CN109302846A - 吲哚啉酮化合物及其在纤维化疾病治疗中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明尤其涉及式(I)的化合物，其中R1、R2、R3和Z如说明书中所定义，并且还涉及包含所述化合物的组合物，以及所述化合物和包含所述化合物的组合物在治疗中，例如在纤维化疾病或间质性肺病、特别是特发性肺纤维化的治疗中的用途。

Description

吲哚啉酮化合物及其在纤维化疾病治疗中的用途
技术领域
本发明尤其涉及抑制蛋白激酶的新化合物及其在疗法中的用途，特别是用于治疗纤维化疾病或间质性肺病、特别是特发性肺纤维化和呼吸疾病。本发明还扩展到包含所述化合物的药物组合物。
背景技术
间质性肺病(ILD)以肺的瘢痕形成为特征，所述瘢痕形成引起肺功能障碍，其最终可引起呼吸衰竭。存在许多病因未知的ILD，它们被称为特发性的。特发性肺纤维化(IPF)是最常见的ILD类型。IPF在欧洲影响约170,000人并在美国影响130,000人，其中仅在美国每年就诊断出大约48,000例新病例，并且在美国每年造成40,000人死亡。IPF的死亡率非常高，中位存活期为从诊断起3-5年，报道的5年存活率低于30％，与最致命的癌症相当。直到最近，除了肺移植之外几乎没有治疗选项显示出有效，并且对于大多数患者来说，治疗仅仅是症状控制和姑息治疗。
IPF是一种慢性且致命的疾病，其主要特征是由导致日益严重的呼吸困难的肺组织疤痕形成引起的肺功能的渐进性下降。血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)是成纤维细胞的已知强力有丝分裂原，所述成纤维细胞随后在纤维化发生时代替肺中的正常组织。在ILD中，已在临床上演示了PDGF、VEGF和FGF的致病作用的证据。受影响的主要位点是间质，即肺中肺泡之间的组织，但是它也影响含气区、外周气道和血管。所述疾病过程据信由肺中肺泡上皮的一系列微损伤引发。在损伤后，血管通透性的增加导致血块形成，并且常驻的上皮细胞增殖以试图代替那些作为损伤的结果而死亡的细胞。这个过程触发各种不同生长因子(例如PDGF、VEGF、FGF和转化生长因子β(TGFβ))的释放，引起上皮细胞的异常活化、异常的血管重塑以及尤其是成纤维细胞的增殖和向肺中的迁移。生长因子也诱导常驻细胞转变成成肌纤维细胞，其与成纤维细胞一起组织成病灶(King TE Jr等，Lancet,2011,3；378(9807):1949-61；Selman M等，Ann InternMed.,2001,16；134(2):136-51)。这些细胞变化引起基底膜的破坏和细胞外基质蛋白在间隙空间中的过量积累。结果是肺泡毛细血管单元的正常体系结构的最终破坏和肺瘢痕形成。定义IPF的纤维化特征的常见间质模式(UIP)的病理学是正常肺、间质炎症、致密纤维化、成纤维细胞病灶和蜂窝状结构的交替区域的非均质模式，特别是在肺的胸膜下区域中(Du Bois RM.,Nat Rev Drug Discov.,2010,9(2):129-40；Selman M等，Ann InternMed.,2001,16；134(2):136-51；King TE Jr等，Lancet,2011,3；378(9807):1949-61)。正常体系结构的丧失和间隙空间的瘢痕形成导致气体交换能力的显著下降，引起所述疾病的典型症状即呼吸困难、长期咳嗽、听诊时的吸气性爆裂音和异常肺活量的发生(CastriottaRJ等，Chest,2010,138(3):693-703)。尽管疾病进程不均一，但中位存活期为约3-5年，并且最常见的死因是由破坏正常肺功能和气体交换的渐进性病理造成的呼吸衰竭。
为了在肺障碍的治疗中实现更好的耐受性和更好的功效，将药物直接递送到肺中的作用位点，可能是有利的。这能够使药物在作用位点处达到更高浓度，导致总剂量降低并因此降低了全身性副作用。
2014年，一种蛋白激酶抑制剂尼达尼布被FDA批准用于通过口服给药治疗IPF。然而，它伴有显著的全身性不利事件，包括腹痛、呕吐和腹泻。WO2006/067165教导了VEGFR、FGFR和PDGFR的抑制剂例如尼达尼布预期可能在纤维化疾病例如IPF的治疗中有用。Fehrenbach.H.等，Virchows Arch.,1999,435(1):20-31公开了VEGFR与肺纤维化的病因相关。Lindroos.P.,Am J Physio Lung Cell Mol Physiol.,2001,280:L354-L362教导了PDGF受体的上调是肺纤维化期间成肌纤维细胞增生的机制。WO01/27081显示，对包括VEGFR、PDGFR和FGFR在内的激酶具有抑制效应的化合物适用于治疗纤维化疾病，并公开了一系列6-位取代的吲哚啉酮化合物。同样，WO2006/067165和WO2006/067168也公开了6-位取代的吲哚啉酮化合物，其用作治疗或预防纤维化疾病的药物。
在本领域中，对开发用于治疗纤维化疾病和间质性肺病例如IPF的其他化合物，特别是比尼达尼布耐受更好的化合物，仍存在需求。理想情况下，这些化合物具有低剂量，适合于每日一次、两次或三次给药的长的作用持续时间，以及当局部递送到肺时良好的功效和耐受性。本文中描述的式(I)的化合物致力于解决这一问题。
发明内容
根据本发明，提供了一种式(I)的化合物或其可药用盐(在后文中称为“本发明的化合物”)：
其中
R1表示H、Me、Et、CH＝CH2、C≡C-H或C≡C-Me；
R2表示H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、-CH2-(C3-C8环烷基)、卤素或氰基；
R3表示(i)
或(ii)
或(iii)
Q表示选自O、N和S的杂原子，并且其中N可以任选地被C1-4烷基取代；
Z表示CO或SO2；
Y1表示(CH2)n，并且除了当n表示0时之外，Y1可以任选地被Me取代；
X1表示(CH2)m，并且除了当m表示0时之外，X1可以任选地被Me取代；
n和m独立地表示0、1、2、3、4或5；
Y2表示(CH2)s，并且可以任选地被Me取代；
s表示2、3、4、5或6；
Y3表示(CH2)t，并且可以任选地被Me取代；
X2表示(CH2)v，并且可以任选地被Me取代；
t和v独立地表示2或3，只不过t+v＝4或5；
R4表示H、OH、NR6R7或含有选自O、N和S的一个或多个杂原子的脂族4-8元杂环，只不过当R4是OH或NR6R7时，m是2、3、4或5；
R5表示H、OH、NR8R9或含有选自O、N和S的一个或多个杂原子的脂族4-8元杂环，只不过当R5是OH或NR8R9时，n是2、3、4或5；
其中R4和R5可以表示的脂族杂环基团可以任选地含有羰基或砜基，并且可以任选地被选自-C1-C4烷基、C1-C4羟基烷基-、C1-C4烷氧基(C1-C4)烷基-、-C1-C4亚烷基CONR10R11、CN、OH和NR12R13的一个或多个基团取代；
R6、R7、R8、R9独立地表示H或任选地被OH、氧代、NR14R15或-C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基；并且
R10、R11、R12、R13、R14和R15独立地表示H或C1-C4烷基。
附图说明
图1：示出了本发明的代表性实施例和尼达尼布的人造膜渗透性(参见PAMPA渗透性测定的结果和表8：在重复实验的情况下将平均值用于化合物)。
图2：示出了在大鼠中，在本发明的实施例或尼达尼布的静脉内和气管内给药后的总肺暴露量(参见啮齿动物中的药代动力学测量的结果)。
图3：示出了在大鼠中，在本发明的实施例或尼达尼布的静脉内和气管内给药后的总肺暴露量(参见啮齿动物中的药代动力学测量的结果)。
图4：示出了在大鼠中，在本发明的实施例或尼达尼布的静脉内和鼻内给药后的总肺暴露量(参见啮齿动物中的药代动力学测量的结果)。
具体实施方式
烷基可以是支链或直链。C1-8烷基可以例如表示C1-6烷基、C1-4烷基或C1-3烷基。示例性的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基和CH2CHMe2。在一个实施方式中，烷基是指直链烷基。亚烷基应该以与烷基相同的方式解释，区别在于它是二价基团。
当在本文中使用时，烷氧基是指-O烷基，并包括直链或支链烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基。
羟基烷基是指在任何位置中具有羟基取代基的烷基。实例包括羟基甲基、2-羟基乙基、3-羟基-正丙基和4-羟基-正丁基。
卤素可以适合地是Br、Cl或F，特别是Cl或F，特别是F。
含有选自O、S和N的一个或多个杂原子的脂族4-8元杂环的实例包括氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、吗啉、二氧杂环己烷、四氢呋喃和硫代吗啉。适合地，所述杂环包括1或2个、特别是1个杂原子。这些环可以含有羰基或砜基，实例包括吡咯烷酮或哌啶酮。
C3-C8环烷基是指通常含有3至8个环成员，具有任选的支链并含有总共3至8个碳原子的脂族碳环。实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、甲基环己基、环庚基和环辛基。
脂族4-8元杂环可以任选被取代。在一个实施方式中，所述环不被取代。在另一个实施方式中，所述环带有一个取代基。取代基可以在碳或氮原子上。取代的杂环的实例包括N-甲基-哌嗪、N-甲基-哌啶、N-乙基-哌嗪、3-(N,N-二甲基胺)-吡咯烷、N-(CH2CH2OH)-哌嗪、4-羟基-哌啶、4-氰基-哌啶、2,6-二甲基-哌啶、N-甲氧基乙基-哌嗪、3-(N,N-二甲基胺)-哌啶和4-甲氧基-哌啶。
在一个实施方式中，提供了本发明的化合物的可药用盐。
本公开的化合物包括那些其中指定的原子是天然存在或非天然存在的同位素的化合物。在一个实施方式中，所述同位素是稳定同位素。因此，本公开的化合物包括例如那些含有一个或多个氘原子来代替氢原子的化合物等。
本公开还扩展到本文中定义的化合物(包括其盐)的所有同质多形形式。
本公开还扩展到本文中定义的化合物的所有溶剂化物。溶剂化物的实例包括水合物。
适合地，R1表示Me或H，特别是Me。
适合地，R2表示H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C6环烷基、卤素或氰基，更适合地表示H、C1-C4烷基或卤素，更适合地表示H、Me或卤素，最适合地表示H、Me或F，特别是H。
在优选实施方式中，Z表示CO。在可选实施方式中，Z是SO2。
在一个优选实施方式中，R3是式(i)。
适合地，R4表示NR6R7或含有选自O、N和S的一个或多个杂原子的脂族4-8元杂环，只不过当R4是NR6R7时，m是2、3、4或5，并且R5表示H或OH，只不过当R5是OH时，n是2、3、4或5；或者
R5表示NR8R9或含有选自O、N和S的一个或多个杂原子的脂族4-8元杂环，只不过当R5是NR8R9时，n是2、3、4或5，并且R4表示H或OH，只不过当R4是OH时，m是2、3、4或5。
适合地，X1表示(CH2)m。
适合地，X1表示(CH2)0、CH2、CH(CH3)CH2或(CH2)2，特别是(CH2)0或CH2，优选为(CH2)0。
适合地，R4表示H、N-甲基-哌啶或二甲基胺，特别是H。
适合地，组成部分-X1-R4表示H、Me、CH2CH3、异丙基、1-甲基-哌啶-4-基或N,N-二甲基胺，特别是H或Me，优选为H。
适合地，Y1表示(CH2)n。
适合地，Y1表示(CH2)0、CH2、(CH2)2或(CH2)3，特别是(CH2)2。
适合地，R5表示H、二甲基胺、N-甲基乙醇胺、N-甲基-哌嗪、N-甲基-哌啶、1,2,6-三甲基哌嗪、N-乙基-哌嗪、3-(N,N-二甲基胺)-吡咯烷、N-(CH2CH2OH)-哌嗪、哌啶、吗啉、4-羟基-哌啶、4-氰基-哌啶、2,6-二甲基-哌啶、N-甲氧基乙基-哌嗪、2-甲基-哌嗪、N-甲基-2-(N-哌嗪基)乙酰胺、4-(N,N-二甲基胺)-哌啶、4-甲氧基-哌啶、S-二氧基-硫代吗啉、N-哌嗪-3-酮、2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚烷、或3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛烷、3,6-二氮杂二环[3.1.1]庚基，特别是二甲基胺或N-甲基-哌嗪，优选为二甲基胺。
适合地，当n表示0时，R5不表示H。
适合地，组成部分-Y1-R5表示Me、-(CH2)2-二甲基氨基、-(CH2)3-二甲基氨基、-(CH2)2-(N-甲基)-乙醇氨基、-(CH2)2-哌嗪-1-基、-(CH2)2-(4-甲基)-哌嗪-1-基、-(CH2)2-(3-甲基)-哌嗪-1-基、-(CH2)3-(4-甲基)-哌嗪-1-基、-(CH2)2-(1-甲基)-哌啶-4-基、N-甲基-哌啶-4-基、-(CH2)2-(4-乙基)-哌嗪-1-基、-(CH2)2-3-(N,N-二甲基氨基)-吡咯烷-1-基、-(CH2)2-(4-(CH2CH2OH)-哌嗪-1-基)、-(CH2)2-3,4,5-三甲基哌嗪-1-基、-(CH2)2-哌啶-1-基、-(CH2)3-哌啶-1-基、-(CH2)2-吗啉-4-基、-(CH2)2-(4-羟基-哌啶-1-基)、-(CH2)2-(4-氰基-哌啶-1-基)、-(CH2)2-(2,6-二甲基-哌啶-1-基)、-(CH2)2-(4-甲氧基乙基-哌嗪-1-基)、-(CH2)2-4-(N,N-二甲基氨基-哌啶-1-基)、-(CH2)2-(4-甲氧基-哌啶-1-基)、-(CH2)3-(4-甲氧基-哌啶-1-基)、-(CH2)2-4-(N-甲基乙酰胺基)-哌嗪-1-基))、-(CH2)2-(4-二氧基-硫代吗啉-1-基)、-(CH2)2-(3-氧代哌嗪-1-基)、-(CH2)2-(2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)、-(CH2)2-(3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛-8-基)、(CH2)2-(3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)、(CH2)2-3,6-二氮杂二环[3.1.1]庚-3-基，特别是-(CH2)2-二甲基胺或-(CH2)2-(4-甲基-哌嗪-1-基)，更优选为-(CH2)2-二甲基氨基。
适合地，在式(i)表示的组成部分中：(a)-X1-R4表示H，并且-Y1-R5表示-(CH2)2-二甲基氨基、-(CH2)3-二甲基氨基、-(CH2)2-(N-甲基)-乙醇氨基、-(CH2)2-4-甲基-哌嗪-1-基、-(CH2)3-(4-甲基)-哌嗪-1-基、N-甲基-哌啶-4-基、-(CH2)2-3,4,5-三甲基哌嗪-1-基、-(CH2)2-4-乙基-哌嗪-N-基、-(CH2)2-3-(N,N-二甲基氨基)-吡咯烷-1-基、-(CH2)2-(4-(CH2CH2OH)-哌嗪-1-基)、-(CH2)2-哌啶-1-基、-(CH2)3-哌啶-1-基、-(CH2)2-吗啉-4-基、-(CH2)2-(4-羟基-哌啶-1-基)、-(CH2)2-4-氰基-哌啶-1-基、-(CH2)2-(2,6-二甲基-哌啶-1-基)、-(CH2)2-4-甲氧基乙基-哌嗪-1-基、-(CH2)2-4-(N,N-二甲基氨基)-哌啶-1-基、-(CH2)2-4-甲氧基-哌啶-1-基、-(CH2)3-4-甲氧基-哌啶-1-基、-(CH2)2-4-二氧基-硫代吗啉-1-基、-(CH2)2-(3-氧代哌嗪-1-基)，特别地-X1-R4表示H，并且-Y1-R5表示-(CH2)2-二甲基氨基或-(CH2)2-4-甲基-哌嗪-1-基，更优选地-X1-R4表示H并且-Y1-R5表示-(CH2)2-二甲基氨基；或(b)-X1-R4表示Me，并且-Y1-R5表示Me、-(CH2)2-二甲基氨基、-(CH2)2-(N-甲基)-乙醇氨基、-(CH2)2-哌嗪-1-基、-(CH2)2-4-甲基-哌嗪-1-基、-(CH2)2-(3-甲基)-哌嗪-1-基、-(CH2)2-(4-(CH2CH2OH)-哌嗪-1-基)、-(CH2)2-(4-(N-甲基乙酰胺基)-哌嗪-1-基))、-(CH2)2-(2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)、-(CH2)2-(3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛-8-基)、(CH2)2-(3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)、(CH2)2-3,6-二氮杂二环[3.1.1]庚-3-基，特别地-X1-R4表示Me，并且Y1-R5表示(CH2)2-二甲基氨基或-(CH2)2-4-甲基-哌嗪-1-基，更优选地-X1-R4表示Me并且-Y1-R5表示-(CH2)2-4-甲基-哌嗪-1-基；或(c)-X1-R4表示1-甲基-哌啶-4-基并且-Y1-R5表示Me；或(d)-X1-R4表示N,N-二甲基氨基并且-Y1-R5表示Me；或(e)-X1-R4表示CH2CH3并且-Y1-R5表示(CH2)2-哌嗪-1-基；或(f)-X1-R4表示异丙基并且-Y1-R5表示(CH2)2-哌嗪-1-基。式(i)的组成部分优选地由(a)表示。
在一个实施方式中，R3是式(ii)。
适合地，Y2表示(CH2)s。
适合地，s是2、3或4，更适合为2或3，特别是2。
适合地，式(ii)表示1,2-氧氮杂环丁烷。
在一个实施方式中，R3是式(iii)。
适合地，Y3表示(CH2)t。
适合地，X2表示(CH2)v。
适合地，t是2并且v是2。
适合地，Q是N或O，特别是N。当Q表示N时，它可以适合地被甲基取代。
在一个实施方式中，式(iii)表示5-甲基-[1,2,5]-氧杂二氮杂环庚烷。
适合地，R6、R7、R8、R9独立地表示H或任选地被OH、氧代、NR14R15或-OMe取代的C1-C4烷基。
适合地，R6和R7独立地表示Me。
适合地，R8表示Me，并且R9表示Me或CH2CH2OH，特别是Me。
适合地，R10表示H，并且R11表示Me。
适合地，R12和R13独立地表示Me。
适合地，R14和R15独立地选自H和Me。
所述式(I)的化合物可以方便地通过下述方法来制备，所述方法包括将其中L是离去基团例如-OC1-C4烷基例如O乙基的式(II)的化合物或其受保护的衍生物：
与式(III)的化合物进行反应：
通常，式(II)和(III)的化合物可以在溶剂例如DMF存在下反应，并加热至约80℃大约18小时。在这一步骤后进行去保护步骤，以移除保护基团乙酰基。为了实现这一点，可以将反应混合物冷却至室温，添加亲核试剂例如哌啶并搅拌1至24小时。
其中L表示-O乙基的式(II)的化合物可以通过将式(IV)的化合物或其受保护的衍生物：
与式(V)的化合物进行反应来制备：
通常，式(IV)和(V)的化合物可以在乙酸酐存在下，在约110℃的温度下反应大约4小时。其他式(II)的化合物可以以类似方式制备。
式(IV)的化合物可以通过将式(VI)的化合物：
与乙酸酐进行反应来制备。通常，所述反应在约110℃下进行。或者，其中L表示-O乙基的式(II)的化合物可以直接从式(VI)的化合物，通过用式(V)的化合物在乙酸酐存在下，在约110℃的温度下处理大约4小时来制备。
式(VI)的化合物可以通过将式(VII)的化合物的-NO2基团还原成-NH2基团：
然后进行形成酰胺的环化来制备，所述环化是本领域中公知的程序。
还原条件通常可以包括使用H2-Pd/C，在室温、5巴压力下，在溶剂例如乙酸中约36小时，这是本领域中公知的程序。
式(VII)的化合物可以通过将式(VIII)的化合物：
与氯代乙酸甲酯进行反应来制备。通常，所述反应在极性有机溶剂例如DMF和碱例如KOtBu存在下，在氮气气氛下，在约-20至-10℃之间进行。
或者，式(Ia)的化合物，即其中Z是CO并且R3是式(i)或(iii)的式(I)的化合物，可以通过将式(IX)的化合物或其受保护的衍生物：
与式(X)的化合物或其受保护的衍生物进行反应来制备：
其中R’可以表示Y1-R5，并且R”可以表示X1-R4，或者R’和R”与N和O原子联合在一起形成从列出的实例中选择的杂环。所述化合物通常可以在室温下，在偶联剂例如HATU和碱例如Hünig碱(DIPEA)存在下，在极性有机溶剂例如DMF中反应约2至18小时，但是也可以使用其他极性有机溶剂。在适合情况下，在这一过程后进行去保护。
式(IX)的化合物可以通过式(XI)的化合物的去保护来制备：
去保护可以使用本领域中的标准试剂例如TFA来实现，并且通常将所述化合物在溶剂例如DCM中，在室温下搅拌约16小时。
式(XI)的化合物可以通过将式(II)的化合物与式(XII)的化合物进行反应来制备：
所述化合物可以在DMF存在下，在100℃下反应约18小时。
或者，式(Ib)的化合物，即其中R3是式(i)并且X1-R4表示H，NR8R9表示如前所定义的NR8R9或如前所定义的含有选自O、N和S的一个或多个杂原子的脂族4-8元杂环的式(I)的化合物：
可以通过将式(XIII)的化合物：
与式(XIV)的化合物进行反应来制备:
或者NR8R9表示如前所定义的含有选自O、N和S的一个或多个杂原子的脂族4-8元杂环。典型的反应条件可以是将所述混合物在室温下搅拌约16小时。在适合情况下，在这一过程后进行去保护。
式(XIII)的化合物可以通过将式(IX)的化合物与式(XV)的化合物进行反应来制备：
所述化合物通常可以在HATU、Hünig碱(DIPEA)和DMF或另一种极性有机溶剂存在下反应。
或者，式(Ic)的化合物，即其中Z表示CO或SO2并且R3表示式(i)，X1-R4表示Me并且NR8R9表示如前所定义的NR8R9或如前所定义的含有选自O、N和S的一个或多个杂原子的脂族4-8元杂环的式(I)的化合物：
可以通过将式(XVI)的化合物：
与式(XIV)的化合物进行反应来制备。典型的反应条件可以是将所述混合物在溶剂例如DMF中，任选地在碱例如Hünig碱(DIPEA)存在下在大约60℃下搅拌约5小时，然后进行去保护步骤，例如用亲核试剂例如哌啶在溶剂例如DMF中，在大约60℃下处理约18小时。
式(XVI)的化合物可以通过将式(XVII)的化合物：
与CBr4和PPh3在温和条件下进行反应来制备，所述反应是在本领域中被称为Appel反应的常用反应。通常，所述反应可以在溶剂例如DCM中，在室温下搅拌2至16小时。
其中Z表示CO的式(XVII)的化合物可以通过将式(IX)的化合物与式(XVIII)的化合物进行反应来制备：
所述化合物通常可以在HATU、Hünig碱(DIPEA)和DMF或另一种极性有机溶剂存在下进行反应。通常，所述反应可以在室温下搅拌约2小时。
其中Z表示SO2的式(XVII)的化合物可以通过将式(II)的化合物与式(III)的化合物进行反应来制备，在所述式(III)的化合物中，Z表示SO2，并且R3是式(i)，其中X1-R4表示Me并且Y1-R5表示CH2CH2OH。所述化合物通常可以在Hünig碱(DIPEA)和DMF或另一种极性有机溶剂存在下，在例如80℃的温度下反应约18小时。
式(III)的化合物的合成可以通过将式(X)的化合物与式(XIX)的化合物进行反应来制备：
所述化合物通常可以在Hünig碱(DIPEA)和DMF存在下，在室温下反应约16小时，然后使用本领域中的标准试剂例如TFA进行去保护步骤。
其中R3是式(ii)和(iii)的式(III)的化合物可以通过将其中R’和R”与N和O原子联合在一起形成从上面列出的实例中选择的杂环的式(X)的化合物与式(XIX)的化合物进行反应来制备。这些杂环和它们的制备方法是本领域中的常识。
其中R’是H的式(X)的化合物通常可以通过将式(XX)的化合物：
与水合肼，在溶剂、通常为甲醇和DCM存在下，在室温反应约18小时来制备。
式(XX)的化合物可以通过将HOR’的化合物与2-羟基异吲哚啉-1,3-二酮的化合物进行反应来制备。所述化合物通常可以在三苯基膦、偶氮二甲酸酯例如DIAD和极性溶剂例如THF存在下进行反应。通常，所述反应在0℃下搅拌1小时，然后升温至室温并搅拌约16小时。
其中R’是Me的式(X)的化合物可以通过将式(XXI)的化合物进行还原来制备：
所述还原使用本领域中的标准方法，例如使用还原剂例如式(XXII)的化合物：
所述反应通常可以在极性溶剂例如THF、酸例如盐酸和非质子溶剂例如二氧杂环己烷存在下发生。
式(XXI)的化合物可以通过式(XXIII)的化合物：
与例如甲醛的缩合来制备。所述缩合通常可以利用聚甲醛作为甲醛来源，在溶剂例如乙醇存在下并在回流下加热约18小时来进行。
在本发明的一方面，要求保护新的中间体，包括其中R1是Me、Et、CH＝CH2、C≡C-H或C≡C-Me的式(II)、(VII)、(IX)、(XI)、(XIII)、(XVI)和(XVII)的化合物以及其中R1是Et、CH＝CH2、C≡C-H或C≡C-Me的式(VI)的化合物及其盐。
式(V)、(VIII)、(X)、(XII)、(XIV)、(XV)、(XVIII)、(XIX)、(XXII)和(XXIII)的化合物可以通过已知方法或与本文中描述的那些方法类似的方法来制备。
式(I)的化合物可以以所述式(I)的化合物能够形成的可药用盐、包括有治疗活性的无毒性酸加成盐的形式制备或使用。这些可药用酸加成盐可以通过将游离碱形式用这些适合的酸在适合的溶剂或溶剂混合物中进行处理而方便地获得。适合的酸包括例如乙磺酸、马来酸、丙二酸、L-酒石酸、延胡索酸、柠檬酸、琥珀酸、乙酸、三苯基乙酸、盐酸、硫酸、磷酸、1-羟基-2-萘甲酸、氢溴酸、甲磺酸、酒石酸、棕榈酸、羟基乙磺酸、双羟萘酸、甲酸、肉桂酸、苯甲酸、抗坏血酸、半乳糖二酸、乳酸、苹果酸、草酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、丙酸、糠酸、膦酸和戊二酸。反过来，所述盐形式可以通过用适合的碱处理转变成游离碱形式。
本发明提供了用作药物的本发明的化合物。
此外，本发明提供了一种药物组合物，其包含任选地与一种或多种可药用稀释剂或载体相组合的本发明的化合物。
稀释剂和载体可以包括那些适合于肠胃外、口服、局部给药，包括经口吸入到肺中或经鼻吸入、粘膜和直肠给药的稀释剂和载体，并且可以随着给药途径而不同。
在一个实施方式中，组合物可以被制备成例如用于肠胃外给药，例如皮下、肌肉内、静脉内、真皮内、关节内或关节周给药，特别是采取液体溶液或悬液的形式；用于口服给药，特别是采取片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、固体分散体的形式，或采取液体溶液或悬液、包括纳米悬液的形式；用于吸入到肺或鼻，例如肺或鼻内给药，特别是采取用于喷雾的干粉、溶液、悬液、包括纳米悬液，包含溶液或悬液的鼻喷剂或滴剂，或者溶液或悬液加压或非加压气溶胶的形式；用于局部或透皮给药，例如作为霜剂、喷剂、泡沫、凝胶、软膏、液体、贴片；用于粘膜给药，例如给药到颊、舌下或阴道粘膜；以及用于直肠给药，例如采取泡沫或栓剂的形式。
所述组合物可以方便地以单位剂型给药，并且可以通过制药技术领域中公知的任何方法制备，例如在《雷明顿制药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company,Easton,PA.,(1985))中所描述的方法。所述组合物也可以方便地以多单位剂型给药。
用于肠胃外给药的制剂可以含有无菌水或盐水、缓冲剂、渗透压调节剂、防腐剂、抗氧化剂、粘度调节剂、亚烷基二醇例如丙二醇、聚亚烷基二醇例如聚乙二醇、植物来源的油、氢化萘等作为赋形剂。
适合于口服给药的组合物可以包含一种或多种生理相容的载体和/或赋形剂，并且可以采取固体或液体形式。片剂和胶囊可以使用以下物质来制备：粘合剂，例如糖浆、阿拉伯树胶(acacia)、明胶、山梨糖醇、黄芪胶、纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨糖醇或甘氨酸；润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇或二氧化硅；以及表面活性剂，例如月桂基硫酸钠。液体组合物可以含有常规添加剂，例如悬浮剂，如山梨糖醇糖浆、甲基纤维素、糖浆、明胶、羧甲基纤维素或可食用脂肪；乳化剂和表面活性剂，例如卵磷脂或阿拉伯树胶；植物油，例如杏仁油、椰子油、鱼肝油或花生油；防腐剂例如丁基羟基茴香醚(BHA)和丁基羟基甲苯(BHT)。液体组合物可以被包封在例如明胶中，以提供单位剂型。
固体口服剂型包括片剂、二件式硬壳胶囊和软质弹性明胶(SEG)胶囊。这种二件式硬壳胶囊可以由例如明胶或羟丙基甲基纤维素(HPMC)制造。
干壳制剂通常包含约40％-60％浓度的明胶、约20％-30％浓度的增塑剂(例如甘油、山梨糖醇或丙二醇)和约30％-40％浓度的水。其他材料例如防腐剂、染料、遮光剂和调味剂也可以存在。液体填充材料包含在介质或介质的组合例如矿物油、植物油、甘油三酯、二醇、多元醇和表面活性剂中的液体药物，或已被溶解、增溶或分散(用悬浮剂例如蜂蜡、氢化蓖麻油或聚乙二醇4000)的固体药物。
用于鼻给药的制剂可以是粉剂并且可以含有赋形剂例如乳糖或葡聚糖，或者可以是以鼻滴剂或计量喷剂的形式使用的水性或油性溶液。用于鼻给药的制剂也可以采取水性悬液或加压非水性溶液或悬液的形式。对于颊给药来说，常用赋形剂包括糖类、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预明胶化淀粉等。
适合地，所述式(I)的化合物被局部给药到肺。因此，在一个实施方式中，提供了一种药物组合物，其包含任选地与一种或多种局部可接受的稀释剂或载体组合的本公开的化合物。
向肺的局部给药可以通过使用非加压制剂例如水性溶液或悬液来实现。这些制剂可以利用喷雾器给药，例如可以手持且便携的或用于家庭或医院使用的(即非便携式)喷雾器。所述制剂可以包含赋形剂例如水、缓冲剂、渗透压调节剂、pH调节剂、表面活性剂、防腐剂、悬浮剂、增量剂和共溶剂。悬浮液体和气溶胶制剂(不论是否加压)通常含有采取适合于沉积在肺中的细粉形式的本发明的化合物，其例如具有0.5-10μm例如1-5μm左右的D50。采取细粉形式的粉末可以通过微粉化或碾磨方法，通过喷雾干燥、通过喷雾冷冻或通过湿法碾磨然后喷雾干燥来制备。微粉化可以使用喷射碾磨机例如由Hosokawa Alpine制造的喷射碾磨机来进行。得到的粒度分布可以使用激光衍射来测量(例如使用Malvern Mastersizer2000S或Mastersizer 3000仪器)。粒度分布可以使用D10、D50和D90值来表示。粒度分布的D50中值被定义为将所述分布分成两半的粒度。该源自于激光衍射的测量更准确地被描述为体积分布，因此使用这种程序获得的D50值被更有意义地称为Dv50值(体积分布的中值)。当在本文中使用时，Dv值是指使用激光衍射测量的粒度分布。同样地，在激光衍射的情形中使用的D10和D90值被认为是指Dv10和Dv90值，并且分别是指所述分布的10％低于D10值和所述分布的90％低于D90值的粒度。在另一个实施方式中，包含本公开的化合物与用于悬液制剂的喷雾的赋形剂的复合粒子，可以通过将所述化合物和赋形剂一起共同碾磨和/或共同喷雾干燥来形成，其中包含活性成分和赋形剂两者的复合粒子具有1-10μm的D50。用于递送到肺的水性悬液制剂也可以包含纳米悬液或含有纳米粒子的复合粒子的悬液。
向肺的局部给药也可以通过使用加压气溶胶制剂来实现。气溶胶制剂通常包含悬浮或溶解在适合的气溶胶推进剂中的活性成分，所述推进剂例如氯氟烃(CFC)或氟烃(HFC)。适合的CFC推进剂包括三氯单氟甲烷(推进剂11)、二氯四氟甲烷(推进剂114)和二氯二氟甲烷(推进剂12)。适合的HFC推进剂包括四氟乙烷(HFC-134a)和七氟丙烷(HFC-227)。所述推进剂通常以重量计占总吸入组合物的40％-99.5％，例如40％-90％。所述制剂可以包含赋形剂，包括共溶剂(例如乙醇)和表面活性剂或稳定剂(例如卵磷脂、失水山梨糖醇三油酸酯等)。其他可能的赋形剂包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油等。气溶胶制剂被包装在罐中，并利用计量阀(例如由Bespak、Aptar或3M或者由Coster或Vari供应的)递送适合的剂量。用于递送到肺的加压悬液制剂也可以包含纳米悬液或含有纳米粒子的复合粒子的悬液。
向肺的局部给药也可以通过使用干粉制剂来实现。干粉制剂含有采取细粉形式的本公开的化合物，其通常具有0.5-10μm、例如1-5μm左右的D50。采取细粉形式的粉末可以通过微粉化或碾磨方法，通过喷雾干燥、通过喷雾冷冻或通过湿法碾磨然后喷雾干燥来制备。微粉化可以使用喷射碾磨机例如由Hosokawa Alpine制造的喷射碾磨机来进行。得到的粒度分布可以使用激光衍射来测量(例如使用Malvern Mastersizer 2000S或Mastersizer3000仪器)。所述制剂通常含有一种或多种局部可接受的赋形剂例如乳糖、葡萄糖、海藻糖或甘露糖醇(优选为乳糖)，其通常具有相对大的粒度例如15-250μm的D50。在另一个实施方式中，包含本公开的化合物与赋形剂的复合粒子也可以通过将所述化合物和赋形剂一起共同碾磨和/或共同喷雾干燥来形成，其中包含活性成分和赋形剂两者的复合粒子具有1-10μm的D50。当在本文中使用时，术语“乳糖”是指含有乳糖的组分，包括α-单水乳糖、β-单水乳糖、α-无水乳糖、β-无水乳糖和无定形乳糖。乳糖组分可以通过微粉化、筛分、碾磨、压制、团集或喷雾干燥来加工。也涵盖了采取各种不同形式的可商购的乳糖形式，例如(DFE Pharma)、(Meggle)、(DFE Pharma)和(DFEPharma)产品。在一个实施方式中，所述乳糖组分选自α-单水乳糖、α-无水乳糖和无定形乳糖。优选地，所述乳糖是α-单水乳糖。
干粉制剂也可以含有其他赋形剂，例如亮氨酸、硬脂酸钠、硬脂酸钙或硬脂酸镁。干粉粒子可以是复合粒子，并且可以包含复合材料基质中的纳米粒子。
干粉制剂通常使用干粉吸入(DPI)装置来递送。这可以是作为胶囊或泡罩的单位剂量装置，其中所述制剂以单个单位存在；或者是多剂量装置，其中在装置中包含超过一剂制剂，其在储存空间中或作为装置内的多个容器(例如多个泡罩或口袋)。示例性的干粉吸入器包括SPINHALER、DISKHALER、TURBOHALER、DISKUS、ELLIPTA、CLICKHALER、ECLIPSE、ROTAHALER、HANDIHALER、AEROLISER、CYCLOHALER、MONODOSE、BREEZHALER/NEOHALER、FLOWCAPS、TWINCAPS、X-CAPS、TWISTER、TURBOSPIN、ELPENHALER、TURBUHALER、MIATHALER、NEXTHaler、TWISTHALER、NOVOLIZER、GENUAIR、SKYEHALER、ORIEL干粉吸入器、MICRODOSE、ACCUHALER、PULVINAL、EASYHALER、ULTRAHALER、TAIFUN、PULMOJET、OMNIHALER、GYROHALER、TAPER、CONIX、XCELOVAIR和PROHALER。
本发明的化合物预期可用于治疗纤维化疾病，例如肺纤维化和带有纤维化组分的肺病，例如选自IPF、巨细胞间质性肺炎、结节病、囊性纤维化、呼吸窘迫综合征、药物引起的肺纤维化、肉芽肿病、硅肺病、石棉肺病、系统性硬皮病、选自丙型肝炎引起的肝硬化的病毒引起的肝硬化，或带有纤维化组分的皮肤疾病，例如选自硬皮病、结节病和系统性红斑狼疮，特别是IPF。更通常地，本发明的化合物预期可用于治疗间质性肺病。此外，本发明的化合物预期可用于治疗以细胞过度增殖为特征的疾病例如癌症，以及其中所述化合物通过吸入来递送的癌症，特别是肺癌。此外，本发明的化合物也可用于治疗呼吸障碍，包括COPD(包括慢性支气管炎和肺气肿)、哮喘、小儿哮喘、过敏性鼻炎、鼻炎、鼻窦炎，特别是哮喘、慢性支气管炎和COPD。
本发明的化合物预期也可用于治疗其他纤维化疾病，例如与类风湿性关节炎相关的肺纤维化、呼吸窘迫综合征包括急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、辐射引起的肺纤维化或肺炎、慢性过敏性肺炎、系统性硬化症、干燥综合征、间质性肺病、肺动脉高压(PAH)包括PAH的血管组分，或例如选自增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的带有纤维化组分的皮肤疾病，或纤维化是其组分的眼病，包括青光眼、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、干眼病和糖尿病性视网膜病变，或肠中的纤维化例如与炎性肠病相关的纤维化。
此外，本发明的化合物预期可用于预防以细胞过度增殖为特征的疾病例如癌症，例如其中所述化合物通过吸入来递送的癌症，特别是肺癌。
本发明提供了本发明的化合物，其用于治疗一种或多种上面提到的疾病。本发明还提供了本发明的化合物在制造用于治疗一种或多种上面提到的疾病的药物中的用途。
本发明还提供了一种治疗上面提到的疾病之一的方法，所述方法包括向需要的对象(特别是人类对象)给药治疗有效量的本发明的化合物。
词“治疗”意图涵盖预防以及治疗性治疗。
本发明的化合物可以每日给药一次、两次或三次，特别是每日一次或两次。适合的剂量可以参考疾病的严重性和对象的大小来确定。典型的剂量在每人0.01mg至100mg、例如0.1mg至10mg例如0.25mg至5mg的范围内，所述剂量每日递送一次、两次或三次，特别是每日一次或两次。
本公开的化合物也可以与一种或多种其他活性成分，例如适用于治疗上面提到的病症的活性成分相组合给药。例如，可能的活性成分包括尼达尼布或吡非尼酮(它们已知用于治疗IPF)。其他组合使用的活性成分包括具有化痰、支气管平抚和/或抗炎活性的物质，例如抗胆碱能药剂、β-2模拟物、甾类、PDE-IV抑制剂、p38MAP激酶抑制剂、MK2抑制剂、半乳糖凝集素抑制剂、NK1拮抗剂、LTD4拮抗剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、PDGF抑制剂、FGF抑制剂、TGFβ抑制剂、LPA1拮抗剂、LOXL2抑制剂、CTGF抑制剂、己酮可可碱、N-乙酰基半胱氨酸、抗IL13药剂、抗IL4药剂、αvβ6整合蛋白抑制剂、IGF抑制剂、PI3K抑制剂、mTOR抑制剂、JNK抑制剂、正五聚蛋白2和内皮素拮抗剂。
其他组合使用的活性成分包括具有抗纤维化活性的物质，例如PDE-III抑制剂、组合的抗IL4/13药剂、组合的PI3k/mTOR抑制剂、自分泌运动因子(autotaxin)抑制剂、P2X3拮抗剂、CTGF拮抗剂、5-LO拮抗剂、白三烯拮抗剂和ROCK抑制剂。
在一个实施方式中，所述活性成分的组合被共同配制。
在一个实施方式中，所述活性成分的组合被顺序或同时共同给药。
在一个实施方式中，本发明的化合物通过吸入来递送，并且其他可能的活性成分口服或肠胃外递送。
在一个实施方式中，提供了一种组合产品，其包含：
(A)本发明的化合物；和
(B)其他活性成分(如上文所提到的)
其中组分(A)和(B)各自与可药用稀释剂或载体混合配制。所述组合可以任选地包含另外的相关赋形剂。
在一个实施方式中，提供了本发明的化合物，其用作药物，与一种或多种其他活性成分(如上文所提到的)相组合给药。
本发明的化合物预期具有一种或多种下述有利性质：
-选自VEGFR(例如VEGFR1和VEGFR2)、FGFR和PDGFR的激酶的良好抑制活性；
-当局部递送到肺时良好的抗纤维化活性，例如在体内模型(例如博来霉素纤维化模型)中所确定的；
-适合的物理和化学性质，以及对于医药产品、特别是旨在局部递送到肺的医药产品来说的低剂量；
-当局部递送到肺时良好的肺中停留时间或作用持续时间；
-在PAMPA渗透性测定中低的渗透性；
-良好的作用持续时间，例如通过在人类胎儿肺成纤维细胞中抑制PDGF-BB诱导的BDGFRβ的磷酸化所测量的；
-当局部给药到肺时良好的安全性和耐受性；
-低的口服生物利用度。
实验部分
本文中使用的缩略语如下所定义(表1)。任何没有定义的缩略语打算传达它们被普遍接受的含义。
表1：缩略语
化学例
通用程序
所有起始原料和溶剂从商业来源获得或者按照引用文献制备。除非另有陈述，否则所有反应都被搅拌。有机溶液常规在无水硫酸镁上干燥。加氢反应在陈述的条件下在Thales H-cube流式反应器上或在压力下在气体压热釜(高压气体罐)中进行。
柱层析在预装填的硅胶(230-400目，40-63μm)柱上，使用指明的量进行。SCX购自Supelco，并在使用前用1M盐酸处理。除非另有陈述，否则将待纯化的反应混合物首先用MeOH稀释并用几滴AcOH酸化。将该溶液直接装载到SCX上并用MeOH洗涤。然后通过用1％NH3的MeOH溶液洗涤来洗脱目标材料。
制备型反相高效液相色谱术
使用215和254nm下的UV检测，使用两种方法进行：Waters X-Select Prep-C18，5μm，19x50mm柱，在10min内用含有0.1％v/v甲酸的H2O-MeCN梯度进行洗脱(方法A)；或WatersX-Bridge Prep-C18，5μm，19x50mm柱，在10min内用含有0.1％碳酸氢铵的H2O-MeCN梯度进行洗脱(方法B)。
分析方法
反相高效液相色谱术
方法1：Waters XSelect CSH C18 2.5μm(4.6x 30mm)，在40℃下；流速2.5-4.5mLmin-1，在4min内用含有0.1％v/v甲酸的H2O-MeCN梯度进行洗脱，使用254和215nm下的UV检测。梯度信息：0-3.00min，从95％H2O-5％MeCN匀变到5％H2O-95％MeCN；3.00-3.01min，保持在5％H2O-95％MeCN，流速提高到4.5mL min-1；3.01-3.50min，保持在5％H2O-95％MeCN；3.50-3.60min，返回到95％H2O-5％MeCN，流速降低到3.50mL min-1；3.60-3.90min，保持在95％H2O-5％MeCN；3.90-4.00min，保持在95％H2O-5％MeCN，流速降低到2.5mL min-1。
方法2：Waters XBridge BEH C18，2.5μm(4.6x 30mm)，在40℃下；流速2.5-4.5mLmin-1，在4min内用含有10mM碳酸氢铵的H2O-MeCN梯度进行洗脱，使用254nm下的UV检测。梯度信息：0-3.00min，从95％H2O-5％MeCN匀变到5％H2O-95％MeCN；3.00-3.01min，保持在5％H2O-95％MeCN，流速提高到4.5mL min-1；3.01-3.50min，保持在5％H2O-95％MeCN；3.50-3.60min，返回到95％H2O-5％MeCN，流速降低到3.50mL min-1；3.60-3.90min，保持在95％H2O-5％MeCN；3.90-4.00min，保持在95％H2O-5％MeCN，流速降低到2.5mL min-1。1H NMR波谱术
1H NMR波谱在Bruker Avance III波谱仪上，在400MHz下，使用残留未氘化溶剂作为参比来获取，并且除非另有规定，否则在DMSO-d6中运行。
所有化学名称使用CambridgeSoft ENotebook 12.0产生。
实施例1：(Z)-3-(((4-(甲氧基(甲基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
中间体A：(E)-1-乙酰基-3-(乙氧基(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
向2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(1.00g，5.23mmol)在乙酸酐(10.9mL，115mmol)中的搅拌的溶液添加(三乙氧基甲基)苯(3.55mL，15.7mmol)，并将所述混合物在110℃下搅拌4h。将反应混合物冷却至rt，并通过过滤收集得到的沉淀物。将所述沉淀物用己烷(100mL)洗涤并真空干燥，得到作为米色固体的副标题化合物(E)-1-乙酰基-3-(乙氧基(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(1.66g，82％)；Rt 2.61min(方法1)；m/z 366(M+H)+(ES+)。
(Z)-3-(((4-(甲氧基(甲基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
将4-氨基-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(32.6mg，0.181mmol)和(E)-1-乙酰基-3-(乙氧基(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(中间体A)(60mg，0.16mmol)在DMF(1mL)中的混合物加热至80℃18h，然后允许其冷却至rt。添加哌啶(45.0μL，0.455mmol)，并将反应混合物在rt下搅拌24h。将所述反应混合物在DCM(25mL)与饱和NaHCO3溶液(25mL)之间分配并进行层分离。将有机层用盐水(25mL)洗涤，然后在减压下浓缩。将如此获得的粗产物通过制备型HPLC进行纯化(方法A，30-50％MeCN的水溶液)，得到作为黄色固体的标题化合物(Z)-3-(((4-(甲氧基(甲基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(21mg，28％)；Rt 2.14min(方法1)；m/z 458(M+H)+(ES+)；1H NMRδ:3.19(3H,s),3.48(3H,s),3.77(3H,s),5.87(1H,d),6.86(2H,m),7.21(1H,dd),7.36-7.45(3H,重叠m),7.53(2H,m),7.56-7.68(3H,重叠m),11.01(1H,s),12.29(1H,s)。
实施例2：(Z)-5-甲基-3-(((4-(N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨磺酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯，甲酸盐
中间体B:4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-2-甲基-5-硝基苯甲酸甲酯
在氮气气氛下，在-20℃下，在40分钟内向叔丁醇钾(35.9g，320mmol)在DMF(350mL)中的搅拌的溶液逐滴添加2-甲基-5-硝基苯甲酸甲酯(25.0g，128mmol)和2-氯乙酸甲酯(16.9mL，192mmol)在DMF(300mL)中的溶液。在2h内将所述反应混合物升温至-10℃，然后倾倒在冰-HCl悬液(900g冰，500mL 35wt％HCl)上。将所述混合物用DCM(2×600mL)萃取，并将合并的有机层用盐水(2x 400mL)洗涤，然后在减压下蒸发。将如此获得的粗产物通过快速柱层析进行纯化(SiO2，330g，0-10％EtOAc的DCM溶液，梯度洗脱)，得到作为橙色糖浆的副标题化合物4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-2-甲基-5-硝基苯甲酸甲酯(31.0g，89％)；Rt2.06min(方法1)；m/z 266(M-H)-(ES-)；1H NMRδ:2.61(3H,s),3.62(3H,s),3.88(3H,s),4.12(2H,s),7.59(1H,s),8.51(1H,s)。
中间体C：5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
向4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-2-甲基-5-硝基苯甲酸甲酯(中间体B)(23.0g，86.0mmol)在乙酸(301mL，5.25mol)中的溶液添加碳载钯[5wt％，58％水，型号87L](3.30g，1.55mmol)。将所述混合物在rt下，在H2气氛(5巴)下加氢36h，然后通过硅藻土垫过滤。将滤饼用EtOAc(500mL)洗涤，并将滤液在减压下浓缩。将粗残留物溶解在热回流的MeOH(200mL)中，并将混合物冷却至rt。将得到的固体过滤，用MeOH(200mL)漂洗并真空干燥，得到作为棕色粉末的副标题化合物5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(7.00g，39％)；Rt 1.48min(方法1)；m/z 206(M+H)+(ES+)；1H NMRδ:2.45(3H,s),3.32(2H,s),3.81(3H,s),7.17(1H,s),7.22(1H,s),10.43(1H,s)。
中间体D：(E)-1-乙酰基-3-(乙氧基(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
向5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(中间体C)(5.00g，24.4mmol)在乙酸酐(50.6mL，536mmol)中的搅拌的溶液添加(三乙氧基甲基)苯(22.1mL，97.0mmol)，并将所述混合物在110℃下搅拌3h。随后，继续在rt下搅拌18h。将反应混合物在减压下浓缩，并将残留物用MeOH(50mL)研磨。将得到的固体过滤，用MeOH(50mL)漂洗并真空干燥，得到作为黄色粉末的副标题化合物(E)-1-乙酰基-3-(乙氧基(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(4.50g，48％)；Rt 2.70min(方法1)；m/z 380(M+H)+(ES+)；1H NMRδ:1.35(3H,t),2.42(3H,s),2.58(3H,s),3.84(3H,s),4.01(2H,q),7.45-7.62(5H,重叠m),7.90(1H,s),8.64(1H,s)。
中间体E：2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)异吲哚啉-1,3-二酮
在0℃下，向2-羟基异吲哚啉-1,3-二酮(2.04g，12.5mmol)和三苯基膦(3.27g，12.5mmol)在THF(40mL)中的溶液逐滴添加2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙醇(1.50mL，10.4mmol)。然后将混合物在0℃下搅拌30min，然后逐滴添加DIAD(2.43mL，12.5mmol)。将反应在0℃下继续搅拌30min，然后升温至rt并搅拌16h。在减压下除去溶剂，将残留物重新溶解在EtOAc(75mL)中。将有机层用饱和NaHCO3溶液(2x 50mL)洗涤，然后在Na2SO4上干燥，过滤，并在减压下浓缩至大约30mL。将有机层冷却至0℃并添加冷的1M HCl水溶液(30mL)。在添加完成后，将混合物升温至rt并搅拌20min。进行层分离，并将水性层用Et2O(2x 30mL)洗涤。在冷却至0℃后，通过缓慢添加饱和NaHCO3溶液将水性层碱化，然后用CHCl3(3x 50mL)萃取。将有机萃取物合并，然后在Na2SO4上干燥，过滤并在减压下浓缩，得到作为米色固体的副标题化合物2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)异吲哚啉-1,3-二酮(1.96g，63％)；1H NMRδ:1.84-2.47(8H,重叠m),1.98(3H,s),2.65(2H,t),4.24(2H,t),7.85-7.87(4H,重叠m)。
中间体F：O-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)羟基胺
向2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)异吲哚啉-1,3-二酮(中间体E)(1.88g，6.50mmol)在MeOH/DCM(2:1，15mL)中的溶液添加25％肼的水溶液(2.45mL，19.5mmol)。将所述混合物在rt下搅拌18h，然后用Et2O(100mL)稀释。通过过滤移除沉淀物，并在减压下除去溶剂。将残留物重新溶解在DCM(30mL)中并在Na2SO4上干燥。在减压下除去溶剂，得到作为浅黄色油状物的副标题化合物O-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)羟基胺(0.902g，83％)；1H NMRδ:2.13(3H,s),2.18-2.47(8H,重叠m),2.43(2H,t),3.60(2H,t),5.96(2H,s)。
中间体G：(4-(N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨磺酰基)苯基)氨基甲酸叔丁基酯
向O-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)羟基胺(中间体F)(464mg，2.91mmol)在DMF(15mL)中的悬液添加Hünig碱(1.05mL，6.00mmol)，然后添加(4-氯磺酰基)苯基)氨基甲酸叔丁基酯(500mg，1.71mmol)。将所述混合物在rt下搅拌过夜。在减压下除去大部分溶剂。将残留物重新溶解在MeOH(50mL)中并通过SCX柱(5g)过滤，用MeOH(75mL)洗涤。舍弃滤液，然后将柱用1％NH3的MeOH溶液(75mL)洗涤。在减压下除去溶剂，得到作为暗淡无色胶质的副标题化合物(4-(N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨磺酰基)苯基)氨基甲酸叔丁基酯(552mg，70％)；Rt 1.77min(方法1)；m/z 415(M+H)+(ES+)；1H NMRδ:1.49(9H,s),2.12(3H,s),2.16-2.46(10H,重叠m),3.93(2H,t),7.64(2H,m),7.74(2H,m),9.87(1H,s),10.19(1H,br s)。
中间体H：4-氨基-N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)苯磺酰胺，二-三氟乙酸盐
向(4-(N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨磺酰基)苯基)氨基甲酸叔丁基酯(中间体G)(334mg，0.806mmol)在DCM(5mL)中的溶液添加TFA(1mL)。将所述混合物在rt下搅拌4h。在减压下除去溶剂，得到作为清澈油状物的4-氨基-N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)苯磺酰胺二-三氟乙酸盐(334mg，67％)；Rt 1.01min(方法2)；m/z 315(M+H)+(ES+)。
(Z)-5-甲基-3-(((4-(N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨磺酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯，甲酸盐
将(E)-1-乙酰基-3-(乙氧基(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(中间体D)(100mg，0.264mmol)和4-氨基-N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)苯磺酰胺二-三氟乙酸盐(中间体H)(172mg，0.316mmol)合并在DMF(3mL)中。将所述混合物在80℃下加热24h。添加更多4-氨基-N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)苯磺酰胺二-三氟乙酸盐(50mg)，并将反应混合物重新加热到80℃24h。添加哌啶(261μL，2.64mmol)并将混合物搅拌1.5h。在减压下除去溶剂。将所述材料转移到10％MeOH的DCM溶液(20mL)中，并用水(20mL)洗涤。使用相分离器筒进行相分离。将粗产物通过快速柱层析进行纯化(SiO2，40g，0-10％MeOH的DCM溶液，梯度洗脱)。将过柱产物通过制备型HPLC进行纯化(方法A，20-50％MeCN的水溶液)，得到作为浅黄色固体的标题化合物(Z)-5-甲基-3-(((4-(N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨磺酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯，甲酸盐(17.4mg，10％)；Rt 1.64min(方法1)；m/z 606(M+H)+(ES+)；1H NMRδ:2.13(3H,s),2.15(3H,s),2.18-2.36(8H,重叠m),2.42(2H,t),3.76(3H,s),3.91(2H,t),5.63(1H,s),6.95(2H,m),7.36(1H,s),7.53-7.60(2H,重叠m),7.60-7.73(5H,重叠m),8.20(1H,s),10.27(1H,br s),10.94(1H,s),12.28(1H,s)。
实施例3：(Z)-3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
中间体I：(Z)-1-乙酰基-3-(((4-(叔丁氧基羰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
将(E)-1-乙酰基-3-(乙氧基(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(中间体A)(4.00g，11.0mmol)和4-氨基苯甲酸叔丁基酯(2.12g，11.0mmol)在DMF(20mL)中的混合物在100℃下加热16h。在冷却至rt后，通过过滤收集沉淀物，用Et2O(100mL)洗涤并真空干燥，得到作为黄色固体的副标题化合物(Z)-1-乙酰基-3-(((4-(叔丁氧基羰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(3.68g，59％)；Rt 3.17min(方法1)；m/z 513(M+H)+(ES+)。
中间体J：(Z)-4-(((1-乙酰基-6-(甲氧基羰基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)(苯基)甲基)氨基)苯甲酸，三氟乙酸加成物
向(Z)-1-乙酰基-3-(((4-(叔丁氧基羰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(中间体I)(3.67g，7.16mmol)在DCM(75mL)中的溶液添加TFA(5.52mL，71.6mmol)，并将所述混合物在rt下搅拌16h。在减压下除去溶剂，得到作为黄色固体的副标题化合物(Z)-4-(((1-乙酰基-6-(甲氧基羰基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)(苯基)甲基)氨基)苯甲酸三氟乙酸加成物(3.63g，84％)；Rt 2.59min(方法1)；m/z 457(M+H)+(ES+)。
中间体K:2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)异吲哚啉-1,3-二酮
在0℃下，向2-羟基异吲哚啉-1,3-二酮(2.34g，14.3mmol)和三苯基膦(3.75g，14.3mmol)在THF(40mL)中的溶液逐滴添加2-(二甲基氨基)乙醇(1.20mL，11.9mmol)。然后将混合物在0℃下搅拌30min，然后逐滴添加DIAD(2.78mL，14.3mmol)。将所述反应在0℃下继续搅拌30min，然后升温至rt并搅拌16h。在减压下除去溶剂，并将残留物重新溶解在EtOAc(75mL)中。将有机层用饱和NaHCO3溶液(2x 50mL)洗涤，然后在Na2SO4上干燥，过滤，并在减压下浓缩至大约30mL。将有机层冷却至0℃并添加冷的1M HCl水溶液(20mL)。在添加完成后，将所述混合物升温至rt并搅拌20min。进行层分离并将水性层用Et2O(2x 30mL)洗涤。然后将水性层冷却至0℃，并通过缓慢添加饱和NaHCO3溶液进行碱化，然后用CHCl3(3x50mL)萃取。将有机萃取物合并，然后在Na2SO4上干燥，过滤并减压浓缩，得到作为黄色油状物的副标题化合物2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)异吲哚啉-1,3-二酮(2.29g，78％)；1H NMR(CDCl3)δ:2.34(6H,s),2.76(2H,t),4.31(2H,t),7.71-7.77(2H,重叠m),7.80-7.86(2H,重叠m)。
中间体L：2-(氨基氧基)-N,N-二甲基乙胺，2HCl
向2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)异吲哚啉-1,3-二酮(中间体K)(2.29g，9.78mmol)在MeOH/DCM(2:1，30mL)中的溶液添加25％肼的水溶液(3.68mL，29.3mmol)。将所述混合物在rt下搅拌18h。将混合物用Et2O(100mL)稀释，并通过相分离器过滤。将滤液脱气，然后添加4M HCl的二氧杂环己烷溶液(10mL)。将所述混合物在rt下搅拌1h。在减压下除去溶剂，并将残留物用Et2O(2x 50mL)研磨，得到作为白色固体的副标题化合物2-(氨基氧基)-N,N-二甲基乙胺，2HCl(891mg，50％)；1H NMRδ:2.79(6H,s),3.42(2H,m),4.45(2H,m),11.13(4H,br s)。
(Z)-3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
向(Z)-4-(((1-乙酰基-6-(甲氧基羰基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)(苯基)甲基)氨基)苯甲酸三氟乙酸加成物(中间体J)(0.050g，0.088mmol)、2-(氨基氧基)-N,N-二甲基乙胺，2HCl(中间体L)(0.031g，0.18mmol)和HATU(0.067g，0.18mmol)在DMF(2mL)中的溶液逐滴添加Hünig碱(0.077mL，0.44mmol)。将所述混合物在rt下搅拌2h，然后添加哌啶(0.087mL，0.876mmol)。将所述混合物在rt下搅拌2h，然后在减压下除去溶剂。将残留物重新溶解在MeOH(5mL)中并通过SCX柱过滤，用MeOH(100mL)洗涤。舍弃滤液，然后将柱用1％NH3的MeOH溶液(100mL)洗涤。在减压下除去溶剂。将粗产物通过制备型HPLC进行纯化(方法B，35-65％MeCN的水溶液)，得到作为黄色固体的标题化合物(Z)-3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(13mg，28％)；Rt 1.80min(方法2)；m/z 501(M+H)+(ES+)1H NMRδ:2.20(6H,s),2.54(2H,m),3.79(3H,s),3.94(2H,t),5.90(1H,d),6.86(2H,m),7.20(1H,dd),7.45(1H,d),7.48-7.68(7H,重叠m),9.41(1H,s),10.73(1H,s),12.28(1H,s)。
实施例4：(Z)-3-(((4-((2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
向(Z)-4-(((1-乙酰基-6-(甲氧基羰基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)(苯基)甲基)氨基)苯甲酸三氟乙酸加成物(中间体J)(100mg，0.18mmol)、O-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)羟基胺(中间体F)(28mg，0.18mmol)和HATU(73mg，0.19mmol)在DMF(3mL)中的溶液逐滴添加Hünig碱(0.092mL，0.53mmol)。将混合物在rt下搅拌18h。添加哌啶(0.17mL，1.75mmol)。将混合物在rt下搅拌1.5h，然后在减压下除去大部分溶剂。将残留物在EtOAc(10mL)与水/饱和NaHCO3溶液(1:1，10mL)之间分配。进行层分离，并将水性层用EtOAc(3x 10mL)萃取。将有机萃取物合并，然后在Na2SO4上干燥，过滤，并在减压下浓缩。将残留物重新溶解在MeOH(10mL)中，通过SCX柱过滤，用MeOH(100mL)洗涤。舍弃滤液，然后将柱用1％NH3的MeOH溶液(100mL)洗涤。在减压下除去溶剂。将粗产物通过快速柱层析进行纯化(SiO2，24g，10％MeOH的DCM溶液，然后1％NH3的MeOH溶液)，得到作为黄色固体的标题化合物(Z)-3-(((4-((2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(64mg，64％)；Rt 1.45min(方法1)；m/z 556(M+H)+(ES+)；1H NMRδ:2.13(3H,s),2.20-2.47(8H,重叠m),2.54(2H,t),3.77(3H,s),3.92(2H,t),5.87(1H,d),6.86(2H,m),7.21(1H,dd),7.42(1H,d),7.49-7.56(4H,重叠m),7.57-7.68(3H,重叠m),11.03(1H,s),12.28(1H,s)。
实施例5：(Z)-3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙氧基)氨基甲酰基)-3-甲基苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
中间体M：(Z)-1-乙酰基-3-(((4-(叔丁氧基羰基)-3-甲基苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
将(E)-1-乙酰基-3-(乙氧基(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(中间体D)(1.11g，2.91mmol)和4-氨基-2-甲基苯甲酸叔丁基酯(604mg，2.91mmol)在DMF(9mL)中的混合物在100℃下加热18h。在冷却至rt后，通过过滤收集沉淀物，用Et2O(10mL)洗涤并真空干燥，得到作为黄色固体的副标题化合物(Z)-1-乙酰基-3-(((4-(叔丁氧基羰基)-3-甲基苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(1.05g，65％)；Rt 3.28min(方法1)；m/z 541(M+H)+(ES+)；1H NMRδ:1.49(9H,s),2.13(3H,s),2.33(3H,s),2.73(3H,s),3.77(3H,s),5.53(1H,s),6.74(1H,dd),6.92(1H,m),7.43-7.56(3H,重叠m),7.57-7.71(3H,重叠m),8.67(1H,s),11.87(1H,s)。
中间体N：(Z)-4-(((1-乙酰基-6-(甲氧基羰基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)(苯基)甲基)氨基)-2-甲基苯甲酸，三氟乙酸加成物
向(Z)-1-乙酰基-3-(((4-(叔丁氧基羰基)-3-甲基苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(中间体M)(1.0g，1.85mmol)在DCM(14mL)中的溶液添加TFA(1.42mL，18.5mmol)，并将所述混合物在rt下搅拌16h。在减压下除去溶剂，得到作为黄色固体的副标题化合物(Z)-4-(((1-乙酰基-6-(甲氧基羰基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)(苯基)甲基)氨基)-2-甲基苯甲酸三氟乙酸加成物(1.1g，97％)；Rt 2.85min(方法1)；m/z 485(M+H)+(ES+)；1H NMRδ:2.13(3H,s),2.36(3H,s),2.73(3H,s),3.77(3H,s),5.53(1H,s),6.74(1H,dd),6.91(1H,m),7.48-7.56(2H,重叠m),7.55-7.73(4H,重叠m),8.68(1H,s),11.89(1H,s)。
(Z)-3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙氧基)氨基甲酰基)-3-甲基苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
向(Z)-4-(((1-乙酰基-6-(甲氧基羰基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)(苯基)甲基)氨基)-2-甲基苯甲酸三氟乙酸加成物(中间体N)(400mg，0.668mmol)、2-(氨基氧基)-N,N-二甲基乙胺2HCl(166mg，0.936mmol)(中间体L)和HATU(305mg，0.802mmol)在DMF(20mL)中的溶液逐滴添加Hünig碱(0.584mL，3.34mmol)。将所述混合物在rt下搅拌2h。添加哌啶(0.662mL，6.68mmol)。将所述混合物在rt下搅拌16h，然后在减压下除去大部分溶剂。将残留物在10％MeOH的DCM溶液(10mL)与水/饱和NaHCO3溶液(1:1，10mL)之间分配。进行层分离，并将水性层用10％MeOH的DCM溶液(3x 10mL)萃取。将有机萃取物合并，然后通过SCX柱过滤，用MeOH(50mL)洗涤。舍弃滤液，然后将柱用1％NH3的MeOH溶液(50mL)洗涤。在减压下除去溶剂。将粗产物通过快速柱层析进行纯化(SiO2，24g，0-10％MeOH的DCM溶液，然后1％NH3的MeOH溶液)，得到作为黄色固体的标题化合物(Z)-3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙氧基)氨基甲酰基)-3-甲基苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(100mg，28％)；Rt 1.66min(方法1)；m/z 529(M+H)+(ES+)；1H NMRδ:2.13(3H,s),2.17(9H,s),2.44-2.48(2H,重叠m),3.75(3H,s),3.91(2H,t),5.58(1H,s),6.59(1H,dd),6.78(1H,m),7.08(1H,d),7.36(1H,s),7.53(2H,m),7.57-7.71(3H,重叠m),10.86(1H,s),12.18(1H,s)。
实施例6：(Z)-5-甲基-3-(((4-((2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
中间体O：(Z)-1-乙酰基-3-(((4-(叔丁氧基羰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
将(E)-1-乙酰基-3-(乙氧基(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(中间体D)(1.00g，2.64mmol)和4-氨基苯甲酸叔丁基酯(509mg，2.64mmol)在DMF(9mL)中的混合物在100℃下加热18h。在冷却至rt后，通过过滤收集沉淀物，用Et2O(10mL)洗涤并真空干燥，得到作为黄色固体的副标题化合物(Z)-1-乙酰基-3-(((4-(叔丁氧基羰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(1.20g，86％)；Rt 3.23min(方法1)；m/z 527(M+H)+(ES+)。
中间体P：(Z)-4-(((1-乙酰基-6-(甲氧基羰基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)(苯基)甲基)氨基)苯甲酸，三氟乙酸加成物
向(Z)-1-乙酰基-3-(((4-(叔丁氧基羰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(中间体O)(1.20g，2.28mmol)在DCM(14mL)中的溶液添加TFA(1.76mL，22.8mmol)，并将所述混合物在rt下搅拌72h。在减压下除去溶剂，得到作为黄色固体的副标题化合物(Z)-4-(((1-乙酰基-6-(甲氧基羰基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)(苯基)甲基)氨基)苯甲酸三氟乙酸加成物(1.00g，72％)；Rt 2.72min(方法1)；m/z 471(M+H)+(ES+)；1H NMRδ:2.13(3H,s),2.73(3H,s),3.78(3H,s),5.54(1H,s),7.04(2H,m),7.50(2H,m),7.57-7.76(5H,重叠m),8.68(1H,s),11.89(1H,s),12.89(1H,s)。
(Z)-5-甲基-3-(((4-((2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
向(Z)-4-(((1-乙酰基-6-(甲氧基羰基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)(苯基)甲基)氨基)苯甲酸三氟乙酸加成物(中间体P)(57mg，0.098mmol)、O-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)羟基胺(中间体F)(16mg，0.098mmol)和HATU(41mg，0.107mmol)在DMF(3mL)中的溶液逐滴添加Hünig碱(0.051mL，0.293mmol)。将所述混合物在rt下搅拌2h。添加哌啶(0.097mL，0.975mmol)。将混合物在rt下搅拌2h，然后在减压下除去大部分溶剂。将残留物在EtOAc(10mL)与水/饱和NaHCO3溶液(1:1，10mL)之间分配。进行层分离，并将水性层用EtOAc(3x 10mL)萃取。将有机萃取物合并，然后通过SCX柱过滤，用MeOH(50mL)洗涤。舍弃滤液，然后将柱用1％NH3的MeOH溶液(50mL)洗涤。在减压下除去溶剂。将粗产物通过快速柱层析进行纯化(SiO2，12g，0-10％MeOH的DCM溶液，然后1％NH3的MeOH溶液)，得到作为黄色固体的标题化合物(Z)-5-甲基-3-(((4-((2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(36mg，64％)；Rt 1.49min(方法1)；m/z 570(M+H)+(ES+)；1H NMRδ:2.13(3H,s),2.13(3H,s),2.17-2.35(4H,重叠m),2.34-2.47(4H,重叠m),2.54(2H,t),3.75(3H,s),3.92(2H,t),5.61(1H,s),6.87(2H,m),7.36(1H,s),7.47-7.56(4H,重叠m),7.57-7.71(3H,重叠m),10.88(1H,s),11.52(1H,s),12.22(1H,s)。
实施例7：(Z)-3-(((4-((2-(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯，甲酸盐
中间体Q：2-(2-溴乙氧基)异吲哚啉-1,3-二酮
将2-羟基异吲哚啉-1,3-二酮(5.00g，30.7mmol)、三乙胺(9.40mL，67.4mmol)和1,2-二溴乙烷(12.4mL，144mmol)合并在DMF(32mL)中，并在rt下搅拌16h。通过过滤移除沉淀物，用DMF(3x5mL)洗涤并舍弃固体。将滤液用水(250mL)稀释，并将产物用EtOAc(50mL)萃取。将有机层用1M HCl水溶液(50mL)和水(50mL)洗涤，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下浓缩，得到作为奶油状固体的副标题化合物2-(2-溴乙氧基)异吲哚啉-1,3-二酮(6.28g，68％)；1H NMRδ:3.75(2H,t),4.45(2H,t),7.82-7.91(4H,重叠m)。
中间体R：O-(2-溴乙基)羟基胺，HBr
将2-(2-溴乙氧基)异吲哚啉-1,3-二酮(中间体Q)(1.00g，3.70mmol)与浓HBr(48wt％，在水中，4.5mL)和乙酸(3mL，52.4mmol)合并。将所述混合物在120℃下加热15min。将反应混合物冷却，通过过滤移除沉淀物，并将滤液在减压下浓缩，得到作为棕褐色固体的副标题化合物O-(2-溴乙基)羟基胺HBr(550mg，74％)；1H NMRδ:3.72(2H,m),4.28(2H,m),10.70(3H,br s)。
中间体S：(Z)-1-乙酰基-3-(((4-((2-溴乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
向(Z)-4-(((1-乙酰基-6-(甲氧基羰基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)(苯基)甲基)氨基)苯甲酸三氟乙酸加成物(中间体P)(300mg，0.638mmol)、HATU(291mg，0.765mmol)和Hünig碱(334μL，1.91mmol)在DMF(2mL)中的溶液添加O-(2-溴乙基)羟基胺HBr(中间体R)(211mg，0.956mmol)。将混合物在rt下搅拌10min。将反应混合物用10％MeOH的DCM溶液稀释，并用饱和氯化铵水溶液洗涤。将有机层在MgSO4上干燥，并在减压下蒸发掉溶剂，得到(Z)-1-乙酰基-3-(((4-((2-溴乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；Rt 2.67min(方法1)；m/z 592/594(M+H)+(ES+)。将所述粗材料假定为定量得率直接使用在下一步骤中。
(Z)-3-(((4-((2-(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯，甲酸盐
将(Z)-1-乙酰基-3-(((4-((2-溴乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(中间体S)(100mg，0.169mmol)与2-(哌嗪-1-基)乙醇(659mg，5.06mmol)合并，并将所述混合物在rt下搅拌16h。将反应混合物用10％MeOH的DCM溶液(10mL)稀释，并用水(5mL)洗涤。将水性层用10％MeOH的DCM溶液(10mL)进一步萃取，并将合并的有机层在减压下浓缩。将粗产物通过制备型HPLC进行纯化(方法A，20-50％MeCN的水溶液)，得到作为黄色固体的标题化合物(Z)-3-(((4-((2-(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯甲酸盐(25mg，23％)；Rt 1.86min(方法2)；m/z 600(M+H)+(ES+)；1H NMRδ:2.13(3H,s),2.30-2.50(8H,重叠m),2.36(2H,t),2.54(2H,m),3.47(2H,t),3.75(3H,s),3.92(2H,t),5.61(1H,s),6.87(2H,m),7.36(1H,s),7.50-7.56(4H,重叠m),7.57-7.70(4H,重叠m),8.17(1H,s),10.89(1H,s),12.21(1H,s)。
实施例8：(Z)-2-氧代-3-(苯基((4-((2-(哌啶-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)亚甲基)吲哚啉-6-甲酸甲酯，0.7甲酸
向(Z)-4-(((1-乙酰基-6-(甲氧基羰基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)(苯基)甲基)氨基)苯甲酸三氟乙酸加成物(中间体J)(100mg，0.2mmol)、HATU(80mg，0.21mmol)和Hünig碱(0.092mL，0.526mmol)在DMF(3mL)中的溶液添加O-(2-溴乙基)羟基胺HBr(中间体R)(27mg，0.123mmol)。将所述混合物在rt下搅拌1h。添加更多O-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)羟基胺HBr(20mg)。将反应混合物继续搅拌1小时。取出一半的反应混合物并添加到0.35mL哌啶，将反应混合物搅拌16h。蒸发掉溶剂，将残留物通过制备型HPLC进行纯化(方法A，15-70％MeCN的水溶液)，得到标题化合物(Z)-2-氧代-3-(苯基((4-((2-(哌啶-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)亚甲基)吲哚啉-6-甲酸甲酯0.7甲酸(1.6mg，2％)。Rt 1.66min(方法1)；m/z541(M+H)+(ES+)；1H NMRδ1.33-1.42(2H,重叠m),1.45-1.52(4H,重叠m),2.40-2.47(4H,重叠m),2.57(2H,t),3.77(3H,s),3.94(2H,t),5.87(1H,d),6.86(2H,m),7.21(1H,dd),7.42(1H,d),7.50-7.56(4H,重叠m),7.57-7.69(3H,重叠m),8.19(0.7H,s),11.04(1H,s),12.27(1H,s)。
实施例9：(Z)-5-甲基-3-(((4-(甲基(2-(4-(2-(甲基氨基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
中间体T：甲醛O-(2-羟基乙基)肟
将2-(氨基氧基)乙醇(3.16g，41.0mmol)和聚甲醛(1.23g，41.0mmol)在EtOH(50mL)中的混合物在回流下加热18h。在减压下除去溶剂，得到作为无色油状物的副标题化合物甲醛O-(2-羟基乙基)肟(3.56g，97％)；1H NMRδ:3.57(2H,q),4.05-3.96(2H,m),4.67(1H,t),6.57(1H,d),7.05(1H,d)。
中间体U：2-((甲基氨基)氧基)乙醇
在0℃下，向甲醛O-(2-羟基乙基)肟(中间体T)(3.56g，40.0mmol)在THF(25mL)中的溶液添加Py-BH3(6.05mL，59.9mmol)。在1h内添加4M HCl的二氧杂环己烷溶液(15mL)。将所述混合物升温至rt并搅拌24h，然后用MeOH(30mL)缓慢稀释并通过SCX柱过滤，用MeOH(250mL)洗涤。舍弃滤液，然后将柱用1％NH3的MeOH溶液(250mL)洗涤。在减压下除去溶剂，得到作为无色油状物的副标题化合物2-((甲基氨基)氧基)乙醇(0.833g，18％)；1H NMRδ:2.51(3H,m),3.50(2H,m),3.57(2H,m),4.53(1H,s),6.45(1H,m)。
中间体V：(Z)-1-乙酰基-3-(((4-((2-羟基乙氧基)(甲基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
向(Z)-4-(((1-乙酰基-6-(甲氧基羰基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)(苯基)甲基)氨基)苯甲酸三氟乙酸加成物(中间体P)(0.528g，0.903mmol)、2-((甲基氨基)氧基)乙醇(中间体U)(0.158g，1.36mmol)和HATU(0.378g，0.99mmol)在DMF(3mL)中的溶液逐滴添加Hünig碱(0.47mL，2.71mmol)。将所述混合物在rt下搅拌2h。在减压下除去溶剂，并将残留物在10％MeOH的EtOAc溶液(10mL)与水(10mL)之间分配。进行层分离，并将水性层用EtOAc(3x 10mL)萃取。将有机萃取物合并，然后在Na2SO4上干燥，过滤，并在减压下浓缩。将粗产物通过快速柱层析进行纯化(SiO2，24g，0-5％MeOH的DCM溶液，梯度洗脱)，得到作为黄色固体的副标题化合物(Z)-1-乙酰基-3-(((4-((2-羟基乙氧基)(甲基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(0.482g，88％)；Rt 2.38min(方法1)；m/z 544(M+H)+(ES+)。
中间体W：(Z)-1-乙酰基-3-(((4-((2-溴乙氧基)(甲基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
在0℃下，向(Z)-1-乙酰基-3-(((4-((2-羟基乙氧基)(甲基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(中间体V)(0.482g，0.887mmol)在DCM(10mL)中的溶液添加三苯基膦(0.256g，0.975mmol)和CBr4(0.323g，0.975mmol)。将混合物升温至rt并搅拌2h。在减压下除去溶剂，将粗产物通过快速柱层析进行纯化(SiO2，24g，0-2％MeOH的DCM溶液，梯度洗脱)，得到作为橙色固体的副标题化合物(Z)-1-乙酰基-3-(((4-((2-溴乙氧基)(甲基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(681mg，定量)；Rt 2.80min(方法2)；m/z 606/608(M+H)+(ES+)。
(Z)-5-甲基-3-(((4-(甲基(2-(4-(2-(甲基氨基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
向(Z)-1-乙酰基-3-(((4-((2-溴乙氧基)(甲基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(中间体W)(75mg，0.124mmol)和N-甲基-2-(哌嗪-1-基)乙酰胺2HCl(142mg，0.618mmol)在DMF(2mL)中的混合物添加Hünig碱(0.259mL，1.48mmol)。将所述混合物在60℃下加热5h。在冷却至rt后，添加哌啶(0.245mL，2.47mmol)，并将所述混合物在60℃下加热16h。将反应混合物冷却至rt，并在减压下除去溶剂。将残留物在EtOAc(10mL)与水/饱和NaHCO3水溶液(1:1，10mL)之间分配。进行层分离，并将水性相用EtOAc(3x 10mL)萃取。将有机萃取物合并，直接通过SCX柱过滤，用MeOH(50mL)洗涤。舍弃滤液，然后将柱用1％NH3的MeOH溶液(50mL)洗涤。在减压下除去溶剂，并将粗产物通过快速柱层析进行纯化(SiO2，12g，在DCM中的0-10％0.7M氨的MeOH溶液，梯度洗脱)，得到作为黄色固体的标题化合物(Z)-5-甲基-3-(((4-(甲基(2-(4-(2-(甲基氨基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(11mg，13％)；Rt 1.58min(方法1)；m/z 641(M+H)+(ES+)；1H NMRδ:2.14(3H,s),2.23-2.36(8H,重叠m),2.59(3H,d),2.87(2H,m),3.21(3H,s),3.31(2H,s),3.75(3H,s),3.78(2H,t),5.62(1H,s),6.86(2H,m),7.36(1H,s),7.42(2H,m),7.53(2H,m),7.58-7.66(3H,重叠m),10.89(1H,s),12.22(1H,s)。
实施例10：(Z)-5-甲基-3-(((4-(甲基(2-(4-(2-(甲基氨基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
中间体X：(4-(N-(2-羟基乙氧基)-N-甲基氨磺酰基)苯基)氨基甲酸叔丁基酯
向2-((甲基氨基)氧基)乙醇(中间体U)(0.116g，1.27mmol)在DMF(3mL)中的溶液添加Hünig碱(0.445mL，2.55mmol)，然后添加(4-氯磺酰基)苯基)氨基甲酸叔丁基酯(0.371g，1.27mmol)。将混合物在rt下搅拌16h。在减压下除去溶剂，并将残留物在DCM(10mL)与1M HCl水溶液(10mL)之间分配。进行层分离，并将水性层用DCM(2x 10mL)萃取。将有机萃取物合并，通过相分离器过滤。在减压下除去溶剂，并将粗产物通过快速柱层析进行纯化(SiO2，24g，0-70％EtOAc的己烷溶液，梯度洗脱)，得到作为粉红色胶质的副标题化合物(4-(N-(2-羟基乙氧基)-N-甲基氨磺酰基)苯基)氨基甲酸叔丁基酯，其在放置过夜后固化(246mg，41％)；Rt 1.97min(方法2)；m/z 347(M+H)+(ES+)；1H NMRδ:1.49(9H,s),2.71(3H,s),3.54(2H,q),3.93(2H,dd),4.68(1H,t),7.69-7.76(4H,重叠m),9.97(1H,s)。
中间体Y：4-氨基-N-(2-羟基乙氧基)-N-甲基苯磺酰胺，三氟乙酸盐
向(4-(N-(2-羟基乙氧基)-N-甲基氨磺酰基)苯基)氨基甲酸叔丁基酯(中间体X)(202mg，0.583mmol)在DCM(3mL)中的溶液添加TFA(0.449mL，5.83mmol)。将所述混合物在rt下搅拌4h。在减压下除去溶剂，并将残留物重新溶解在MeOH(3mL)中，通过SAX柱过滤，用MeOH(75mL)洗涤。在减压下除去溶剂，得到作为橙色胶质的副标题化合物4-氨基-N-(2-羟基乙氧基)-N-甲基苯磺酰胺三氟乙酸盐(0.23g，95％)；Rt 1.13min(方法2)；m/z 247(M+H)+(ES+)。
中间体Z：(Z)-1-乙酰基-3-(((4-(N-(2-羟基乙氧基)-N-甲基氨磺酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
将(E)-1-乙酰基-3-(乙氧基(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(中间体D)(0.231g，0.61mmol)和4-氨基-N-(2-羟基乙氧基)-N-甲基苯磺酰胺三氟乙酸盐(中间体Y)(0.219g，0.608mmol)在DMF(3mL)中的混合物用Hünig碱(0.106mL，0.608mmol)处理，并在80℃下加热18h。在减压下除去溶剂，并将粗产物通过快速柱层析进行纯化(SiO2，24g，0-2％MeOH的DCM溶液，梯度洗脱)，得到作为橙色胶质的副标题化合物(Z)-1-乙酰基-3-(((4-(N-(2-羟基乙氧基)-N-甲基氨磺酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(226mg，63％)；Rt 2.58min(方法2)；m/z 580(M+H)+(ES+)。
中间体AA：(Z)-1-乙酰基-3-(((4-(N-(2-溴乙氧基)-N-甲基氨磺酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
向(Z)-1-乙酰基-3-(((4-(N-(2-羟基乙氧基)-N-甲基氨磺酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(0.226g，0.390mmol)(中间体Z)在DCM(4mL)中的溶液添加三苯基膦(0.112g，0.429mmol)和CBr4(41μL，0.429mmol)。将混合物在rt下搅拌16h。添加另一部分的PPh3(0.112g，0.429mmol)和CBr4(41μL，0.429mmol)，并将混合物在rt下搅拌2h。在减压下除去溶剂，并将粗产物通过快速柱层析进行纯化(SiO2，12g，0-2％MeOH的DCM溶液，梯度洗脱)，得到作为黄色固体的副标题化合物(Z)-1-乙酰基-3-(((4-(N-(2-溴乙氧基)-N-甲基氨磺酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(161mg，64％)；Rt 3.01min(方法2)；m/z 642/644(M+H)+(ES+)。
(Z)-3-(((4-(N-(2-((2-羟基乙基)(甲基)氨基)乙氧基)-N-甲基氨磺酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯
将(Z)-1-乙酰基-3-(((4-(N-(2-溴乙氧基)-N-甲基氨磺酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(中间体AA)(77mg，0.120mmol)和2-(甲基氨基)乙醇(0.096mL，1.20mmol)在DMF(2mL)中的溶液在60℃下加热16h。在冷却至rt后，在减压下除去溶剂，并将残留物在EtOAc(10mL)与水/饱和NaHCO3水溶液(1:1，10mL)之间分配。进行层分离，将水性层用EtOAc(3x 10mL)萃取。将有机萃取物合并，通过SCX柱过滤，用MeOH(50mL)洗涤。舍弃滤液，然后将柱用1％NH3的MeOH溶液(50mL)洗涤。在减压下除去溶剂，并将粗产物通过快速柱层析进行纯化(SiO2，12g，在DCM中的0-10％0.7M氨的MeOH溶液)，得到作为黄色固体的标题化合物(Z)-3-(((4-(N-(2-((2-羟基乙基)(甲基)氨基)乙氧基)-N-甲基氨磺酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯(41mg，55％)；Rt 1.72min(方法1)；m/z 595(M+H)+(ES+)；1H NMRδ:2.14(3H,s),2.17-2.30(4H,重叠m),2.68(3H,s),3.43-3.54(2H,重叠m),3.76(3H,s),3.96-4.08(2H,重叠m),4.40(1H,m),5.65(1H,s),6.96(2H,m),7.36(1H,s),7.53-7.75(7H,重叠m),10.96(1H,s),12.29(1H,s),(丢失3H——推测与溶剂重叠)。
下述化合物实例(表2)可以通过与上面提到的实施例相似的合成方法或通过本文中别处描述的方法来制备：
表2：本发明的其他化合物实例
*路线代码索引：
路线1A：参见实施例1或实施例2
路线1B：参见实施例3、实施例4、实施例5或实施例6
路线1C：参见实施例7或实施例8
路线1D：参见实施例9
路线1E：参见实施例10
实施例号、结构、名称、路线代码、LC-MS分析和1H NMR波谱数据
实施例11：
路线代码*：1A
实施例12：
路线代码*：1B
实施例13：
路线代码*：1B
实施例14：
路线代码*：1B
实施例15：
路线代码*：1A
实施例16：
路线代码*：1B
实施例17：
路线代码*：1B
实施例18：
路线代码*：1B
实施例19：
路线代码*：1B
实施例20：
路线代码*：1B
实施例21：
路线代码*：1B
实施例22：
路线代码*：1B
实施例23：
路线代码*：1B
实施例24：
路线代码*：1B
实施例25：
路线代码*：1A
实施例26：
路线代码*：1B
实施例27：
路线代码*：1B
实施例28：
路线代码*：1B
实施例29：
路线代码*：1B
实施例30：
路线代码*：1B
实施例31：
路线代码*：1B
实施例32：
路线代码*：1B
实施例33：
路线代码*：1B
实施例34：
路线代码*：1B
实施例35：
路线代码*：1B
实施例36：
路线代码*：1B
实施例37：
路线代码*：1C
实施例38：
路线代码*：1C
实施例39：
路线代码*：1C
实施例40：
路线代码*：1C
实施例41：
路线代码*：1C
实施例42：
路线代码*：1C
实施例43：
路线代码*：1C
实施例44：
路线代码*：1C
实施例45：
路线代码*：1C
实施例46：
路线代码*：1C
实施例47：
路线代码*：1C
实施例48：
路线代码*：1A
实施例49：
路线代码*：1C
实施例50：
路线代码*：1C
实施例51：
路线代码*：1C
实施例52：
路线代码*：1C
实施例53：
路线代码*：1B
实施例54：
路线代码*：1C
实施例55：
路线代码*：1B
实施例56：
路线代码*：1D
实施例57：
路线代码*：1D
实施例58：
路线代码*：1D
实施例59：
路线代码*：1D
实施例60：
路线代码*：1D
实施例61：
路线代码*：1D
实施例62：
路线代码*：1D
实施例63：
路线代码*：1C
实施例64：
路线代码*：1B
实施例65：
路线代码*：1D
实施例66：
路线代码*：1D
实施例67：
路线代码*：1C
实施例68：
路线代码*：1B
实施例69：
路线*：1B
路线*：1C
实施例71：
路线*：1D
实施例72
路线*：1C
路线*：1C
生物学测试：实验方法
酶抑制测定
本文公开的化合物的酶抑制活性使用ADP-GloTM测定(Promega，UK)来确定。对于FGFR1、PDGFRα、PDGFRβ和VEGFR2来说，测定在含有40mM Tris pH 7.5、20mM MgCl2、0.1mg/mL BSA和1mM DTT的缓冲液中进行；而对于FGFR3和VEGFR1来说，测定在增补有2mM MnCl2的上述缓冲液中进行。
FGFR1酶抑制
本发明的化合物对FGFR1(FGFR1激酶系统：Promega)的抑制活性如下进行评估：将FGFR1蛋白(3.12ng/mL，2μL)、底物(聚(4:1Glu4,Tyr1)，100ng/mL，2μL)与测试化合物(2μL，浓度为3μM、0.67μM、0.15μM、0.033μM、0.0073μM、0.0016μM、0.0036μM或0.00008μM)在25℃下混合90min。然后通过添加ATP(50μM，2μL)启动激酶反应，并将所述混合物在25℃下温育1hr。添加ADP-GloTM试剂40min(8μL)，然后添加显色试剂(16μL)40min，随后在微孔板读板器(Multilabel Reader,Perkin Elmer)中检测。
FGFR3酶抑制
本发明的化合物对FGFR3(FGFR3激酶系统：Promega)的抑制活性如下进行评估：将FGFR3蛋白(12.5ng/mL，2μL)、底物(聚(Ala6,Glu2,Lys5,Tyr1)，100ng/mL，2μL)与测试化合物(2μL，浓度为3μM、0.67μM、0.15μM、0.033μM、0.0073μM、0.0016μM、0.0036μM或0.00008μM)在25℃下混合90min。通过添加ATP(50μM，2μL)启动激酶反应，并将所述混合物在25℃下温育90min。添加ADP-GloTM试剂40min(8μL)，然后添加显色试剂(16μL)40min，随后在微孔板读板器(Multilabel Reader,Perkin Elmer)中检测。
PDGFRα酶抑制
本发明的化合物对PDGFRα(PDGFRα激酶系统：Promega)的抑制活性如下进行评估：将PDGFRα蛋白(12.5ng/mL，2μL)、底物(聚(4:1Glu4,Tyr1)，100ng/mL，2μL)与测试化合物(2μL，浓度为3μM、0.67μM、0.15μM、0.033μM、0.0073μM、0.0016μM、0.0036μM或0.00008μM)在25℃下混合90min。通过添加ATP(25μM，2μL)启动激酶反应，并将所述混合物在25℃下温育1hr。添加ADP-GloTM试剂40min(8μL)，然后添加显色试剂(16μL)40min，随后在微孔板读板器(Multilabel Reader,Perkin Elmer)中检测。
PDGFRβ酶抑制
本发明的化合物对PDGFRβ(PDGFRβ激酶系统：Promega)的抑制活性如下进行评估：将PDGFRβ蛋白(6.25ng/mL，2μL)、底物(聚(4:1Glu4,Tyr1)，100ng/mL，2μL)与测试化合物(2μL，浓度为3μM、0.67μM、0.15μM、0.033μM、0.0073μM、0.0016μM、0.0036μM或0.00008μM)在25℃下混合90min。通过添加ATP(25μM，2μL)启动激酶反应，并将所述混合物在25℃下温育1hr。添加ADP-GloTM试剂40min(8μL)，然后添加显色试剂(16μL)40min，随后在微孔板读板器(Multilabel Reader,Perkin Elmer)中检测。
VEGFR1酶抑制
本发明的化合物对VEGFR1(VEGFR1激酶系统：Promega)的抑制活性如下进行评估：将VEGFR1蛋白(12.5ng/mL，2μL)、底物(IGFR1Rtide，100ng/mL，2μL)与测试化合物(2μL，浓度为3μM、0.67μM、0.15μM、0.033μM、0.0073μM、0.0016μM、0.0036μM或0.00008μM)在25℃下混合90min。通过添加ATP(50μM，2μL)启动激酶反应，并将所述混合物在25℃下温育90min。添加ADP-GloTM试剂40min(8μL)，然后添加显色试剂(16μL)40min，随后在微孔板读板器(Multilabel Reader,Perkin Elmer)中检测。
VEGFR2酶抑制
本发明的化合物对VEGFR2(VEGFR2激酶系统：Promega)的抑制活性如下进行评估：将VEGFR2蛋白(1.56ng/mL，2μL)、底物(聚(4:1Glu4,Tyr1)，100ng/mL，2μL)与测试化合物(2μL，浓度为3μM、0.67μM、0.15μM、0.033μM、0.0073μM、0.0016μM、0.0036μM或0.00008μM)在25℃下混合90min。通过添加ATP(50μM，2μL)启动激酶反应，并将所述混合物在25℃下温育1hr。添加ADP-GloTM试剂40min(8μL)，然后添加显色试剂(16μL)40min，随后在微孔板读板器(Multilabel Reader,Perkin Elmer)中检测。
在所有情况下，激酶将ATP转变成ADP，并且ADP-GloTM试剂随后耗尽任何剩余的ATP。检测试剂将已产生的ADP转变回ATP并产生荧光素酶，其可以作为发光进行检测。因此，发光信号与由酶反应产生的ADP的量成正比，并且在化合物处理后这个信号的降低证实了抑制。由每种浓度的化合物产生的抑制百分率使用下面示出的方程来计算：
然后将抑制百分率对化合物浓度作图，并从得到的浓度-响应曲线确定相对50％抑制浓度(RIC50)。在它已被确定后，使用下述方程计算Ki：
细胞和其他体外测定
PDGF-BB诱导的正常人肺成纤维细胞(NHLF)增殖
将NHLF(Lonza group Ltd)在增补有2％FBS的FGM-2生长培养基(加上SingleQuotTM生长因子；Lonza)中扩增直至90％合生。将成纤维细胞收获(胰蛋白酶/EDTA)，以每ml 25x103个细胞的密度悬浮在生长培养基中，并在96孔组织培养板的每个孔中添加200μl(5x103个细胞/孔)。在温育24hr(37℃/5％CO2/95％O2)后，通过将培养基中FBS浓度降低到0.1％，对细胞进行血清饥饿(24hr)。将细胞与测试化合物预温育1hr，然后用rhuPDGF-BB(100ng/ml，R&D Systems)刺激48hr。通过BrdU掺入评估细胞增殖(细胞增殖比色ELISA，Roche)。每种浓度下的测试化合物对rhuPDGF-BB诱导的NHLF增殖的抑制百分数被计算为，与介质对照(基础增殖)相比较，在每种测试化合物浓度下由rhuPDGF-BB实现的增殖的百分率。从得到的浓度-响应曲线确定相对50％抑制浓度(RIC50)。
PDGF-BB/FGF-Basic诱导的MRC-5人类胎儿肺成纤维细胞增殖
将MRC-5成纤维细胞(LGC Standards)在增补有10％FBS的DMEM培养基中扩增直至90％合生。将细胞收获(胰蛋白酶/EDTA)，以每ml 25x103个细胞的密度悬浮在生长培养基中，并在96孔组织培养板的每个孔中添加200μl(5x103个细胞/孔)。在温育24hr(37℃/5％CO2/95％O2)后，通过用含有0.1％FBS的培养基代替生长培养基，对细胞进行血清饥饿(3hr)。然后将细胞与测试化合物预温育1hr，然后用rhuPDGF-BB(100ng/ml，R&D Systems)或rhuFGF-basic(5ng/ml；R&D Systems)刺激48hr。通过BrdU掺入评估细胞增殖(细胞增殖比色ELISA，Roche)。每种浓度下的测试化合物对rhuPDGF-BB/rhuFGF诱导的MRC-5增殖的抑制百分数被计算为，与介质对照(基础增殖)相比较，在每种测试化合物浓度下由rhuPDGF-BB/FGF-basic实现的增殖的百分率。从得到的浓度-响应曲线确定相对50％抑制浓度(RIC50)。
VEGF165/FGF-Basic诱导的内皮细胞增殖
将TeloHAEC(端粒酶永生化的人类主动脉内皮细胞；ATCC)以每孔(100μl)4000个细胞的细胞密度接种在96孔组织培养板中的内皮细胞饥饿培养基(0.5％FBS，不含FGF和VEGF生长因子)中，并培养3hr(37℃/5％CO2/95％O2)。将细胞与测试化合物预温育1hr，然后用rhuVEGF165(10ng/mL，R&D Systems)或rhuFGF-basic(5ng/ml，R&D Systems)刺激48hr。通过BrdU掺入评估细胞增殖(细胞增殖比色ELISA，Roche)。每种浓度下的测试化合物对rhuVEGF165/rhuFGF-basic诱导的TeloHAEC增殖的抑制百分数被计算为，与介质对照(基础增殖)相比较，在每种测试化合物浓度下由rhuVEGF165/FGF-basic实现的增殖的百分率。从得到的浓度-响应曲线确定相对50％抑制浓度(RIC50)。
PDGF-BB诱导的成纤维细胞中PDGFRβ的磷酸化
MRC-5/NHLF/NIH-3T3(小鼠胚胎成纤维细胞，LGC Standards)被用于使用HTRF(均相时间分辨荧光)phospho-PDGFRβ(Tyr751)细胞测定试剂盒(Cisbio)评估测试化合物对PDGFRβ磷酸化的抑制效果。将MRC-5/NHLF以每孔10000个细胞的细胞密度分别接种到96孔组织培养板中的DMEM生长培养基(10％FBS)或FGM-2生长培养基(2％FBS)中，并培养48hr(37℃/5％CO2/95％O2)。将NIH-3T3以每孔7000个细胞的细胞密度接种到96孔组织培养板中的DMEM生长培养基(10％FBS)中，并培养48hr(37℃/5％CO2/95％O2)。将细胞培养基用含有0.1％FBS的相应的饥饿培养基替换，并对MRC-5/NHLF板继续温育24hr(37℃/5％CO2/95％O2)，对NIH-3T3板继续温育3hr。将细胞与测试化合物预温育1hr，然后用rhuPDGF-BB(25-50ng/mL，R&D Systems)刺激5min，对NIH-3T3来说用rmPDGF-BB(25ng/mL，LifeTechnologies)刺激。吸出培养基，并通过添加50μl在HTRF测定试剂盒中提供的裂解缓冲液，将细胞立即裂解。将来自于每个孔的16μl细胞裂解物转移到白色小体积384孔板，所述384孔板中已按照试剂盒说明书添加了专用试剂盒试剂。PDGFRβ的磷酸化通过计算在665nm和620nm处的荧光读数之比来定量。测试化合物对rPDGF-BB诱导的PDGFRβ磷酸化的抑制百分数被计算为，与介质对照相比较，在每种测试化合物浓度下由rPDGF-BB实现的磷酸化的百分率。从得到的浓度-响应曲线确定相对50％抑制浓度(RIC50)。
VEGF165诱导的内皮细胞中VEGFR2的磷酸化
TeloHAEC(端粒酶永生化的人类主动脉内皮细胞；ATCC)被用于使用HTRF(均相时间分辨荧光)phospho-VEGFR2(Tyr1175)细胞测定试剂盒(Cisbio)评估测试化合物对VEGFR2磷酸化的抑制效果。将TeloHAEC以每孔12000个细胞的细胞密度接种到96孔组织培养板中的内皮细胞生长培养基(ATCC；2％FBS)中，并培养48hr(37℃/5％CO2/95％O2)。将细胞培养基用含有0.5％FBS的饥饿培养基(不含VEGF和FGF生长因子)更换，并将板继续温育24hr(37℃/5％CO2/95％O2)。将细胞与测试化合物预温育1hr，然后用rhuVEGF165(50ng/mL，R&D Systems)刺激5min。吸出培养基，并通过添加50μl在HTRF测定试剂盒中提供的裂解缓冲液，将细胞立即裂解。将来自于每个孔的16μl细胞裂解物转移到白色小体积384孔板，所述384孔板中已按照试剂盒说明书添加了专用试剂盒试剂。VEGFR2的磷酸化通过计算在665nm和620nm处的荧光读数之比来定量。测试化合物对rhuVEGF165诱导的VEGFR2磷酸化的抑制百分数被计算为，与介质对照相比较，在每种测试化合物浓度下由rhuVEGF165实现的磷酸化的百分率。从得到的浓度-响应曲线确定相对50％抑制浓度(RIC50)。
成纤维细胞凝胶收缩测定
将NHLF在增补有2％FBS(加上SingleQuotTM生长因子)的FGM-2生长培养基(Lonza)中扩增直至90％合生。将成纤维细胞收获(胰蛋白酶/EDTA)，以每ml 1x106个细胞的密度悬浮在无血清培养基中。基于细胞收缩测定试剂盒(Cell Biolabs)，通过按照试剂盒所描述将1份细胞悬液+4份胶原蛋白凝胶溶液混合来制备细胞网格。向1.5ml离心管添加0.9ml所述胶原蛋白网格的等分试样，并用最终测定浓度的测试化合物处理。然后将250μl化合物处理过的网格吸取到48孔组织培养板的每个孔中(每种测试浓度三份平行样)。将板温育90min(37℃/5％CO2/95％O2)，以允许所述凝胶聚合。然后向每个相应的凝胶添加250μl含有最终测定浓度的测试化合物的无血清培养基。在进一步温育30min后，将所述凝胶用TGFβ1(10ng/ml；R&D Systems)刺激。在24hr(37℃/5％CO2/95％O2)温育期后，取出将每个单独凝胶并在精密天平上称重。每种浓度下测试化合物的效应被表示成TGFβ1诱导的收缩相对于介质处理的基础收缩的回撤百分数。
成纤维细胞IL-6释放测定
将NHLF在增补有2％FBS(加上SingleQuotTM生长因子)的FGM-2生长培养基(Lonza)中扩增直至90％合生。将成纤维细胞收获(胰蛋白酶/EDTA)，以每ml 50x103个细胞的密度悬浮在生长培养基中，并在96孔组织培养板的每个孔中添加200μl(5x103个细胞/孔)。在温育24hr(37℃/5％CO2/95％O2)后，通过将培养基的FBS浓度降低到0.1％，对细胞进行血清饥饿(24hr)。将细胞与测试化合物预温育1hr，然后用TGFβ1(5ng/ml，R&D Systems)刺激24hr。回收无细胞上清液，用于通过夹心ELISA(Duo-set，R&D systems)确定IL-6浓度。IL-6生产的抑制被计算为，与介质对照相比较，在每种测试化合物浓度下由5ng/ml TGFβ1实现的IL-6生产的百分率。从得到的浓度-响应曲线确定相对50％抑制浓度(RIC50)。
肥大细胞凋亡
肥大细胞从脐带血CD34+细胞(Lonza)，在增补有100ng/ml SCF和10ng/ml IL-6的生长培养基中分化8周。将肥大细胞以2500至10000个细胞/孔的密度接种在384孔白色透明底板中含有SCF(100ng/ml)的生长培养基中。作为凋亡的阳性对照，将8个孔在不含SCF的生长培养基中温育。将细胞与测试化合物或介质温育24hr(37℃/5％CO2/95％O2)。向细胞添加半胱天冬酶-3/7发光底物(半胱天冬酶-Glo 3/7测定，Promega)并在室温下温育30min，然后读取发光信号。测试化合物对凋亡的诱导被计算为与介质(基线凋亡)相比，在每种测试化合物浓度下在不存在SCF的情况下温育的细胞所实现的凋亡(最大凋亡响应)的百分率。从得到的浓度-响应曲线确定相对50％抑制浓度(RIC50)。
测试化合物对细胞存活性的影响
将MRC-5细胞以每孔12x 103个细胞的细胞密度接种在白色透明底(用于荧光/发光读数)或透明(用于比色读数)96孔组织培养板中的DMEM生长培养基(10％FBS)中。温育24hr(37℃/5％CO2/95％O2)后，将生长培养基用含有0.1％FBS加上测试化合物/介质的培养基替换，并继续温育48hr。对于比色MTT测定(细胞代谢活性的评估)来说，从每个孔吸出上清液，用100μl/孔的新鲜培养基(0.1％FBS)和10μl/孔的5mg/ml MTT替换。在1hr温育期(37℃/5％CO2/95％O2)后，吸出培养基，并向每个孔添加100％DMSO(100μl)。将板轻轻振摇15分钟，然后在550nm处读取吸光度。为每种化合物浓度计算相对于介质(0.5％DMSO)处理的细胞的细胞存活性丧失百分率(由吸光度值的减少表示)。
使用与半胱天冬酶-Glo 3/7测定法(Promega)相结合的MultiTox-Fluor多路细胞毒性测定法来测量细胞的细胞毒性/存活性和凋亡。所述MultiTox-Fluor多路细胞毒性测定法是一种添加单一试剂的荧光测定法，其同时测量细胞群体中活细胞和死细胞的相对数目。所述测定法给出细胞存活性和细胞毒性的比率计量的反相关的度量。活细胞与死细胞之比不依赖于细胞数目，因此可用于将数据归一化。以“添加-混合-测量”的格式添加单一半胱天冬酶-3/7试剂引起细胞裂解，随后半胱天冬酶切割底物并产生“辉光类型”的发光信号。对于这种多路细胞毒性测定法来说，从每个孔小心地取出来自于48hr化合物处理的细胞的100μl细胞上清液，然后添加50μl MultiTox试剂(专用MultiTox试剂的工作溶液通过按照试剂盒说明书将10μl GF-AFC和bis AAF-R110在10ml测定缓冲液中稀释来制备)。将细胞在暗处温育30分钟，然后在400Ex/505Em(活细胞读取)和485Ex/520Em(死细胞读取)处获取两个分开的荧光读数。接下来，从每个孔小心地取出100μl上清液，向细胞板添加50μl半胱天冬酶3/7Glo试剂并在暗处温育30分钟。半胱天冬酶3/7活性通过读取发光信号来定量。与介质处理的对照细胞相比信号的提高，代表细胞凋亡的增加。
成纤维细胞向成肌纤维细胞的转变测定
为了评估测试化合物的抗纤维化活性，使用两种可选的流程。在第一种流程中，将分离的肺成纤维细胞以3000个细胞/孔的密度接种在96孔板上。接种后5天，将细胞更换培养基，并向细胞添加测试化合物或介质。在1小时后，添加TGF-β1(1.25ng/mL)以诱导成纤维细胞向成肌纤维细胞的转变。成肌纤维细胞转变的标志物αSMA的表达，在72小时后通过免疫染色进行测量，通过在IN Cell Analyzer 2200(GE Healthcare)上的高内涵成像来评估，并用IN Cell developer软件(GE Healthcare)使用专用(BioFocus)算法来定量。所述算法的输出代表染色强度乘以被染色的面积(DxA水平)。使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核的共染色，以便定量细胞数目作为潜在毒性的度量，和/或针对细胞密度的差异将αSMA归一化。
在可选流程中，将分离的肺成纤维细胞以5100个细胞/孔的密度接种在96孔板上。24小时后，将细胞更换为饥饿培养基继续温育24小时。向细胞添加测试化合物或介质。在1小时后，添加TGF-β1(0.1ng/mL)以诱导成纤维细胞向成肌纤维细胞的转变。成肌纤维细胞转变的标志物αSMA的表达，在48小时后通过免疫染色进行测量，通过在ImageXpres micro(Molecular Devices)上的高内涵成像来评估，并使用MetaXpress软件(MolecularDevices)来定量。阳性细胞百分数被用于评估αSMA染色以及因此成纤维细胞向成肌纤维细胞转变的程度。使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核的共染色，以便定量细胞数目作为潜在毒性的度量，和/或针对细胞密度的差异将αSMA归一化。
在人类胎儿肺成纤维细胞中评估测试化合物对PDGF-BB诱导的PDGFRβ磷酸化的作用持续时间
为了确定药物暴露对PDGF-BB诱导的PDGFRβ磷酸化的影响的相对持久性，使用了冲刷实验，其利用MRC-5人类胎儿肺成纤维细胞和均相HTRF(均相时间分辨荧光)phospho-PDGFRβ(Tyr751)细胞测定试剂盒(Cisbio)，所述试剂盒检测PDGF-BB诱导的PDGFRβ磷酸化的受体调节。
冲刷流程
将MRC-5细胞最初用胰蛋白酶释放出来并用完全培养基(DMEM生长培养基，10％FBS)中和。将1.2x106个细胞置于微量离心管中，使用台式离心机以10,000rpm离心30sec，移除上清液，并将细胞在1ml预加温(37℃)的洗涤缓冲液(HBSS pH7.4，0.1％BSA和0.04％普朗尼克酸)中洗涤，以除去任何残留的FBS。然后将细胞再次离心，移除上清液并与500μL介质、测试对照化合物和测试化合物(在提供70％抑制的浓度下)在37℃下在轻柔振摇的同时温育1hr。在温育后，将细胞均匀分散，从每个管取出100μL等分试样，用于未洗涤对照。然后对剩余的细胞进行5次重复的洗涤步骤，其中将细胞离心，移除上清液并重悬浮在1ml新鲜的预加温(37℃)的洗涤缓冲液中。为了避免由粘附于塑料造成的化合物携带的影响，在每个洗涤步骤后将细胞转移到新的管中，并在洗涤之间置于37℃摇床(900rpm)中温育10分钟，以允许细胞与缓冲液之间的重新平衡。在最后一个洗涤步骤之后，将细胞重悬浮在360ul预加温的洗涤缓冲液中。将来自于未洗涤和洗涤管两者的5μL悬液置于384孔白色聚丙烯微量滴定板(Greiner)中，并在37℃下温育15分钟。然后将细胞用5μL rhuPDGF-BB(3ng/ml，R&D Systems)刺激5min，随后通过添加10μl在HTRF测定试剂盒中提供的裂解缓冲液，将细胞立即裂解。将细胞在板摇床(rpm 1450)上放置1hr，随后将板简短离心30sec(3000rpm)，并按照试剂盒说明书添加专用HTRF试剂盒试剂。PDGFRβ的磷酸化通过计算在665nm和620nm处的荧光读数之比来定量。测试化合物对rhuPDGF-BB诱导的PDGFRβ磷酸化的抑制百分率被计算为在3μg/ml rhuPDGF-BB下实现的抑制相对于测试介质对照的百分率。表7示出的数据是相对于对照的最大磷酸化，冲刷后的磷酸化百分率(其等于100减去上面提到的抑制百分率数字)。
PAMPA渗透性测定
这种测定测量跨过人造膜的渗透性，并通过Cyprotex使用平行人造膜渗透性测定法来进行。它是一种通过人造十六烷膜的被动跨细胞渗透的体外模型(Wohnsland F等，Med.Chem.,2001 44；923-930)。化合物可以被分类成低和高渗透性。通常，具有Papp<10x10-6cm/s的化合物被分类为低渗透性，具有Papp>10x 10-6cm/s的化合物被分类为高渗透性。具有低渗透性的化合物据信由于它们较缓慢的吸收而有可能在肺中具有长的停留时间(Tronde Ann等，J Pharm.Sci.,2003,92(6),1216-33)。
流程概述
将测试化合物添加到包被有人造PAMPA膜的滤器的供体侧，并通过使用LC-MS/MS监测测试化合物在细胞膜的受体侧上的出现来测量渗透性。
实验程序
制备十六烷的己烷溶液(5％v/v)，并将等分试样添加到过滤(供体)板(用于渗透性的Multiscreen过滤板，Millipore)中每个孔的膜上。然后允许所述供体板干燥，以确保己烷蒸发。
向受体板的每个孔添加含有DMSO(5％)的缓冲液(pH 7)。通过将10mM DMSO浓溶液在缓冲液中稀释来制备测试化合物溶液，其给出10μM的最终测试化合物浓度(最终DMSO浓度为5％)。荧光整体性标志物萤光黄也被包含在所述测试化合物溶液中。将供体板插入到受体板中，然后将所述板在室温下温育5hr。分析标准品从测试化合物溶液制备。测试化合物的渗透性一式四份进行评估。在每块板上运行渗透性特征已知的化合物作为对照。
在温育期结束时，将供体板从受体板取出。将测试和对照化合物的供体和受体样品，通过LC-MS/MS盒式分析，使用5-点校准，利用样品的适当稀释液来定量。从供体和受体区室两者的浓度计算实验回收率。
如果对于1、2或3个单独的测试化合物孔来说萤光黄渗透性高于QC限，则报告n＝3、2或1的结果。
数据分析
每种化合物的表观渗透系数(Papp)从下述方程计算：
其中
其中VD和VA分别是供体和受体区室的体积，面积是膜的表面积乘以孔隙率，并且平衡药物浓度是供体和受体区室的总体积中测试化合物的浓度。
体内筛选：药效学和药代动力学
小鼠中博来霉素诱导的纤维化(肺纤维化的小鼠模型)
在第0天，将C57BL6/J小鼠通过气管内途径给药介质或硫酸博来霉素(MPBiomedicals，2U/kg)。从第5天直到第20天，每天一次鼻内给药化合物(作为水性溶液或悬液，25-50ul)。在24hr后，将动物麻醉，对它们的气管插管，并使用计算机控制的活塞式呼吸机(flexiVent，SCIREQ Inc.，Montreal，Canada)对动物进行机械通气。在肺功能测量后，对小鼠抽血并抽取支气管肺泡灌洗液(BALF)。使用Neubaur血细胞计数器测量BALF样品中的总的和差异白细胞计数。通过离心制备BALF样品的细胞离心涂片，并使用DiffQuik染色系统(Dade Behring)进行染色。使用油浸显微镜对细胞计数。保存残余的BALF上清液用于细胞因子分析。
在25cm水压下使用10％的中性缓冲的福尔马林通过气管插管使整个肺膨胀，并在福尔马林中浸泡至少24h。在加工成石腊块后，将肺切片(5μm)并用苏木精和曙红(H&E)或天狼星红(PSR)染色。随机获取4个横断面的恒定数目的图片。图片由2位不知情的调查人员从0(无PF)至8(最大PF)进行评分，以评估肺中的纤维化变化。此外，使用标准方法进行α-平滑肌肌动蛋白的染色(Thermo Scientific,Freemont,CA)。全肺匀浆液中的可溶性胶原蛋白，通过Sircol胶原蛋白测定体系(Biocolor Ltd,Carrickfergus,UK)来评估。
小鼠中PDGFBB诱导的PDGFRβ磷酸化
将7至12周龄的C57BL/6小鼠(Charles River)饲养在12小时光/暗循环下，并随意取用食物和水。制备化合物的水性溶液或悬液，以根据组中小鼠的平均体重递送指定的剂量(mg/kg)。将动物麻醉，并将化合物或介质鼻内给药(50ul)。在指定时间点复苏后，将动物再次麻醉，将重组小鼠PDGF-BB(50ug/动物，Cambridge Biosciences)或介质气管内给药，然后在PDGF-BB滴注后5至30分钟，获取末梢血样品并将整个肺切下。通过离心从血液分离血浆。将大约一半的左叶使用FastPrep-24 5G仪器在Matrix D裂解管(MP Biomedicals)中匀浆。使用抗磷酸化PDGFRα(Y849)/β(Y857)、抗全PDGFRβ/α和抗GAPDH抗体(CellSignaling)，通过蛋白质印迹来测量PDGFRβ的磷酸化水平。PDGFRβ的磷酸化水平被报告为与总PDGFRβ水平或与GAPDH的比率。对每种处理来说，相对于介质处理计算PDGFRβ磷酸化的抑制百分率。血浆或肺匀浆液中的化合物水平的测量值，通过LC-MS/MS来确定。
啮齿动物中的药代动力学测量
将雄性CD大鼠或C57BL/6J小鼠用于药代动力学研究，其中动物对于大鼠来说通过气管内、口服或静脉内给药，对于小鼠来说通过鼻内、口服或静脉内给药。
通过外侧尾静脉对动物进行静脉内给药。通过气管内或鼻内途径给药的动物在给药之前被麻醉，麻醉剂在大鼠研究中使用异氟烷和一氧化二氮，或在小鼠研究中使用氧。
将动物在外侧尾静脉中插管，并在每个取样时间点之前约5分钟置于热箱(37-40℃)中，以使尾静脉膨胀。将化合物配制成用于静脉内给药的溶液和用于所有其他方法的溶液或悬液。在给药当天将动物称重并接受单次制剂给药，制剂体积按照个体的体重进行调整(表3)。对于系列样品来说，在24小时内，在预定的时间点，从插管端口获取150-200μl大鼠血液样品或20μl小鼠血液样品(并添加相同体积的水)到K2EDTA包被的微量采血管中。仅在大鼠研究中，通过离心(8200rcf 5分钟)分离血浆。
在结束时，通过下腔静脉收集血液样品到K2EDTA包被的微量采血管中，并通过对大鼠使用3x 4ml的4％BSA PBS溶液滴注和对小鼠使用3x 0.4ml的4％BSA PBS溶液滴注，经由气管冲洗肺，来获得BAL液。将肺切下，称重并记录重量，并在液氮中速冻。
血浆或血液、肺匀浆液和BAL液中的化合物水平的测量值，通过LC-MS/MS来确定。使用含有适合的内标的过量溶剂，通过蛋白质沉淀来提取药物。针对外部基质匹配的标准曲线来确定药物浓度。
将所述药物浓度在半对数图上对时间作图(参见图1、2和3)。使用非区室分析来计算标准的药代动力学参数。在每个时间点处肺和BAL液中的浓度被表示为给药剂量的百分率。
结果
酶抑制测定中以及细胞和其他体外测定中的测试结果示出在下面的表4至10中和图1至4中。
表4本发明的化合物和尼达尼布对FGFR1、FGFR3、PDGFRα、PDGFRβ、VEGFR1和VEGFR2的抑制活性
ND：未测定；除非另有指明，否则n＝2(平均值)；*n＝34
表5本发明的化合物和尼达尼布对MRC5细胞中由PDGFBB诱导的成纤维细胞中PDGFRβ的磷酸化和由VEGF165诱导的内皮细胞中VEGFR2的磷酸化的抑制效果
ND：未测定；除非另有指明，否则n＝1。
表6本发明的化合物和尼达尼布对MRC5细胞的细胞存活性的影响(MTT测定法)
ND：未测定；除非另有指明，否则n＝1
表7在人类胎儿肺成纤维细胞中实施例化合物作为PDGF-BB诱导的PDGFRβ磷酸化的抑制剂的作用持续时间。相对于3μg/ml rhuPDGF-BB测试介质对照的最大磷酸化(100％)，冲刷后的磷酸化百分率。
由于较低的值指示PDGFRβ磷酸化的较高的抑制百分率，因此表7的数据揭示，在这个测定中，实施例化合物4和6作为PDGFRβ的抑制剂具有比尼达尼布更长的作用持续时间。
表8本发明的化合物在PAMPA渗透性测定中的Papp的确定
ND＝未测定*对某些化合物来说示出了来自于重复实验的值
表9在静脉内(i.v.)和气管内(i.t.)给药本发明的化合物或尼达尼布的大鼠中24小时时间段内的药代动力学测量值
ND：未测定
NC：由于一个参数是BLQ而不可计算
BLQ：低于定量水平
表10在静脉内(i.v.)和鼻内((i.n.)给药本发明的化合物或尼达尼布的小鼠中24小时时间段内的药代动力学测量值
ND：未测定
NC：由于一个参数是BLQ而不可计算：
BLQ：低于定量水平
sd：标准偏差
结果概述
本文中公开的本发明的化合物对FGFR1、FGFR3、PDGFRα、PDGFRβ、VEGFR1和VEGFR2表现出抑制活性(表4和表5)和纳摩尔级的效力。绝大多数测试化合物在细胞存活性测定中没有显示出不利效应(表6)。此外，所述化合物通常具有低的跨膜渗透性(表8和图1)。某些化合物相对于尼达尼布显示出作用持续时间增加的证据，如对于人类胎儿肺成纤维细胞的PDGF-BB诱导的磷酸化的抑制所确定的(参见表7)。药代动力学测量显示，在局部递送后，在对象接受药剂后24小时，发现本发明的化合物通常具有比尼达尼布更高的肺中残留的相对含量(表9和10以及图2至4)。在24h时间段内注意到的低的BAL水平与量的减少一起，表明伴随着本发明的化合物发生了在肺组织中的快速溶解和吸收。
这种情况表明，本发明的化合物预期适合作为医药，尤其是用于治疗纤维化疾病或间质性肺病例如IPF或呼吸障碍，特别是当局部递送到肺时。
参考文献
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在整个本说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则短语“包含”及其变化形式例如“包括”应该被理解为暗示包含所陈述的整数、步骤、整数组或步骤组，但不排除任何其他整数、步骤、整数组或步骤组。
本文中提及的所有专利和专利申请通过参考以其整体并入本文。

Claims (42)

1.一种式(I)的化合物或其可药用盐：
其中
R1表示H、Me、Et、CH＝CH2、C≡C-H或C≡C-Me；
R2表示H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、-CH2-(C3-C8环烷基)、卤素或氰基；
R3表示(i)
或(ii)
或(iii)
Q表示选自O、N和S的杂原子，并且其中N可以任选地被C1-4烷基取代；
Z表示CO或SO2；
Y1表示(CH2)n，并且除了当n表示0时之外，Y1可以任选地被Me取代；
X1表示(CH2)m，并且除了当m表示0时之外，X1可以任选地被Me取代；
n和m独立地表示0、1、2、3、4或5；
Y2表示(CH2)s，并且可以任选地被Me取代；
s表示2、3、4、5或6；
Y3表示(CH2)t，并且可以任选地被Me取代；
X2表示(CH2)v，并且可以任选地被Me取代；
t和v独立地表示2或3，只不过t+v＝4或5；
R4表示H、OH、NR6R7或含有选自O、N和S的一个或多个杂原子的脂族4-8元杂环，只不过当R4是OH或NR6R7时，m是2、3、4或5；
R5表示H、OH、NR8R9或含有选自O、N和S的一个或多个杂原子的脂族4-8元杂环，只不过当R5是OH或NR8R9时，n是2、3、4或5；
其中R4和R5可以表示的脂族杂环基团可以任选地含有羰基或砜基，并且可以任选地被选自-C1-C4烷基、C1-C4羟基烷基-、C1-C4烷氧基(C1-C4)烷基-、-C1-C4亚烷基CONR10R11、CN、OH和NR12R13的一个或多个基团取代；
R6、R7、R8、R9独立地表示H或任选地被OH、氧代、NR14R15或-C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基；并且
R10、R11、R12、R13、R14和R15独立地表示H或C1-C4烷基。
2.权利要求1的式(I)的化合物，其中R1表示Me或H。
3.权利要求2的式(I)的化合物，其中R1表示Me。
4.权利要求1至3任一项的式(I)的化合物，其中R2表示H、Me或F，特别是H。
5.权利要求1至4任一项的式(I)的化合物，其中Z表示CO。
6.权利要求1至4任一项的式(I)的化合物，其中Z表示SO2。
7.权利要求1至6任一项的式(I)的化合物，其中R3由式(i)表示。
8.权利要求7的式(I)的化合物，其中X1表示(CH2)0、CH2、CH(CH3)CH2或(CH2)2，特别是(CH2)0或CH2，优选为(CH2)0。
9.权利要求7或8的式(I)的化合物，其中R4表示H、N-甲基-哌啶或二甲基胺，特别是H。
10.权利要求7至9任一项的式(I)的化合物，其中组成部分-X1-R4表示H、Me、CH2CH3、异丙基、1-甲基-哌啶-4-基或N,N-二甲基胺，特别是H或Me，优选为H。
11.权利要求7至10任一项的式(I)的化合物，其中Y1表示(CH2)0、CH2、(CH2)2或(CH2)3，特别是(CH2)2。
12.权利要求7至11任一项的式(I)的化合物，其中R5表示H、二甲基胺、N-甲基乙醇胺、N-甲基-哌嗪、N-甲基-哌啶、1,2,6-三甲基哌嗪、N-乙基-哌嗪、3-(N,N-二甲基胺)-吡咯烷、N-(CH2CH2OH)-哌嗪、哌啶、吗啉、4-羟基-哌啶、4-氰基-哌啶、2,6-二甲基-哌啶、N-甲氧基乙基-哌嗪、2-甲基-哌嗪、N-甲基-2-(N-哌嗪基)乙酰胺、4-(N,N-二甲基胺)-哌啶、4-甲氧基-哌啶、S-二氧基-硫代吗啉、N-哌嗪-3-酮、2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚烷或3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛烷、3,6-二氮杂二环[3.1.1]庚基，特别是二甲基胺或N-甲基-哌嗪，优选为二甲基胺。
13.权利要求7至12任一项的式(I)的化合物，其中组成部分-Y1-R5表示Me、-(CH2)2-二甲基氨基、-(CH2)3-二甲基氨基、-(CH2)2-(N-甲基)-乙醇氨基、-(CH2)2-哌嗪-1-基、-(CH2)2-(4-甲基)-哌嗪-1-基、-(CH2)2-(3-甲基)-哌嗪-1-基、-(CH2)3-(4-甲基)-哌嗪-1-基、-(CH2)2-(1-甲基)-哌啶-4-基、N-甲基-哌啶-4-基、-(CH2)2-(4-乙基)-哌嗪-1-基、-(CH2)2-3-(N,N-二甲基氨基)-吡咯烷-1-基、-(CH2)2-(4-(CH2CH2OH)-哌嗪-1-基)、-(CH2)2-3,4,5-三甲基哌嗪-1-基、-(CH2)2-哌啶-1-基、-(CH2)3-哌啶-1-基、-(CH2)2-吗啉-4-基、-(CH2)2-(4-羟基-哌啶-1-基)、-(CH2)2-(4-氰基-哌啶-1-基)、-(CH2)2-(2,6-二甲基-哌啶-1-基)、-(CH2)2-(4-甲氧基乙基-哌嗪-1-基)、-(CH2)2-4-(N,N-二甲基氨基-哌啶-1-基)、-(CH2)2-(4-甲氧基-哌啶-1-基)、-(CH2)3-(4-甲氧基-哌啶-1-基)、-(CH2)2-4-(N-甲基乙酰胺基)-哌嗪-1-基))、-(CH2)2-(4-二氧基-硫代吗啉-1-基)、-(CH2)2-(3-氧代哌嗪-1-基)、-(CH2)2-(2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)、-(CH2)2-(3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛-8-基)、(CH2)2-(3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)、(CH2)2-3,6-二氮杂二环[3.1.1]庚-3-基，特别是-(CH2)2-二甲基氨基或-(CH2)2-(4-甲基-哌嗪-1-基)，更优选为-(CH2)2-二甲基氨基。
14.权利要求7至13任一项的式(I)的化合物，其中在式(i)表示的组成部分中：(a)-X1-R4表示H，并且-Y1-R5表示-(CH2)2-二甲基氨基、-(CH2)3-二甲基氨基、-(CH2)2-(N-甲基)-乙醇氨基、-(CH2)2-4-甲基-哌嗪-1-基、-(CH2)3-(4-甲基)-哌嗪-1-基、N-甲基-哌啶-4-基、-(CH2)2-3,4,5-三甲基哌嗪-1-基、-(CH2)2-4-乙基-哌嗪-N-基、-(CH2)2-3-(N,N-二甲基氨基)-吡咯烷-1-基、-(CH2)2-(4-(CH2CH2OH)-哌嗪-1-基)、-(CH2)2-哌啶-1-基、-(CH2)3-哌啶-1-基、-(CH2)2-吗啉-4-基、-(CH2)2-(4-羟基-哌啶-1-基)、-(CH2)2-4-氰基-哌啶-1-基、-(CH2)2-(2,6-二甲基-哌啶-1-基)、-(CH2)2-4-甲氧基乙基-哌嗪-1-基、-(CH2)2-4-(N,N-二甲基氨基)-哌啶-1-基、-(CH2)2-4-甲氧基-哌啶-1-基、-(CH2)3-4-甲氧基-哌啶-1-基、-(CH2)2-4-二氧基-硫代吗啉-1-基、-(CH2)2-(3-氧代哌嗪-1-基)，特别地-X1-R4表示H，并且-Y1-R5表示-(CH2)2-二甲基氨基或-(CH2)2-4-甲基-哌嗪-1-基，更优选地-X1-R4表示H并且-Y1-R5表示-(CH2)2-二甲基氨基；或(b)-X1-R4表示Me，并且-Y1-R5表示Me、-(CH2)2-二甲基氨基、-(CH2)2-(N-甲基)-乙醇氨基、-(CH2)2-哌嗪-1-基、-(CH2)2-4-甲基-哌嗪-1-基、-(CH2)2-(3-甲基)-哌嗪-1-基、-(CH2)2-(4-(CH2CH2OH)-哌嗪-1-基)、-(CH2)2-(4-(N-甲基乙酰胺基)-哌嗪-1-基))、-(CH2)2-(2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)、-(CH2)2-(3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛-8-基)、(CH2)2-(3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)、(CH2)2-3,6-二氮杂二环[3.1.1]庚-3-基，特别地-X1-R4表示Me，并且-Y1-R5表示(CH2)2-二甲基氨基或-(CH2)2-4-甲基-哌嗪-1-基，更优选地-X1-R4表示Me并且-Y1-R5表示-(CH2)2-4-甲基-哌嗪-1-基；或(c)-X1-R4表示1-甲基-哌啶-4-基并且-Y1-R5表示Me；或(d)-X1-R4表示N,N-二甲基氨基并且-Y1-R5表示Me；或(e)-X1-R4表示CH2CH3并且-Y1-R5表示(CH2)2-哌嗪-1-基；或(f)-X1-R4表示异丙基并且-Y1-R5表示(CH2)2-哌嗪-1-基，特别是组成部分(a)。
15.权利要求1至6任一项的式(I)的化合物，其中R3由式(ii)表示。
16.权利要求15的式(I)的化合物，其中s表示2。
17.权利要求1至6任一项的式(I)的化合物，其中R3由式(iii)表示。
18.权利要求17的式(I)的化合物，其中t表示2并且v表示2。
19.权利要求16至18任一项的式(I)的化合物，其中Q是N或O，特别是N。
20.权利要求1的式(I)的化合物，所述化合物选自：
(Z)-3-(((4-(甲氧基(甲基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-5-甲基-3-(((4-(N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨磺酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙氧基)氨基甲酰基)-3-甲基苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-5-甲基-3-(((4-((2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-2-氧代-3-(苯基((4-((2-(哌啶-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)亚甲基)吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-5-甲基-3-(((4-(甲基(2-(4-(2-(甲基氨基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-5-甲基-3-(((4-(甲基(2-(4-(2-(甲基氨基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-(N-甲氧基-N-甲基氨磺酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-吗啉代乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙氧基)氨基甲酰基)-3-甲基苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-(甲基(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-(N-(2-(二甲基氨基)乙氧基)氨磺酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((3-甲基-4-((2-吗啉代乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((3-甲基-4-((2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((3-甲基-4-(甲基(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((3-(二甲基氨基)丙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙氧基)氨基甲酰基)-3-氟苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-(甲氧基(1-甲基哌啶-4-基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙氧基)(甲基)氨基甲酰基)-3-甲基苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-(5-甲基-1,2,5-氧杂二氮杂环庚烷-2-羰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-(N-甲基-N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨磺酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((3-(二甲基氨基)丙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-5-甲基-3-(((3-甲基-4-((2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((3-(二甲基氨基)丙氧基)氨基甲酰基)-3-甲基苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-5-甲基-3-(((4-(((1-甲基哌啶-4-基)氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-5-甲基-3-(((3-甲基-4-(((1-甲基哌啶-4-基)氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((3-氟-4-((2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((3-氟-4-((2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-(甲氧基(1-甲基哌啶-4-基)氨基甲酰基)-3-甲基苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-(甲氧基(1-甲基哌啶-4-基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(4-乙基哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-(1,2-氧氮杂环丁烷-2-羰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(S,Z)-3-(((4-((2-(3-(二甲基氨基)吡咯烷-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(4-羟基哌啶-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(1,1-二氧化硫代吗啉代)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-2-氧代-3-(((4-((2-(3-氧代哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(4-氰基哌啶-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-((2S,6R)-2,6-二甲基哌啶-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-甲基-3-(((4-((2-((2-羟基乙基)(甲基)氨基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(4-(2-甲氧基乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-(N-(2-(二甲基氨基)乙氧基)氨磺酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-5-甲基-2-氧代-3-(苯基((4-((2-(哌啶-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)亚甲基)吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(S,Z)-3-(((4-((2-(3-(二甲基氨基)吡咯烷-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(4-甲氧基哌啶-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-5-甲基-2-氧代-3-(苯基((4-((3-(哌啶-1-基)丙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)亚甲基)吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(4-羟基哌啶-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((3-(4-甲氧基哌啶-1-基)丙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-((2-羟基乙基)(甲基)氨基)乙氧基)(甲基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-5-甲基-3-(((4-(甲基(2-(哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)(甲基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-((1S,4S)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)乙氧基)(甲基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛-8-基)乙氧基)(甲基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)乙氧基)(甲基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(S,Z)-5-甲基-3-(((4-(甲基(2-(3-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(4-氰基哌啶-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-5-甲基-3-(((4-((3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(R,Z)-5-甲基-3-(((4-(甲基(2-(3-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(3,6-二氮杂二环[3.1.1]庚-3-基)乙氧基)(甲基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-5-甲基-2-氧代-3-(苯基((4-((2-((3R,5S)-3,4,5-三甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)亚甲基)吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-(乙基(2-(哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；和
(Z)-3-(((4-(异丙基(2-(哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(R,Z)-5-甲基-3-(((4-(甲基(2-(3-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(3,6-二氮杂二环[3.1.1]庚-3-基)乙氧基)(甲基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-5-甲基-2-氧代-3-(苯基((4-((2-((3R,5S)-3,4,5-三甲基哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)亚甲基)吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-(乙基(2-(哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-(异丙基(2-(哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
及其可药用盐。
21.权利要求1的式(I)的化合物，所述化合物选自：
(Z)-5-甲基-2-氧代-3-(((4-((2-(3-氧代哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-(甲基(2-(4-(2-(甲基氨基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-3-(((4-((2-(4-(2-(甲基氨基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
(Z)-5-甲基-3-(((4-((2-(4-(2-(甲基氨基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)氨基甲酰基)苯基)氨基)(苯基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-6-甲酸甲酯；
及其可药用盐。
22.一种药物组合物，其包含权利要求1至21任一项的化合物与一种或多种可药用稀释剂或载体的组合。
23.权利要求1至21任一项的式(I)的化合物，其用作药物。
24.权利要求1至21任一项的式(I)的化合物或权利要求22的组合物，所述化合物或组合物用于治疗纤维化疾病或间质性肺病，例如选自IPF、巨细胞间质性肺炎、结节病、囊性纤维化、呼吸窘迫综合征、药物引起的肺纤维化、肉芽肿病、硅肺病、石棉肺病、系统性硬皮病、选自丙型肝炎引起的肝硬化的病毒引起的肝硬化，或例如选自硬皮病、结节病和系统性红斑狼疮的带有纤维化组分的皮肤疾病，特别是IPF，或用于治疗以细胞过度增殖为特征的疾病，例如癌症，特别是肺癌，或用于治疗呼吸障碍，包括COPD(包括慢性支气管炎和肺气肿)、哮喘、小儿哮喘、过敏性鼻炎、鼻炎、鼻窦炎，特别是哮喘、慢性支气管炎和COPD。
25.权利要求1至21任一项的式(I)的化合物或权利要求22的组合物，其用于治疗纤维化疾病例如与类风湿性关节炎相关的肺纤维化、呼吸窘迫综合征包括急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、辐射引起的肺纤维化或肺炎、慢性过敏性肺炎、系统性硬化症、干燥综合征、间质性肺病、肺动脉高压(PAH)包括PAH的血管组分，或例如选自增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的带有纤维化组分的皮肤疾病，或纤维化是其组分的眼病，包括青光眼、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、干眼病和糖尿病性视网膜病变，或肠中的纤维化例如与炎性肠病相关的纤维化。
26.权利要求1至21任一项的式(I)的化合物或权利要求22的组合物在制造药物中的用途，所述药物用于治疗纤维化疾病或间质性肺病，其选自IPF、巨细胞间质性肺炎、结节病、囊性纤维化、呼吸窘迫综合征、药物引起的肺纤维化、肉芽肿病、硅肺病、石棉肺病、系统性硬皮病、选自丙型肝炎引起的肝硬化的病毒引起的肝硬化，或例如选自硬皮病、结节病和系统性红斑狼疮的带有纤维化组分的皮肤疾病，特别是IPF，或用于治疗以细胞过度增殖为特征的疾病，例如癌症，特别是肺癌，或用于治疗呼吸障碍，包括COPD(包括慢性支气管炎和肺气肿)、哮喘、小儿哮喘、过敏性鼻炎、鼻炎、鼻窦炎，特别是哮喘、慢性支气管炎和COPD。
27.权利要求1至21任一项的式(I)的化合物或权利要求22的组合物在制造药物中的用途，所述药物用于治疗纤维化疾病例如与类风湿性关节炎相关的肺纤维化、呼吸窘迫综合征包括急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、辐射引起的肺纤维化或肺炎、慢性过敏性肺炎、系统性硬化症、干燥综合征、间质性肺病、肺动脉高压(PAH)包括PAH的血管组分，或例如选自增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的带有纤维化组分的皮肤疾病，或纤维化是其组分的眼病，包括青光眼、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、干眼病和糖尿病性视网膜病变，或肠中的纤维化例如与炎性肠病相关的纤维化。
28.权利要求1至21任一项的式(I)的化合物或权利要求22的组合物，所述化合物或组合物与尼达尼布或吡非尼酮相组合用于治疗纤维化疾病或间质性肺病，其选自IPF、巨细胞间质性肺炎、结节病、囊性纤维化、呼吸窘迫综合征、药物引起的肺纤维化、肉芽肿病、硅肺病、石棉肺病、系统性硬皮病、选自丙型肝炎引起的肝硬化的病毒引起的肝硬化，或例如选自硬皮病、结节病和系统性红斑狼疮的带有纤维化组分的皮肤疾病，特别是IPF，或用于治疗以细胞过度增殖为特征的疾病，例如癌症，特别是肺癌，或用于治疗呼吸障碍，包括COPD(包括慢性支气管炎和肺气肿)、哮喘、小儿哮喘、过敏性鼻炎、鼻炎、鼻窦炎，特别是哮喘、慢性支气管炎和COPD。
29.权利要求1至21任一项的式(I)的化合物或权利要求22的组合物，所述化合物或组合物与尼达尼布或吡非尼酮相组合用于治疗纤维化疾病例如与类风湿性关节炎相关的肺纤维化、呼吸窘迫综合征包括急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、辐射引起的肺纤维化或肺炎、慢性过敏性肺炎、系统性硬化症、干燥综合征、间质性肺病、肺动脉高压(PAH)包括PAH的血管组分，或例如选自增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的带有纤维化组分的皮肤疾病，或纤维化是其组分的眼病，包括青光眼、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、干眼病和糖尿病性视网膜病变，或肠中的纤维化例如与炎性肠病相关的纤维化。
30.一种治疗以下疾病的方法：纤维化疾病或间质性肺病，其例如选自IPF、巨细胞间质性肺炎、结节病、囊性纤维化、呼吸窘迫综合征、药物引起的肺纤维化、肉芽肿病、硅肺病、石棉肺病、系统性硬皮病、选自丙型肝炎引起的肝硬化的病毒引起的肝硬化，或例如选自硬皮病、结节病和系统性红斑狼疮的带有纤维化组分的皮肤疾病，特别是IPF；或者以细胞过度增殖为特征的疾病，例如癌症，特别是肺癌；或者呼吸障碍，包括COPD(包括慢性支气管炎和肺气肿)、哮喘、小儿哮喘、过敏性鼻炎、鼻炎、鼻窦炎，特别是哮喘、慢性支气管炎和COPD，所述方法包括向对象给药有效量的权利要求1至21任一项的式(I)的化合物或权利要求22的药物组合物。
31.一种治疗以下疾病的方法：纤维化疾病例如与类风湿性关节炎相关的肺纤维化、呼吸窘迫综合征包括急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、辐射引起的肺纤维化或肺炎、慢性过敏性肺炎、系统性硬化症、干燥综合征、间质性肺病、肺动脉高压(PAH)包括PAH的血管组分，或例如选自增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的带有纤维化组分的皮肤疾病，或纤维化是其组分的眼病，包括青光眼、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、干眼病和糖尿病性视网膜病变，或肠中的纤维化例如与炎性肠病相关的纤维化，所述方法包括向对象给药有效量的权利要求1至21任一项的式(I)的化合物或权利要求22的药物组合物。
32.一种式(II)的化合物或其受保护的衍生物或其盐：
其中
R1表示Me、Et、CH＝CH2、C≡C-H或C≡C-Me，特别是Me。
33.一种式(VI)的化合物或其受保护的衍生物或其盐：
其中
R1表示Et、CH＝CH2、C≡C-H或C≡C-Me。
34.一种式(VII)的化合物或其受保护的衍生物或其盐：
其中
R1表示Me、Et、CH＝CH2、C≡C-H或C≡C-Me，特别是Me。
35.一种式(IX)的化合物或其受保护的衍生物或其盐：
其中
R1表示Me、Et、CH＝CH2、C≡C-H或C≡C-Me，特别是Me；并且
R2表示H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、-CH2-(C3-C8环烷基)、卤素或氰基。
36.一种式(XI)的化合物或其受保护的衍生物或其盐：
其中
R1表示Me、Et、CH＝CH2、C≡C-H或C≡C-Me，特别是Me；并且
R2表示H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、-CH2-(C3-C8环烷基)、卤素或氰基。
37.一种式(XIII)的化合物或其受保护的衍生物或其盐：
其中
R1表示Me、Et、CH＝CH2、C≡C-H或C≡C-Me，特别是Me；并且
R2表示H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、-CH2-(C3-C8环烷基)、卤素或氰基。
38.一种式(XVI)的化合物或其受保护的衍生物或其盐：
其中
Z表示CO或SO2；并且
R1表示Me、Et、CH＝CH2、C≡C-H或C≡C-Me；并且
R2表示H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、-CH2-(C3-C8环烷基)、卤素或氰基。
39.一种式(XVII)的化合物或其受保护的衍生物或其盐：
其中
Z表示CO或SO2；并且
R1表示Me、Et、CH＝CH2、C≡C-H或C≡C-Me；并且
R2表示H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、-CH2-(C3-C8环烷基)、卤素或氰基。
40.一种用于制备权利要求1至21任一项的式(I)的化合物或其可药用盐的方法，所述方法包括将式(II)的化合物或其盐：
其中
R1如权利要求1至21任一项中所定义；
与式(III)的化合物或其盐进行反应：
其中
R2、R3和Z如权利要求1至21任一项中所定义。
41.一种用于制备权利要求1至21任一项的式(I)的化合物或其可药用盐的方法，其中Z是CO并且R3是式(i)，所述方法包括将式(IX)的化合物或其受保护的衍生物或其盐：
其中
R1和R2如权利要求1至21任一项中所定义；
与式(X)的化合物或其受保护的衍生物或其盐进行反应：
其中
R’表示权利要求1至21任一项中所定义的Y1-R5；
R”表示权利要求1至21任一项中所定义的X1-R4。
42.一种用于制备权利要求1至21任一项的式(I)的化合物或其可药用盐的方法，其中R3是式(i)并且X1-R4是Me，所述方法包括将式(XVI)的化合物或其受保护的衍生物或其盐：
其中
R1和R2如权利要求1至21任一项中所定义；
与式(XIV)的化合物或其受保护的衍生物或其盐进行反应：
其中
R8和R9如权利要求1至21任一项中所定义，或者NR8R9表示权利要求1至21任一项中所定义的含有选自O、N和S的一个或多个杂原子的脂族4-8元杂环。
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