JP7030358B2 - パーキンソン病バイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡ及びこれを用いた診断キット - Google Patents

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Description

本発明は、パーキンソン病で発現が減少又は増加するｍｉＲＮＡを用いたパーキンソン病の診断方法及び前記ｍｉＲＮＡを用いたパーキンソン病の予防又は治療用組成物に関する。
パーキンソン病は、中枢神経系退行性疾患の一つであり、中脳の黒質緻密部（Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ ｐａｒｓ ｃｏｍｐａｃｔａ）の変形を始めとして、脳の体積の減少、アルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，αＳｙｎ）の凝集などを病態生理的症状として有する疾患であり、歩行の不完全、手の震え、強張った動きなどを示す。
韓国のパーキンソン病患者の現況は、２０１０年６万１，５６５名から年平均で８．７％ずつ増え、２０１４年には８万５，８８８名と増加した。２０１４年の患者を見ると、６０歳以上の患者比率が９５．７％で、有病率は患者の年齢と相関関係を示し、性比は、男性が３万３，８３１名、女性が５万２，０５７名だった（ここ５年間のパーキンソン病患者・診療費の増加傾向、青年医師、２０１５年）。
主要７ケ国（米国、日本、フランス、ドイツ、イタリア、スペイン、英国）のパーキンソン病患者人口は、２００８年に約４５４万名、２０１２年には５０５万名と年平均で２．７２％増加し、アジアでは、２００８年１９８万名から２０１２年２１９万名に増加し、ヨーロッパでは、２００８年８２万名から２０１２年９１万名に増加した（Ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ Ｐｉｐｅｌｉｎｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｌｏｂａｌ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍａｒｋｅｔ，Ｆ＆Ｓ，２０１４年）。
世界のパーキンソン病治療剤製品動向について説明すると、２０１１年に４７％と最大シェアを占めたドーパミンアゴニスト薬物が２０２１年には４２％と減ることが予想され、新規パイプライン薬物が２０２１年に約２０％のシェアを占めると見込まれている（Ｒ＆Ｄ Ｔｒｅｎｄｓ：Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｄａｔａｍｏｎｉｔｏｒ，２０１２年）。
パーキンソン病の診断と関連して行われる検査には、１）ＰＥＴ検査、２）ＭＲＩ検査、３）内科的疾患に対する検査などがある。
脳ドーパミン運搬体陽電子断層撮影（ｄｏｐａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＰＥＴ，ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）検査は、ドーパミン性細胞の損傷の有無が分かる検査であり、脳ドーパミン運搬体陽電子断層撮影をすると、パーキンソン病以外の原因によるパーキンソン症状を確認することができる。薬物誘発性パーキンソン症候群、血管性パーキンソン症候群、アルツハイマー病に同伴するパーキンソン症状、本態性振戦に伴うパーキンソン症状は、一見してはパーキンソン症状と同様の震え、運動緩徐を見せるが、ドーパミン性神経細胞は正常であることが確認できる。
パーキンソン症状を示す場合に、パーキンソン病に類似する疾患と区別することが重要であり、二次性パーキンソン症候群及び非定型性パーキンソン症候群などと区別するためには、まず最初に脳磁気共鳴映像（ＭＲＩ）検査が必要である。パーキンソン病の場合は、ＭＲＩが正常所見であるのに対し、他の疾患は特徴的なＭＲＩ所見を呈する。
パーキンソン病診断方法のうち、内科的疾患に対する検査（血液検査、小便検査、心電図、胸部エックス線検査）方法は、内科的疾患が前身萎弱感を起こし、パーキンソン症状と誤認する場合があるが、これを判別するために別の内科的な疾患がないか確認するための検査である。
しかしながら、これらのパーキンソン病診断方法は高価であり、診断手順が複雑であるという問題がある。パーキンソン病の治療及び診断に注力しているトップ企業の一つであるルンドベック（Ｌｕｎｄｂｅｃｋ）社の場合、ホームページにパーキンソン病の早期診断のためのツールの開発の重要性について言及してはいるが、商用化した試薬又はキットは現在販売していない。また、パーキンソン病の患者は毎年大きく増加しており、これに比例して治療剤市場も大きく成長しているが、実際にパーキンソン病診断市場の発展は微々たる実情である。したがって、パーキンソン病をその類似疾患と区別して迅速で経済的に診断できる技術及びこれと同時に治療を並行できる技術の開発が至急望まれる。
上の背景技術として説明された事項は本発明の背景に対する理解増進のためのものに過ぎず、この技術分野で通常の知識を有する者に既に知られた従来技術に該当すると認めるものとして理解してはならないだろう。
本発明者らは、パーキンソン病をその類似疾患と区別して迅速で経済的に診断できる技術及びこれと同時に治療を並行できる技術を開発しようと鋭意努力した。その結果、パーキンソン病モデルで特定ｍｉＲＮＡの発現量が特異的に増加又は減少していることを見出し、これを用いてパーキンソン病の効率的な診断及び治療ができることを確認することによって、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、パーキンソン病の診断のための情報を提供する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、パーキンソン病の診断又は予後分析用キットを提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、パーキンソン病誘発物質のスクリーニング方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、パーキンソン病治療剤のスクリーニング方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、パーキンソン病の予防、改善又は治療用組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、パーキンソン病の治療方法を提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面から、より明確になる。
本発明の一態様によれば、本発明は、下記の段階を含むパーキンソン病の診断のための情報を提供する方法を提供する：
（ａ）被検者から取得したサンプル中に含まれたｍｉＲ－４９４－３ｐ、ｍｉＲ－５０１－５ｐ、ｍｉＲ－１２４４、ｍｉＲ－６７６８－５ｐ、ｍｉＲ－４３２４及びｍｉＲ－４７２６－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡの発現量を正常群サンプル中に含まれた前記ｍｉＲＮＡの発現量と比較する段階；及び
（ｂ）前記被検者のサンプル中に含まれた前記ｍｉＲＮＡの発現量が正常群サンプル中に含まれたｍｉＲＮＡの発現量よりも減少した場合、パーキンソン病と診断する段階。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明は、下記の段階をさらに含む：
（ａ）被検者から取得したサンプル中に含まれたｍｉＲ－１２２６－５ｐ、ｍｉＲ－４７６７及びｍｉＲ－３０６４－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡの発現量を正常群サンプル中に含まれた前記ｍｉＲＮＡの発現量と比較する段階；及び
（ｂ）前記被検者のサンプル中に含まれた前記ｍｉＲＮＡの発現量が正常群サンプル中に含まれたｍｉＲＮＡの発現量よりも増加した場合、パーキンソン病と診断する段階。
本発明の他の態様によれば、本発明は、下記の段階を含むパーキンソン病の診断のための情報を提供する方法を提供する：
（ａ）被検者から取得したサンプル中に含まれたｍｉＲ－１２２６－５ｐ、ｍｉＲ－４７６７及びｍｉＲ－３０６４－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡの発現量を正常群サンプル中に含まれた前記ｍｉＲＮＡの発現量と比較する段階；及び
（ｂ）前記被検者のサンプル中に含まれた前記ｍｉＲＮＡの発現量が正常群サンプル中に含まれたｍｉＲＮＡの発現量よりも増加した場合、パーキンソン病と診断する段階。
本明細書において“ｍｉＲＮＡ”は、特に言及しない限り、ヘアピン状構造のＲＮＡ前駆体として転写され、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ切断活性を有するｄｓＲＮＡ切断酵素によって切断されてＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質複合体に導入され、ｍＲＮＡの翻訳抑制に関与する１５～２５塩基の非コーディングＲＮＡを意図して使用される。また、本明細書で使用するｍｉＲＮＡは、特定塩基配列（又は配列番号）で表されるｍｉＲＮＡだけでなく、前記ｍｉＲＮＡの前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）、それらと生物学的機能が同等なｍｉＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログ又はオーソログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体も含む。このような前駆体、同族体、変異体又は誘導体としては、具体的にはｍｉＲＢａｓｅ ｒｅｌｅａｓｅ ２０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）によって同定でき、厳格な条件下で配列目録第１配列～第９配列のｍｉＲＮＡの相補配列とハイブリダイジングする塩基配列を有するｍｉＲＮＡを挙げることができる。また、本明細書で使用するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ遺伝子の遺伝子産物であってもよく、それらの遺伝子産物は成熟ｍｉＲＮＡ（例えば、上記のようなｍＲＮＡの翻訳抑制に関与する１５～２５塩基又は１９～２５塩基の非コーディングＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ前駆体（例えば、上記のようなｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）を含む。
本明細書において“核酸”とは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びＲＮＡ／ＤＮＡ（キメラ）のいずれも含む核酸を意味する。また、前記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれも含まれる。また、前記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、非コーディング（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ）ＲＮＡ及び合成ＲＮＡのいずれも含まれる。本明細書において“合成ＤＮＡ”及び“合成ＲＮＡ”とは、所定の塩基配列（天然型配列又は非天然形配列のいずれであってもよい。）に基づいて、例えば自動核酸合成機を用いて人工的に作製されたＤＮＡ及びＲＮＡを指す。本明細書において“非天然形配列”は、広義の意味で使用することを意図しており、天然型配列と異なる、例えば１以上のヌクレオチドの置換、欠失、挿入及び／又は付加を含む配列（すなわち、変異配列）、１以上の修飾ヌクレオチドを含む配列（すなわち、修飾配列）などを含む。また、本明細書ではポリヌクレオチドが核酸と同じ意味で使われる。
本明細書で使われる“被検者”とは、ヒト、チンパンジーを含む霊長類、イヌ、ネコなどの愛玩動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギなどの家畜動物、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳動物を含む意味と解釈される。また、“正常群”も同様の意味と解釈され、検出しようとするパーキンソン病を有しない客体を意味する。
本発明が含むサンプルは、被検者から自然的又は人工的に分離されて被検者のパーキンソン病関連遺伝情報を含むものであれば制限されず、好ましくは、体外に分離された糞便、細胞、血液、血漿、血清、毛髪又は尿などから分離可能であり、より好ましくは、体外に分離された血液、血漿、血清などを用いることができる。
本発明のパーキンソン病診断のための情報を提供する方法は、公知の様々な試験方法を用いることができ、例えば、混成化法、免疫分析（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）方法又は遺伝子増幅方法を用いて行うことができ、これに限定されるものではない。
前記混成化法は、プローブを用いてｍｉＲＮＡの存在を確認する。
本明細書で使われた用語“プローブ”とは、自然の又は変形されたモノマー又は連鎖（ｌｉｎｋａｇｅｓ）の線形オリゴマーを意味し、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含み、ターゲットヌクレオチド配列に特異的に混成化でき、自然的に存在するか或いは人工的に合成されたものである。本発明のプローブは、ましくは単一鎖であり、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。
本発明の方法が混成化方式のうちマイクロアレイ方式で行われる場合、上記のプローブは混成化アレイ要素（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ ａｒｒａｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）として用いられ、基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上に固定化される。好ましい基質は、堅固性又は半－堅固性支持体として、例えば、膜、フィルター、チップ、スライド、ウエハー、ファイバー、磁気性ビーズ又は非磁気性ビーズ、ゲル、チュービング、プレート、高分子、微小粒子及び毛細管を含む。前記混成化アレイ要素は、前記の基質上に配列され固定化される。このような固定化は、化学的結合方法又はＵＶのような共有結合的方法によって行われる。例えば、前記混成化アレイ要素は、エポキシ化合物又はアルデヒド基を含むように変形されたグラス表面に結合し、また、ポリリシンコーティング表面においてＵＶによって結合し得る。また、前記混成化アレイ要素はリンカー（例：エチレングリコールオリゴマー及びジアミン）によって基質に結合し得る。
一方、本発明のマイクロアレイに適用される試料ＤＮＡは標識（ｌａｂｅｌｉｎｇ）され得、マイクロアレイ上のアレイ要素と混成化される。混成化条件は様々に変更可能である。また、混成化程度の検出及び分析は標識物質によって様々に実施可能である。
プローブの標識は、混成化の有無を検出可能にするシグナルを提供でき、これは、オリゴヌクレオチドに連結され得る。適合した標識は、蛍光団（例えば、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ローダミン、リサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、そしてＣｙ３とＣｙ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、ＴｄＴ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、発色団、化学発光団、磁気粒子、放射性同位元素（Ｐ３２又はＳ３５）、マス標識、電子密集粒子、酵素（アルカリンフォスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼ）、助因子、酵素に対する基質、重金属（例えば、金）そして抗体、ストレプトアビジン、バイオチン、ジゴキシゲニン、キレート基のような特定結合パートナーを有するヘプテンを含むが、これらに限定されるものではない。標識は、当業界で通常用いられる様々な方法、例えば、ニックトランスレーション方法（ｎｉｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）、無作為プライミング方法（Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｏｏｋｌｅｔ，“Ａｍｅｒｓｈａｍ”（１９８９））及びキネーション方法（Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９（１９８６））によって実施できる。標識は、蛍光、放射能、発色測定、重量測定、Ｘ線回折又は吸収、磁気、酵素的活性、マス分析、結合親和度、混成化高周波、ナノクリスタルによって検出できるシグナルを提供する。
プローブを用いる場合、プローブをｃＤＮＡ分子と混成化させる。本発明において、適合した混成化条件は、最適化手順によって一連の過程で決定され得る。このような手順は、研究室における使用のためのプロトコルを樹立するために当業者によって一連の過程で行われる。例えば、温度、成分の濃度、混成化及び洗浄時間、緩衝液成分及びそれらのｐＨ及びイオン強度などの条件は、プローブの長さ及びＧＣ量及びターゲットヌクレオチド配列などの様々な因子に依存する。混成化のための詳細な条件は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＭ．Ｌ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９９）から確認できる。
混成化反応後に、混成化反応から発生する混成化シグナルを検出する。混成化シグナルは、例えば、プローブに結合した標識の種類によって様々な方法で行うことができる。例えば、プローブが酵素によって標識された場合、この酵素の基質を混成化反応結果と反応させて混成化の有無を確認することができる。利用可能な酵素／基質の組合せは、ペルオキシダーゼ（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）と、クロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジミノベンジジン、Ｄ－ルシフェリン、ルシゲニン（ビス－Ｎ－メチルアクリジニウムニトレート）、レゾルフィンベンジルエーテル、ルミノール、アンプレックスレッド試薬（１０－アセチル－３，７－ジヒドロキシフェノキサジン）、ＨＹＲ（ｐ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ－ＨＣｌ ａｎｄ ｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ）、ＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（２，２‘－Ａｚｉｎｅ－ｄｉ［３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］）、ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）及びナフトール／ピロニン；アルカリホスファターゼとブロモクロロインドールイルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ナフトール－ＡＳ－Ｂ１－ホスフェート（ｎａｐｈｔｈｏｌ－ＡＳ－Ｂ１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びＥＣＦ基質；グルコースオキシダーゼと、ｔ－ＮＢＴ（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ） 及びｍ－ＰＭＳ（ｐｈｅｎｚａｉｎｅ ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）などである。プローブが金粒子で標識された場合には、硝酸銀を用いてシルバー染色方法で検出することができる。
生物学的試料において前記ｍｉＲＮＡの配列に対する混成化シグナルが正常試料に比べて上向き調節（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）又は下向き調節（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）される場合にはパーキンソン病と診断される。
本発明のパーキンソン病診断のための情報を提供する方法は、免疫分析方法によって行うことができる。前記免疫分析方法は、放射能免疫分析、放射能免疫沈殿、免疫沈殿、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、キャプチャー－ＥＬＩＳＡ、抑制又は競合分析、サンドウィッチ分析、流細胞分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、免疫蛍光染色及び免疫親和性精製を含むが、これに限定されるものではない。前記免疫分析の方法は、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｅ．Ｔ．Ｍａｇｇｉｏ，ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８０；Ｇａａｓｔｒａ，Ｗ．，Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ），ｉｎＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，１９８４；及びＥｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，ＵｓｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されており、これらの文献は本明細書に参照として組み込まれる。
本発明のパーキンソン病診断のための情報を提供する方法は、遺伝子増幅方法によって行うことができる。遺伝子増幅方法を用いたｍｉＲＮＡの検出は、当業界に公知された様々な方法を用いて行うことができ、この場合、ｍｉＲＮＡのプライマー又はプローブを用いることができる。
プライマーを用いる場合には、遺伝子増幅反応を実施して前記ｍｉＲＮＡの遺伝子の発現程度を調べる。本発明は前記遺伝子の発現程度を分析するものであるから、分析対象の試料（例えば、細胞）において前記マーカーのｍＲＮＡ量を調べて前記マーカーの遺伝子の発現程度を決定する。したがって、本発明は原則的に生物学的試料内のｍＲＮＡを鋳型とし、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに結合するプライマーを用いて遺伝子増幅反応を行う。
まず、ｍＲＮＡを得るために試料からｔｏｔａｌ ＲＮＡを分離する。ｔｏｔａｌ ＲＮＡの分離は、当業界に公知の通常の方法によって行うことができる（参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｔｅｓｎｉｅｒｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，９：２４２（１９９１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７）；及びＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６（１９８７）。例えば、Ｔｒｉｚｏｌを用いて容易に細胞内のｔｏｔａｌ ＲＮＡを分離することができる。
次に、分離されたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを増幅する。本発明のｔｏｔａｌ ＲＮＡはヒトの試料から分離されるものであるから、ｍＲＮＡの末端にはポリＡテールを有しており、このような配列特性を用いたオリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを容易に合成することができる（参照：ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８５：８９９８（１９８８）；Ｌｉｂｅｒｔ Ｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：５６９（１９８９）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１））。次に、遺伝子増幅反応によって合成されたｃＤＮＡを増幅する。本発明に用いられるプライマーは鋳型の一箇所に混成化又はアニーリングされ、二重鎖構造を形成する。このような二重鎖構造を形成するのに適合した核酸混成化の条件は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）及びＨａｙｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）に開示されている。
様々なＤＮＡ重合酵素を本発明の増幅に用いることができ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ重合酵素Ｉの“クレノウ”断片、熱安定性ＤＮＡ重合酵素及びバクテリオファージＴ７ ＤＮＡ重合酵素を含む。重合酵素は、様々なバクテリア種から得られる熱安定性ＤＮＡ重合酵素であり、これは、Ｔａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔｔｈ（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマスフィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、サーマスフラバス（Ｔｈｅｒｍｉｓｆｌａｖｕｓ）、サーモコッカスリトラリス （Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ）、及びＰｆｕ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）を含む。重合反応を行う時、反応容器に反応に必要な成分を過量で提供することが好ましい。増幅反応に必要な成分の過量は、増幅反応が成分の濃度に実質的に制限されない程度の量を意味する。Ｍｇ２＋のような助因子、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを所望の増幅程度が達成され得るような程度に反応混合物に提供することが望まれる。増幅反応に用いられる酵素はいずれも、同じ反応条件で活性状態であり得る。事実上、緩衝液は全ての酵素が最適の反応条件に近接するようにする。したがって、本発明の増幅過程は、反応物の添加のような条件の変化無しに単一反応物で行うことができる。
本発明においてアニーリング又は混成化は、ターゲットヌクレオチド配列とプライマーとの特異的結合を可能にする厳格条件下で行われる。アニーリングのための厳格条件は配列－依存的であり、周囲環境的変数によって様々である。
本明細書の用語“増幅反応”は、核酸分子を増幅する反応を意味する。様々な増幅反応が当業界に報告されており、これは、重合酵素連鎖反応（以下、ＰＣＲという。）（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、及び第４，８００，１５９号）、逆転写－重合酵素連鎖反応（以下、ＲＴ－ＰＣＲと表記する。）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１）），Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈ．Ｉ．（ＷＯ８９／０６７００）及びＤａｖｅｙ，Ｃ．等（ＥＰ３２９，８２２）の方法、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＬＣＲ）（１７，１８）、Ｇａｐ－ＬＣＲ（ＷＯ９０／０１０６９）、復旧連鎖反応（ｒｅｐａｉｒ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＥＰ４３９，１８２）、転写－介在増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＴＭＡ）（１９）（ＷＯ８８／１０３１５）、自己維持塩基配列複製（ｓｅｌｆ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（２０）（ＷＯ９０／０６９９５）、ターゲットポリヌクレオチド塩基配列の選択的増幅（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）（米国特許第６，４１０，２７６号）、コンセンサス配列プライミング重合酵素連鎖反応（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｒｉｍｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＣＰ－ＰＣＲ）（米国特許第４，４３７，９７５号）及びループ－介在等温増幅（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＬＡＭＰ）を含むが、これに限定されない。利用可能な他の増幅方法は、米国特許第５，２４２，７９４号、第５，４９４，８１０号、第４，９８８，６１７号及び米国特許第０９／８５４，３１７号に記述されている。本発明の遺伝子増幅方法は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号に開示されたＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって行われる。
ＰＣＲは、最も周知された核酸増幅方法であり、その多くの変形と応用が開発されている。例えば、ＰＣＲの特異性又は敏感性を増進させるために伝統的なＰＣＲ手順を変形させ、タッチダウン（ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ）ＰＣＲ、ホットスタート（ｈｏｔ ｓｔａｒｔ）ＰＣＲ、入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ及びブースター（ｂｏｏｓｔｅｒ）ＰＣＲが開発された。また、実時間（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）ＰＣＲ、分別ディスプレイＰＣＲ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ ＰＣＲ：ＤＤ－ＰＣＲ）、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ：ＲＡＣＥ）、マルチプレクスＰＣＲ、逆重合酵素連鎖反応（ｉｎｖｅｒｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＩＰＣＲ）、ベクトレット（ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ）ＰＣＲ、ＴＡＩＬ－ＰＣＲ（ｔｈｅｒｍａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ ＰＣＲ）及びマルチプレクスＰＣＲが特定の応用のために開発された。ＰＣＲに対する詳細な内容はＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．、及びＭｏｌｌｅｒ，Ｓ．Ｇ．ＰＣＲ．ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｎ．Ｙ．（２０００）に記載されており、その教示事項は本明細書に参照として組み込まれる。
本発明で遺伝子増幅方法に用いられるプライマーは、前記ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡ配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。本明細書で用語“プライマー”とは、適度の温度で適合な緩衝液内で適合な条件（すなわち、４種の異なるヌクレオチドトリホスフェート及び重合反応酵素）下で鋳型－指示ＤＮＡ合成の開始点として作用し得る単一鎖オリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの適度の長さは、様々な因子、例えば、温度とプライマーの用途によって変異があるが、典型的に１５－３０ヌクレオチドである。短いプライマー分子は鋳型と十分に安定したハイブリッド複合体を形成するために、通常、より低い温度を要求する。
プライマーの配列は、鋳型の一部配列と完全に相補的な配列を有する必要はなく、鋳型と混成化されてプライマー固有の作用が可能な範囲内における十分の相補性を有すれば足りる。したがって、本発明におけるプライマーセットは、鋳型である前記マーカーのｃＤＮＡ配列に完壁に相補的な配列を有する必要はなく、この配列に混成化されてプライマー作用ができる範囲内で十分の相補性を有すれば足りる。好ましくは、本発明で用いられるプライマーは、前記マーカーのｃＤＮＡ配列に完壁に相補的な配列を有するものである。
このようなプライマーのデザインは、前記ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡ配列を参照して当業者にとって容易に実施可能であり、例えば、プライマーデザイン用プログラム（例：ＰＲＩＭＥＲ３プログラム）を用いて実施することができる。
このように増幅された前記マーカーのｃＤＮＡを適合な方法で分析して前記マーカーの遺伝子の発現程度を調べる。例えば、上述した増幅反応結果をゲル電気泳動をし、その結果として形成されるバンドを観察及び分析することによって、前記マーカーの遺伝子の発現程度を調べる。
このような増幅反応の結果、生物学的試料において前記遺伝子の発現が正常試料よりも高い又は低い場合はパーキンソン病と診断される。
本発明においてｍｉＲＮＡは、パーキンソン病で発現が減少又は増加する生体分子である。本明細書で使われる用語“高発現（又は過発現）”或いは“上向き調節（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）”は、調査対象の生物学的試料において対象ヌクレオチド配列又はタンパク質の発現程度が正常試料に比べて高い場合を意味する。例えば、当業界で通常用いられる発現分析方法、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ方法又はＥＬＩＳＡ方法（参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１））によって発現分析をした場合、発現が高いものと分析される場合を意味する。例えば、上述した診断方法によって分析した結果、本発明のｍｉＲＮＡが正常試料に比べて１０％以上高発現又は低発現される場合、本発明における“高発現”又は“低発現”と判断し、パーキンソン病と判定する。
本発明の一実施例によれば、本発明の診断方法が含む前記ｍｉＲＮＡは、正常人と比較してパーキンソン病患者において上向き調節（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）又は下向き調節（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）されており、１０％以上、好ましくは５０％以上と上向き又は下向き調節されていることを確認した。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、ｍｉＲ－４９４－３ｐ、ｍｉＲ－５０１－５ｐ、ｍｉＲ－１２４４、ｍｉＲ－６７６８－５ｐ、ｍｉＲ－４３２４、ｍｉＲ－４７２６－５ｐ、ｍｉＲ－１２２６－５ｐ、ｍｉＲ－４７６７及びｍｉＲ－３０６４－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡと特異的に結合可能な核酸を含むパーキンソン病の診断又は予後分析用キットを提供する。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明のキットは、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４４、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７６８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４３２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７６７及びｈｓａ－ｍｉＲ－３０６４－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡと特異的に結合可能な核酸をさらに含む。
本発明のキットは前記核酸に加えて、パーキンソン病の検出を可能にする既知の核酸又は将来発見され得る核酸を含むことができ、公知のパーキンソン病検査用マーカーを測定するための抗体も含むことができる。
本発明のキットに含まれる前記核酸は、個別に又は任意に組み合わせて他の容器に包装することができる。
本発明のキットには体液、細胞又は組織から核酸（例えば、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を抽出するためのキット、標識用蛍光物質、核酸増幅用酵素及び培地、使用説明書などを含めることができる。
本発明のキットは、前記核酸が、例えば固相に結合又は付着したパーキンソン病マーカー測定のためのデバイスである。固相の材質の例は、プラスチック、紙、ガラス、シリコンなどであり、加工の容易性からは、固相の材質はプラスチックが好ましい。固相の形状は任意であり、例えば、四角形、円形、長方形、フィルム形などである。
本発明のキットは、前記ｍｉＲＮＡの少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個のそれぞれと特異的に結合可能な核酸を含むことができる。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、下記の段階を含むパーキンソン病誘発物質のスクリーニング方法を提供する：
（ｉ）ｍｉＲ－４９４－３ｐ、ｍｉＲ－５０１－５ｐ、ｍｉＲ－１２４４、ｍｉＲ－６７６８－５ｐ、ｍｉＲ－４３２４及びｍｉＲ－４７２６－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡを発現する細胞にパーキンソン病誘発候補物質を処理し、該細胞から前記ｍｉＲＮＡの発現量を確認する段階；及び
（ｉｉ）前記パーキンソン病誘発候補物質を処理した細胞において前記ｍｉＲＮＡの発現量が下向き調節（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）される場合、パーキンソン病誘発物質と判断する段階。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明のスクリーニング方法は、下記の段階をさらに含む：
（ｉ）ｍｉＲ－１２２６－５ｐ、ｍｉＲ－４７６７及びｍｉＲ－３０６４－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡを発現する細胞にパーキンソン病誘発候補物質を処理し、該細胞から前記ｍｉＲＮＡの発現量を確認する段階；及び
（ｉｉ）前記パーキンソン病誘発候補物質を処理した細胞において前記ｍｉＲＮＡの発現量が上向き調節（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）される場合、パーキンソン病誘発物質と判断する段階。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、下記の段階を含むパーキンソン病誘発物質のスクリーニング方法を提供する：
（ｉ）ｍｉＲ－１２２６－５ｐ、ｍｉＲ－４７６７及びｍｉＲ－３０６４－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡを発現する細胞にパーキンソン病誘発候補物質を処理し、該細胞から前記ｍｉＲＮＡの発現量を確認する段階；及び
（ｉｉ）前記パーキンソン病誘発候補物質を処理した細胞において前記ｍｉＲＮＡの発現量が上向き調節（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）される場合、パーキンソン病誘発物質と判断する段階。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、下記の段階を含むパーキンソン病治療剤のスクリーニング方法を提供する：
（ｉ）ｍｉＲ－４９４－３ｐ、ｍｉＲ－５０１－５ｐ、ｍｉＲ－１２４４、ｍｉＲ－６７６８－５ｐ、ｍｉＲ－４３２４及びｍｉＲ－４７２６－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡを発現する細胞にパーキンソン病治療剤候補物質を処理し、該細胞から前記ｍｉＲＮＡの発現量を確認する段階；及び
（ｉｉ）前記パーキンソン病治療剤候補物質を処理した細胞において前記ｍｉＲＮＡの発現量が上向き調節（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）される場合、パーキンソン病治療剤と判断する段階。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明のスクリーニング方法は、下記の段階をさらに含む：
（ｉ）ｍｉＲ－１２２６－５ｐ、ｍｉＲ－４７６７及びｍｉＲ－３０６４－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡを発現する細胞にパーキンソン病治療剤候補物質を処理し、該細胞から前記ｍｉＲＮＡの発現量を確認する段階；及び
（ｉｉ）前記パーキンソン病治療剤候補物質を処理した細胞において前記ｍｉＲＮＡの発現量が下向き調節（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）される場合、パーキンソン病治療剤と判断する段階。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は下記の段階を含むパーキンソン病治療剤のスクリーニング方法を提供する：
（ｉ）ｍｉＲ－１２２６－５ｐ、ｍｉＲ－４７６７及びｍｉＲ－３０６４－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡを発現する細胞にパーキンソン病治療剤候補物質を処理し、該細胞から前記ｍｉＲＮＡの発現量を確認する段階；及び
（ｉｉ）前記パーキンソン病治療剤候補物質を処理した細胞において前記ｍｉＲＮＡの発現量が下向き調節（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）される場合、パーキンソン病治療剤と判断する段階。
本発明のスクリーニング方法を言及する上で使用した用語、“候補物質”は、パーキンソン病症状を誘発、減少、防止又は除去させる活性があるか否かを検査するためにスクリーニングで用いられる未知の物質（例えば、各種天然物、化合物ライブラリー、遺伝子又はタンパク質ライブラリーなど）である。
本明細書で使われた用語、“パーキンソン病治療剤”は、パーキンソン病に対する薬理活性を示すものと知られた、或いは示すものと確認された薬物（薬剤学的組成物）、健康機能食品又は食餌療法を意味する。一例として、本発明では、パーキンソン病に対する薬理活性を有するものと当業界に知られた薬物と機能性食品を用いて、これに対するパーキンソン病と診断された対象体の敏感性を診断するか、或いは予後を予測することができる。他の例として、本発明は、パーキンソン病に対する薬理活性が知られていない候補物質のの中からパーキンソン病に対する薬理活性を有する物質をスクリーニングするために適用することができる。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、ｍｉＲ－４９４－３ｐ、ｍｉＲ－５０１－５ｐ、ｍｉＲ－１２４４、ｍｉＲ－６７６８－５ｐ、ｍｉＲ－４３２４及びｍｉＲ－４７２６－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡを有効成分として含むパーキンソン病の予防、改善又は治療用組成物を提供する。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、ｍｉＲ－４９４－３ｐ、ｍｉＲ－５０１－５ｐ、ｍｉＲ－１２４４、ｍｉＲ－６７６８－５ｐ、ｍｉＲ－４３２４及びｍｉＲ－４７２６－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡを患者に有効量投与する段階を含むパーキンソン病の治療方法を提供する。
本発明の一具現例によれば、本発明の組成物は薬剤学的組成物である。
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は製剤時に通常使用されるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるのではない。本発明の薬剤学的組成物は、これらの成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適合な薬剤学的に許容される担体及び製剤はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
本発明の薬剤学的組成物は経口又は非経口で投与でき、非経口投与の場合には、鼻腔投与、点眼投与、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与できる。
本発明の薬剤学的組成物の適度の投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、通常熟練した医師は所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方できる。本発明の好ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇである。
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されるか、又は多用量容器内に内入して製造され得る。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
本発明の薬剤学的組成物は、皮膚外用剤、エアゾール、スプレー、点眼剤、経口剤及び注射剤形態の剤形で製造され得る。
本発明の一具現例によれば、本発明の組成物は食品組成物である。
本発明の組成物が食品組成物として製造される場合、食品製造時に通常添加される成分を含み、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、営養素、調味剤及び香味剤を含む。上述した炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えばマルトース、スクロース、オリゴ糖など；及びポリサッカライド、例えばデキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。香味剤として天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物［例えば、レバウディオサイドＡ、グリチルリチンなど］）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を使用することができる。
例えば、本発明の食品組成物がドリンク剤として製造される場合には、クエン酸、液状果糖、砂糖、ブドウ糖、酢酸、リンゴ酸、果汁、杜仲抽出液、ナツメ抽出液、甘草抽出液などをさらに含めることができる。
本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
（ｉ）本発明は、パーキンソン病の診断のための情報を提供する方法を提供する。
（ｉｉ）また、本発明は、パーキンソン病の予防、改善又は治療用組成物を提供する。
（ｉｉｉ）本発明のｍｉＲＮＡは、パーキンソン病モデルにおいて特異的に発現が減少又は増加し、パーキンソン病の診断及び治療に効果的に用いることができる。
パーキンソン病モデル細胞の死滅段階で発現量が減少したｍｉＲＮＡを示すものである。 パーキンソン病モデル細胞の死滅段階で発現量が増加したｍｉＲＮＡを示すものである。 ６－ＯＨＤＡを注入した内部対照群（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）の写真である。脳組織に何も処理しなかった左半球の黒質（Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ）（Ａ）は完全に保存されているのに対し、右半球の６－ヒドロキシドーパミン注入（６－ｈｙｄｒｏｘｙ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｉｎｊｅｃｔｅｄ）は、黒質（Ｂ）の神経細胞死滅は勿論、組織の変形によってその大きさが過度に収縮されている。 ６－ＯＨＤＡと共に注入された４９４－３ｐの影響で黒質の神経細胞が生きていることを確認した結果である。同一個体内のＡ（正常）とＢ（ｉｎｊｅｃｔｅｄ）における病変をＨ＆Ｅ染色で確認した。 ６－ＯＨＤＡと共に注入されたｍｉＲ１２４４の影響で黒質の神経細胞が生きていることを確認した結果である。同一個体内のＡ（正常）とＢ（ｉｎｊｅｃｔｅｄ）における病変をＨ＆Ｅ染色で確認した。 ６－ＯＨＤＡと共に注入されたｍｉＲ４３２４の影響で黒質の神経細胞が生きていることを確認した結果である。同一個体内のＡ（正常）とＢ（ｉｎｊｅｃｔｅｄ）における病変をＨ＆Ｅ染色で確認した。 ６－ＯＨＤＡと共に注入されたｍｉＲ４７２６－５ｐの影響で黒質の神経細胞が生きていることを確認した結果である。同一個体内のＡ（正常）とＢ（ｉｎｊｅｃｔｅｄ）における病変をＨ＆Ｅ染色で確認した。 ６－ＯＨＤＡと共に注入されたｍｉＲ６７６８－５ｐの影響で黒質の神経細胞が生きていることを確認した結果である。同一個体内のＡ（正常）とＢ（ｉｎｊｅｃｔｅｄ）における病変をＨ＆Ｅ染色で確認した。 ６－ＯＨＤＡと共に注入されたｍｉＲ５０１－５ｐの影響で黒質の神経細胞が生きていることを確認した結果である。同一個体内のＡ（正常）とＢ（ｉｎｊｅｃｔｅｄ）における病変をＨ＆Ｅ染色で確認した。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかである。
材料及び方法
１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞培養
Ｃ５７ＢＬ／６ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽細胞（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ）は、熱非働化ウシ胎児血清（ｈｅａｔ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（ＧＩＢＣＯ，ＭＤ，ＵＳＡ）が最終濃度１０％となるように添加されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）培地を用いて、３７℃湿潤５％ ＣＯ２チャンバー内で培養した（Ｊａｎｇ，Ｓ．－Ｗ．，Ｏｈ，Ｍ．－Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｓ．Ｉ．＆ Ｃｈｏ，Ｅ．－Ｍ．Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ＣｕＯ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｃｕ ｉｏｎｓ．ＢｉｏＣｈｉｐ Ｊｏｕｒｎａｌ １０，１４０－１４９（２０１６））。そして、６－ヒドロキシドーパミン（６－ｈｙｄｒｏｘｙ ｄｏｐａｍｉｎｅ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）は、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）に溶かして－８０℃に保管しながら、使用の度に、分注された培地の試薬を使用し、特に光に注意（ｌｉｇｈｔ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）した。
２．細胞生存能試験
細胞の生存に関する観察のためには安定したテトラゾリウム塩（ｓｔａｂｌｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｓａｌｔ）ＷＳＴ－１アッセイ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を使用したが、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を９６－ウェルプレートの各ウェルに５０００ｃｅｌｌｓにして６－ヒドロキシドーパミン（６ＯＨＤＡ、２５μＭ、２４ｈ）を処置した。単にＰＢＳを処置した対照群と比較し、実験終了２時間前にＷＳＴ－１溶液を１０μｌ／ウェル添加して３７℃チャンバー内培養した。実験終了後、４５０ｎｍで変化した色を測定して確認した。
３．ＲＮＡ分離
６ＯＨＤＡ（２５μＭ、２４ｈ）が処理されたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株のｔｏｔａｌ ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔを使用して分離した。その方法は、メーカーの勧告方法にそのまま従った（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）。分離されたＲＮＡの総量と純度はＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－２０００ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ，Ｄｅｌａｗａｒｅ，ＵＳＡ）を用いて２６０／２８０ｎｍ（比率１．８～２．０）比率を基準に測定した（Ｋｉｍ，Ｇ．Ｗ．ｅ．ａ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅ－ｅｘｐｏｓｅｄ ｗｏｒｋｅｒｓ．ＢｉｏＣｈｉｐ Ｊｏｕｒｎａｌ ９，２５９－２６７（２０１５））。
４．ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング
ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング分析のためにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｍｉＲＮＡ４．０アレイ（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ａｃｒｏｌｅｉｎ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ．．ＢｉｏＣｈｉｐ Ｊｏｕｒｎａｌ ９，１４４－１５５（２０１５））を使用し、マイクロアレイデータ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａ）はＧＥＯ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ）データベースを用いて分析した。
５．ターゲット予測及び遺伝子オントロジー分析
ｍｉＲＮＡ発現の様相に基づくｍｉＲＮＡターゲット遺伝子の予測のために、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ６．２ ＤＢを活用し、ｍｉＲａｎｄａ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（Ｋｉｍ，Ｇ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅ－ｅｘｐｏｓｅｄ ｗｏｒｋｅｒｓ．ＢｉｏＣｈｉｐ Ｊｏｕｒｎａｌ ９，２５９－２６７（２０１５））に従った。また、最も頻繁に多量で発現変化を示すｍｉＲＮＡターゲットは、ＧＯカテゴリー（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／）（Ｃｈｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｉＲＮＡ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ Ｓｅｒｔｏｌｉ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｂｉｓｐｈｅｎｏｌ Ａ．ＢｉｏＣｈｉｐ Ｊｏｕｒｎａｌ ４，７５－８１（２０１０）；Ｊｅｏｎｇ，Ｓ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｂｅｎｚｏ（ａ）ｐｙｒｅｎｅ．ＢｉｏＣｈｉｐ Ｊｏｕｒｎａｌ ６，１９１－１９６（２０１２）；Ｐａｒｋ，Ｈ．Ｒ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｅ．，Ｙａｎｇ，Ｈ．，Ｓｏｎ，Ｇ．Ｗ．＆ Ｐａｒｋ，Ｙ．Ｓ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａｌｔｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ３－ｍｅｔｈｙｌｃｈｏｌａｎｔｈｒｅｎｅ－ｔｒｅａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．ＢｉｏＣｈｉｐ Ｊｏｕｒｎａｌ ８，２６０－２６８（２０１４）；Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｍｉＲＮＡｓ ｄｕｒｉｎｇ ｅｔｈａｎｏｌ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．ＢｉｏＣｈｉｐ Ｊｏｕｒｎａｌ ６，７３－８３（２０１２））を用いて再確認した。ｌｏｇ２倍率変化（ｌｏｇ２ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）に基づいて、発現の増減が目立つ順序でｍｉＲを選別した。
６．パーキンソン病の動物モデル製造
６－ＯＨＤＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）による毒性がドーパミン性神経細胞にのみ影響を与え得るようにノルアドレナリン運搬体ブロッカー（ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｂｌｏｃｋｅｒ）であるデシプラミン（ｄｅｓｉｐｒａｍｉｎｅ）（１２．５ｍｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を、６－ＯＨＤＡを注入する３０分前に実験動物に腹腔で注入した。ケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｅ）（４０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）（５ｍｇ／ｋｇ）混合液を腹腔注射して実験動物が深い麻酔状態に入ると呼吸麻酔し、脳定位装置（Ｄａｖｉｄ ＫＯＰＦ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ．，ＣＡ，ＵＳＡ）に固定し、頭の皮膚を切開して頭骨を露出させた後、頭頂点を確認し、それを基点にして裏側に１．１ｍｍ、右に１．２ｍｍ移動した地点に、歯科用ドリルを用いて小さな穴をあけた。穴から腹部側に５．０ｍｍ地点まで２６ゲージ針を挿入して右側の内側前脳束（ｍｅｄｉａｌ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ｂｕｎｄｌｅ；ＭＦＢ）に位置させた。５μＬのハミルトンシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｓｙｒｉｎｇｅ）を用いて０．１％アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）を溶かした６－ＯＨＤＡ ２μＬ（２．５μｇ／μＬ）を注入ポンプ（Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｐｕｍｐ）（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ．，ＵＳＡ）を用いて０．５μＬ／ｍｉｎの速度で注入した。別の５μＬのハミルトンシリンジを用いて５ｕＬ実験物質ｍｉＲＮＡを０．５μＬ／ｍｉｎの速度で注入し、注入完了して５分をさらに待ってからハミルトンシリンジを除去し、皮膚を縫合した。左側は内部対照群（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用するために何にも注入しなかった。実験動物をケタミン（７０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）との混合液で麻酔した後、心臓を通じて４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）（０．１Ｍリン酸緩衝液内、ｐＨ７．４）で貫流固定して脳組織を摘出した。
結果
１．ＰＤモデルの細胞の死滅段階で減少したｍｉＲ
前記発現の増減が目立つｍｉＲＮＡのうち、ＰＤモデルの細胞の死滅段階で発現の減少が最も目立つｍｉＲは、図１の通りである。このうち、ｍｉＲ４９４－３ｐはまだパーキンソン病関連報告がない状態であり、顕著な減少が毎実験ごとに反復して現れた。その他にも、対数比（ｌｏｇ ｒａｔｉｏ）を基準に－２．０（３０％）以上の減少を示したｍｉＲを図１に列挙した。また、その中、ｍｉＲ－１２４４は、バイオインフォマティクスデータ解析（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ）の結果、‘ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー２Ｂ（ＴＢＣ１ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ２Ｂ）’というタンパク質をターゲティングするものと分析された。ここで重要な点は、パーキンソン病における神経細胞死滅で特異的に現れる遺伝子と知られたいずれか一つをターゲティングする根本的な調節子としてのｍｉＲＮＡを見出したことである（Ａ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｖｉｅｗ ｏｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２０１３；７：ｅ２０１３０４００４）。
２．ＰＤモデルの細胞の死滅段階で増加したｍｉＲ
前記発現の増減が目立つｍｉＲＮＡのうち、ＰＤモデルの細胞の死滅段階で発現の増加が最も目立つｍｉＲは、図２の通りである。
３．ｍｉＲ ＳＥＱ
前記発現の増減が目立つｍｉＲＮＡの配列情報は、次の通りである：
ＰＤモデルの細胞の死滅段階で発現の減少が最も目立つｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９４－３ｐ（配列目録第１配列：ＵＧＡＡＡＣＡＵＡＣＡＣＧＧＧＡＡＡＣＣＵＣ）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４４（配列目録第２配列：ＡＡＧＵＡＧＵＵＧＧＵＵＵＧＵＡＵＧＡＧＡＵＧＧＵＵ）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７６８－５ｐ（配列目録第３配列：ＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＧＧＣＣＣＵＧ）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４３２４（配列目録第４配列：ＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＣＵＡＡＣＣＵＵＡＡ）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７２６－５ｐ（配列目録第５配列：ＡＧＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣＣＵＧＧＡＧＵＧＧ）及びｈｓａ－ｍｉＲ－５０１－５ｐ（配列目録第６配列：ＡＡＵＣＣＵＵＵＧＵＣＣＣＵＧＧＧＵＧＡＧＡ）である。
ＰＤモデルの細胞の死滅段階で発現の増加が最も目立つｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２６－５ｐ（配列目録第７配列：ＧＵＧＡＧＧＧＣＡＵＧＣＡＧＧＣＣＵＧＧＡＵＧＧＧＧ）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７６７（配列目録第８配列：ＣＧＣＧＧＧＣＧＣＵＣＣＵＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣ）及びｈｓａ－ｍｉＲ－３０６４－５ｐ（配列目録第９配列：ＵＣＵＧＧＣＵＧＵＵＧＵＧＧＵＧＵＧＣＡＡ）である。
４．Ｈ＆Ｅ染色
脳の効能評価は、パーキンソン病の主要病変となる黒質緻密部の細胞生存率をＨ＆Ｅ染色で確認比較した。
１）組織の固定：細胞の酵素を不活性化し、組織内成分を凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）又は沈殿（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）させて不溶性状態（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｔｅ）に切り替えて構造をよく保存させるために固定液に浸して４℃で一日以上固定する。
２）脱水及びクリーニング：水分の除去及び水分の除去に用いた溶媒の除去過程。細部組織までのパラフィン侵入を容易にするためである。
３）パラフィンブロックの製造：パラフィンを用いて組織の内外部を整形することにより、組織や細胞の構造が変形されない。
４）スライド作製：薄切というパラフィンブロックをミクロトーム刀（Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ ｋｎｉｆｅ）で１０μｍ厚の連続冠状切片をシロキサンコーティングスライド（Ｓｉｌｏｘａｎｅ ｃｏａｔｉｎｇ ｓｌｉｄｅ）に作製する。
５）染色：組織の保存のために処理したパラフィンを除去し、ハリスヘマトキシリン（Ｈａｒｒｉｓ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）を用いて細胞の核を染色し、エオシンＹを用いて対比染色した。
６）結果は、細胞で区分される藍色部位と対比染色したピンク色で分けられる。
５．ｍｉＲＮＡの神経細胞死滅抑制効果
図３～図９から確認できるように、６－ＯＨＤＡのみ注入された内部対照群（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）（図３）において神経細胞死滅だけでなく、組織の変形によってその大きさが過度に収縮しているのに対し、ｍｉＲ４９４－３ｐ（図４）、ｍｉＲ１２４４（図５）、ｍｉＲ４３２４（図６）、ｍｉＲ４７２６－５ｐ（図７）、ｍｉＲ６７６８－５ｐ（図８）又はｍｉＲ５０１－５ｐ（図９）を投与した実験群では神経細胞が生きていることが確認された。このことから、本発明のｍｉＲＮＡが神経細胞死滅作用を防御するのに優れた効果を有すると証明された。
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は単に好ましい具現例であるだけで、これらに本発明の範囲が制限されるない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物によって定義されるへきであろう。

Claims (8)

  1. 下記の段階を含むパーキンソン病の診断のための情報を提供する方法：
    （ａ）被検者から取得したサンプル中に含まれたｍｉＲ－４９４－３ｐ、ｍｉＲ－６７６８－５ｐ、ｍｉＲ－４３２４及びｍｉＲ－４７２６－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡの発現量を正常群サンプル中に含まれた前記ｍｉＲＮＡの発現量と比較する段階；及び
    （ｂ）前記被検者のサンプル中に含まれた前記ｍｉＲＮＡの発現量が正常群サンプル中に含まれたｍｉＲＮＡの発現量よりも減少したことを確認する段階。
  2. 前記方法は、下記の段階をさらに含むことを特徴とするパーキンソン病の診断のための情報を提供する、請求項１に記載の方法：
    （ａ）被検者から取得したサンプル中に含まれたｍｉＲ－１２２６－５ｐ、ｍｉＲ－４７６７及びｍｉＲ－３０６４－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡの発現量を正常群サンプル中に含まれた前記ｍｉＲＮＡの発現量と比較する段階；及び
    （ｂ）前記被検者のサンプル中に含まれた前記ｍｉＲＮＡの発現量が正常群サンプル中に含まれたｍｉＲＮＡの発現量よりも増加したことを確認する段階。
  3. 下記の段階を含むパーキンソン病の診断のための情報を提供する方法：
    （ａ）被検者から取得したサンプル中に含まれたｍｉＲ－４７６７及びｍｉＲ－３０６４－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡの発現量を正常群サンプル中に含まれた前記ｍｉＲＮＡの発現量と比較する段階；及び
    （ｂ）前記被検者のサンプル中に含まれた前記ｍｉＲＮＡの発現量が正常群サンプル中に含まれたｍｉＲＮＡの発現量よりも増加したことを確認する段階。
  4. 下記の段階を含むパーキンソン病誘発物質のスクリーニング方法：
    （ｉ）ｍｉＲ－４９４－３ｐ、ｍｉＲ－６７６８－５ｐ、ｍｉＲ－４３２４及びｍｉＲ－４７２６－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡを発現する細胞にパーキンソン病誘発候補物質を処理し、該細胞から前記ｍｉＲＮＡの発現量を確認する段階；及び
    （ｉｉ）前記パーキンソン病誘発候補物質を処理した細胞において前記ｍｉＲＮＡの発現量が下向き調節（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）される場合、前記パーキンソン病誘発候補物質をパーキンソン病誘発物質と判断する段階。
  5. 下記の段階を含むパーキンソン病誘発物質のスクリーニング方法：
    （ｉ）ｍｉＲ－４７６７及びｍｉＲ－３０６４－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡを発現する細胞にパーキンソン病誘発候補物質を処理し、該細胞から前記ｍｉＲＮＡの発現量を確認する段階；及び
    （ｉｉ）前記パーキンソン病誘発候補物質を処理した細胞において前記ｍｉＲＮＡの発現量が上向き調節（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）される場合、前記パーキンソン病誘発候補物質をパーキンソン病誘発物質と判断する段階。
  6. 下記の段階を含むパーキンソン病治療剤のスクリーニング方法：
    （ｉ）ｍｉＲ－４９４－３ｐ、ｍｉＲ－６７６８－５ｐ、ｍｉＲ－４３２４及びｍｉＲ－４７２６－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡを発現する細胞にパーキンソン病治療剤候補物質を処理し、該細胞から前記ｍｉＲＮＡの発現量を確認する段階；及び
    （ｉｉ）前記パーキンソン病治療剤候補物質を処理した細胞において前記ｍｉＲＮＡの発現量が上向き調節（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）される場合、前記パーキンソン病治療剤候補物質をパーキンソン病治療剤と判断する段階。
  7. 下記の段階を含むパーキンソン病治療剤のスクリーニング方法：
    （ｉ）ｍｉＲ－４７６７及びｍｉＲ－３０６４－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡを発現する細胞にパーキンソン病治療剤候補物質を処理し、該細胞から前記ｍｉＲＮＡの発現量を確認する段階；及び
    （ｉｉ）前記パーキンソン病治療剤候補物質を処理した細胞において前記ｍｉＲＮＡの発現量が下向き調節（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）される場合、前記パーキンソン病治療剤候補物質をパーキンソン病治療剤と判断する段階。
  8. ｍｉＲ－４９４－３ｐ、ｍｉＲ－６７６８－５ｐ、ｍｉＲ－４３２４及びｍｉＲ－４７２６－５ｐから構成された群から選ばれる１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡを有効成分として含むパーキンソン病の予防又は治療用薬剤学的組成物。
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