JP6883330B2 - 有機酸の製造方法 - Google Patents
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Description
1.以下の(A)及び(B)の工程を含む、微細藻からの有機酸の製造方法:
(A)炭酸イオン及び/又は重炭酸イオンの含有量が20〜2000 mMの水性媒体中で微細藻を培養する工程;
(B)前記(A)の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。
2.炭酸イオン及び/又は重炭酸イオンの含有量が20〜2000 mMの水性媒体が、(1)二酸化炭素の充填、及び/又は、(2)炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウムより選択されるいずれか1種又は2種以上の炭酸塩の添加、による水性媒体である、前項1に記載の製造方法。
3.(1)二酸化炭素の充填、及び/又は、(2)炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウムより選択されるいずれか1種又は2種以上の炭酸塩の添加が、微細藻の培養の嫌気培養条件下で行われる、前項2に記載の製造方法。
4.二酸化炭素の充填が、水性媒体中で飽和状態になるまで行われる、前項2又は3に記載の製造方法。
5.前記微細藻がシアノバクテリア、ユーグレナ及びクラミドモナスから選択されるいずれか1種又は2種以上である、前項1〜4のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
6.シアノバクテリアが、シネコシスティスである、前項5に記載の有機酸の製造方法。
7.前記有機酸が、脂肪族ジカルボン酸である、前項1〜6のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
8.前記有機酸が、コハク酸、乳酸、酢酸、フマル酸、2-ケトグルタル酸、リンゴ酸、クエン酸から選択されるいずれか1種又は2種以上である、前項1〜6のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
9.微細藻が、PEPカルボキシラーゼの機能が増強された微細藻である、前項1〜8のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
10.以下の(a)及び(b)の工程を含む、微細藻からの有機酸の製造方法:
(a)PEPカルボキシラーゼの機能が増強された微細藻を水性媒体中で培養する工程;
(b)前記(a)の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。
11.微細藻が、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素の機能が増強された微細藻である、前項1〜8のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
12.以下の(c)及び(d)の工程を含む、微細藻からの有機酸の製造方法:
(c)ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素の機能が増強された微細藻を水性媒体中で培養する工程;
(d)前記(c)の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。
13.微細藻が、ホスフォグルコムターゼの機能が増強された微細藻である、前項1〜8のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
14.以下の(e)及び(f)の工程を含む、微細藻からの有機酸の製造方法:
(e)ホスフォグルコムターゼの機能が増強された微細藻を水性媒体中で培養する工程;
(f)前記(e)の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。
15.微細藻を炭酸イオン及び/又は重炭酸イオンの含有量が20〜2000 mMの水性媒体中で培養することを特徴とする、微細藻内のクエン酸回路の活性化方法。
16.微細藻が、NADPH-O2オキシドレダクターゼの発現又は発現増強するように形質転換された微細藻である、前項1〜8のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
17.以下の(C)及び(D)の工程を含む、微細藻からの有機酸の製造方法:
(C)NADPH-O2オキシドレダクターゼの機能が増強された微細藻を水性媒体中で培養する工程;
(D)前記(C)の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。
18.以下の(g)〜(i)の工程を含む、微細藻からの有機酸の製造方法:
(g)NADPH-O2オキシドレダクターゼが発現又は発現増強するように微細藻を形質転換する工程;
(h)前記(g)のNADPH-O2オキシドレダクターゼを発現又は発現増強された微細藻を水性媒体中で培養する工程;
(i)前記(h)の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。
19.前記NADPH-O2オキシドレダクターゼが、フラボジアイロンタンパク質である、前項16〜18のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
20.前記フラボジアイロンタンパク質がFlv3である、前項19に記載の有機酸の製造方法。
21.PEPカルボキシラーゼ、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、ホスフォグルコムターゼ、及びNADPH-O2オキシドレダクターゼから選択されるいずれか1種又は複数種のタンパク質が発現増強するように形質転換された、有機酸の製造用微細藻。
22.前記NADPH-O2オキシドレダクターゼがFlv3である、前項21に記載の有機酸の製造用微細藻。
23.前記微細藻がシアノバクテリアである、前項21又は22の有機酸の製造用微細藻。
(A)炭酸イオン及び/又は重炭酸イオンを20〜2000 mM含む水性媒体中で微細藻を培養する工程;
(B)前記(A)の微細藻から産生された有機酸を回収する工程。
本明細書において、「微細藻」とは、葉緑素(クロロフィル)を持ち、光合成を行う微生物をいう。微細藻は、光合成によって大気中のCO2を固定化して糖類(例えば、グリコーゲン)を合成し、他方、水(H2O)から酸素(O2)を発生させ得る(「酸素発生型光合成」ともいう)。微細藻は、単細胞形態を有するものであってもよく、又はコロニー形態(例えば、フィラメント、シート又はボール)を有するものであってもよい。微細藻は、海洋又は淡水のいずれで繁殖するものであってもよい。
上記において「水性媒体」とは、種培養及び/又は本培養に用いられる水溶液をいう。後述するように窒素源、無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。具体的には、微細藻に応じて、人工又は天然の海水、あるいは淡水(例えば、蒸留水)を用いてもよい。例えば、BG-11培地(J Gen Microbiol 111: 1-61 (1979));HSM培地及びTAP培地(低温科学,67:17-21 (2009))、Cramer-Myers培地(CM培地)等を使用することができる。具体的には、以下の表1に示す組成の培地を用いてもよい。
微細藻の培養温度は、通常15〜40℃、好ましくは20〜37℃であり、より好ましくは25℃〜35℃である。水性媒体のpHは、微細藻の増殖に適した任意のpH、例えば、pH 5〜10、好ましくは、pH 6〜9、より好ましくは、pH 6〜8に調整することができる。pHは、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を添加することによって適宜調整することができる。
以上の様な方法で産生された有機酸は、必要に応じて、水性媒体から、自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる分離、精製方法により分離、精製することができる。具体的には、限外ろ過膜分離、遠心分離、濃縮等により微細藻及びその産生物と分離した後、カラム法、晶析法等の公知の方法で精製し、乾燥させる事により、結晶として採取する方法等が挙げられる。本発明で、製造の対象となる有機酸としては、特に限定されるものではないが、クエン酸回路において産生される細胞内代謝有機酸であり、具体的には有機カルボン酸である。有機カルボン酸として、例えばコハク酸、乳酸、酢酸、フマル酸、2-ケトグルタル酸、リンゴ酸、クエン酸等が挙げられる。有機酸のうちコハク酸、フマル酸、2-ケトグルタル酸、リンゴ酸等の脂肪族ジカルボン酸が好適であり、特にコハク酸が好適である。
上記方法で微細藻から産生された有機酸を回収することで、化石燃料資源を用いず、環境に優しく効果的に有機酸を製造することができる。すなわち、微細藻の光合成と微細藻に取り込まれた炭素源によりバイオマスから有機酸を産生可能となり、環境に優しく効果的に有機酸を製造することができる。水性媒体への炭酸イオン及び/又は重炭酸イオンの供給は、例えば電気や鉄鋼等の製造工程において産業的に排出された大気中のCO2を利用し、有効活用することができる。大気中のCO2を有効活用できる点で、自然環境に対して優れた効果を有する。さらに、本発明の微細藻によれば、バイオマスとして使用される水性媒体は淡水のみならず海水を活用することができ、水資源の枯渇や耕作地の限界に左右されず安定的に有効活用することができる。
本発明は、微細藻を炭酸イオン及び/又は重炭酸イオンの含有量が20〜2000 mMの水性媒体中で培養することを特徴とする、微細藻内クエン酸回路の活性化方法にも及ぶ。本発明の方法によれば、クエン酸回路が活性化され、その結果、細胞内代謝物である有機酸の産生が増強される。
本実施例において、微細藻類の微生物種としてシネコシスティスPCC6803種(Synechocystis sp. PCC6803)グルコース耐性(GT)(Williams JGK, 1988, Methods Enzymol 167: 766-778)(以下、本実施例及び各実施例において「PCC6803(GT)」という。)を用いた。
BG-11寒天培地(1.5% Agarを含むBG-11)上で生育したPCC6803(GT)のコロニーを白金耳でとり、水性媒体(70 mL)に加え、pH7.8にて通気条件下、50μmol photons m-2 s-1で30℃にて4〜5日間培養した。ここでは水性媒体として、BG-11液体培地(Rippka Rら, 1J Gen Microbiol 111: 1-61 (1979))に17.6 mM NaNO3, 20 mM Hepes-KOHを含む培養液を用いた。藻体密度は、Shimadzu UV mini spectrophotometer(紫外可視分光光度計:株式会社島津製作所製)を用いてOD750により測定した。培養後のOD750は1〜1.5であった。通気とは、特に言及しない場合は空気による通気を意味する。以下の実施例についても同様である。
上記(1)で前々培養したPCC6803(GT)を、OD750が0.1になるように水性媒体(150 mL)に加え、pH7.8にて通気条件下、50μmol photons m-2 s-1で30℃にて4〜5日間培養した。ここでは水性媒体として、BG-11液体培地に17.6 mM NaNO3, 20 mM Hepes-KOHを含む培養液を用いた。培養後のOD750は1〜1.5であった。
上記(2)で前培養したPCC6803(GT)を、OD750が0.4になるように水性媒体(70 mL)に加え、pH7.8にてCO2通気条件下、120μmol photons m-2 s-1で30℃にて3日間培養した。ここでは、水性媒体としてBG-11液体培地に5 mM NH4Cl, 50 mM Hepes-KOHを含む培養液を用いた。培養後のOD750は6〜7であった。培養後、フィルター(polytetrafluoroethylene膜、孔径1μm)濾過にてPCC6803(GT)を回収した。
上記(3)で回収したPCC6803(GT)を、OD750が20になるように水性媒体(10 mL)に加えた。ここでは水性媒体として100 mM Hepes-KOH(pH7.8)を用いた。0〜500 mMの炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)を水性媒体に添加し、10分間のN2通気後、嫌気条件下で培養を開始し、72時間後にPCC6803(GT)を含む水性媒体を回収した。
本実施例において、微細藻類の微生物種としてユーグレナ(Euglena gracilis (NIES-48))株を用いた。以下「NIES-48」という。
Cramer-Myers寒天培地(1.5% Agarを含むCM培地)上で生育したNIES-48のコロニーを白金耳でとり、水性媒体(70 mL)に加え、pH7.8にて通気条件下、50μmol photons m-2 s-1で30℃にて4〜5日間培養した。ここでは水性媒体として、表2に示す組成のCM培地に7.5mM (NH4)2HPO4を含む培養液を用いた。培養後のOD750は1〜1.5であった。
上記(1)で前々培養したNIES-48を、OD750が0.1になるように水性媒体(150 mL)に加え、pH3.5にて通気条件下、50μmol photons m-2 s-1で30℃にて4〜5日間培養した。ここでは水性媒体として、CM培地に7.5 mM (NH4)2HPO4を含む培養液を用いた。培養後のOD750は1〜1.5であった。
上記(2)で前培養したNIES-48を、OD750が0.4になるように水性媒体(70 mL)に加え、pH3.5にてCO2通気条件下、120μmol photons m-2 s-1で30℃にて5日間培養した。ここでは、水性媒体としてCM培地に3 mM (NH4)2HPO4を含む培養液を用いた。培養後のOD750は6〜7であった。培養後、遠心分離(3000g、5分、4℃)によりNIES-48を回収した。
上記(3)で回収したNIES-48を、OD750が20になるように水性媒体(10 mL)に加えた。ここでは水性媒体として100 mM Hepes-KOH(pH7.8)を用いた。そして、0、100、200 mMとなるようにNaHCO3を水性媒体に添加し、10分間のN2通気後、嫌気条件下で170rpmで撹拌しながら30℃で培養を開始し、72時間培養した。密閉状態を維持したままNIES-48を含む水性媒体を回収した。
本実施例において、微細藻類の微生物種としてクラミドモナス(Chlamydomonas reinhardtii)株を用いた。以下「C. reinhardtii」という。
TAP寒天培地(1.5%Agarを含むTAP培地)上で生育したC. reinhardtiiのコロニーを白金耳でとり、水性媒体(70 mL)に加え、pH7.8にてCO2通気条件下、100μmol photons m-2 s-1で30℃にて4〜5日間培養した。ここでは水性媒体としてMB6N培地を用いた。培養後のOD750は2.5〜3.5であった。TAP培地及びMB6N培地の組成は表3に示した。
上記(1)で前々培養したC. reinhardtiiを、OD750が0.1になるように水性媒体(150 mL)に加え、pH7.8にてCO2通気条件下、120μmol photons m-2 s-1で30℃にて3日間培養した。ここでは水性媒体としてMB6N培地を用いた。培養後のOD750は2.5〜3.5であった。
上記(2)で前培養したC. reinhardtiiを、OD750が0.4になるように水性媒体(70 mL)に加え、pH7.8にてCO2通気条件下、120μmol photons m-2 s-1で30℃にて5日間培養した。ここでは水性媒体としてMB6N培地を用いた。培養後のOD750は3.5〜4.5であった。培養後、遠心分離(14000g、5分、4℃)でC. reinhardtiiを回収した。
上記(3)で回収したC. reinhardtiiを、OD750が20になるように水性媒体(10 mL)に加えた。ここでは水性媒体として50 mM Hepes-KOH (pH7.8)を用いた。また、0、100 mMとなるようにNaHCO3を添加し、10分間のN2通気後、嫌気条件下170rpmで撹拌しながら、30℃で培養を開始し、72時間培養した。密閉状態を維持したままC. reinhardtiiを含む水性媒体を回収した。
本実施例では、微細藻類を飽和状態のCO2条件下で培養したときの有機酸の産生について確認した。本実施例では、実施例1と同様にPCC6803(GT)を用いた。
BG-11寒天培地(1.5% Agarを含むBG-11)上で生育したPCC6803(GT)のコロニーを白金耳でとり、水性媒体(70 mL)に加え、pH7.8にて通気条件下、50μmol photons m-2 s-1で30℃にて4〜5日間培養した。ここでは水性媒体として、BG-11液体培地(Rippka Rら, 1J Gen Microbiol 111: 1-61 (1979))に17.6 mM NaNO3, 20 mM Hepes-KOHを含む培養液を用いた。藻体密度は、Shimadzu UV mini spectrophotometer(紫外可視分光光度計:株式会社島津製作所製)を用いてOD750により測定した。培養後のOD750は1〜1.5であった。通気とは、特に言及しない場合は空気による通気を意味する。以下の実施例についても同様である。
上記(1)で前々培養したPCC6803(GT)を、OD750が0.1になるように水性媒体(150 mL)に加え、pH7.8にて通気条件下、50μmol photons m-2 s-1で30℃にて4〜5日間培養した。ここでは水性媒体として、BG-11液体培地に17.6 mM NaNO3, 20 mM Hepes-KOHを含む培養液を用いた。培養後のOD750は1〜1.5であった。
上記(2)で前培養したPCC6803(GT)を、OD750が0.4になるように水性媒体(70 mL)に加え、pH7.8にてCO2通気条件下、120μmol photons m-2 s-1で30℃にて3日間培養した。ここでは、水性媒体としてBG-11液体培地に5 mM NH4Cl, 50 mM Hepes-KOHを含む培養液を用いた。培養後のOD750は6〜7であった。培養後、フィルター(polytetrafluoroethylene膜、孔径1μm)濾過にてPCC6803(GT)を回収した。
上記(3)で回収したPCC6803(GT)を、OD750が20になるように水性媒体(10 mL)に加えた。ここでは水性媒体として100 mM Hepes-KOH(pH7.8)を用いた。72時間N2を通気する条件及び72時間CO2を通気する条件下で培養し、PCC6803(GT)を含む水性媒体を回収した。この条件により、液体培地においてN2及びCO2は飽和状態となった。
本実施例ではPEPカルボキシラーゼ過剰発現微細藻による有機酸の産生を確認した。本実施例では実施例1に示すPCC6803(GT)を用いて、遺伝子組換え操作によりPEPカルボキシラーゼ過剰発現株PCC6803(PEPox)を作製した。PCC6803(PEPox)の作製方法は以下のとおりである。微細藻によるコハク酸の産生経路を図6に示し、PEPカルボキシラーゼ作用点を示した。
配列番号4:5'-GCCAGCCCCAACACCTGACGCGTTTCCCCACTTAGATAAAAAATCC-3'
配列番号5:5'-TCTAAGTGGGGAAACGCGTCAGGTGTTGGGGCTGGC-3'
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配列番号14:5'- AACCTGCAGGTCGACTCAACCAGTATTACGCA -3'
本実施例では、PGM過剰発現微細藻による有機酸の産生を確認した。本実施例では実施例1に示すPCC6803(GT)を用いて、遺伝子組換え操作によりPGM過剰発現株PCC6803(PGMox)を作製した。PCC6803(PGMox)の作製方法は、図8に示した。微細藻によるコハク酸の産生経路を図6に示し、PGM作用点を示した。
本実施例では、PFOR過剰発現微細藻による有機酸の産生を確認した。本実施例では実施例1に示すPCC6803(GT)を用いて、遺伝子組換え操作によりSynechococcus sp. PCC7002由来PFOR遺伝子(A1443)を過剰発現する株PCC6803(PFORox)を作製した。PCC6803(PFORox)の作製方法は、図10に示した。微細藻によるコハク酸の産生経路を図6に示し、PFOの作用点を示した。
8−1.Flv3過剰発現微細藻の作製
本実施例では実施例1に示すPCC6803(GT)を用いて、遺伝子組換え操作によりFlv3過剰発現株PCC6803(Flv3ox)を作製した。PCC6803(Flv3ox)の作製方法は以下のとおりである。
本実施例では、PCC6803(Flv3ox)を用いて有機酸産生プロセスの検討を行った。
BG11寒天培地(1.5%Agarを含むBG11)上で生育したPCC6803(Flv3ox)のコロニーを白金耳でとり、水性媒体(70 mL)に加え、pH7.8にて通気条件下、50μmol photons m-2 s-1で30℃にて4〜5日間培養した。ここでは水性媒体として、BG-11液体培地(Rippka Rら, 1979, J Gen Microbiol 111: 1-61)に17.6 mM NaNO3, 20 mM Hepes-KOHを含む培養液を用いた。Shimadzu UV mini spectrophotometer(紫外可視分光光度計:株式会社島津製作所製)を用いてOD750により細胞密度を測定した。培養後のOD750は1〜1.5であった。
上記(1)で前々培養したPCC6803(Flv3ox)を、OD750が0.1になるように水性媒体(150 mL)に加え、pH7.8にて通気条件下、50μmol photons m-2 s-1で30℃にて4〜5日間培養した。ここでは水性媒体として、G-11液体培地に17.6 mM NaNO3, 20 mM Hepes-KOHを含む培養液を用いた。培養後のOD750は1〜1.5であった。
上記(2)で前培養したPCC6803(Flv3ox)を、OD750が0.4になるように水性媒体(70 mL)に加え、pH7.8にて1% CO2通気条件下、120μmol photons m-2 s-1で30℃にて3日間培養した。ここでは、水性媒体としてBG-11液体培地に5 mM NH4Cl/NaNO3, 50 mM Hepes-KOHを含む培養液を用いた。培養後のOD750は6〜7であった。培養後、菌体を遠心分離(14000g、5分、4℃)で回収した。
上記(3)で培養したPCC6803(Flv3ox)を、OD750が20になるように水性媒体(10 mL)に加え、N2通気による嫌気条件下で10分後に170rpmで撹拌し、30℃で培養を開始した。ここでは水性媒体として50 mM Hepes-KOHを用いた。密閉状態を維持したまま水性媒体を回収し、OD/pHを測定し、有機酸分析、メタボローム解析、グリコーゲン分析を行った。
上記8−2の嫌気・暗所条件下で培養したPCC6803(Flv3ox)及び比較例としてのPCC6803(VC)について、コハク酸及び乳酸の産生量を確認した。水性媒体中の窒素源として塩化アンモニウム(NH4Cl)を用いた。
上記8−2の(4)で培養したPCC6803(Flv3ox)培養液及び比較例の培養液を、各々14000g、4℃にて5分間遠心分離し、上清を回収した。0.45μm孔径Mini-uniPrep(GEヘルスケア・ジャパン株式会社製)を用いて濾過し、HPLCカラム(Aminex HPX-87H;Bio-Rad社製)及び屈折率検出器(RID-10A;株式会社島津製作所製)を備えた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)(株式会社島津製作所製)を用いて、コハク酸及び乳酸の産生量を測定した。その結果、Flv3過剰発現させたPCC6803(Flv3ox)がコハク酸及び乳酸のいずれについても高い産生量を示した(図12)。
実施例8(8−2)の嫌気・暗所条件下で培養したPCC6803(Flv3ox)及び比較例としてのPCC6803(VC)について、細胞内グリコーゲン及びATPの蓄積量を測定した。水性媒体中の窒素源として塩化アンモニウム(NH4Cl)を用いた。その結果、グリコーゲン及びATPのいずれについてもFlv3過剰発現させたPCC6803(Flv3ox)が高い蓄積量を示した(図13)。
1μm孔径ポリテトラフルオロエチレン(PTEE)メンブレンフィルター(Omnipore;Millipore社製)を用いて5 mg乾燥重のPCC6803(Flv3ox)を採取した。濾過直後、細胞を20 mMの予冷した炭酸アンモニウムで洗浄した。すぐに、メンブレンフィルター上のPCC6803(Flv3ox)を液体窒素中で凍結し、凍結乾燥機(Labconco社製)内で凍結乾燥した。既報(Izumi Yら, 2013, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 930: 90-97)の通り、細胞からグリコーゲンを抽出した後、サイズ排除HPLCカラム(OHpak SB-806M HQ;昭和電工株式会社製)及び屈折率検出器(RID-10A;株式会社島津製作所製)を備えた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)(株式会社島津製作所製)を用いて、グリコーゲン含量を測定した。
ATP量は、非特許文献2に記載の通り、細胞内代謝物を抽出し、そしてキャピラリー電気泳動/質量分析(CE/MS)システム(CE:Agilent G7100;MS,Agilent G6224AA LC/MSD TOF; Agilent Technologies社製)及びMassHunter Workstation Data Acquisitionソフトウェア(Agilent Technologies社製)により制御される液体クロマトグラフィー−トリプル四重極質量分析(LC/QqQ-MS)システム(LC:Agilent 1200 series;MS,Agilent 6460 with Jet Stream Technology;Agilent Technologies社製)を用いて分析し、測定した。
本参考例では、微細藻として実施例1に示したPCC6803(GT)を用い、細胞内代謝物質の13C標識率の経時変化を確認した。PCC6803(GT)を100 mMのNaH13CO3を含む100 mM Hepes-KOH水性媒体(pH7.8)に懸濁し、N2通気後嫌気条件下で培養した。ラベル後24時間目に、1μm孔径ポリテトラフルオロエチレン(PTEE)メンブレンフィルター(Omnipore;Millipore社製)を用いて5 mg乾燥重のPCC6803(GT)を採取した。濾過直後、細胞を20 mMの予冷した炭酸アンモニウムで洗浄した。すぐに、メンブレンフィルター上のPCC6803(GT)を液体窒素中で凍結し、凍結乾燥機(Labconco社製)内で凍結乾燥した。非特許文献2に記載の通り、細胞内代謝物を抽出し、そしてキャピラリー電気泳動/質量分析(CE/MS)システム(CE:Agilent G7100;MS,Agilent G6224AA LC/MSD TOF; Agilent Technologies社製)及びMassHunter Workstation Data Acquisitionソフトウェア(Agilent Technologies社製)により制御される液体クロマトグラフィー−トリプル四重極質量分析(LC/QqQ-MS)システム(LC:Agilent 1200 series;MS,Agilent 6460 with Jet Stream Technology;Agilent Technologies社製)を用いて分析し、測定した。その結果を、図14に示した。細胞内代謝経路は図15に示した。上記結果より、PCC6803(GT)の嫌気条件培養により、微細藻に取り込まれたNaHCO3は、有機酸に異化されることが確認された。
本参考例では微細藻としてPCC6803(GT)を用い、実施例8の嫌気・暗所条件下で培養したときの、細胞密度変化、グリコーゲン蓄積量を確認した。水性媒体中の窒素源として塩化アンモニウム(NH4Cl)又は硝酸ナトリウム(NaNO3)を用いた。
上記培養したPCC6803(GT)について、Shimadzu UV mini spectrophotometer(紫外可視分光光度計:株式会社島津製作所製)を用いてOD750により細胞密度を測定した。
その結果、窒素源の違いによる細胞密度はほとんど差がなかった(図16A)。
グリコーゲンは、実施例9)と同手法により測定した。その結果、窒素源の違いによるグリコーゲンの細胞内蓄積量はほとんど差がなかった(図16B)。
本参考例ではPCC6803(GT)を参考例2と同手法にて培養したときの酢酸、乳酸及びコハク酸の産生を確認した。乳酸及びコハク酸の産生量は、非特許文献2に記載の通り、細胞内代謝物を抽出し、そしてキャピラリー電気泳動/質量分析(CE/MS)システム(CE:Agilent G7100;MS,Agilent G6224AA LC/MSD TOF; Agilent Technologies社製)及びMassHunter Workstation Data Acquisitionソフトウェア(Agilent Technologies社製)により制御される液体クロマトグラフィー−トリプル四重極質量分析(LC/QqQ-MS)システム(LC:Agilent 1200 series;MS,Agilent 6460 with Jet Stream Technology;Agilent Technologies社製)を用いて分析し、測定した。
本参考例では、PCC6803(GT)を参考例2と同手法にて培養したときの細胞内代謝プロファイルを調べた。細胞内代謝プロファイルは、非特許文献2に記載の通り、細胞内代謝物を抽出し、そしてキャピラリー電気泳動/質量分析(CE/MS)システム(CE:Agilent G7100;MS,Agilent G6224AA LC/MSD TOF; Agilent Technologies社製)及びMassHunter Workstation Data Acquisitionソフトウェア(Agilent Technologies社製)により制御される液体クロマトグラフィー−トリプル四重極質量分析(LC/QqQ-MS)システム(LC:Agilent 1200 series;MS,Agilent 6460 with Jet Stream Technology;Agilent Technologies社製)を用いて分析し、測定した。
本参考例では、PCC6803(GT)を参考例2と同手法にて培養したときの細胞内のATP量を調べた。即ち、コハク酸、乳酸及びリンゴ酸等の有機酸の産生に伴うATPの利用を確認した。その結果、有機酸の産生に伴い、ATPがADP及びAMPに分解することが確認された(図20)。即ち、細胞内に蓄積されたATPを有効活用し、コハク酸、乳酸及びリンゴ酸等の有機酸が効果的に産生されることが確認された。即ち、本発明のFlv3が過剰発現するよう作製されたPCC6803(Flv3ox)によれば、より効果的に有機酸が産生されることが示唆された。
Claims (9)
- 以下の(A)及び(B)の工程を含む、シネコシスティスからの脂肪族ジカルボン酸、コハク酸及び乳酸から選択されるいずれかの有機酸の製造方法:
(A)炭酸イオン及び/又は重炭酸イオンの含有量が100〜500mMの水性媒体中、暗所及び嫌気的培養条件下でNADPH−O2オキシドレダクターゼの機能が増強されたシネコシスティスを培養する工程;
(B)前記(A)のシネコシスティスから産生された有機酸を回収する工程。 - 炭酸イオン及び/又は重炭酸イオンの含有量が100〜500mMの水性媒体が、(1)二酸化炭素の充填、及び/又は、(2)炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウムより選択されるいずれか1種又は2種以上の炭酸塩の添加、による水性媒体である、請求項1に記載の製造方法。
- 二酸化炭素の充填が、水性媒体中で飽和状態になるまで行われる、請求項2に記載の製造方法。
- NADPH−O2オキシドレダクターゼの機能が増強されたシネコシスティスが、NADPH−O2オキシドレダクターゼが発現又は発現増強するように形質転換されたシネコシスティスである、請求項1〜3のいずれかに記載の製造方法。
- 前記NADPH−O2オキシドレダクターゼが、フラボジアイロンタンパク質である、請求項1〜4のいずれかに記載の製造方法。
- 前記フラボジアイロンタンパク質が、Flv3である、請求項5に記載の製造方法。
- シネコシスティスが、さらにPEPカルボキシラーゼの機能が増強されたシネコシスティスである、請求項1〜6のいずれかに記載の製造方法。
- シネコシスティスが、さらにピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素の機能が増強されたシネコシスティスである、請求項1〜6のいずれかに記載の製造方法。
- シネコシスティスが、さらにホスフォグルコムターゼの機能が増強されたシネコシスティスである、請求項1〜6のいずれかに記載の製造方法。
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