JP7020924B2 - IgG4κ/λハイブリッド抗体の検出によってIgG4関連疾患を検出またはモニタリングする方法 - Google Patents
IgG4κ/λハイブリッド抗体の検出によってIgG4関連疾患を検出またはモニタリングする方法 Download PDFInfo
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Description
(i)IgG重鎖クラス;
(ii)κ軽鎖およびλ軽鎖の両方に結合するIgG4重鎖クラス;
および場合によっては、
(iii)同じ重鎖クラスを有するが、κ軽鎖のみ、またはλ軽鎖のみに結合した免疫グロブリン
を有する、抗体の相対量の間の比を検出すること
を含み、
前記方法は、
(i)前記免疫グロブリンを前記免疫グロブリンに特異的な結合剤に結合させ、ここで前記結合剤は、基材に固定化されているか、レポーター分子と複合化されており、
(ii)前記結合剤に結合した、又はレポーター分子と複合化された免疫グロブリンを検出する、標識化された検出剤を使用すること
を含む、前記免疫グロブリンの定量的検出を含む、方法が提供される。
(i)IgG重鎖クラスに特異的な少なくとも1つの結合剤;および、
a)κ軽鎖に結合したIgG重鎖クラスに特異的な結合剤と、λ軽鎖に特異的な結合剤の組み合わせ;および/または
b)λ軽鎖に結合したIgG重鎖クラスに特異的な結合剤と、κ軽鎖に特異的な結合剤の組み合わせ;および/または
c)κ軽鎖に結合したIgG重鎖クラスに特異的な結合剤と、λ軽鎖に結合したIgG重鎖クラスに特異的な結合剤の組み合わせ;
を使用して決定され得る。
(i)κ軽鎖およびλ軽鎖の両方に結合したIgG4重鎖クラス;
および場合によっては、
(ii)同じ重鎖クラスを有するが、κ軽鎖のみ、またはλ軽鎖のみに結合した免疫グロブリン
を有する、2つ以上の免疫グロブリンの相対量の比を検出することを含み、
前記方法は、
(i)前記免疫グロブリンを前記免疫グロブリンに特異的な結合剤に結合させ、ここで前記結合剤は、基材に固定化されているか、レポーター分子と複合化されており、
(ii)前記結合剤に結合した、又はレポーター分子と複合化された免疫グロブリンを検出する、標識化された検出剤を使用すること
を含む結合アッセイによる、前記免疫グロブリンの定量的検出を含む。
(i)特定の軽鎖クラスに結合するIgG4重鎖クラスに特異的な結合剤と;
(ii)反対側の軽鎖クラスに特異的な結合剤と;場合によっては
(iii)IgG4に特異的な結合剤と、1つのIgG重鎖クラスに特異的な結合剤
を含むアッセイキット、好ましくはELISAが提供される。
(i)IgG重鎖クラスに特異的な少なくとも1つの結合剤;および
a)κ軽鎖に結合するIgG重鎖クラスに特異的な結合剤と、λ軽鎖に特異的な結合剤の組み合わせ;および/または
b)λ軽鎖に結合するIgG重鎖クラスに特異的な結合剤と、κ軽鎖に特異的な結合剤の組み合わせ;および/または
c)κ軽鎖に結合するIgG重鎖クラスに特異的な結合剤と、λ軽鎖に結合するIgG重鎖クラスに特異的な結合剤の組み合わせ
を有する、2つ以上の免疫グロブリンの相対量の間で検出する方法において使用するためのキットである。
(a)κ軽鎖に特異的な結合剤と;
(b)λ軽鎖に特異的な結合剤と;
(c)所定量のIgG4λ/κ混合ハイブリッド較正剤
を含んでいる。
抗原捕獲EIAを使用してIgG4κ/λハイブリッドのレベルを測定した。22℃の湿潤な箱の中で、EIAプレート(Maxisorp(商標)平底透明96ウエルプレート;Nunc社、ロスキルデ、デンマーク国)を、2.5μg/mlのIgG4λを含むリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で一晩被覆した。その被覆溶液を除去した後、Stabicoat(商標)(SurModics社、エデン・プレリー、ミネソタ州、アメリカ合衆国)を22℃で30分間用いてプレートをブロックした。ブロックの除去後、プレートを真空下で乾燥させ、乾燥剤の袋を収容したホイル製パウチの中に密封した。希釈した患者サンプルを、2通り用意したすべてのストリップに添加した。IgG4が欠乏した血清中の精製IgG4κ/λハイブリッド(1/5000)を較正剤として用い、3回希釈して300 ng/mlから3.7 ng/mlにした。0.1%Tween(商標)(PBS-T)サンプル希釈剤を含むPBSの中で血清サンプルを1/5000に希釈し、22℃で30分間インキュベートした。0.1%Tween(商標)-Tを含むPBSで洗浄(Bio-Teck instruments Inc社、ヴァーモント州、アメリカ合衆国)した後、結合したIgG4κ/λハイブリッドを、10%StabiZyme-HRP(SurModics社)を含む生理食塩水の中で1/3000に希釈した抗κ-HRP(BindingSite社、イギリス)によって検出した。さらに30分間インキュベートして洗浄した後、テトラメチルベンジジン(TMB、SurModics社)溶液を用いてプレートを現像し、吸光度を450 nmで測定した(Bio-Teck EL800マイクロプレートリーダー)。得られた較正範囲は、18.5~1500 mg/lである。
EIAを使用して90人の健康な対象で全IgG4とIgG4κ/λハイブリッドのレベル(異常値は除外)を求めた(図5A~図5C)。全IgG4の濃度は17.25 mg/lと1587.7 mg/lの間であり、中央値は267.44 mg/l、平均値は350.217 mg/l、標準偏差は290.587である(図5A)。非パラメトリック百分位数法(CLSI C28-A3)によって求めた95%基準範囲は28.9~1603 mg/lであり、この値は血清IgG4に関して公開されている予想範囲内である。IgG4κ/λハイブリッドのレベルは16.309 mg/lと494.3 mg/lの間であり、中央値は84.085 mg/l、平均値は108.284 mg/l、標準偏差は82.7324である(図5B)。非パラメトリック百分位数法(CLSI C28-A3)によって求めた95%基準範囲は20.3~460 mg/lである。全IgG4に対するIgG4κ/λハイブリッドの比は0.163と0.9450の間の範囲であり、中央値は0.328、平均値は0.353、標準偏差は0.127525であった(図5C)。全IgG4とIgG4κ/λハイブリッドの直線プロットに同定された異常値を含めたもの(図6A)または含めないもの(図6B)は、R2値が0.95、勾配が0.27と0.28の間であった。この勾配は、全ポリクローナルIgG4の27~28%がIgG4κ/λハイブリッド分子で構成されていることを示している。これは、ポリクローナルIgG4の精製、分画、定量によって得られた公開値とよく一致している(Young他、2014年)。この分析により、IgG4κ/λハイブリッドなしの3つのサンプルが同定された。これらは、Fabアーム交換を受けていないIgG4のK409アイソアロタイプ変異体を有する人たちに由来する可能性が大きい(Brusco他、1998年)。
Claims (18)
- 対象のIgG4関連疾患を検出またはモニタリングするための方法であって、
サンプル中で、
(i)IgG重鎖クラス;および
(ii)κ軽鎖およびλ軽鎖の両方に結合したIgG4重鎖;
および場合によっては、
(iii)同じ重鎖クラスを有するが、κ軽鎖のみ、またはλ軽鎖のみに結合した免疫グロブリン
を有する、2つ以上の免疫グロブリンの相対量の間の比を検出すること
を含み、
前記方法は、
(i)前記免疫グロブリンを前記免疫グロブリンに特異的な結合剤に結合させ、ここで前記結合剤は、基材に固定化されているか、レポーター分子と複合化されており、
(ii)前記結合剤に結合した、又はレポーター分子と複合化された免疫グロブリンを検出する、標識化された検出剤を使用すること
を含む結合アッセイによる、前記免疫グロブリンの定量的検出を含み、
前記比は、以下:
(i)IgG重鎖クラスに特異的な少なくとも1つの結合剤;および
a)κ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤と、λ軽鎖に特異的な結合剤の組み合わせ;および/または
b)λ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤と、κ軽鎖に特異的な結合剤の組み合わせ;および/または
c)κ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤と、λ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤の組み合わせ;
を使用するか、あるいは、
(ii)κ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤と、λ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤の組み合わせ
を使用して、決定される、方法。 - IgG4κ/λハイブリッド分子の量を検出する方法であって、
サンプル中で、
(i)κ軽鎖とλ軽鎖の両方に結合したIgG4重鎖;
および場合によっては、
(iii)同じ重鎖クラスを有するが、κ軽鎖のみ、またはλ軽鎖のみに結合した免疫グロブリン
を有する免疫グロブリンの量を検出すること
を含み、
前記方法は、
(i)前記免疫グロブリンを前記免疫グロブリンに特異的な結合剤に結合させ、ここで前記結合剤は、基材に固定化されているか、レポーター分子と複合化されており、および
(ii)前記結合剤に結合した、又はレポーター分子と複合化された免疫グロブリンを検出する、標識化された検出剤を使用すること
を含む結合アッセイによる、前記免疫グロブリンの定量的検出を含み、
前記IgG4κ/λハイブリッド分子の量が、以下:
(i)以下:
a)κ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤と、λ軽鎖に特異的な結合剤の組み合わせ;および/または
b)λ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤と、κ軽鎖に特異的な結合剤の組み合わせ;および/または
c)κ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤と、λ軽鎖に結合したIgG重鎖クラスに特異的な結合剤の組み合わせ;
を使用するか、あるいは、
(ii)κ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤と、λ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤の組み合わせ
を使用して、決定される、方法。 - 前記IgG重鎖クラスがIgG4である、請求項1または2に記載の方法。
- 抗体を含む酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して前記比が決定される、請求項1に記載の方法。
- フローサイトメトリーまたは蛍光標識ビーズを使用して前記結合が決定される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記サンプルが、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、リンパ液、組織、または腫瘍組織であり、最も典型的には、全血、血漿、または血清である、請求項1または2に記載の方法。
- 結果が、
i)IgG4関連疾患の治療に対する対象の応答;および/または
ii)対象の環境からの抗原の除去;および/または
iii)IgG4関連疾患またはアレルギー応答のさらなる特徴づけ、
を決定するために使用される、請求項1または2に記載の方法。 - IgG4アイソアロタイプK409の存在を決定する工程をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- サンプル中の遊離したκ軽鎖および/または遊離したλ軽鎖の、存在および/または量を検出する工程をさらに含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 遊離したκ軽鎖と遊離したλ軽鎖の量の比が決定される、請求項9に記載の方法。
- 前記遊離したκ軽鎖および/または前記遊離したλ軽鎖は、遊離したκ軽鎖および/または遊離したλ軽鎖に特異的な抗体または結合剤によって検出される、請求項9または10に記載の方法。
- 合成抗体調製物の中のκ軽鎖およびλ軽鎖の両方に結合したIgG4重鎖の量または割合を決定する方法であって、
前記合成抗体調製物のサンプル中で、
(i)IgG重鎖クラス;および
(ii)κ軽鎖およびλ軽鎖の両方に結合したIgG4重鎖;
および場合によっては、
(iii)同じ重鎖クラスを有するが、κ軽鎖のみ、またはλ軽鎖のみに結合した免疫グロブリン
を有する、2つ以上の免疫グロブリンの相対量の間の比を検出すること
を含み、
前記方法は、
(i)前記免疫グロブリンを前記免疫グロブリンに特異的な結合剤に結合させ、ここで前記結合剤は、基材に固定化されているか、レポーター分子と複合化されており、
(ii)前記結合剤に結合した、又はレポーター分子と複合化された免疫グロブリンを検出する、標識化された検出剤を使用すること
を含む結合アッセイによる、前記免疫グロブリンの定量的検出を含み、
前記κ軽鎖およびλ軽鎖の両方に結合したIgG4重鎖の量または割合が、以下:
(i)IgG重鎖クラスに特異的な少なくとも1つの結合剤;および
a)κ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤と、λ軽鎖に特異的な結合剤の組み合わせ;および/または
b)λ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤と、κ軽鎖に特異的な結合剤の組み合わせ;および/または
c)κ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤と、λ軽鎖に結合したIgG重鎖クラスに特異的な結合剤の組み合わせ;
を使用するか、あるいは、
(ii)κ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤と、λ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤の組み合わせ
を使用して、決定される、方法。 - (i)以下:
a)κ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤と、λ軽鎖に特異的な結合剤の組み合わせ;および/または
b)λ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤と、κ軽鎖に特異的な結合剤の組み合わせ;および/または
c)κ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤と、λ軽鎖に結合したIgG重鎖クラスに特異的な結合剤の組み合わせ;あるいは、
(ii)κ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤と、λ軽鎖に結合したIgG4重鎖に特異的な結合剤の組み合わせ;
および場合によっては、
(iii)IgG4に特異的な結合剤、およびIgG重鎖クラスに特異的な結合剤、
を含む、アッセイキット。 - 所定量の実質的に純粋なIgG4κ/λハイブリッドを含む、請求項13に記載のアッセイキット。
- IgG重鎖クラスに特異的な少なくとも1つの結合剤を含む、請求項13または14に記載のアッセイキット。
- 請求項15のアッセイキットによって実施される方法であって、
(i)IgG重鎖クラスに特異的な結合剤;および、
a)κ軽鎖に結合したIgG重鎖クラスに特異的な結合剤と、κ軽鎖に特異的な結合剤の組み合わせ;および/または
b)λ軽鎖に結合したIgG重鎖クラスに特異的な結合剤と、λ軽鎖に特異的な結合剤の組み合わせ;および/または
c)κ軽鎖に結合したIgG重鎖クラスに特異的な結合剤と、λ軽鎖に結合したIgG重鎖クラスに特異的な結合剤の組み合わせ;
を有する、2つ以上の免疫グロブリンの相対量の間の比が検出される、方法。 - (i)IgG4κ軽鎖に特異的な結合剤と;
(ii)IgG4λ軽鎖に特異的な結合剤と;
(iii)所定量の実質的に純粋なIgG4λ/κハイブリッドと
を含む、アッセイキット。 - 前記結合剤または検出剤が、抗原特異的アプタマー、抗体、またはその抗原特異的フラグメントである、請求項1~17のいずれか1項に記載の方法またはキット。
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