JP6873201B2

JP6873201B2 - Ｔｒａｉｌ誘導のためのファーマコフォア

Info

Publication number: JP6873201B2
Application number: JP2019164086A
Authority: JP
Inventors: キムディー．ヤンダ; ニコラスティー．ジェイコブ; ジョナサンダブリュ．ロックナー
Original assignee: ザスクリプスリサーチインスティテュート
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2019-09-10
Publication date: 2021-05-19
Anticipated expiration: 2035-03-30
Also published as: HRP20200478T1; KR102473930B1; WO2015153468A1; US10239877B2; SI3125898T1; JP2017511321A; EP3125898A1; CA3158795A1; ES2779979T3; JP2021119157A; CA2944452C; LT3125898T; EP3125898A4; KR20220163533A; AU2015241069A1; DK3125898T3; PL3125898T3; KR102611067B1; HUE049013T2; CN111499636B

Description

関連出願の相互参照
本願は、2014年3月31日に出願の米国仮特許出願第61/972,689号の優先権を主張し、その開示はその全体において参照により本明細書に組み入れられる。

政府支援の言明
本発明は、国立衛生研究所によって与えられたHHSN27200700038C、AI077644、AI079436、およびAI094348の下で政府の支援によって行われた。合衆国政府は本発明において一定の権利を有する。

背景
癌免疫監視は、誘発性発癌および自然発生的な発癌をいずれも修飾することができる免疫系の様々なエフェクター機能に依存している。TRAILは、正常細胞と比較して癌細胞におけるアポトーシスを選択的に誘導するその能力のため、この過程に強く関与している免疫監視サイトカインである(S. R. Wiley, K. Schooley, P. J. Smolak, W. S. Din, C. P. Huang, J. K. Nicholl, G. R. Sutherland, T. D. Smith, C. Rauch, C. A. Smith, Immunity 1995, 3, 673-682（非特許文献1）; A. Ashkenazi, V. M. Dixit, Science 1998（非特許文献2）; H. Walczak, R. E. Miller, K. Ariail, B. Gliniak, T. S. Griffith, M. Kubin, W. Chin, J. Jones, A. Woodward, T. Le, et al, Nat. Med. 1999, 5, 157-163（非特許文献3）;およびA. Ashkenazi, R. C. Pai, S. Fong, S. Leung, D. A. Lawrence, S. A. Marsters, C. Blackie, L. Chang, A. E. McMurtrey, A. Hebert, et al., J. C1in. Invest. 1999, 104, 155-162（非特許文献4）)。TRAIL遺伝子は、様々な組織および細胞で発現しており(S. R. Wiley, K. Schooley, P. J. Smolak, W. S. Din, C. P. Huang, J. K. Nicholl, G. R. Sutherland, T. D. Smith, C. Rauch, C. A. Smith, Immunity 1995, 3, 673-682（非特許文献1）)、樹状細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、および単球／マクロファージが含まれる(M. J. Smyth, K. Takeda, Y. Hayakawa, J. J. Peschon, M. R. M. van den Brink, H. Yagita, Immunity 2003, 18, 1-6（非特許文献5）)。その遺伝子発現は、転写因子NF-κBおよびp53などのいくつかの転写制御因子に制御されている(K. Kuribayashi, G. Krigsfeld, W. Wang, J. Xu, P. A. Mayes, D. T. Dicker, G. S. Wu, W. S. El-Deiry, Cancer Biol. Ther. 2008, 7, 2034-2038（非特許文献6）)。中和抗体によるTRAIL発現の減少およびTRAIL遺伝子が欠如したマウスにおけるTRAIL発現の消失は、特にp53欠損マウスにおいて、発癌物質誘発性線維肉腫、肉腫、およびリンパ腫の発達をもたらす(E. Cretney, K. Takeda, H. Yagita, M. Glaccum, J. J. Peschon, M. J. Smyth, J. Immunol. 2002（非特許文献7）;およびK. Takeda, M. J. Smyth, E. Cretney, Y. Hayakawa, N. Kayagaki, H. Yagita, K. Okumura, J. Exp. Med. 2002, 195, 161-169（非特許文献8）)。これらのデータは、免疫細胞におけるTRAIL発現の変化が癌細胞におけるTRAIL抵抗性に関連しているという所見とも一致している(N. S. M. Azahri, M. M. Kavurma, Cell. Mol. Life Sci. 2013, 70, 3617-3629（非特許文献9）)。よって、免疫細胞におけるTRAIL産生のエフェクターは臨床的意義を有し(M. J. Smyth, K. Takeda, Y. Hayakawa, J. J. Peschon, M. R. M. van den Brink, H. Yagita, Immunity 2003, 18, 1-6（非特許文献5）)、複雑な免疫監視シグナル伝達システムを研究するためのモデル系を実現する手段としても使用されうる。

S. R. Wiley, K. Schooley, P. J. Smolak, W. S. Din, C. P. Huang, J. K. Nicholl, G. R. Sutherland, T. D. Smith, C. Rauch, C. A. Smith, Immunity 1995, 3, 673-682 A. Ashkenazi, V. M. Dixit, Science 1998 H. Walczak, R. E. Miller, K. Ariail, B. Gliniak, T. S. Griffith, M. Kubin, W. Chin, J. Jones, A. Woodward, T. Le, et al, Nat. Med. 1999, 5, 157-163 A. Ashkenazi, R. C. Pai, S. Fong, S. Leung, D. A. Lawrence, S. A. Marsters, C. Blackie, L. Chang, A. E. McMurtrey, A. Hebert, et al., J. C1in. Invest. 1999, 104, 155-162 M. J. Smyth, K. Takeda, Y. Hayakawa, J. J. Peschon, M. R. M. van den Brink, H. Yagita, Immunity 2003, 18, 1-6 K. Kuribayashi, G. Krigsfeld, W. Wang, J. Xu, P. A. Mayes, D. T. Dicker, G. S. Wu, W. S. El-Deiry, Cancer Biol. Ther. 2008, 7, 2034-2038 E. Cretney, K. Takeda, H. Yagita, M. Glaccum, J. J. Peschon, M. J. Smyth, J. Immunol. 2002 K. Takeda, M. J. Smyth, E. Cretney, Y. Hayakawa, N. Kayagaki, H. Yagita, K. Okumura, J. Exp. Med. 2002, 195, 161-169 N. S. M. Azahri, M. M. Kavurma, Cell. Mol. Life Sci. 2013, 70, 3617-3629

概要
本発明は、様々な態様において、サイトカインTRAILを産生するためのTRAIL遺伝子を発現することが可能である細胞においてTRAIL遺伝子の発現を誘導することが可能な化合物の有効量を含む化合物および薬学的組成物に指向されている。TRAIL(サイトカイン)は、正常細胞と比較して癌細胞におけるアポトーシスを選択的に誘導することができる。したがって、本開示は、様々な癌を治療するために有効な化合物および医薬を提供する。理論に拘束されるものではないが、開示された化合物および薬学的組成物はTRAILの発現を誘導する。

様々な態様において、本発明は、式(I)

の化合物、またはその薬学的に許容される塩に指向されており、
式中、
Cycは、少なくとも1個の窒素原子を含み該窒素原子に式Ar¹-CR₂-の基が結合している、単一の5〜8員ヘテロシクリル環であり；
Ar¹およびAr²は、それぞれ独立して選択されるアリール基であり、該アリール基は、0、1、または2個のJ基で独立して置換されており；
それぞれ独立して選択されるRは、Hであるかまたは(C1〜C6)アルキルであり；
Jは、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C9)シクロアルキル、(C3〜C9)シクロアルキル(C1〜C6)アルキル、またはハロである。

本開示は、

からなる群より選択される化合物を含む薬学的組成物を提供する。様々な態様において、TRAILを誘導するために使用される化合物は、化合物2

またはその薬学的に許容される塩である。化合物2のIUPAC名は、7-ベンジル-4-(2-メチルベンジル)-1,2,6,7,8,9-ヘキサヒドロイミダゾ[1,2-a]ピリド[3,4-e]ピリミジン-5(4H)-オンである。

本開示は、患者に化合物2などの式(I)の化合物の有効量を投与する工程を含む、様々な癌を治療するための方法を提供する。広範な哺乳類の癌を治療するための方法は、治療される広範な哺乳類の癌が、卵巣癌、結腸癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、胃腸癌、頭頸部癌、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、メラノーマ、神経膠芽腫、ミエローマ、神経芽細胞由来CNS腫瘍、単球性白血病、B細胞由来白血病、T細胞由来白血病、B細胞由来リンパ腫、T細胞由来リンパ腫、および肥満細胞由来腫瘍、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される。
[本発明1001]
式(I)

の化合物、またはその薬学的に許容される塩：
式中、
Cycは、1個の窒素原子を含み環窒素原子に式Ar¹-CR₂-の基が結合している、5〜8員単環式ヘテロシクリル環であり；
Ar¹およびAr²はそれぞれ独立して、0、1、または2個のJ基で置換されているアリール基であり；
Rは独立してHまたは(C1〜C6)アルキルであり；
Jは独立して、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C9)シクロアルキル、(C3〜C9)シクロアルキル(C1〜C6)アルキル、ハロ、または(C1〜C6)ハロアルキルである。
[本発明1002]
下位分類である式(IA)

の範囲内にある本発明1001の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
[本発明1003]
Ar¹およびAr²がそれぞれ、0、1、または2個のJ基で置換されているフェニル基であり；かつ
それぞれの場合のRが独立してHまたは(C1〜C6)アルキルである、
本発明1002の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
[本発明1004]

からなる群より選択される本発明1001の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
[本発明1005]
式(I)

の化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を投与する工程を含む、癌を治療するための方法：
式中、
Cycは、1個の窒素原子を含み該窒素原子に式Ar¹-CR₂-の基が結合している、5〜8員単環式ヘテロシクリル環であり；
Ar¹およびAr²は、0、1、または2個のJ基で置換されているアリール基であり；
Rは独立してHまたは(C1〜C6)アルキルであり；
Jは独立して、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C9)シクロアルキル、(C3〜C9)シクロアルキル(C1〜C6)アルキル、ハロ、または(C1〜C6)ハロアルキルである。
[本発明1006]
前記化合物が、式(IA)

の化合物、またはその薬学的に許容される塩である、本発明1005の方法。
[本発明1007]
式(IA)の化合物、Ar¹およびAr²が、0、1、または2個のJ基で置換されているフェニル基である、本発明1005の方法。
[本発明1008]
式(I)の化合物が、式2

である、本発明1005の方法。
[本発明1009]
前記癌が、卵巣癌、結腸癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、胃腸癌、頭頸部癌、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、メラノーマ、神経膠芽腫、ミエローマ、神経芽細胞由来CNS腫瘍、単球性白血病、B細胞由来白血病、T細胞由来白血病、B細胞由来リンパ腫、T細胞由来リンパ腫、および肥満細胞由来腫瘍、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1005の方法。

(a)表示した用量の直線型(linear)異性体(1)または角度型(angular)異性体2で48時間処理したRAW細胞におけるTRAIL mRNAの誘導；(b)表示した時間での5μMの化合物1および化合物2に対するTRAIL mRNA誘導の誘導を示す。(c)角度型(2)および(9)に対する用量依存的反応。化合物2aはNCIレポジトリから入手した試料であり、化合物2bは本明細書において合成した化合物であり；いずれも構造2の化合物であることが示された。 TRAIL発現に関する不活性化合物1および活性化合物2のイミダゾリノピリミダノン構造の比較を示す。それぞれの構造は、X線結晶解析により確認した。構造異性体である化合物9の構造を示す。化合物1および化合物2の比較構造を示す。化合物2について得られたX線結晶構造を示す。化合物9について得られたX線結晶構造を示す。化合物2(HIPPO)および本明細書における化合物A〜Rを含む、20mM濃度の様々な化合物の活性を比較した細胞生存度アッセイ法を示す。

詳細な説明
本開示は、式(I)

の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供し、
式中、
Cycは、1個の窒素原子を含み該環窒素原子に式Ar¹-CR₂-の基が結合している、5〜8員単環式ヘテロシクリル環であり；
Ar¹およびAr²はそれぞれ独立して、0、1、または2個のJ基で置換されているアリール基であり；
Rは独立してHまたは(C1〜C6)アルキルであり；
Jは独立して、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C9)シクロアルキル、(C3〜C9)シクロアルキル(C1〜C6)アルキル、ハロ、または(C1〜C6)ハロアルキルである。

好ましくは、式(I)の化合物は、下位分類である式(IA)

の範囲内の化合物、またはその薬学的に許容される塩である。

より具体的には、式(IA)の化合物は、
Ar¹およびAr²がそれぞれ、0、1、または2個のJ基で置換されているフェニル基であり；かつ
それぞれの場合のRが独立して、Hまたは(C1〜C6)アルキルである、
化合物、またはその薬学的に許容される塩である。

好ましくは、式(I)の化合物は、化合物2

またはその薬学的に許容される塩である。

様々な態様では、本発明は、化合物2ではない式(I)の化合物を提供する。

本開示は、式(I)

の化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を投与する工程を含む、様々な癌を治療するための方法をさらに提供し、
式中、
Cycは、1個の窒素原子を含み該窒素原子に式Ar¹-CR₂-の基が結合している、5〜8員単環式ヘテロシクリル環であり；
Ar¹およびAr²は、0、1、または2個のJ基で置換されているアリール基であり；
Rは独立してHまたは(C1〜C6)アルキルであり；
Jは独立して、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C9)シクロアルキル、(C3〜C9)シクロアルキル(C1〜C6)アルキル、ハロ、または(C1〜C6)ハロアルキルである。

好ましくは、化合物は、式(IA)

の下位分類より選択される化合物、またはその薬学的に許容される塩である。

より好ましくは、式(IA)の化合物において、Ar¹およびAr²は、0、1、または2個のJ基で置換されているフェニル基である。

最も好ましくは、式(I)の化合物は、化合物2

である。

様々な態様において、本発明は、化合物2ではない式(I)の化合物によって様々な癌を治療するための方法を提供する。

方法は、広範な哺乳類の癌を治療するために使用でき、治療される広範な哺乳類の癌は、卵巣癌、結腸癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、胃腸癌、頭頸部癌、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、メラノーマ、神経膠芽腫、ミエローマ、神経芽細胞由来CNS腫瘍、単球性白血病、B細胞由来白血病、T細胞由来白血病、B細胞由来リンパ腫、T細胞由来リンパ腫、および肥満細胞由来腫瘍、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される。

別のイミダゾリノピリミジノン(本明細書において化合物1と呼ぶ)は、2012年11月1日に公開された米国特許出願第20120276088号に開示されている。この特許出願は、本明細書において比較目的のために使用する直線型化合物1を開示している。本発明者は、4-クロロニコチン酸から4段階で化合物1を合成した(スキーム1)。
スキーム1

化合物1の合成： (a)SOCl₂、90℃、1時間、次いで2-メチルチオイミダゾリンヨウ化水素酸塩、Et₃N、CH₂Cl₂、0℃〜室温、19時間、96％；(b)2-メチルベンジルアミン、K₃P0₄、N,N-ジメチルアセトアミド、還流、1時間、79％；(c)45psi H₂(g)、PtO₂、MeOH/TFA、室温、5時間、80％；(d)ベンズアルデヒド、Na(OAc)₃BH、AcOH、CH₂Cl₂、室温、4時間、87％。

簡潔に記載すると、活性化されたカルボン酸をアシル化し、次いで二重置換反応させ、続いて水素化および還元的アミノ化して、52％の全収率で化合物1が生じた。化合物1のこの構造は、質量分析、核磁気共鳴(NMR)分光法、およびX線結晶解析により確認した(実施例部分を参照されたい)。

化合物1の生物活性は、マウスマクロファージ細胞株RAW264.7におけるTRAIL mRNA発現のRT-PCR分析によって測定した。10μMもの高い用量(図1a)においてまたは長期の曝露(図1b)によっても、対照と比べてTRAIL mRNA発現における変化は観察されなかった。図1に示すように、化合物2a(NCIから入手)は、合成した化合物2bと同様に所望のTRAIL生物活性を呈するが、合成した化合物1はそうではない。したがって、当技術分野では、より角度型である式(I)の化合物である生物学的に活性なイミダゾリノピリミジノン、特に化合物2を生成する必要がある。

化合物2は、82％の収率で3段階において調製した(スキーム2)。本明細書において化合物2bと称される合成物が得られ、その構造は2であると確認した。
スキーム2

化合物2の合成： (a)クロロ蟻酸メチル、Et₃N、CH₂Cl₂、0℃〜室温、44時間、97％；(b)2-メチルベンジルアミン、MeOH、AcOH、還流、45時間、87％；(c)NaOMe、MeOH、還流、18時間、97％。

還流するメタノール中およびナトリウムメトキシド中のグアニジン7と1-ベンジル-4-オキソピペリジン-3-カルボキシレート塩酸塩(8)との混合物は、ほぼ2bのみを生じ；この反応の後処理に続く¹H NMRにより微量の1が検出されたが、続く精製によって除去された。本発明者らは、7のイミダゾリニル窒素が7のベンジル窒素と比べて統計的および立体的の両方の優位性を有すると考えることによって、この結果を理論的に説明する。8のケトンカルボニルに対する窒素による最初の攻撃でアミノカルビノール中間体が生じ、これは分子内環状縮合を受けて合成試料2bを提供する。その構造2は、質量分析およびNMR分光法により確認した。

合成試料2bとして得られた化合物2は、リポジトリ化合物2aと同様にTRAIL mRNA発現を誘導することが可能であった(図1c)。

したがって、角度型化合物2(本明細書における発明者により活性TRAIL誘導因子であることが示された)は、構造

を有する。化合物1(活性であるとは見受けられない)は、構造

を有し、異性体である直線型化合物は、構造9

を有する。これら3つの化合物のうち、化合物2のみが所望のTRAIL生物活性を呈する。

実施例部分で記載するように取り上げたX線結晶構造は図に提供している。

これらの知見は、三環式コアの角度的融合がマクロファージにおけるTRAIL誘導のためのファーマコフォアには必要であるという構造-活性相関関係を提供する。

化合物2の本発明者の3段階合成は、カルバメート6の調製(T. Smejkal, D. Gribkov, J. Geier, M. Keller, B. Breit, Chemistry 2010, 16, 2470-2478)およびグアニジン7へのその変換(W. K. Fang, P. X. Nguyen, K. Chow, T. M. Heidelbaugh, D. G. Gomez, M. E. Garst, S. C. Sinha, Allergan Inc., USA, 2011)から開始した。1,1-ジアミンが非対称である場合、生成物の異性体混合物が予想される(J. V. Greenhill, M. J. Ismail, P. N. Edwards, P. J. Taylor, J Chem Soc Perk T 2 1985, 1255-1264; C. Romano, E. Delacuesta, C. Avendano, F. Florencio, J. Sainzaparicio, Tetrahedron 1988, 44, 7185-7192; F. Esser, K. H. Pook, A. Carpy, Synthesis-Stuttgart 1990, 72-78を参照されたい)。還流するメタノール(NaOMeを補充した)中のグアニジン7と1-ベンジル-4-オキソピペリジン-3-カルボキシレート塩酸塩との混合物は、ほぼ化合物2のみを生じ；この反応の後処理に続く¹H NMRにより微量の化合物1が検出された。本発明者は、7のイミダゾリニル窒素が7のベンジル窒素と比べて統計的および立体的両方の優位性を有すると考えることによってこの結果を理論的に説明する。ケトンカルボニルに対する窒素による最初の攻撃でアミノカルビノール中間体が生じ、これは分子内環状縮合を受けて2を提供する。

2-アミノ-2-オキサゾリン(非対称1,1-ジアミンの一種)とのβ−ケトエステルのK₂CO₃媒介反応は、直線型および角度型生成物の混合物をもたらす(I. Forfar, C. Jarry, M. Laguerre, J. M. Leger, I. Pianet, Tetrahedron 1999, 55, 12819-12828)。著者らは「環内の窒素原子が最も求核性であり、二求電子種(biselectrophile)の最も求電子性の炭素を攻撃する。環外の窒素原子と第2の求電子中心との閉環で二環式ヘテロ環合成が完了する」との考えを支持する実験的および理論的証拠を集めた。これは、同様のストラテジーでの7の合成における本発明者自身の所見と一致している。

本合成の顕著な特徴を繰り返して記載すると、還流するメタノール中のナトリウムメトキシドを使用することにより(M. F. Koehler, P. Bergeron, E. Blackwood, K. K. Bowman, Y. H. Chen, G. Deshmukh, X. Ding, J. Epler, K. Lau, L. Lee, L. Liu, C. Ly, S. Malek, J. Nonomiya, J. Oeh, D. F. Ortwine, D. Sampath, S. Sideris, L. Trinh, T. Truong, J. Wu, Z. Pei, J. P. Lyssikatos, J. Med. Chem. 2012, 55, 10958-10971)、ほぼ化合物2のみが生成される。塩基の存在下および／または高温で縮合が実施される場合、統計的および立体的により可能性の高いアミノカルビノール中間体が迅速な分子内環状縮合を受けて化合物2に至るのに十分な手段が使用可能である。

さらに、関連する化合物A〜Rが合成された。化合物A〜Rの特徴を下の表1に提供する。

（表１）

本明細書において使用する単数形の「1つの(a)」「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈上明らかに他の意味である場合を除き複数形の対象を含む。

本明細書において使用する「約」という用語は、数的な値または範囲を指す際には、値または範囲におけるある程度のばらつき、例えば、記載の値または記載の範囲の限度の10％以内または5％以内を許容する。

すべてのパーセント組成は、特に記載のない場合、重量パーセントとして与えられる。

「病気」または「疾患」または「異常(malcondition)」は区別なく使用され、TRAILの発現を誘導するのに、かつ、例えば選択的に癌細胞においてアポトーシスを誘導するのに適切な有効量または濃度の本発明の合成リガンドを用いて治療上有益な効果を達成することができるように疾患もしくは異常またはそれらの症状に関与する生化学的機序においてTRAILが、細胞におけるTRAIL遺伝子の発現を誘導することなど、重要な役割を果たす病気または状態を指すべく使用される。例えば、本開示の化合物により治療される癌は広範な哺乳類の癌を含み、治療される広範な哺乳類の癌は、卵巣癌、結腸癌、乳房癌、肺癌、ミエローマ、神経芽細胞由来CNS腫瘍、単球性白血病、B細胞由来白血病、T細胞由来白血病、B細胞由来リンパ腫、T細胞由来リンパ腫、および肥満細胞由来腫瘍、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される。

「有効量」という表現は、疾患を患う個体に対する治療法を記載するために使用される際には、個体の組織におけるTRAILの発現を誘導するのに有効な本発明の化合物の分量または濃度を指す。

「ハロ」または「ハロゲン」または「ハライド」という用語はそれ自体でまたは別の置換基の一部として、特に記載のない場合、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子、好ましくはフッ素、塩素、または臭素を意味する。

当技術分野において周知のように「塩」は、イオン形態のカルボン酸、スルホン酸、またはアミンなどの有機化合物を対イオンと組み合わせて含む。例えば、酸はそれらのアニオン形態で、金属カチオン、例えば、ナトリウム、カリウムなどのカチオンと；NH₄ ⁺などのアンモニウム塩もしくはテトラメチルアンモニウムなどのテトラアルキルアンモニウム塩を含む様々なアミンのカチオンと、またはトリメチルスルホニウムなどの他のカチオンなどと塩を形成しうる。「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」塩は、塩化物塩またはナトリウム塩などの、ヒトの摂取について承認されており、一般に非毒性であるイオンから形成される塩である。「両性イオン」は、一方がアニオンを形成し他方がカチオンを形成する互いに平衡を保つ役目をする少なくとも2つのイオン化可能な基を有する分子の中で形成しうるものなどの内部塩である。例えば、グリシンなどのアミノ酸は両性イオン形態で存在しうる。「両性イオン」は、本明細書における意味内の塩である。本発明の化合物は塩の形態をとってもよい。「塩」という用語は、本発明の化合物である遊離酸または遊離塩基の付加塩を包含する。塩は「薬学的に許容される塩」でありうる。「薬学的に許容される塩」という用語は、薬学的用途において有用性がある範囲内の毒性プロファイルを有する塩を指す。薬学的に許容されない塩はそれでもなお、高い結晶性などの特性を有する場合があり、本発明の実施における有用性、例えば、本発明の化合物の合成、精製、または製剤化の過程において有用性を有する。「薬学的にまたは薬理学的に許容される」とは、必要に応じて動物またはヒトに投与した際に、有害反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を生じさせない分子実体および組成物を含む。ヒトの投与については、製剤は、FDA Office of Biologicsの基準により要求される無菌性、発熱性、ならびに一般的安全性および純度基準を満たしているのがよい。

一般的手法
特に記載のない場合、すべての反応は無水条件を用いて乾燥溶媒とともにアルゴン雰囲気下で行った。化学薬品は、Acros Organics、Oakwood Products、およびSigma-Aldrichから購入した。注記のない場合、それらは受領した状態のままで使用した。乾燥ジクロロメタン(CH₂Cl₂)は、水素化カルシウム(CaH₂)で蒸留して得た。乾燥メタノール(MeOH)は、屑状マグネシウム(magnesium turning)で蒸留して得た。試薬は、特に記載のない場合、市販の最も高品質なものを購入し、さらなる精製はせずに使用した。収率は、特に記載のない場合、クロマトグラフィーおよび分光法(¹H NMR)的に均質な物質を指す。反応は、可視化作用因子としてのUV光、または塩基性の過マンガン酸カリウム(KMnO₄)水溶液、および展開作用因子としての熱を用いて0.25mmのE. Merckシリカゲルプレート(60F-254)で行った薄層クロマトグラフィー(TLC)によりモニタリングした。E. Merckシリカゲル(60、粒度0.040〜0.063mm)をフラッシュカラムクロマトグラフィーに使用した。分取薄層クロマトグラフィー(PTLC)分離を0.50mmのE. Merckシリカゲルプレート(60F-254)で行った。有機溶媒の濃縮は、減圧下にてロータリーエバポレータで実施し、続いてデュアルステージメカニカルポンプを用いてさらに排気した。NMRスペクトルは、Bruker DRX-600、DRX-500、およびAMX-400機器に記録し、内部基準として残留非重水素化溶媒を用いて較正した(CHCl₃＠δ7.26ppm ¹H NMR,δ77.16ppm ¹³C NMR;CD₃OD＠δ4.87ppm ¹H NMR,δ49.00 ppm ¹³C NMR)。¹H NMR多重度を説明するため次の略語(またはそれらの組み合わせ)を使用した：s=一重線、d=二重線、t=三重線、m=多重線、br=ブロード。高解像度質量スペクトル(HRMS)は、エレクトロスプレーイオン化飛行時間リフレクトロン実験によりAgilent LC/MSD TOF質量分析計に記録した。IRスペクトルは、ATRアクセサリーを備えたPerkinElmer Spectrum 100 FTIR分光計、またはJasco 480 Plus FTIR分光計のいずれかに記録した。融点はFisher-Johns 12-144融点測定装置に記録し、校正はしていない。

合成手法

(4-クロロピリジン-3-イル)(2-(メチルチオ)-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル)メタノン (3)
4-クロロニコチン酸(1.00g、6.35mmol)とSOCl₂(15mL)との混合物を90℃で1時間撹拌した。回転蒸発によるSOCl₂の除去で4-クロロニコチン酸クロリド塩酸塩が淡黄色の固形物として得られ、これをアルゴンバルーン下に配置し、0℃まで冷却し、CH₂Cl₂(45mL)に溶解した。CH₂Cl₂(75mL)中の2-メチルチオ-2-イミダゾリンヨウ化水素酸塩(1.32g、5.40mmol)とEt₃N(2.92mL、20.95mmol)との溶液をカニューレで添加した。淡い琥珀色の溶液を室温で一晩撹拌した。19時間後、CH₂Cl₂(150mL)を添加し、得られた溶液を飽和NaHCO₃水溶液(2×100mL)および塩水(2×100mL)で洗浄した。有機層を乾燥させ(Na₂SO₄)、真空下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー(19:1 CH₂Cl₂/MeOH)による精製で、3(1.32g、96％)を淡黄色のシロップとしてもたらした。
R_f=0.19(シリカゲル、19:1 CH₂Cl₂/MeOH)

10-(2-メチルベンジル)-2,3-ジヒドロイミダゾ[1,2-a]ピリド[4,3-ｄ]ピリミジン-5(10H)-オン (4)
3(1.30g、5.08mmol)、2-メチルベンジルアミン(1.89mL、15.25mmol)、粉末K₃PO₄(1.08g、5.08mmol)、およびN,N-ジメチルアセトアミド(10mL)の混合物を還流状態で1時間加熱した。得られた混合物を、冷却し、CH₂Cl₂(30mL)およびH₂O(30mL)に分割した。有機層を乾燥させ(Na₂SO₄)、真空下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー(19:1 CH₂Cl₂/MeOH)および冷ヘキサンでの研和による精製で、4(1.17g、79％)を白色の固形物としてもたらした。
融点182〜188℃(ヘキサン)
R_f=0.32(シリカゲル、19:1 CH₂Cl₂/MeOH)

10-(2-メチルベンジル)-2,3,6,7,8,9-ヘキサヒドロイミダゾ[1,2-a]ピリド[4,3-d]ピリミジン-5(10H)-オン (5)
4(300mg、1.03mmol)、PtO₂(60mg)、MeOH(3mL)、およびTFA(3mL)の混合物をパルシェーカー(Parr shaker)中で5時間水素化(45psi)した。混合物をCelite(登録商標)パッドでろ過して触媒を除去し、次いで真空下で濃縮した。無色のシロップを1:1 EtOAc/H₂O(40mL)に溶解し、2M NaOH(10mL)の添加により塩基性にし、層を分割した。水層をEtOAc(40mL)で抽出した。合わせた有機層を塩水(20mL)で洗浄し、乾燥させ(Na₂SO₄)、真空下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー(19:1:0.1 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OH)による精製で、5(244mg、80％)を白色の固形物としてもたらした。
融点170〜174℃(MeOH)
R_f=0.12(シリカゲル、19:1:0.1 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄0H)

7-ベンジル-10-(2-メチルベンジル)-2,6,7,8,9,10-ヘキサヒドロイミダゾ[1,2-a]ピリド][4,3-d]ピリミジン-5(3H)-オン (1)
CH₂Cl₂(2.5mL)中の5(230mg、0.78mmol)とベンズアルデヒド(103μL、1.02mmol)との溶液を室温においてAcOH(76μL、1.35mmol)およびNa(OAc)₃BH(267mg、1.26mmol)で処理した。混合物を4時間撹拌し、次いでCH₂Cl₂(10mL)で希釈し、飽和NaHCO₃(10mL)水溶液で洗浄した。水層をCH₂Cl₂(10mL)で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ(Na₂SO₄)、真空下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー(19:1 CH₂Cl₂/MeOH)による精製で、1(261mg、87％)を白色の固形物としてもたらした。
融点166〜168℃(MeOH)
R_f=0.25(シリカゲル、19:1 CH₂Cl₂/MeOH)

2-(メチルチオ)-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-カルボン酸メチル (6)
0℃でCH₂Cl₂(50mL)中の2-メチルチオ-2-イミダゾリンヨウ化水素酸塩(12.21g、50mmol)とEt₃N(16mL、115mmol)との溶液にクロロ蟻酸メチル(5.0mL、65mmol)を滴下して処理した。混合物を室温まで温め一晩撹拌した。44時間後、混合物をEtOAc(200mL)で希釈し、撹拌し、次いでろ過して不溶性の塩を除去した。塩をEtOAc(50mL)ですすいだ。ろ液を真空下で濃縮して、6(8.47g、97％)が白色の固形物としてもたらした。
R_f=0.33(シリカゲル、19:1 CH₂Cl₂/MeOH)

N-(2-メチルベンジル)-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-2-アミン (7)
MeOH(48mL)中の6(1.5g、8.61mmol)と2-メチルベンジルアミン(1.08mL、8.74mmol)との溶液をAcOH(4.8mL)で処理した。溶液を穏やかに還流させながら撹拌した。45時間後、溶液を室温まで冷却し、真空下で濃縮した。残渣をCH₂Cl₂(100mL)に溶解し、1M NaOH(55mL)、塩水(55mL)で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥させ、ろ過し、真空下で濃縮した。冷CH₃CNでの研和で、7(1.42g、87％)を白色の固形物としてもたらした。
R_f=0.14(シリカゲル、9:1:0.1 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OH)

7-ベンジル-4-(2-メチルベンジル)-1,2,6,7,8,9-ヘキサヒドロイミダゾ[1,2-a]ピリド[3,4-e]ピリミジン-5(4H)-オン (2)
1-ベンジル-4-オキソピペリジン-3-カルボン酸メチル塩酸塩8(568mg、2.0mmol)と7(795mg、4.2mmol)との混合物をMeOH(0.5M、3.0mL、1.5mmol)中のナトリウムメトキシドの溶液で処理した。混合物を穏やかに還流させながら一晩撹拌した。18時間後、反応を室温まで冷却し、CH₂Cl₂(50mL)で希釈し、塩水(20mL)で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥させ、ろ過し、真空下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー(19:1 CH₂Cl₂/MeOH)による精製で、2(753mg、97％)を淡黄色の固形物としてもたらした。
融点132〜135℃(MeOH)
R_f=0.25(シリカゲル、19:1 CH₂Cl₂/MeOH)

（表１）化合物1、2、および9についての13C NMR化学シフトの比較

スペクトルはCDCl₃において150MHzで記録した。

X線結晶構造
化合物2(合成試料2bとして)および9のX線結晶構造を得た。パラメータは下に与える通りであり、得られた構造は図5および6にそれぞれ提供する。

化合物2(HIPPOとも呼ぶ)
Mo Kα放射線(λ=0.71073)搭載のBruker X8 APEX II Ultra CCD回折計で単結晶X線回折研究を行った。パラトンオイルのついたCryoloopに0.18×0.16×0.08mmの無色透明なプレートの2を載置した。データは、

走査を用いて窒素ガス流中で100Kにて収集した。1.0°の走査幅で5秒の曝露時間を用いて結晶検出器間距離は50mmとした。データ収集は、θで25.00°に対して99.9％の完全性であった。指数-11<=h<=10、-11<=k<=11、-19<=l<=18をカバーする合計14019個の反射が収集された。4833個の反射が対称非依存性であり、Rintが0.0391であることがわかった。指数付けおよび単位格子の精密化が単純三斜格子を示した。空間群はP-1であることが分かった。データは、Bruker SAINTソフトウェアプログラムを用いて統合し、SADABSソフトウェアプログラムを用いて位取りした。直接法(SHELXT)によって解くと、提唱した構造と一致する完全なフェージングモデルが生成された。

すべての非水素原子は、完全行列最小二乗法(SHELXL)により異方的に精密化した。すべての水素原子は、騎乗(riding)モデルを用いて配置した。それらの位置は、SHELXLにおける適切なHFIXコマンドを用いてそれらの親原子に対して束縛した。

結晶学的データを下にまとめる。完全な計測パラメータは、番号981022の元でCCDCから使用可能である。図5を参照されたい。

化合物2についての結晶データおよび構造精密化
識別コード Janda01(2)
実験式 C₂₄H₂₆N₄O
分子式 C₂₄H₂₆N₄O
式量 386.49
温度 100K
波長 0.71073Å
結晶系三斜晶
空間群 P-1
単位格子寸法 a=8.1173(11)Å α=85.638(3)°
b=8.4320(11)Å β=85.045(3)°
c=14.6360(19)Å γ=83.059(3)°
体積 988.5(2)Å³
Z 2
密度(計算値) 1.298Mg/m³
吸収係数 0.082mm^-1
F(000) 412
結晶サイズ 0.18×0.16×0.08mm³
結晶色、晶癖無色の板状
データ収集のためのθ範囲 2.439〜29.252°
指数範囲 -11<=h<=10、-11<=k<=11、-19<=l<=18
収集された反射 14019
独立した反射 4833[R(int)=0.0391]
θ=25.000°に対する完全性 99.9％
吸収補正同等物から半経験的
最大透過および最少透過 0.0976および0.0673
精密化方法 F²に対する完全行列最小二乗法
データ/束縛/パラメータ 4833/0/263
F²に対する適合度 1.027
最終R指数[I>2Σ(I)] R1=0.0433、wR2=0.1082
R指数(全データ) R1=0.0697、wR2=0.1181
吸光係数該当せず
ピークおよびホールの最大差(Largest diff. peak and hole)
0.320および-0.204e.Å^-3

パラトンオイルのついたCryoloopに化合物9の無色の結晶を載置し、データをMo K_α放射線(Mo回転陽極から生成)を伴うBruker APEX II CCDで100Kにて収集した。吸収についてはデータをSADABSで補正し、構造は直接法により解明した。

すべての非水素原子は、F²に対する完全行列最小二乗法により異方的に精密化し、すべての水素原子は適切な騎乗パラメータを有する算出位置に配置した。
最も高いピーク 0.4224 0.6962 0.1821において0.20[C9からの0.63A]
最も深いホール 0.0912 0.4660 0.3644において-0.23[C17からの0.93A]
結晶学的パラメータを下にまとめる。完全な計測パラメータは、番号981024の元でCCDCから使用可能である。図6を参照されたい。

化合物9についての結晶データおよび構造精密化
識別コード Janda03(9)
実験式 C₂₄H₂₆N₄O
分子式 C₂₄H₂₆N₄O
式量 386.49
温度 100K
波長 0.71073Å
結晶系三斜晶
空間群 P-1
単位格子寸法 a=5.6439(18)Å α=93.194(9)°
b=10.537(4)Å β=91.021(6)°
c=16.502(5)Å γ=96.745(5)°
体積 972.8(6)Å³
Z 2
密度(計算値) 1.319Mg/m³
吸収係数 0.083mm^-1
F(000) 412
結晶サイズ 0.22×0.02×0.02mm³
結晶色、晶癖無色の棒状
データ収集のためのθ範囲 1.95〜26.34°
指数範囲 -6<=h<=6、-13<=k<=12、-20<=l<=18
収集された反射 10564
独立した反射 3904[R(int)=0.0507]
θ=25.00°に対する完全性 99.9％
吸収補正マルチスキャン/SADABS
最大透過および最少透過 0.9983および0.9820
精密化方法 F²に対する完全行列最小二乗法
データ/束縛/パラメータ 3904/0/263
F²に対する適合度 1.003
最終R指数[I>2Σ(I)] R1=0.0430、wR2=0.0942
R指数(全データ) R1=0.0719、wR2=0.1068
ピークおよびホールの最大差 0.201および-0.229e.Å^-3

生物学的方法
細胞培養方法：
RAW264.7細胞(ATCC TIB-71)を、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、非必須アミノ酸(100×ストック、Invitrogen Corp.)、pH7.4の1OmM HEPES(1Mストック、Invitrogen)、および10％ウシ胎児血清(FBS、Hyclone)を添加したダルベッコ変法イーグル培地(4.5g/Lグルコースおよびピルビン酸を含むDMEM, Gibco BRL, Invitrogen Corp., USA)の増殖培地中で維持した(V. V. Kravchenko, R. J. Ulevitch, G. F. Kaufmann, Methods Mol. Biol. 2011, 692, 133-145)。

RNA RT-PCR実験：
細胞を3mLの増殖培地で1:5に希釈して6ウェルプレート(Corning Costar 3506)に播種し、細胞が接着した後に培地を交換した。12時間の培養後、DMSO中の記載濃度の化合物で細胞を処理し、その化合物またはビヒクルの存在下で記載の時間にわたり培養した。このとき、培地を除去し、細胞をTRIzol試薬(Life Technologies)で処理し、添付のプロトコールでRNAを抽出した。RNA濃度はHitachi U-2000 UV-Vis分光光度計で決定し、試料はH2O中で12μg/5μLまで希釈した。この溶液をH₂O中で1:5に希釈し、この溶液1μLを50μLのRT-PCR反応混合液(Qiagen Onestep RT-PCRキット)およびTRAILプライマーの

と混合した。

RT-PCRは、Applied Biosystems Gene Amp 9700 PCRシステムで実行した。RT-PCR産物をTAE緩衝液中の5.5％アクリルアミドゲル上で分析した(T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1989)。

RAW264.7細胞を、10％ウシ胎児血清(Gibco BRL, Invitrogen Corp., USA)、L-グルタミン、ピルビン酸、ペニシリン/ストレプトマイシン、および非必須アミノ酸(Invitrogenからの100×ストック)を添加したフェノール不含ダルベッコ変法イーグル培地(4.5g/Lグルコースを含むDMEM, Gibco BRL, Invitrogen Corporation, USA)においてCostar 96ウェルプレート(Corning Inc, NY)に細胞約500個／ウェルで播種した。4時間後、細胞をビヒクル、溶解緩衝液、化合物2(HIPPO)20μM、または上の表1に列挙した18種類の誘導体化合物(A〜R)20μMで処理し、これを3回通り繰り返した。48時間後、細胞生存率を製造元のプロトコールにしたがって比色定量XTTホルマザンアッセイ法(Cell Signaling Tech.)により評価した。相対吸光度は、Mac(GraphPad)用のPrism 5を用いて、ビヒクルで処理した細胞(陰性対照)および溶解緩衝液で処理した細胞(陽性対照)に対して規準化した。このアッセイ法の結果を図7にまとめる。図7は、RAW264.7癌細胞の増殖を弱める能力におけるHIPPOに対する化合物A〜Rの比較を示す。化合物A〜FはHIPPOと同様の活性を呈し、三環のコアの外側にあるアミド窒素の置換基の修飾は十分に許容されかつオキソフォア(auxophore)ということになることを実証している。

Claims

還流メタノールおよびナトリウムメトキシド中で化合物7

を化合物8

と接触させて、化合物2

を生成する段階を含む、化合物2を製造する方法。
化合物7と化合物8のモル比が2.1：1である、請求項1に記載の方法。
還流が18時間実施される、請求項1に記載の方法。
ナトリウムメトキシドと化合物8のモル比が0.75：1である、請求項1に記載の方法。
化合物8がその塩酸塩として存在する、請求項1に記載の方法。