溶液を混合することによって、細胞格子を調製する。０．９ｍｌアリコートのコラーゲン格子を１．５ｍｌ遠心チューブに追加し、最終アッセイ濃度の試験化合物で処理する。次いで、２５０μｌの化合物処理格子を４８ウェル組織培養プレートの各ウェルにピペッティングする（試験濃度当たり３回反復）。プレートを９０分間インキュベートして（３７Ｃ／５％ＣＯ２／９５％Ｏ２）、ゲルを重合させる。次いで、最終アッセイ濃度の試験化合物を含有する２５０μｌの無血清培地を対応する各ゲルに追加する。さらに３０分間インキュベートした後、ＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でゲルを刺激する。２４時間（３７Ｃ／５％ＣＯ２／９５％Ｏ２）のインキュベーション期間後、個々の各ゲルを取り出し、精密天秤で計量する。各濃度における試験化合物の効果を、ビヒクル処理基本収縮と比べたＴＧＦβ１誘導性収縮の逆転率として表す。
線維芽細胞ＩＬ－６放出アッセイ
２％ＦＢＳ（ｐｌｕｓ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ（商標）成長因子）を補充したＦＧＭ－２成長培地（Ｌｏｎｚａ）中で、ＮＨＬＦを９０％コンフルエントまで増殖させる。線維芽細胞を採取し（トリプシン／ＥＤＴＡ）、５０×１０３個／ｍｌ成長培地で懸濁し、９６ウェル組織培養プレートの１ウェル当たり２００μｌ（細胞１０×１０３個／ウェル）を追加する。２４時間のインキュベーション（３７Ｃ／５％ＣＯ２／９５％Ｏ２）後、培地のＦＢＳ濃度を０．１％に減少させることによって、細胞を（２４時間）血清飢餓状態にする。細胞を試験化合物と共に１時間プレインキュベートし、次いで、ＴＧＦβ１（５ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で２４時間刺激する。サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｄｕｏ－ｓｅｔ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）によるＩＬ－６濃度の決定のために、無細胞上清を回収する。ＩＬ－６産生の阻害を、ビヒクル対照に対する比較によって、各試験化合物濃度で５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１によって達成されたものに対する割合として計算する。得られた濃度－応答曲線から、相対５０％阻害濃度（ＲＩＣ５０）を決定する。
マスト細胞のアポトーシス
１００ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６を補充した成長培地中で、臍帯血ＣＤ３４＋細胞（Ｌｏｎｚａ）からマスト細胞を８週間分化させる。ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含有する成長培地中で、マスト細胞を細胞２５００～１００００個／ウェルで３８４ウェルホワイトクリアボトムプレートに播種する。アポトーシスの陽性対照として、ＳＣＦを含まない成長培地中で、８ウェルをインキュベートする。細胞を試験化合物またはビヒクルと共に２４時間インキュベートする（３７Ｃ／５％ＣＯ２／９５％Ｏ２）。カスパーゼ－３／７発光基質（Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ３／７アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞に追加し、室温で３０分間インキュベートした後、発光シグナルを読み取る。試験化合物によるアポトーシスの誘導を、ビヒクル（ベースラインアポトーシス）と比較して、各試験化合物濃度についてＳＣＦの非存在下でインキュベートした細胞によって達成されたもの（最大アポトーシス応答）に対する割合として計算する。得られた濃度－応答曲線から、相対５０％阻害濃度（ＲＩＣ５０）を決定する。
細胞生存率に対する試験化合物の効果
ＤＭＥＭ成長培地（１０％ＦＢＳ）中で、ＭＲＣ－５細胞を、細胞１２×１０３個／ウェルの細胞密度で（蛍光／発光読み取り用）ホワイトクリアボトムプレートまたはクリア（比色読み取り用）９６ウェル組織培養プレートに播種した。２４時間のインキュベーション（３７Ｃ／５％ＣＯ２／９５％Ｏ２）後、成長培地を０．１％ＦＢＳ＋試験化合物／ビヒクル含有培地と交換し、さらに４８時間インキュベートした。比色ＭＴＴアッセイ（細胞代謝活性の評価）のために、各ウェルの上清を吸引除去し、１００μｌ／ウェルの新鮮培地（０．１％ＦＢＳ）および１０μｌ／ウェルの５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴと交換した。１時間のインキュベーション（３７Ｃ／５％ＣＯ２／９５％Ｏ２）期間後、培地を吸引除去し、１００％ＤＭＳＯ（１００μｌ）を各ウェルに追加した。５５０ｎｍの吸光度を読み取る前に、プレートを軽く１５分間振盪した。ビヒクル（０．５％ＤＭＳＯ）処理細胞と比べた各化合物濃度について、（吸光度値の減少によって表される）細胞生存率の低下率を計算した。
Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と併せたＭｕｌｔｉＴｏｘ－Ｆｌｕｏｒ多重細胞毒性アッセイを使用して、細胞毒性／生存率およびアポトーシスを測定した。ＭｕｌｔｉＴｏｘ－Ｆｌｕｏｒ多重細胞毒性アッセイは、細胞集団における生細胞および死細胞の相対数を同時に測定する単一試薬追加蛍光アッセイである。前記アッセイは、細胞生存率および細胞傷害性のレシオメトリックな逆相関尺度を与える。生細胞と死細胞との比は細胞数とは無関係であるので、データを正規化するために使用することができる。「追加－混合－測定（ａｄｄ－ｍｉｘ－ｍｅａｓｕｒｅ）」形式による単一Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７試薬の追加は細胞溶解をもたらし、続いて、基質のカスパーゼ切断および「グロータイプ」発光シグナルの生成をもたらす。この多重細胞毒性アッセイのために、化合物で４８時間処理した細胞由来の１００μｌの細胞上清を各ウェルから慎重に取り除き、次いで、５０μｌのＭｕｌｔｉＴｏｘ試薬を追加した（キット説明書にしたがって、１０μｌのＧＦ－ＡＦＣおよびビスＡＡＦ－Ｒ１１０を１０ｍｌのアッセイ緩衝液に希釈することによって、専用ＭｕｌｔｉＴｏｘ試薬の使用溶液を調製した）。細胞を暗所で３０分間インキュベートした後、４００Ｅｘ／５０５Ｅｍ（生細胞の読み取り）および４８５Ｅｘ／５２０Ｅｍ（死細胞の読み取り）で２回の別個の蛍光読み取りを行った。次に、１００μｌの上清を各ウェルから慎重に取り除き、５０μｌのカスパーゼ３／７Ｇｌｏ試薬を細胞プレートに追加し、暗所で３０分間インキュベートした。発光シグナルを読み取ることによって、カスパーゼ３／７活性を定量した。ビヒクル処理対照細胞を超えるシグナルの増加により、細胞アポトーシスの増加が示された。
線維芽細胞－筋線維芽細胞移行アッセイ
試験化合物の抗線維化活性を評価するために、２つの代替プロトコールを使用した。第１のものでは、単離された肺線維芽細胞を細胞３０００個／ウェルで９６ウェルプレートに播種する。播種の５日後、細胞をリフレッシュし、試験化合物またはビヒクルを細胞に追加する。１時間後、ＴＧＦ－β１（１．２５ｎｇ／ｍＬ）を追加して、線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行を誘導する。７２時間後、免疫染色によってαＳＭＡ（筋線維芽細胞移行のマーカー）の発現を測定し、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるハイコンテントイメージングによって評価し、ＩＮ Ｃｅｌｌディベロッパーソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共に専用（ＢｉｏＦｏｃｕｓ）アルゴリズムを使用して定量する。アルゴリズムの出力は、染色強度に染色面積を掛けたもの（Ｄ×Ａレベル）を表す。潜在的毒性の尺度として細胞数を定量するために、および／または細胞密度の差異についてαＳＭＡを正規化するために、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）による細胞核の共染色を実施する。
代替プロトコールでは、単離された肺線維芽細胞を細胞５１００個／ウェルで９６ウェルプレートに播種する。２４時間後、飢餓培地で細胞をさらに２４時間リフレッシュする。試験化合物またはビヒクルを細胞に追加する。１時間後、ＴＧＦ－β１（０．１ｎｇ／ｍＬ）を追加して、線維芽細胞から筋線維芽細胞への転移を誘導する。４８時間後、免疫染色によってαＳＭＡ（筋細胞芽細胞移行のマーカー）の発現を測定し、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓ ｍｉｃｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によるハイコンテントイメージングによって評価し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して定量する。％陽性細胞を使用して、αＳＭＡ染色およびしたがって線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行の程度を評価する。潜在的毒性の尺度として細胞数を定量するために、および／または細胞密度の差異についてαＳＭＡを正規化するために、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）による細胞核の共染色を実施する。
ヒト胎児肺線維芽細胞におけるＰＤＧＦＲβのＰＤＧＦ－ＢＢ誘導性リン酸化に対する試験化合物の作用持続時間の評価
ＰＤＧＦ－ＢＢ誘導性ＰＤＧＦＲβリン酸化に対する薬物曝露の効果の相対的な持続性を決定するために、ＭＲＣ－５ヒト胎児肺線維芽細胞と、ＰＤＧＦＲβのＰＤＧＦ－ＢＢ誘導性リン酸化の受容体調節を検出する均一ＨＴＲＦ（均一時間分解蛍光）ホスホ－ＰＤＧＦＲβ（Ｔｙｒ７５１）細胞アッセイキット（Ｃｉｓｂｉｏ）とを利用して、ウォッシュアウト実験を使用する。
ウォッシュアウトプロトコール
最初に、トリプシンでＭＲＣ－５細胞を取り除き、完全培地（ＤＭＥＭ成長培地、１０％ＦＢＳ）で中和する。１．２×１０６個の細胞を微量遠心チューブに入れ、ベンチトップ遠心分離機を利用して１０，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、上清を取り除き、１ｍｌの予熱（３７℃）洗浄緩衝液（ＨＢＳＳ ｐＨ７．４、０．１％ＢＳＡおよび０．０４％プルロニック酸）で細胞を洗浄して、残存ＦＢＳを除去した。次いで、細胞を再び遠心分離し、上清を取り除き、３７℃で穏やかに振盪しながら５００μＬのビヒクル、試験対照化合物および試験化合物（７０％阻害を与える濃度）と共に１時間インキュベートする。インキュベーションの後、細胞を均一に分散させ、非ウォッシュ対照のために各チューブから１００μＬアリコートを取り除く。次いで、残った細胞を５回の反復洗浄工程に供し、細胞を遠心分離し、上清を取り除き、１ｍｌの新たな予熱（３７℃）洗浄緩衝液に再懸濁する。プラスチックへの付着により化合物が持ち越されることの影響を回避するために、各洗浄工程後に細胞を新たなチューブに移し、３７℃シェーカー（９００ｒｐｍ）に入れて洗浄の間に１０分間インキュベートして、細胞と緩衝液との間で再平衡化させる。最後の洗浄工程の後、細胞を３６０μｌの予熱洗浄緩衝液に再懸濁する。非洗浄チューブおよび洗浄チューブの両方からの５μＬを３８４ホワイトポリプロピレンマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に入れ、３７℃で１５分間インキュベートする。次いで、５μＬのｒｈｕＰＤＧＦ－ＢＢ（３ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で細胞を５分間刺激し、その後、ＨＴＲＦアッセイキットで提供されている１０μｌの溶解緩衝液を追加することによって、細胞を直ぐに溶解させる。細胞をプレートシェーカー（ｒｐｍ１４５０）上に１時間置き、その後、プレートを簡単に３０秒間（３０００ｒｐｍ）遠心分離し、キット説明書にしたがって専用ＨＴＲＦキット試薬を追加する。６６５ｎｍおよび６２０ｎｍで読み取った蛍光の比を計算することによって、ＰＤＧＦＲβのリン酸化を定量する。試験化合物によるｒｈｕＰＤＧＦ－ＢＢ誘導性ＰＤＧＦＲβリン酸化の阻害率を、試験ビヒクル対照に対する３μｇ／ｍｌ ｒｈｕＰＤＧＦ－ＢＢで達成されたものに対する割合として計算する。表７は、対照の最大リン酸化と比べたウォッシュアウト後のリン酸化率としてデータを示す（これは、１００－上記阻害率値である）。
ＰＡＭＰＡ透過性アッセイ
このアッセイは、人工膜を通過する透過性を測定し、並行人工膜透過性アッセイを使用してＣｙｐｒｏｔｅｘによって実施された。それは、人工ヘキサデカン膜を介した受動的細胞間透過性のインビトロモデルである（Ｗｏｈｎｓｌａｎｄ Ｆら、Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００１ ４４；９２３－９３０）。化合物は、低透過性および高透過性に分類され得る。一般に、Ｐａｐｐ＜１０×１０－６ｃｍ／ｓの化合物は低透過性として分類され、Ｐａｐｐ＞１０×１０－６ｃｍ／ｓの化合物は高透過性として分類される。低透過性を有する化合物は、吸収がより遅いために、長い肺内滞留時間を有する可能性が高いと考えられている（Ｔｒｏｎｄｅ Ａｎｎら、Ｊ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，２００３，９２（６），１２１６－３３）。
プロトコールの概要
試験化合物をフィルタコーティング人工ＰＡＭＰＡ膜のドナー側に追加し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して細胞膜のアクセプター側における試験化合物の出現をモニタリングすることによって、透過性を測定する。
実験手順
ヘキサデカンのヘキサン溶液を調製し（５％ｖ／ｖ）、アリコートをフィルタ（ドナー）プレート（透過性用マルチスクリーンフィルタプレート、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の各ウェルの膜に追加した。次いで、ドナープレートを乾燥させて、ヘキサンを確実に蒸発させた。
ＤＭＳＯ（５％）を含有する緩衝液（ｐＨ７）をアクセプタープレートの各ウェルに追加した。緩衝液で１０ｍＭ ＤＭＳＯ濃縮物を希釈して最終試験化合物濃度を１０μＭ（最終ＤＭＳＯ濃度５％）とすることによって、試験化合物溶液を調製した。蛍光完全性マーカーのルシファーイエローも試験化合物溶液に含めた。ドナープレートをアクセプタープレートに挿入し、次いで、プレートを室温で５時間インキュベートした。試験化合物溶液から分析標準を調製した。試験化合物の透過性を４回反復で評価した。各プレート上では、透過性特性が公知の化合物を対照としてランした。
インキュベーション期間の終了時に、アクセプタープレートからドナープレートを取り除いた。サンプルの適切な希釈による５点較正を使用してＬＣ－ＭＳ／ＭＳカセット分析によって、試験化合物および対照化合物のドナーサンプルおよびアクセプターサンプルを定量した。ドナーおよびアクセプター区画濃度の両方から、実験的回収率を計算した。
１つ、２つまたは３つの個々の試験化合物ウェルについて、ルシファーイエローの透過がＱＣ限界を超えた場合、ｎ＝３、２または１の結果を報告した。
データ分析
以下の式から、各化合物の見掛けの透過係数（Ｐａｐｐ）を計算した：
Figure 0007068172000096
 （式中、
Figure 0007068172000097
 （式中、ＶＤおよびＶＡは、それぞれドナー区画およびアクセプター区画の体積であり、面積は、膜の表面積に空隙率を掛けたものであり、平衡薬物濃度は、ドナー区画およびアクセプター区画の総体積における試験化合物の濃度である））。
インビボスクリーニング：薬理動態および薬物動態
マウスにおけるブレオマイシン誘導性線維症（肺線維症のマウスモデル）
０日目に、ビヒクルまたは硫酸ブレオマイシン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、２Ｕ／ｋｇ）のいずれかを気管内経路によってＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスに投与する。５日目から２０日目まで、化合物を（水溶液または懸濁液、２５～５０μｌとして）１日１回鼻腔内投与する。さらに２４時間後、動物を麻酔し、それらの気管にカニューレを挿入し、コンピュータ制御ピストンベンチレーター（ｆｌｅｘｉＶｅｎｔ，ＳＣＩＲＥＱ Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）を使用して動物に機械的に酸素供給する。肺機能測定後、マウスを放血させ、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を抽出する。Ｎｅｕｂａｕｒ血球計算器を使用して、ＢＡＬＦサンプル中の総白血球数および白血球百分率を測定する。遠心分離によってＢＡＬＦサンプルのサイトスピンスミアを調製し、ＤｉｆｆＱｕｉｋ染色システム（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）を使用して染色する。油浸顕微鏡法を使用して、細胞を計数する。サイトカイン分析のために、残りのＢＡＬＦ上清を保存する。
２５ｃｍ Ｈ２Ｏ圧下、気管カニューレを通して１０％中性緩衝ホルマリンで全肺を膨張させ、ホルマリンに少なくとも２４時間浸漬する。パラフィンブロックに加工した後、肺を切片化し（５μｍ）、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）またはピクロ－シリウスレッド（ＰＳＲ）のいずれかで染色する。４つの横断切片から一定数の画像をランダムに採用する。肺における線維性変化を評価するために、２人の盲検の研究者が画像を０（ＰＦなし）～８（最大ＰＦ）にスコア化する。加えて、標準的な方法を使用して、α－平滑筋アクチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）の染色を行う。Ｓｉｒｃｏｌコラーゲンアッセイ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ Ｌｔｄ，Ｃａｒｒｉｃｋｆｅｒｇｕｓ，ＵＫ）を使用して、全肺ホモジネート中の可溶性コラーゲンを評価する。
マウスにおけるＰＤＧＦＢＢ誘導性ＰＤＧＦＲβリン酸化
１２時間の明／暗周期下で、７～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を飼育し、食物および水を不断給餌する。化合物の水溶液または懸濁液を調製して、群のマウスの平均重量に基づいて指示用量（ｍｇ／ｋｇ）を送達する。動物を麻酔し、化合物またはビヒクルを鼻腔内投与する（５０μｌ）。指示時点における回復後、動物を再び麻酔し、組換えマウスＰＤＧＦ－ＢＢ（５０μｇ／動物、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはビヒクルを気管内投与し、次いで、ＰＤＧＦ－ＢＢ注入の５～３０分後に終末部血液サンプルを採取し、全肺を切除する。遠心分離によって、血液から血漿を単離する。Ｍａｔｒｉｘ Ｄ溶解チューブ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）中、ＦａｓｔＰｒｅｐ－２４ ５Ｇ機器を使用して、左葉の約半分をホモジナイズする。抗ホスホ－ＰＤＧＦＲα（Ｙ８４９）／β（Ｙ８５７）、抗全ＰＤＧＦＲβ／αおよび抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用してウエスタンブロットによって、ＰＤＧＦＲβのリン酸化レベルを測定する。ＰＤＧＦＲβのリン酸化レベルを、全ＰＤＧＦＲβレベルまたはＧＡＰＤＨに対する比として報告する。ビヒクル処置と比べて、各処置について、ＰＤＧＦＲβのリン酸化の阻害率を計算する。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって、血漿または肺ホモジネート中の化合物レベルの測定を決定する。
齧歯類における薬物動態測定
雄性ＣＤラットまたはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを薬物動態研究に使用し、動物に気管内投与、経口投与または静脈内投与（ラットの場合）および鼻腔内投与、経口投与または静脈内投与（マウスの場合）した。
外側尾静脈を介して動物に静脈内投与した。気管内経路または鼻腔内経路を介して投与した動物を麻酔した後、イソフルランおよびラット研究では亜酸化窒素またはマウス研究では酸素を使用して投与した。
動物の外側尾静脈にカニューレを挿入し、各サンプリング時点前にホットボックス（３７～４０℃）内に約５分間入れて、尾静脈を拡張した。静脈内投与の場合には溶液として、およびすべての他の方法の場合には溶液または懸濁液として化合物を製剤化した。投与日に動物を計量し、個体の体重に応じて調整した容量で製剤の単回投与を行った（表３）。連続サンプルのために、所定の時点において、１５０～２００μｌのラット血液サンプルまたは２０μｌのマウス血液サンプル（同じ容量の水を追加）をカニューレポートからＫ２ＥＤＴＡコーティングマイクロテナーに２４時間採取した。ラット研究においてのみ、遠心分離（８２００ｒｃｆで５分間）によって、血漿を単離した。
終了時に、下行大静脈からＫ２ＥＤＴＡコーティングマイクロテナーに血液サンプルを収集し、気管を介して３×４ｍｌの４％ＢＳＡ ＰＢＳ溶液注入（ラットの場合）および３×０．４ｍｌの４％ＢＳＡ ＰＢＳ溶液注入（マウスの場合）で肺をフラッシュすることによって、ＢＡＬ液を得た。肺を切除し、計量し、重量を記録し、液体窒素中で急速凍結した。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって、血漿または血液、肺ホモジネートおよびＢＡＬ液中の化合物レベルの測定を決定した。適切な内部標準を含有する過剰な溶媒を使用してタンパク質沈殿によって、薬物を抽出した。外部マトリックス適合標準曲線に対して、薬物濃度を決定した。
半対数プロットで時間に対して薬物濃度をプロットした（図１、２および３を参照のこと）。非コンパートメント分析を使用して、標準薬物動態パラメータを計算した。各時点における肺およびＢＡＬ液中の濃度を、投与用量の割合として表した。
Figure 0007068172000098
結果
酵素阻害アッセイならびに細胞アッセイおよび他のインビトロアッセイにおける試験の結果は、以下の表４～１０および図１～４に示されている。
Figure 0007068172000099
Figure 0007068172000100
Figure 0007068172000101
Figure 0007068172000102
Figure 0007068172000103
Figure 0007068172000104
Figure 0007068172000105
Figure 0007068172000106
Figure 0007068172000107
Figure 0007068172000108
Figure 0007068172000109
より低い値は、ＰＤＧＦＲβのリン酸化のより高い阻害率を示すので、表７のデータは、このアッセイでは、実施例化合物４および６が、ＰＤＧＦＲβの阻害剤として、ニンテダニブよりも長い作用持続時間を有することを明らかにしている。
Figure 0007068172000110
Figure 0007068172000111
Figure 0007068172000112
Figure 0007068172000113
Figure 0007068172000114
Figure 0007068172000115
Figure 0007068172000116
Figure 0007068172000117
結果の概要
本明細書に開示される本発明の化合物は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２に対する阻害活性（表４および表５）ならびにナノモル効力を示す。試験化合物の大部分は、細胞生存率アッセイにおいて有害効果を示さない（表６）。さらに、前記化合物は、一般に、膜を通過する透過性が低い（表８および図１）。ヒト胎児肺線維芽細胞のＰＤＧＦ－ＢＢ誘導性リン酸化の阻害に関して決定されたように、特定の化合物は、ニンテダニブと比べて増加した作用持続時間の証拠を示した（表７を参照のこと）。薬物動態学測定は、一般に、本発明の化合物が、用量を被験体に投与した局所送達の２４時間後において、肺内に残存する相対含有量がニンテダニブよりも高いことが見出されたことを示している（表９および１０および図２～４）。２４時間にわたる量の減少と共に認められた低いＢＡＬレベルは、急速な溶解および肺組織への吸収が本発明の化合物で起こっていることを示している。
このプロファイルは、本発明の化合物が、医薬品、とりわけ、線維性疾患または間質性肺疾患、例えばＩＰＦ、または特に肺に局所送達される場合には呼吸器障害の処置のための医薬品として適切であると予想されることを示している。
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本明細書および以下の特許請求の範囲を通じて、特に文脈上必要がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語および変化形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載されている整数、工程、整数群または工程群を含むが、いかなる他の整数、工程、整数群または工程群も排除しないことを意味すると理解される。
本明細書で参照されているすべての特許および特許出願は、その全体が参照により組み込まれる。

Claims (17)

  1. 式（Ｉ）の化合物：
    Figure 0007068172000118
     （式中、
    Ｒ１は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、ＣＨ＝ＣＨ２、Ｃ≡Ｃ－ＨまたはＣ≡Ｃ－Ｍｅを表し；
    Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、－ＣＨ２－（Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル）、ハロゲンまたはシアノを表し；
    Ｒ３は、式（ｉ）
    Figure 0007068172000119
     または式（ｉｉ）
    Figure 0007068172000120
     または式（ｉｉｉ）
    Figure 0007068172000121
     を表し；
    Ｑは、Ｏ、ＮおよびＳから選択されるヘテロ原子を表し、Ｎの場合には、Ｃ１－４アルキルで場合により置換されていてもよく；
    Ｚは、ＣＯまたはＳＯ２を表し；
    Ｙ１は、（ＣＨ２）ｎを表し、ｎが０を表す場合を除いて、Ｍｅで場合により置換されていてもよく；
    Ｘ１は、（ＣＨ２）ｍを表し、ｍが０を表す場合を除いて、Ｍｅで場合により置換されていてもよく；
    ｎおよびｍは独立して、０、１、２、３、４または５を表し；
    Ｙ２は、（ＣＨ２）ｓを表し、Ｍｅで場合により置換されていてもよく；
    ｓは、２、３、４、５または６を表し；
    Ｙ３は、（ＣＨ２）ｔを表し、Ｍｅで場合により置換されていてもよく；
    Ｘ２は、（ＣＨ２）ｖを表し、Ｍｅで場合により置換されていてもよく；
    ｔおよびｖは独立して、２または３を表していて、ｔ＋ｖ＝４または５であり；
    Ｒ４は、Ｈ、ＯＨ、ＮＲ６Ｒ７、またはＯ、ＮおよびＳから選択される１個もしくはそれを超えるヘテロ原子を含有する脂肪族４～８員複素環を表していて、Ｒ４がＯＨまたはＮＲ６Ｒ７であるときｍは２、３、４または５であり；
    Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＮＲ８Ｒ９、またはＯ、ＮおよびＳから選択される１個もしくはそれを超えるヘテロ原子を含有する脂肪族４～８員複素環を表していて、Ｒ５がＯＨまたはＮＲ８Ｒ９であるときｎは２、３、４または５であり；
    ここで、Ｒ４およびＲ５が表し得る前記脂肪族４～８員複素環基は、カルボニルまたはスルホン基を場合により含有していてもよく、－Ｃ１－Ｃ４アルキル、Ｃ１－Ｃ４ヒドロキシアルキル－、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル－、－Ｃ１－Ｃ４アルキレンＣＯＮＲ１０Ｒ１１、ＣＮ、ＯＨおよびＮＲ１２Ｒ１３から選択される１つまたはそれを超える基で場合により置換されていてもよく；
    Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は独立して、Ｈを表すか、またはＯＨ、オキソ、ＮＲ１４Ｒ１５もしくは－Ｃ１－Ｃ４アルコキシで場合により置換されているＣ１－Ｃ４アルキルを表し；ならびに
    Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ４アルキルを表す）
    またはその薬学的に許容され得る塩。
  2. １つまたはそれを超える薬学的に許容され得る希釈剤または担体と組み合わせて、請求項１に記載の化合物を含む、医薬組成物。
  3. ＩＰＦ、巨細胞間質性肺炎、サルコイドーシス、嚢胞性線維症、呼吸窮迫症候群、薬物誘導性肺線維症、肉芽腫症、珪肺症、石綿症および全身性強皮症から選択される線維性疾患もしくは間質性肺疾患；Ｃ型肝炎誘導性肝硬変から選択されるウイルス誘導性肝硬変；もしくは、強皮症、サルコイドーシスおよび全身性エリテマトーデスから選択される線維性成分を有する皮膚の疾患の処置のための、または
    がんおよび肺がんから選択される細胞の過剰増殖を特徴とする疾患の処置のための、または
    ＣＯＰＤ、慢性気管支炎、気腫、喘息、小児喘息、アレルギー性鼻炎、鼻炎および副鼻腔炎から選択される呼吸器障害の処置のための
    医薬を製造するための、請求項１に記載の化合物の使用。
  4. 関節リウマチに関連する肺線維症、呼吸窮迫症候群、急性呼吸窮迫症候群、急性肺傷害、放射線誘導性肺線維症または肺炎、慢性過敏性肺炎、全身性硬化症、シェーグレン症候群、間質性肺疾患および肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）から選択される線維性疾患、；または
    肥厚性瘢痕およびケロイドから選択される線維性成分を有する皮膚の疾患；または
    緑内障、加齢性黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫、ドライアイ疾患および糖尿病性網膜症から選択される線維症が構成要素である眼疾患；または
    炎症性腸疾患に場合により関連する腸の線維症
    の処置のための医薬を製造するための、請求項１に記載の化合物の使用。
  5. ＩＰＦ、巨細胞間質性肺炎、サルコイドーシス、嚢胞性線維症、呼吸窮迫症候群、薬物誘導性肺線維症、肉芽腫症、珪肺症、石綿症および全身性強皮症から選択される線維性疾患もしくは間質性肺疾患；Ｃ型肝炎誘導性肝硬変から選択されるウイルス誘導性肝硬変；もしくは、強皮症、サルコイドーシスおよび全身性エリテマトーデスから選択される線維性成分を有する皮膚の疾患を処置するための組成物；または
    がんおよび肺がんから選択される細胞の過剰増殖を特徴とする疾患を処置するための組成物；または
    ＣＯＰＤ、慢性気管支炎、気腫、喘息、小児喘息、アレルギー性鼻炎、鼻炎および副鼻腔炎から選択される呼吸器障害を処置するための組成物であって、
    請求項１に記載の化合物または請求項２に記載の医薬組成物を含む、前記組成物。
  6. 関節リウマチに関連する肺線維症、呼吸窮迫症候群（急性呼吸窮迫症候群を含む）、急性肺傷害、放射線誘導性肺線維症または肺炎、慢性過敏性肺炎、全身性硬化症、シェーグレン症候群、間質性肺疾患および肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）から選択される線維性疾患；または
    肥厚性瘢痕およびケロイドから選択される線維性成分を有する皮膚の疾患；または
    緑内障、加齢性黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫、ドライアイ疾患および糖尿病性網膜症から選択される線維症が構成要素である眼疾患；または
    炎症性腸疾患に場合により関連する腸の線維症
    を処置するための組成物であって、請求項１に記載の化合物または請求項２に記載の医薬組成物を含む、前記組成物。
  7. 式（ＩＩ）の化合物：
    Figure 0007068172000122
     （式中、
    Ｒ１は、Ｍｅ、Ｅｔ、ＣＨ＝ＣＨ２、Ｃ≡Ｃ－ＨまたはＣ≡Ｃ－Ｍｅを表し；および
    Ｌは、－ＯＣ１－Ｃ４アルキルを表す）
    またはその塩。
  8. 式（ＶＩ）の化合物：
    Figure 0007068172000123
     （式中、
    Ｒ１は、Ｅｔ、ＣＨ＝ＣＨ２、Ｃ≡Ｃ－ＨまたはＣ≡Ｃ－Ｍｅを表す）
    またはその塩。
  9. 式（ＶＩＩ）の化合物：
    Figure 0007068172000124
     （式中、
    Ｒ１は、Ｍｅ、Ｅｔ、ＣＨ＝ＣＨ２、Ｃ≡Ｃ－ＨまたはＣ≡Ｃ－Ｍｅを表す）
    またはその塩。
  10. 式（ＩＸ）の化合物：
    Figure 0007068172000125
     （式中、
    Ｒ１は、Ｍｅ、Ｅｔ、ＣＨ＝ＣＨ２、Ｃ≡Ｃ－ＨまたはＣ≡Ｃ－Ｍｅを表し；および
    Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、－ＣＨ２－（Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル）、ハロゲンまたはシアノを表す）
    またはその塩。
  11. 式（ＸＩ）の化合物：
    Figure 0007068172000126
     （式中、
    Ｒ１は、Ｍｅ、Ｅｔ、ＣＨ＝ＣＨ２、Ｃ≡Ｃ－ＨまたはＣ≡Ｃ－Ｍｅを表し；および
    Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、－ＣＨ２－（Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル）、ハロゲンまたはシアノを表す）
    またはその塩。
  12. 式（ＸＩＩＩ）の化合物：
    Figure 0007068172000127
     （式中、
    Ｒ１は、Ｍｅ、Ｅｔ、ＣＨ＝ＣＨ２、Ｃ≡Ｃ－ＨまたはＣ≡Ｃ－Ｍｅを表し；および
    Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、－ＣＨ２－（Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル）、ハロゲンまたはシアノを表す）
    またはその塩。
  13. 式（ＸＶＩ）の化合物：
    Figure 0007068172000128
     （式中、
    Ｚは、ＣＯまたはＳＯ２を表し；および
    Ｒ１は、Ｍｅ、Ｅｔ、ＣＨ＝ＣＨ２、Ｃ≡Ｃ－ＨまたはＣ≡Ｃ－Ｍｅを表し；および
    Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、－ＣＨ２－（Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル）、ハロゲンまたはシアノを表す）
    またはその塩。
  14. 式（ＸＶＩＩ）の化合物：
    Figure 0007068172000129
     （式中、
    Ｚは、ＣＯまたはＳＯ２を表し；および
    Ｒ１は、Ｍｅ、Ｅｔ、ＣＨ＝ＣＨ２、Ｃ≡Ｃ－ＨまたはＣ≡Ｃ－Ｍｅを表し；および
    Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、－ＣＨ２－（Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル）、ハロゲンまたはシアノを表す）
    またはその塩。
  15. 請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容され得る塩を調製するためのプロセスであって、式（ＩＩ）の化合物：
    Figure 0007068172000130
     （式中、
    Ｒ１は、請求項１で定義されるとおりであり；および
    Ｌは、－ＯＣ１－Ｃ４アルキルを表す）
    またはその塩を、式（ＩＩＩ）の化合物：
    Figure 0007068172000131
     （式中、
    Ｒ２、Ｒ３およびＺは、請求項１で定義されるとおりである）
    またはその塩と反応させることを含む、前記プロセス。
  16. 請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容され得る塩（式（Ｉ）中、Ｚは、ＣＯであり、Ｒ３は、式（ｉ）である）を調製するためのプロセスであって、式（ＩＸ）の化合物：
    Figure 0007068172000132
     （式中、
    Ｒ１およびＲ２は、請求項１で定義されるとおりである）
    またはその塩を、式（Ｘ）の化合物：
    Figure 0007068172000133
     （式中、
    Ｒ’は、請求項１で定義されるＹ１－Ｒ５を表し、
    Ｒ’’は、請求項１で定義されるＸ１－Ｒ４を表す）
    またはその塩と反応させることを含む、前記プロセス。
  17. 請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容され得る塩（式（Ｉ）中、Ｒ３は、式（ｉ）であり、Ｘ１－Ｒ４は、Ｍｅである）を調製するためのプロセスであって、式（ＸＶＩ）の化合物：
    Figure 0007068172000134
     （式中、
    Ｚ、Ｒ１およびＲ２は、請求項１で定義されるとおりである）
    またはその塩を；式（ＸＩＶ）の化合物：
    Figure 0007068172000135
     （式中、
    Ｒ８およびＲ９は、請求項１で定義されるとおりであるか、または
    ＮＲ８Ｒ９は、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１個もしくはそれを超えるヘテロ原子を含有する脂肪族４～８員複素環を表す）
    またはその塩と反応させることを含む、前記プロセス。
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