JP6854266B2 - 抗体製剤および方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１３年７月４日に出願された米国仮特許出願第６１／８４３，０１１号、および２０１４年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／９７９，８８６号（両方とも、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる）の恩典を主張する。

配列表への言及
「抗体製剤および方法」のための、２０１４年７月１日に作成されたファイル４４６２５７ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに書かれた配列表は３７．９キロバイトである。このファイルに含まれる情報はこれにより、参照により組み込まれる。

シヌクレイン病は、レビー小体病（ＬＢＤ）としても知られており、ドーパミン作動系の変性、運動変化、認知障害、およびレビー小体（ＬＢ）および／またはレビー神経突起の形成により特徴付けられる（ＭｃＫｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ （１９９６） ４７：１１１３−２４）。シヌクレイン病はパーキンソン病（特発性パーキンソン病を含む）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）としても知られているびまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病のレビー小体バリアント（ＬＢＶ）、アルツハイマー病とパーキンソン病の複合型、純粋自律神経失調症および多系統萎縮症（ＭＳＡ；例えば、オリーブ橋小脳萎縮症、線条体黒質変性症およびシャイ・ドレーガー症候群）を含む。いくつかの非運動性の徴候および症状が、疾患の前駆期（すなわち、症状が出る前、無症候性、前臨床、または運動前野期間）におけるシヌクレイン病の前兆であると考えられる。そのような初期徴候としては、例えば、レム睡眠行動障害（ＲＢＤ）、嗅覚喪失および便秘が挙げられる（Ｍａｈｏｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ （２０１０） ７５：４８８−４８９）。レビー小体病は、老齢集団における運動障害および認知衰退の共通原因であり続ける（Ｇａｌａｓｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｎｅｕｒｏｌ． （１９９４） ５１：８８８−９５）。

αシヌクレインはβおよびγシヌクレインならびにシノレチンを含むタンパク質の大きなファミリーの一部である。αシヌクレインは正常状態で、シナプスと関連して発現され、神経可塑性、学習および記憶において、役割を果たすと考えられる。いくつかの研究は、αシヌクレインをＰＤ発病における中心的役割と関連づけている。このタンパク質は、病態において凝集して、不溶性原線維を形成し得る。例えば、シヌクレインはＬＢ中に蓄積する（Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９９７） ３８８：８３９−４０； Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． （１９９８） １５２：３６７−７２； Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ． （１９９７） ２３９：４５−８）。αシヌクレイン遺伝子における突然変異は希な家族性形態のパーキンソニズムと同時分離する（Ｋｒｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ． （１９９８） １８：１０６−８； Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９７） ２７６：２０４５−７）。トランスジェニックマウス（Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０００） ２８７：１２６５−９）およびショウジョウバエ（Ｆｅａｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （２０００） ４０４：３９４−８）におけるαシヌクレインの過剰発現は、レビー小体病のいくつかの病理学的側面を模倣する。加えて、シヌクレインの可溶性オリゴマーは神経毒性となり得ることが示唆されている（Ｃｏｎｗａｙ ＫＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ （２０００） ９７：５７１−５７６； ＶｏｌｌｅｓＭＪ， Ｌａｎｓｂｕｒｙ ＰＴ， Ｊｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （２００３） ４２：７８７１−７８７８）。ヒト、マウス、およびハエという多様な種および動物モデルにおいてαシヌクレインの蓄積が同様の形態学的および神経学的変化を有することより、この分子がレビー小体病の発症の一因であることが示唆される。

本発明はシヌクレイン病の予防および治療に有用な抗体製剤を提供する。発明は、（ａ）抗体９Ｅ４（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−８２２１）のキメラ、ベニヤ化、またはヒト化バージョン、または、結合に関して９Ｅ４と特異的に競合する、および／またはαシヌクレインのアミノ酸残基１１８−１２６内のエピトープに対するものである、そのフラグメント（抗体は約１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度で存在する）；（ｂ）約１０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲内の濃度で存在するクエン酸塩バッファー；（ｃ）約２１０ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲内の濃度で存在するトレハロース；および（ｄ）約０．００５重量％〜約０．０５重量％の範囲内の濃度で存在するポリソルベート２０を含む医薬製剤を提供し；ここで、製剤は、約５．５〜約７の範囲内のｐＨにより特徴付けられる。いくつかの製剤は、例えば、配列番号：１１と少なくとも９０％同一であり配列番号：１１の３つのＫａｂａｔ ＣＤＲを含む成熟ヒト化重鎖可変領域、および、配列番号：４に少なくとも９０％同一であり配列番号：４の３つのＫａｂａｔ ＣＤＲを含むヒト化軽鎖を含む抗体を含む。

発明のいくつかの製剤では、抗体は約５−１００ｍｇ／ｍｌ、例えば、５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度（例えば、約１０ｍｇ／ｍＬ）で存在し、または、約２５−７５ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度（例えば、約５０ｍｇ／ｍＬ）で存在する。発明のいくつかの製剤では、抗体は、約３６ｍｇ／ｍＬ〜約４４ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度で存在する（例えば、約４０ｍｇ／ｍＬ）。

発明のいくつかの製剤では、クエン酸塩バッファーは約２０ｍＭの濃度で存在する。

発明のいくつかの製剤では、トレハロースは約２３０ｍＭの濃度で存在する。

本明細書で記載されるように調製される、発明のいくつかの代表的な製剤は（ａ）約３３５ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧により特徴付けられ；（ｂ）製剤中で凝集物として存在する約１０％未満の抗体を含み；（ｃ）さらに増量剤を含み；（ｄ）無菌であり；および／または（ｅ）凍結解凍で安定である。本明細書で記載されるように調製される、発明のいくつかの代表的な製剤は、（ａ）約２９５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３７５ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧により特徴付けられ；（ｂ）製剤中で凝集物として存在する約１０％未満または約５％未満の抗体を含み；（ｃ）さらに増量剤を含み；（ｄ）無菌であり；および／または（ｅ）凍結解凍で安定である。

発明の１つの態様では、製剤は、（ａ）配列番号：２９を含むアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号：３１または３２を含むアミノ酸配列を有する重鎖（Ｃ末端リジンありまたはなし）を含む抗体であって、約４０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する抗体；（ｂ）約２０ｍＭの濃度で存在するクエン酸塩バッファー；（ｃ）約２３０ｍＭの濃度で存在するトレハロース；（ｄ）約０．２ｇ／Ｌの濃度で存在するポリソルベート２０；および（ｅ）約６．０のｐＨを含む。

医薬製剤は、（ａ）抗体９Ｅ４（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−８２２１）または抗体９Ｅ４のキメラ、ベニヤ化、またはヒト化バージョン、結合に関して９Ｅ４と特異的に競合するそのフラグメント、および／またはαシヌクレインのアミノ酸残基１１８−１２６内のエピトープに対するものであるキメラ、ベニヤ化、ヒト化、またはヒト抗体である抗体（抗体は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度で存在する）；（ｂ）バッファー；（ｃ）糖および／またはポリオール；ならびに（ｄ）界面活性剤を含んでよい。特定の例では、開示される製剤の抗体は配列番号：２９を含むアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号：３２を含むアミノ酸配列を有する重鎖（Ｃ末端リジンありまたはなし）を含む。

抗体製剤は凍結乾燥できる。例えば、代表的な凍結乾燥製剤は、下記を含んでよい：（ａ）抗体９Ｅ４（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−８２２１）のヒト化バージョンまたはその抗原結合性フラグメント；（ｂ）ヒスチジン、クエン酸塩、またはコハク酸塩；（ｃ）トレハロース、スクロース、またはスクロースおよびマンニトールの混合物；ならびに（ｄ）ポリソルベート２０。凍結乾燥製剤は、再構成されると約６〜約７の間のｐＨ、例えば再構成されるとｐＨ６．０または６．５を有してよい。凍結乾燥製剤は典型的には約４０ｍｇ〜約１０００ｍｇの抗体を含む。凍結乾燥製剤は、典型的には、ポリソルベート２０を約０．００５重量％〜約０．０５重量％の範囲内の濃度で含む。再構成後、凍結乾燥製剤は水溶液をもたらす。例えば、再構成された水溶液は、下記を含んでよい：（ａ）約４０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、抗体９Ｅ４のヒト化バージョン（例えば、配列番号：２９を含むアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号：３１または３２のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する重鎖（Ｃ末端リジンありまたはなし）を含む抗体）；（ｂ）約２０ｍＭの濃度で存在するクエン酸塩バッファー；（ｃ）約２３０ｍＭの濃度で存在するトレハロース；（ｄ）約０．２ｇ／Ｌの濃度で存在するポリソルベート２０；ならびに（ｅ）約６．０のｐＨ。代表的な凍結乾燥製剤は約２００ｍｇの抗体を含む。

開示される製剤を調製するために使用される抗体をコードする核酸もまた、提供される。例えば、そのような核酸としては、配列番号：２９の抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、および配列番号：３２の抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。例えば、配列番号：１７として明記されるヌクレオチド配列は、配列番号：２９のヒト化９Ｅ４軽鎖可変領域成分をコードする。別の例として、配列番号：２０として明記されるヌクレオチド配列は配列番号：３２のヒト化９Ｅ４重鎖可変領域成分をコードする。

抗体の産生のために、開示される核酸は、単独で、または組み合わせて（例えば、ヒト化９Ｅ４軽鎖をコードする核酸およびヒト化９Ｅ４重鎖をコードする核酸の組み合わせ）ベクターに含められ得る。例えば、ベクターは配列番号：１５−１７のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；配列番号：１８−２０のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む核酸、またはそれらの組み合わせを含んでよい。発明の代表的なベクターとしては、（ａ）配列番号：２９として明記されるヒト化９Ｅ４軽鎖および配列番号：３１として明記されるヒト化９Ｅ４重鎖をコードする核酸配列を含むベクター；ならびに（ｂ）配列番号：２９のアミノ酸配列をコードする核酸および配列番号：３２のアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクターが挙げられる。

それらのゲノムに本明細書で開示される核酸の１つ以上を安定して組み込んだ宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）もまた、提供される。例えば、宿主細胞は、そのゲノム中に、配列番号：１５−１７のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列を含む安定して組み込まれた核酸；配列番号：１８−２０のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む安定して組み込まれた核酸、またはそれらの組み合わせを含んでよい。発明の代表的な宿主細胞としては下記が挙げられる：（ａ）配列番号：２９として明記されるヒト化９Ｅ４軽鎖および配列番号：３１として明記されるヒト化９Ｅ４重鎖をコードする核酸配列を含む宿主細胞；ならびに（ｂ）配列番号：２９のヌクレオチド配列を有する核酸および配列番号：３２のヌクレオチド配列を有する核酸を含む宿主細胞。

本発明はまた、医薬製剤を調製する方法を提供する。発明の１つの態様では、そのような方法は、下記を含み：（ａ）細胞が抗体を細胞培地中に分泌するように、それらのゲノムに、マウス、キメラ、ベニヤ化またはヒト化９Ｅ４抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸を安定して組み込んだ哺乳類細胞を培養し、抗体を細胞培地から精製すること；ならびに（ｂ）（ｉ）抗体９Ｅ４（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−８２２１）のキメラ、ベニヤ化、またはヒト化バージョン、または結合に関して９Ｅ４と特異的に競合するそのフラグメント（抗体は、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度で存在する）；（ｉｉ）約２０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲内の濃度で存在するクエン酸塩バッファー；（ｉｉｉ）約２１０ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲内の濃度で存在するトレハロース；ならびに（ｉｖ）約０．００５重量％〜約０．０５重量％の範囲内の濃度で存在するポリソルベート２０を含む製剤を調製すること；ここで、製剤は、約５．５〜約６．５の範囲内のｐＨにより特徴付けられる。この目的のために有用な哺乳類細胞としては下記が挙げられる：（ａ）それらのゲノムに配列番号：２９として明記されるヒト化９Ｅ４軽鎖および配列番号：３１として明記されるヒト化９Ｅ４重鎖をコードする核酸配列を安定して組み込んだ宿主細胞；ならびに（ｂ）それらのゲノムに配列番号：２９のヌクレオチド配列を有する核酸および配列番号：３２のヌクレオチド配列を有する核酸を安定して組み込んだ宿主細胞。発明のいくつかの態様では、医薬製剤を調製する開示される方法は、製剤中の抗体の少なくとも１つの特性、例えば物理的安定性、化学的安定性、および／または生物活性を評価する追加の工程を含む。

シヌクレイン病を有する、またはそのリスクがあるヒト患者を治療的にまたは予防的に治療する方法がさらに提供され、方法は患者に有効投与量の発明の製剤を投与することを含む。治療に適している患者の中にはパーキンソン病を有するものがいる。

開示される治療的および予防的治療方法は併用療法（すなわち、開示される抗体製剤の１つ以上の追加の原薬との投与）を含み、これにより相乗的な結果が誘発される。２つ以上の原薬が同時にまたは順次、任意の順序で投与される。例えば、発明の製剤は、第２の原薬の投与前に、第２の原薬と同時に、または第２の原薬の投与後に投与できる。発明の製剤は、例えば、レボドパ、ベンザセリド（ｂｅｎｚａｓｅｒｉｄｅ）、カルビドパ、ドパミンアゴニスト、ＣＯＭＴ阻害剤、ＭＡＯ阻害剤、アマンタジン、または抗コリン薬と組み合わせて、同時にまたは連続的に投与できる。

開示される治療的および予防的治療方法にしたがい、発明の製剤は、複数回投与で、例えば、約毎日〜約毎年の範囲の頻度で、例えば約１週間おき〜約３ヶ月毎の範囲の頻度で、または例えば１ヶ月に１回または４週毎に投与できる。１つの態様では、発明の抗体製剤は、静脈内に、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ原薬の範囲の用量で投与される。例示的な投与レジームは、静脈内に単回投与または４週に１回として投与される、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約３．０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇおよび約３０ｍｇ／ｋｇのヒト化９Ｅ４原薬を含む。

例えば、シヌクレイン病、例えばパーキンソン病を有する、またはそのリスクがあるヒト患者を治療的にまたは予防的に治療する方法は、患者に有効投与量の、下記を含む医薬製剤を投与することを含んでよい：（ａ）配列番号：２９を含むアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号：３２を含むアミノ酸配列を有する重鎖（Ｃ末端リジンありまたはなし）を含み、約４０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する抗体；（ｂ）約２０ｍＭの濃度で存在するクエン酸塩バッファー；（ｃ）約２３０ｍＭの濃度で存在するトレハロース；（ｄ）約０．２ｇ／Ｌの濃度で存在するポリソルベート２０；ならびに（ｅ）約６．０のｐＨ。そのような方法では、投与量は典型的には、静脈内または皮下に、約毎週〜約２８日毎に１回、または約年４回の頻度で投与される、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの抗体（例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ、または約８ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ）である。

本発明はさらに、下記を含む医薬品を提供し：（ａ）約２００ｍｇの抗体を粉末形態で含むバイアル；（ｂ）抗体の再構成のための説明書；ならびに（ｃ）注入のために再構成された抗体を調製するための説明書、ここで、例えば、（ｉ）抗体は配列番号：２９を含むアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号：３２を含むアミノ酸配列を有する重鎖（Ｃ末端リジンありまたはなし）を含み；ならびに（ｉｉ）再構成説明書は、注射のための水を用いた約５ｍＬの抽出可能な体積への再構成を要求する。

ヒト化９Ｅ４抗体に対するＤＳＣサーモグラムであり、１．５ｍｇ／ｍｌのヒト化９Ｅ４抗体（バージョンＨ３Ｌ３）を含む溶液の温度の増加または減少と関連するエネルギーの流れ（カロリー／℃）を示す。抗体溶液を順次、挿入ボックスで示される順に加熱し、冷却した。線はどの線が挿入ボックスで示される５つの温度遷移の各々と関連するかを示すために番号づけされている。 ｐＨの関数としてのヒト化９Ｅ４抗体（バージョンＨ３Ｌ３）に対する転移温度を示すグラフである。異なる記号は、ＲＡＬＳ、ＩＦ、およびＤＳＣにより決定された転移温度を示す。２つまたは３つのＤＳＣ転移温度が各ｐＨで観察され、各々に異なる記号が与えられる。 凍結乾燥および再構成後、貯蔵期間なしでの、製剤Ｆ１−Ｆ４（表１０で示される）に対する顕微鏡でないと見えない粒子数（≧２．０ｍｍ、≧１０．０ｍｍ、および≧２５．０ｍｍ）を示す棒グラフである。 凍結乾燥、４０℃での１ヶ月間の貯蔵、および再構成後の、製剤Ｆ１−Ｆ４（表１０で示される）に対する顕微鏡でないと見えない粒子数（≧２．０ｍｍ、≧１０．０ｍｍ、および≧２５．０ｍｍ）を示す棒グラフである。 凍結乾燥、４０℃での２ヶ月間の貯蔵、および再構成後の、製剤Ｆ１−Ｆ４（表１０で示される）に対する顕微鏡でないと見えない粒子数（≧２．０ｍｍ、≧１０．０ｍｍ、および≧２５．０ｍｍ）を示す棒グラフである。 凍結乾燥、４０℃での３ヶ月間の貯蔵、および再構成後の、製剤Ｆ１−Ｆ４（表１０で示される）に対する顕微鏡でないと見えない粒子数（≧２．０ｍｍ、≧１０．０ｍｍ、および≧２５．０ｍｍ）を示す棒グラフである。 製剤（Ｆ１−Ｆ４、表１０で示される）および凍結乾燥形態で４０℃にて貯蔵した時間の関数としての単量体ヒト化９Ｅ４抗体（バージョンＨ３Ｌ３）の損失を示すグラフである。

配列の簡単な説明
配列番号：１は、９Ｅ４ＶＬ可変領域のアミノ酸配列である。

配列番号：２は、ヒトＶＬアクセプター配列（ＮＣＢＩ受入コードＡＡＹ３３３５０）の可変領域のアミノ酸配列である。

配列番号：３は、Ｈｕ９Ｅ４ＶＬｖ１可変領域のアミノ酸配列である。

配列番号：４は、Ｈｕ９Ｅ４ＶＬｖ２可変領域のアミノ酸配列である。

配列番号：５は、Ｈｕ９Ｅ４ＶＬｖ３可変領域のアミノ酸配列である。

配列番号：６は、ｍ９Ｅ４ＶＨ可変領域のアミノ酸配列である。

配列番号：７は、ヒトＶＨアクセプター配列（ＮＣＢＩ受入コードＡＡＣ５０９９８）の可変領域のアミノ酸配列である。

配列番号：８は、Ｈｕ９Ｅ４ＶＨｖ１可変領域のアミノ酸配列である。

配列番号：９は、Ｈｕ９Ｅ４ＶＨｖ２可変領域のアミノ酸配列である。

配列番号：１０は、Ｈｕ９Ｅ４ＶＨｖ３可変領域のアミノ酸配列である。

配列番号：１１は、Ｈｕ９Ｅ４ＶＨｖ４可変領域のアミノ酸配列である。

配列番号：１２は、野生型ヒトαシヌクレインのアミノ酸配列である。

配列番号：１３は、Ｎ末端にアルギニンを有する、ヒト化９Ｅ４軽鎖定常領域のアミノ酸配列である。

配列番号：１４は、ヒト化９Ｅ４重鎖定常領域のアミノ酸配列である。

配列番号：１５は、Ｈｕ９Ｅ４ＶＬｖ１可変領域をコードするヌクレオチド配列である。

配列番号：１６は、Ｈｕ９Ｅ４ＶＬｖ２可変領域をコードするヌクレオチド配列である。

配列番号：１７は、Ｈｕ９Ｅ４ＶＬｖ３可変領域をコードするヌクレオチド配列である。

配列番号：１８は、Ｈｕ９Ｅ４ＶＨｖ１可変領域をコードするヌクレオチド配列である。

配列番号：１９は、Ｈｕ９Ｅ４ＶＨｖ２可変領域をコードするヌクレオチド配列である。

配列番号：２０は、Ｈｕ９Ｅ４ＶＨｖ３可変領域をコードするヌクレオチド配列である。

配列番号：２１は、Ｈｕ９Ｅ４ＶＨｖ４可変領域をコードするヌクレオチド配列である。

配列番号：２２は、Ｈｕ９Ｅ４ＶＬシグナルペプチドのアミノ酸配列である。

配列番号：２３は、Ｈｕ９Ｅ４ＶＬシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列である。

配列番号：２４は、Ｈｕ９Ｅ４ＶＨシグナルペプチドのアミノ酸配列である。

配列番号：２５は、Ｈｕ９Ｅ４ＶＨシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列である。

配列番号：２６はＨｕ９Ｅ４ＶＬコンセンサスアミノ酸配列である。

配列番号：２７はＨｕ９Ｅ４ＶＨコンセンサスアミノ酸配列である。

配列番号：２８は、Ｎ末端にアルギニンを有さない、ヒト化９Ｅ４軽鎖定常領域のアミノ酸配列である。

配列番号：２９は、（ａ）可変領域（バージョン３）、および（ｂ）Ｎ末端にアルギニンを有する定常領域を含むヒト化９Ｅ４軽鎖のアミノ酸配列である。

配列番号：３０は、（ａ）可変領域（バージョン３）、および（ｂ）Ｎ末端にアルギニンを有さない定常領域を含むヒト化９Ｅ４軽鎖のアミノ酸配列である。

配列番号：３１は、（ａ）可変領域（バージョン３）、および（ｂ）定常領域を含むヒト化９Ｅ４重鎖のアミノ酸配列である。

配列番号：３２は、（ａ）可変領域（バージョン３）、および（ｂ）ＢＩＰバージョン重鎖Ｇ１ｍ３アロタイプ定常領域を含むヒト化９Ｅ４重鎖のアミノ酸配列である。

配列番号：３３は、ＢＩＰバージョン重鎖Ｇ１ｍ３アロタイプ定常領域のアミノ酸配列である。

定義
「抗体」という用語は、無傷の抗体およびその結合フラグメントを含む。典型的には、フラグメントは無傷の抗体と競合し、それから標的への特異的結合について誘導されたものである。フラグメントは別々の重鎖、別々の軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）ｃ、Ｆｖ、単鎖抗体、およびシングルドメイン抗体を含む。「抗体」という用語はまた、二重特異性抗体を含む。二重特異性または二価抗体は２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である（例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎｎ， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ７９：３１５−３２１ （１９９０）； Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４８：１５４７−５３ （１９９２）を参照されたい）。

基本的な抗体構造単位はサブユニットの四量体である。各四量体は２つの同一のポリペプチド鎖対を含み、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識に関与する、約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。最初に発現されると、この可変領域は、典型的には切断可能なシグナルペプチドに結合される。シグナルペプチドのない可変領域は時として、成熟可変領域と呼ばれる。よって、例えば、軽鎖成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドを有さない軽鎖可変領域を意味する。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。定常領域はＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域のいずれかまたは全てを含んでよい。

軽鎖はκまたはλのいずれかとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεとして分類され、抗体のアイソタイプを、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥとして規定する。軽鎖および重鎖内では、可変および定常領域は、約１２またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結され、重鎖はまた、約１０またはそれ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。（一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｐａｕｌ， Ｗ．， ｅｄ．， ２ｎｄ ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， １９８９）， Ｃｈ． ７を参照されたい）（参照により、その全体が全ての目的のために組み込まれる）。

各軽鎖／重鎖対の成熟可変領域は抗体結合部位を形成する。よって、無傷の抗体は２つの結合部位を有する。二価または二重特異性抗体を除き、２つの結合部位は同じである。鎖は全て、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域により連結される比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２つの鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域により整列され、特異的エピトープに結合できる。Ｎ末端からＣ末端へと、軽鎖および重鎖はどちらも、領域ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。アミノ酸の各領域への割当は、Ｋａｂａｔ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（国立衛生研究所、ベテスダ、ＭＤ、１９８７および１９９１）、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１−９１７ （１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３ （１９８９）の定義に従う。Ｋａｂａｔはまた、広く使用される番号付け協定（Ｋａｂａｔ番号付け）を提供し、この場合、異なる重鎖間または異なる軽鎖間の対応する残基には同じ番号が割り当てられる。

パーセンテージ配列同一性はＫａｂａｔ番号付け協定により最大限に整列された抗体配列を用いて決定される。整列後、対象抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の全成熟可変領域）が基準抗体の同じ領域と比較された場合、対象抗体領域と基準抗体領域間のパーセンテージ配列同一性は、対象および基準抗体領域の両方において同じアミノ酸により占有された位置の数を、２つの領域の整列された位置の総数（ギャップはカウントされない）で割り、１００をかけてパーセンテージに変換したものである。

アミノ酸置換を保存的または非保存的として分類するために、アミノ酸を下記の通りグループ分けする：グループＩ（疎水性側鎖）：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；グループＶ（鎖配向に影響する残基）：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；ならびにグループＶＩ（芳香族側鎖）：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。保存的置換は、同じクラス内のアミノ酸間の置換を含む。

非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと変換することに相当する。

発明の抗体は、典型的には、それらの指定された標的に少なくとも１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、または１０^１０Ｍ^−１の親和定数で結合する。そのような結合は、検出可能なほど規模が大きく、少なくとも１つの関連しない標的に対して起こる非特異的結合と区別できるという点で、特異的結合である。特異的結合は特定の官能基間の結合の形成または特定の空間的適合（例えば、ロックと鍵型）の結果であってよく、一方、非特異的結合は通常、ファンデルワールス力の結果である。しかしながら、特異的結合は、必ずしも、モノクローナル抗体がただ１つの標的だけに結合することを意味しない。

「症状」という用語は、被験体により知覚される疾患の主観的なエビデンス、例えば歩調の変化を指す。「徴候」は、医師により観察される疾患の客観的なエビデンスを指す。

被験体が、少なくとも１つの公知の危険因子（例えば、遺伝的な、生化学的な、家族歴、曝露状況）を有し、これにより、その危険因子を有する個体が、その危険因子を有さない個体よりも疾患を発症する統計的に有意に大きなリスクに置かれる場合、個体は疾患のリスクが増加する。統計学的有意性はｐ≦０．０５を意味する。

文脈から別様に明らかにならない限り、「約」という用語は、明言された値の平均の標準偏差または明言された値の＋／−５％内の値、どちらか大きい方を包含する。

「９Ｅ４抗体」という用語は、ＣＤＲの各々が実質的に９Ｅ４のものである任意の抗体を指し、よって、マウス、キメラ、ベニヤ化、およびヒト化９Ｅ４を含む。

文脈から別様に明らかにならない限り、範囲への言及は、その範囲内の任意の整数を含む。

詳細な説明
Ｉ．一般
９Ｅ４は、ヒトαシヌクレインのアミノ酸残基１１８−１２６内のエピトープに結合する抗体である。この抗体のヒト化形態は、ＷＯ／２０１３／０６３５１６号（参照により、その全体が全ての目的のために組み込まれる）に記載される。本出願は、９Ｅ４（時として、９Ｅ４抗体と呼ばれる）のキメラ、ベニヤ化、またはヒト化形態を組み込んだ液体および凍結乾燥製剤を提供する。製剤は、以下でさらに記載されるように、抗体に安定性を付与する成分の組み合わせを有するように設計される。

ＩＩ．標的分子
天然ヒト野生型αシヌクレインは、下記アミノ酸配列を有する１４０アミノ酸のペプチドである：
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ （配列番号：１２）
（Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９３） ９０：１１２８２−６）；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｐ３７８４０。タンパク質は３つの認識されたドメインを有する：アミノ酸１−６１に及ぶＫＴＫＥリピートドメイン；約アミノ酸６０−９５に及ぶＮＡＣ（非アミロイド成分）ドメイン；ならびに約アミノ酸９８〜１４０に及ぶＣ末端酸性ドメイン。

文脈から別様に明らかにならない限り、αシヌクレインまたはそのフラグメントへの言及は、以上で示される天然ヒト野生型アミノ酸配列、およびそのヒトアレルバリアント、特にレビー小体病と関連するもの（例えば、バリアントＥ４６Ｋ、Ａ３０ＰおよびＡ５３Ｔ、最初の文字は配列番号：１２におけるアミノ酸を示し、数字は配列番号：１２におけるコドン位置を示し、第２の文字はアレルバリアントにおけるアミノ酸を示す）を含む。そのようなバリアントは任意で、以下で記載される発明の態様のいずれかにおいて個々にまたは任意の組み合わせで存在してよい。誘導された突然変異Ｅ８３Ｑ、Ａ９０Ｖ、Ａ７６Ｔは、αシヌクレイン凝集を増強させ、これらはまた、個々にまたは互いとの組み合わせでおよび／またはヒトアレルバリアントＥ４６Ｋ、Ａ３０ＰおよびＡ５３Ｔとの組み合わせで存在してよい。

ＩＩＩ．レビー小体病
レビー小体病（ＬＢＤ）は、ドーパミン作動系の変性、運動変化、認知障害、およびレビー小体（ＬＢ）の形成により特徴付けられる。（ＭｃＫｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ （１９９６） ４７：１１１３−２４）。レビー小体は神経細胞で見出される球状タンパク質沈着物である。それらが脳中に存在すると、アセチルコリンおよびドーパミンを含む化学伝達物質の作用を中断して脳の正常な機能を破壊する。レビー小体病としては、パーキンソン病（特発性パーキンソン病を含む）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）（レビー小体型認知症（ＤＬＢ）としても知られている）、アルツハイマー病のレビー小体バリアント（ＬＢＶ）、アルツハイマー病とパーキンソン病の複合型、および多系統萎縮症（ＭＳＡ；例えば、オリーブ橋小脳萎縮症、線条体黒質変性症、およびシャイ・ドレーガー症候群）が挙げられる。ＤＬＢＤはアルツハイマーおよびパーキンソン病の両方の症状を共有する。ＤＬＢＤは、主にレビー小体の位置がパーキンソン病と異なる。ＤＬＢＤでは、レビー小体は主に皮質内で形成する。パーキンソン病では、それらは主に黒質で形成する。他のレビー小体病としては、純粋自律神経失調症、レビー小体嚥下障害、偶発的ＬＢＤ、および遺伝性ＬＢＤ（例えば、αシヌクレイン遺伝子、ＰＡＲＫ３およびＰＡＲＫ４の突然変異）が挙げられる。

ＩＶ．ヒト化９Ｅ４抗体
Ａ．結合特異性および機能特性
発明のヒト化抗体は、ヒトαシヌクレインに特異的に結合する。いくつかのヒト化抗体の親和性（すなわち、Ｋａ）は、好ましくはマウス抗体９Ｅ４の親和性の５または２倍以内である。いくつかのヒト化抗体はマウス９Ｅ４抗体の親和性と同じ（実験誤差内）かまたはそれを超える親和性を有する。好ましいヒト化抗体は、ヒトαシヌクレインへの結合に関し、マウス抗体９Ｅ４と同じエピトープに結合し、および／またはマウス抗体９Ｅ４と競合する。

いくつかの抗体では、ヒト化９Ｅ４は二重特異性抗体の１つのアームを形成し、そのもう一方のアームは、血液脳関門上で発現される受容体、例えばインスリン受容体、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、またはリポタンパク質受容体、または好ましくはトランスフェリン受容体に結合する抗体である（Ｆｒｉｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８８：４７７１−４７７５， １９９１；Ｆｒｉｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：３７３−３７７， １９９３）。そのような二重特異性抗体は、受容体介在性経細胞輸送により血液脳関門を横切って移動させることができる。二重特異性抗体の脳取り込みは、二重特異性抗体を操作して、その血液脳関門受容体への親和性を低減することにより、さらに増強させることができる。受容体に対する親和性を低減すると、脳内でのより広い分布が得られた（例えば、Ａｔｗａｌ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓ． Ｍｅｄ．３， ８４ｒａ４３， ２０１１； Ｙｕｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓ． Ｍｅｄ．３， ８４ｒａ４４， ２０１１を参照されたい）。

例示的な二重特異性抗体はまた、下記のものであってよい：（１）二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ）、この場合、各軽鎖および重鎖は２つの可変ドメインを短ペプチド結合により直列に含む（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｕａｌ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ （ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）） Ｍｏｌｅｃｕｌｅ， Ｉｎ： Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ （２０１０））；（２）Ｔａｎｄａｂ、これは２つの単鎖ダイアボディの融合物であり、標的抗原の各々に対する２つの結合部位を有する四価二重特異性抗体が得られる；（３）フレキシボディ、これはｓｃＦｖのダイアボディとの組み合わせであり、多価分子が得られる；（４）いわゆる「ドックアンドロック」分子（プロテインキナーゼＡにおける「二量体化およびドメインドッキング」に基づく）、これは、Ｆａｂに適用すると、異なるＦａｂフラグメントに結合された２つの同一のＦａｂフラグメントから構成される三価二重特異性結合タンパク質が得られ得る；（５）例えば、ヒトＦｃ−領域の両末端に融合された２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるスコーピオン分子。二重特異性抗体を調製するために有用なプラットフォームの例としては下記が挙げられるが、それらに限定されない：ＢｉＴＥ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、ＤＡＲＴ（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、ＦｃａｂおよびＭａｂ２（Ｆ−ｓｔａｒ）、Ｆｃ改変ＩｇＧ１（Ｘｅｎｃｏｒ）またはＤｕｏＢｏｄｙ（Ｆａｂアーム交換に基づく、Ｇｅｎｍａｂ）。

Ｂ．ヒト化抗体
ヒト化抗体は遺伝子改変抗体であり、この場合、非ヒト「ドナー」抗体由来のＣＤＲがヒト「アクセプター」抗体配列中にグラフトされる（例えば、Ｑｕｅｅｎら、ＵＳ５，５３０，１０１号および５，５８５，０８９号；Ｗｉｎｔｅｒら、ＵＳ５，２２５，５３９号、Ｃａｒｔｅｒ、ＵＳ６，４０７，２１３号、Ａｄａｉｒ、ＵＳ５，８５９，２０５号６，８８１，５５７号、Ｆｏｏｔｅ、ＵＳ６，８８１，５５７号を参照されたい）。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体可変領域配列、そのような配列の複合物、ヒト抗体配列のコンセンサス配列（例えば、Ｋａｂａｔの軽鎖および重鎖可変領域コンセンサス配列、１９９１、上記）、または生殖系列可変領域配列であってよい。重鎖のための好ましいアクセプター配列は、ＮＣＢＩ受入コードＡＡＣ５０９９８（ＧＩ：１７９１００９）のヒト成熟重鎖可変領域または生殖系列ＩＧＨＶ３−７’０１もしくはＩＧＨＶ３−７’０２由来の他の成熟重鎖可変領域（クローン名Ｖ３−７またはＶＨ３−１１）（Ｇｌａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０７：３７２−８０， １９９７）、またはこれらの生殖系列配列の１つを組み込んだ成熟重鎖可変領域配列である。軽鎖については、好ましいアクセプター配列は、ＮＣＢＩ受入コードＡＡＹ３３３５０（ＧＩ：６３１０２８８９）を有する軽鎖成熟可変領域または生殖系列ＩＧＫＶ１Ｄ−３９またはＩＧＫＶ１−３９由来の他の成熟軽鎖配列（クローン名Ｏ２またはＯ１２）（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３５：２１３１−４５， ２００５）、またはこれらの生殖系列配列の１つを組み込んだ軽鎖成熟可変領域配列である。よって、発明のヒト化抗体は、マウス９Ｅ４抗体（ドナー抗体）由来のＫａｂａｔにより規定される３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲならびに存在する場合、完全にまたは実質的にヒト抗体配列由来の、成熟可変領域フレームワーク配列および定常領域を有する抗体を含む。同様に、ヒト化重鎖は、マウス９Ｅ４抗体の重鎖由来のＫａｂａｔにより規定される３つの重鎖ＣＤＲ、ならびに、存在する場合、完全にまたは実質的にヒト抗体重鎖配列由来の成熟重鎖可変配列および重鎖定常領域配列を有する重鎖を含む。同様に、ヒト化軽鎖は、マウス９Ｅ４抗体の軽鎖由来のＫａｂａｔにより規定される３つの軽鎖ＣＤＲ、ならびに、存在する場合、完全にまたは実質的にヒト抗体軽鎖配列由来の成熟軽鎖可変配列および軽鎖定常領域配列を有する軽鎖を含む。Ｋａｂａｔにより規定される対応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が同一である場合、抗体鎖の成熟可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域配列は、それぞれ、実質的にヒト成熟可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域配列に由来する。

ヒト成熟可変領域フレームワーク残基由来のあるアミノ酸は、ＣＤＲコンフォメーションおよび／または抗原への結合へのそれらの潜在的な影響に基づいて置換のために選択できる。そのような潜在的な影響は、モデリング、特定の場所でのアミノ酸の特性の検査、または特定のアミノ酸の置換または変異誘発の効果の実験による観察により調査される。

例えば、１つのアミノ酸がマウス成熟可変領域フレームワーク残基と選択されたヒト成熟可変領域フレームワーク残基との間で異なる場合、ヒトフレームワークアミノ酸は、アミノ酸が：
（１）非共有結合により抗原に直接結合し
（２）ＣＤＲ領域に隣接し
（３）またはＣＤＲ領域と相互作用する（例えば、約６ÅのＣＤＲ領域内にある）
（４）重鎖と軽鎖との間の相互作用を媒介する
ことが合理的に予測される場合、マウス抗体由来の等価のフレームワークアミノ酸により置換できる。

発明は、３つの例示されたヒト化軽鎖成熟可変領域（Ｈｕ９Ｅ４ＶＬｖ１−ｖ３；配列番号：３−５）および４つの例示されたヒト化重鎖成熟可変領域（Ｈｕ９Ｅ４ＶＨｖ１−ｖ４；配列番号：８−１１）を含むマウス９Ｅ４抗体のヒト化形態を含む製剤を提供する。配列番号：４は、マウス９Ｅ４軽鎖の３つのＫａｂａｔ ＣＤＲおよびＡＡＹ３３３５０の成熟可変領域フレームワークを含む。配列番号．３および５は、表２で示される逆突然変異を含む。配列番号：１１は、マウス９Ｅ４の３つのＫａｂａｔ ＣＤＲおよびＡＡＣ５０９９８の成熟可変領域フレームワークを含む。配列番号：８−１０は表３で示される逆突然変異を含む。

発明は、本明細書で開示されるヒト化９Ｅ４抗体のバリアントを含む製剤を提供し、ここで、ヒト化重鎖成熟可変領域は、配列番号：８−１１に対し少なくとも９０％、９５％または９９％同一性を示し、ヒト化軽鎖成熟可変領域は、配列番号：３−５に対し少なくとも９０、９５または９９％配列同一性を示すが、指定された配列番号：からのいずれの変異も、Ｋａｂａｔ ＣＤＲではなく、成熟可変領域フレームワークにおいて起こる。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ３６はＹまたはＦにより占有され、および／または位置Ｌ８３はＦまたはＬにより占有され、および／または位置Ｈ７３はＮまたはＤにより占有され、および／または位置Ｈ９３はＡまたはＳにより占有される（ここでの位置は全て、本出願での他のどこでも同じように、Ｋａｂａｔ番号付けによる）。いくつかのそのような抗体では、Ｈｕ９Ｅ４ＶＬｖ１−ｖ３およびＨｕ９Ｅ４ＶＨｖ１−ｖ４における逆突然変異のいくつかまたは全ては保持される。言い換えれば、重鎖位置Ｈ７３およびＨ９３の１つまたは両方は、それぞれ、ＤおよびＡにより占有される。同様に、いくつかの抗体では、軽鎖位置Ｌ３６およびＬ８３の１つまたは両方は、それぞれＦおよびＬにより占有される。いくつかの抗体では、位置Ｈ７３、Ｈ９３、Ｌ３６およびＬ８３の１、２、３または４つ全ては、それぞれＤ、Ａ、ＦおよびＬにより占有される。いくつかの抗体では、０、１、または２つの位置が重鎖成熟可変領域フレームワークにおいて、配列番号：１１に対して変更され、０、１、または２つの位置が軽鎖成熟可変領域フレームワークにおいて、配列番号：４に対して変更される。

発明は、いくつかの抗体が配列番号：１１の３つのＫａｂａｔ ＣＤＲを含むヒト化重鎖および配列番号：４の３つのＫａｂａｔ ＣＤＲを含むヒト化軽鎖を含む製剤を提供し、ただし、位置Ｌ３６（Ｋａｂａｔ番号付け）はＦまたはＹにより占有されおよび／または位置Ｌ８３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＬまたはＦにより占有され、および／または位置Ｈ７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＤまたはＮにより占有され、および／または位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＳまたはＡにより占有されることを条件とする。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ３６（Ｋａｂａｔ番号付け）は、Ｆにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ３６（Ｋａｂａｔ番号付け）はＦにより占有され、位置Ｌ８３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＬにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ３６（Ｋａｂａｔ番号付け）はＦにより占有され、位置Ｈ７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＤにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ３６（Ｋａｂａｔ番号付け）はＦにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＳにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ３６（Ｋａｂａｔ番号付け）はＦにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＡにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ３６（Ｋａｂａｔ番号付け）はＦにより占有され、位置Ｌ８３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＬにより占有され、位置Ｈ７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＤにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ３６（Ｋａｂａｔ番号付け）はＦにより占有され、位置Ｌ８３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＬにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＳにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ３６（Ｋａｂａｔ番号付け）はＦにより占有され、位置Ｌ８３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＬにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＡにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ３６（Ｋａｂａｔ番号付け）はＦにより占有され、位置Ｈ７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＤにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＳにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ３６（Ｋａｂａｔ番号付け）はＦにより占有され、位置Ｌ８３はＦにより占有され、位置Ｈ７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＤにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＳにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ３６（Ｋａｂａｔ番号付け）はＦにより占有され、位置Ｈ７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＤにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＡにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ３６（Ｋａｂａｔ番号付け）はＦにより占有され、位置Ｌ８３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＬにより占有され、位置Ｈ７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＤにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＳにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ３６（Ｋａｂａｔ番号付け）はＦにより占有され、位置Ｌ８３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＬにより占有され、位置Ｈ７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＤにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＡにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ８３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＬにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ８３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＬにより占有され、位置Ｈ７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＤにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ８３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＬにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＳにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ８３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＬにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＡにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ８３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＬにより占有され、位置Ｈ７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＤにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＳにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ８３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＬにより占有され、位置Ｈ７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＤにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＡにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｈ７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＤにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｈ７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＤにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＳにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｈ７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＤにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＡにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＳにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＡにより占有される。いくつかのそのような抗体では、位置Ｌ３６はＹにより占有され、位置Ｌ８３はＦにより占有され、位置Ｈ７３はＮにより占有され、位置Ｈ９３はＳにより占有される。位置Ｌ３６、Ｌ８３、Ｈ７３、およびＨ９３ならびにそれらの組み合わせに望ましい残基を有するいくつかの例示的な抗体は下記表１に列挙される。

いくつかの抗体では、重鎖成熟可変領域は配列番号：１０と指定されたアミノ酸配列を有する。いくつかの抗体では、軽鎖成熟可変領域は配列番号：５または配列番号：３と指定されたアミノ酸配列を有する。いくつかのそのような抗体では、重鎖成熟可変領域は配列番号：１０と指定されたアミノ酸配列を有し、軽鎖成熟可変領域は配列番号：５または配列番号：３と指定されたアミノ酸配列を有する。いくつかのそのような抗体では、重鎖成熟可変領域は配列番号：１０と指定されたアミノ酸配列を有し、軽鎖成熟可変領域は配列番号：５と指定されたアミノ酸配列を有する。

他のアミノ酸置換が成熟可変領域フレームワークで、例えば、ＣＤＲと接触していない残基において生成され得る。しばしば、バリアントヒト化配列において生成される置換は、置換されるアミノ酸に対して保存的である。いくつかの抗体では、Ｈｕ９Ｅ４ＶＬｖ１−ｖ３およびＨｕ９Ｅ４ＶＨｖ１−ｖ４に対する置換（保存的であるかないかに関係なく）は、Ｈｕ９Ｅ４ＶＬｖ１−ｖ３およびＨｕ９Ｅ４ＶＨｖ１−ｖ４に対する得られた抗体の結合親和性または効力、すなわち、そのヒトαシヌクレインに結合する能力に実質的な効果を有さない。

バリアントは典型的にはＨｕ９Ｅ４ＶＬｖ１−ｖ３およびＨｕ９Ｅ４ＶＨｖ１−ｖ４の重鎖および軽鎖成熟可変領域配列と、少数（例えば、典型的には、軽鎖または重鎖成熟可変領域フレームワークのいずれか、または両方において、１、２、３、５または１０以下）の置換、欠失または挿入だけ異なる。

以下で記載される製剤は、以上で、または配列表においてまたは出願のどこかで記載されるヒト化９Ｅ４鎖のいずれかを、ヒトαシヌクレインに特異的に結合するヒト化９Ｅ４抗体を形成する軽鎖および重鎖の任意の組み合わせで含んでよい。

Ｃ．キメラおよびベニヤ化抗体
発明はさらに、非ヒト抗体、特に９Ｅ４のキメラおよびベニヤ化形態を提供する。

キメラ抗体は非ヒト抗体（例えば、マウス）の軽鎖および重鎖の成熟可変領域が異なる種の抗体由来の軽鎖および重鎖定常領域と組み合わされた抗体である。典型的には、軽鎖および重鎖定常領域はヒト起源であるが、定常領域は必要に応じ（例えば、適切な動物モデルでの非ヒト抗体の試験を容易にするため）、異なる非ヒト種、例えばラットを起源としてよい。そのような抗体は実質的にまたは完全に、可変領域を供給する非ヒト（例えば、マウス）抗体の結合特異性を保持し、約３分の２ヒト（または異なる非ヒト種）配列である。

ベニヤ化抗体は、非ヒト抗体のいくらかの、および通常全てのＣＤＲならびに非ヒト可変領域フレームワーク残基のいくらかを保持するが、Ｂ−またはＴ−細胞エピトープに寄与し得る他の可変領域フレームワーク残基、例えば露出残基（Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８：４８９， １９９１）をヒト抗体配列の対応する位置由来の残基と置き換えたヒト化抗体の型である。結果として、ＣＤＲが完全にまたは実質的に非ヒト抗体由来であり、非ヒト抗体の可変領域フレームワークが置換により、よりヒト様とされる抗体が得られる。９Ｅ４のベニヤ化形態は発明に含まれる。

Ｄ．定常領域の選択
キメラ、ベニヤ化またはヒト化抗体の重鎖および軽鎖可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部に連結させることができる。定常領域の選択は、一部には、抗体依存性細胞介在型細胞傷害、抗体依存性細胞食作用および／または補体依存性細胞傷害が所望されるかどうかに依存する。例えば、ヒト同位体ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は補体依存性細胞傷害性を有し、ヒトアイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４は有さない。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３はまた、ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも強い細胞媒介性エフェクター機能を誘導する。軽鎖定常領域はλまたはκであってよい。例示的なヒト軽鎖κ定常領域は配列番号：１３のアミノ酸配列を有する。いくつかのそのような軽鎖κ定常領域は、核酸配列によりコードされてよい。配列番号：１３のＮ末端アルギニンは省略でき、この場合、軽鎖κ定常領域は配列番号：２８のアミノ酸配列を有する。いくつかのそのような軽鎖κ定常領域は、核酸配列によりコードされてよい。例示的なヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、配列番号：１４のアミノ酸配列（Ｃ末端リジンありまたはなし）または配列番号：３１の重鎖定常領域成分を有する。いくつかのそのような重鎖定常領域は、核酸配列によりコードされてよい。抗体は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含む四量体として、別々の重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖとして、または重鎖および軽鎖成熟可変ドメインがスペーサーにより連結される単鎖抗体として発現させることができる。

ヒト定常領域は、異なる個体間でアロタイプバリエーションおよびイソアロタイプバリエーションを示し、すなわち、定常領域は異なる個体において、１つ以上の多型位置で異なり得る。イソアロタイプは、イソアロタイプを認識する血清が１つ以上の他のアイソタイプの非多型領域に結合するという点でアロタイプとは異なる。よって、例えば、別の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１ Ｇ１ｍ３アロタイプであり、配列番号：３２の定常領域をコードするアミノ酸配列を有する。別の重鎖定常領域は配列番号：３３のアミノ酸配列を有する。さらに別の重鎖定常領域は、Ｃ末端リジンを欠いていることを除き、配列番号：３２の定常領域（ｃｏｎｔｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）をコードするアミノ酸配列を有する。さらに別の重鎖定常領域はＣ末端リジンを欠いていることを除き、配列番号：３３のアミノ酸配列を有する。

軽鎖および／または重鎖のアミノまたはカルボキシ末端での１つのまたはいくつかのアミノ酸、例えば重鎖のＣ末端リジンは、分子の一部または全てにおいて欠損してもよく、誘導体化されてもよい。置換は定常領域において、エフェクター機能、例えば補体媒介性細胞傷害またはＡＤＣＣを低減または増加させるために（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、米国特許第５，６２４，８２１号；Ｔｓｏら、米国特許第５，８３４，５９７号；ならびにＬａｚａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０３：４００５， ２００６を参照されたい）、またはヒトにおける半減期を長くするために（例えば、Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９：６２１３， ２００４を参照されたい）なされてよい。例示的な置換としては、抗体の半減期を増加させるための、位置２５０でのＧｌｎおよび／または位置４２８でのＬｅｕ（ＥＵ番号付けがこの段落において定常領域に対して使用される）が挙げられる。位置２３４、２３５、２３６および／または２３７のいずれかでまたは全てでの置換はＦｃγ受容体、特にＦｃγＲＩ受容体に対する親和性を低減させる（例えば、ＵＳ６，６２４，８２１号を参照されたい）。いくつかの抗体は、エフェクター機能を低減するために、ヒトＩｇＧ１の位置２３４、２３５および２３７でのアラニン置換を有する。任意で、ヒトＩｇＧ２における位置２３４、２３６および／または２３７はアラニンで置換され、位置２３５はグルタミンで置換される（例えば、ＵＳ５，６２４，８２１号を参照されたい）。

Ｅ．組換え抗体の発現
抗体は組換え発現により生成させることができる。抗体をコードする核酸は、所望の細胞型（例えば、ＣＨＯまたはＳｐ２／０）における発現のためにコドンが最適化されていてよい。組換え核酸コンストラクトは典型的には、抗体鎖のコード配列に作動可能に連結される発現制御配列を含み、天然に関連するまたは異種のプロモーター領域を含む。発現制御配列は、真核生物宿主細胞をトランスフォームまたはトランスフェクトできるベクターにおける真核生物プロモーター系であってよい。ベクターが適切な宿主に組み込まれたら、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現、および交差反応抗体の収集および精製に好適な条件下で維持される。抗体鎖をコードする１つまたは複数のベクターはまた、抗体鎖をコードする核酸のコピー数の増幅を可能にするために選択できる遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼを含んでよい。

大腸菌は抗体、特に抗体フラグメントを発現させるのに特に有用な原核生物宿主である。微生物、例えば酵母もまた、発現に有用である。サッカロマイセスは好ましい酵母宿主であり、要望通りに発現制御配列、複製開始点、終止配列などを有する好適なベクターがある。典型的なプロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の解糖酵素を含む。誘導性酵母プロモーターは、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソチトクロムＣ、およびマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素からのプロモーターを含む。

哺乳類細胞は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチドセグメントを発現させるために使用できる。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ， Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ， （ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， ＮＹ， １９８７）を参照されたい。無傷の異種タンパク質を分泌できる多くの好適な宿主細胞株が当技術分野において開発されており、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞、ならびにＳｐ２／０およびＮＳ０を含む非抗体産生骨髄腫が含まれる。非ヒト細胞を使用することは有利であり得る。これらの細胞に対する発現ベクターは、発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ８９：４９ （１９８６））、および必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列を含んでよい。好適な発現制御配列は内在性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、などに由来するプロモーターである。Ｃｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１１４９ （１９９２）を参照されたい。

抗体重鎖および軽鎖をコードするベクター（複数可）を細胞培養物に導入して、細胞プールを、無血清培地で増殖生産性および生成物品質についてスクリーニングできる。最高産生細胞プールをその後、ＦＡＣＳに基づく単細胞クローニングに供してモノクローナル系を生成させてもよい。５０ｐｇまたは１００ｐｇ／細胞／日を超える特定生産性は、７．５ｇ／Ｌ培養物を超える生成物力価に対応し、有利であり得る。単細胞クローンにより産生される抗体はまた、濁度、濾過特性、ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、ＵＶ走査、ＨＰ−ＳＥＣ、炭水化物−オリゴ糖マッピング、質量分析、および結合（ｂｉｎｉｎｇ）アッセイ、例えばＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅについて試験できる。選択されたクローンはその後、複数のバイアル中で貯蔵され、その後の使用のために凍結保存され得る。

発現されるとすぐに、抗体は、プロテインＡ捕獲、カラムクロマトグラフィー（例えば、疎水性相互作用またはイオン交換）、ウイルス不活性化のための低ｐＨなどを含む当技術分野の標準手順により精製され得る（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， ＮＹ， １９８２）を参照されたい）。

抗体の商業的生産のための方法は、コドン最適化、プロモーター、転写要素、およびターミネーターの選択、無血清単細胞クローニング、細胞バンキング、コピー数の増幅のための選択マーカーの使用、ＣＨＯターミネーター、無血清単細胞クローニング、タンパク質力価の改善を含む（例えば、ＵＳ５，７８６，４６４号、ＵＳ６，１１４，１４８号、ＵＳ６，０６３，５９８号、ＵＳ７，５６９，３３９号、ＷＯ２００４／０５０８８４号、ＷＯ２００８／０１２１４２号、ＷＯ２００８／０１２１４２号、ＷＯ２００５／０１９４４２号、ＷＯ２００８／１０７３８８号、およびＷＯ２００９／０２７４７１、およびＵＳ５，８８８，８０９号を参照されたい）。

Ｖ．核酸
発明はさらに、以上で記載される重鎖および軽鎖のいずれかをコードする核酸を提供する。典型的には、核酸はまた、成熟重鎖および軽鎖に融合されるシグナルペプチド（例えば、配列番号：２３および２５によりコードできる配列番号：２２および２４のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド）もコードする。核酸上のコード配列は、コード配列の発現を確実にするための調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナルなどと動作可能に連結されていてよい。重鎖および軽鎖をコードする核酸は、単離された形態で存在してよく、または１つ以上のベクター中にクローニングされ得る。核酸は、例えば、重複オリゴヌクレオチドの固体合成またはＰＣＲにより合成され得る。重鎖および軽鎖をコードする核酸は、１つの連続的な核酸として、例えば、一つの発現ベクター内で連結されていてよく、または別々であってよく、例えば、それぞれがそれ自体の発現ベクター中にクローニングされ得る。

ＶＩ．治療応用
発明は、そのような疾患を患う、またはそのリスクがある患者において、レビー小体病を治療するまたはその予防を実施するいくつかの方法を提供する。治療に適している患者は、ＬＢＤの疾患のリスクがあるが症状を示さない個体、ならびに現在、シヌクレイン病の症状または初期警告徴候、例えば、ＥＥＧ緩徐化、精神神経症状（うつ病、認知症、幻覚、不安、感情鈍麻、快感消失）、自律神経系の変化（起立性低血圧、膀胱障害、便秘、便失禁、流涎症、嚥下障害、性機能障害、脳血流の変化）、感覚的変化（嗅覚、疼痛、色識別知覚異常）、睡眠障害（レム睡眠行動障害（ＲＢＤ）、下肢静止不能症候群／周期性四肢運動、過眠症、不眠）ならびに種々の他の徴候および症状（疲労、複視、霧視、脂漏、体重減少／増加）を示す患者を含む。よって、本方法は、ＬＢＤの既知の遺伝的リスクを有する個体に予防的に投与できる。そのような個体としては、この疾患を経験した近親者を有するもの、およびそのリスクが遺伝的または生化学的マーカーの分析により決定されているものが挙げられる。ＰＤに対するリスクの遺伝子マーカーは、αシヌクレインまたはパーキン、ＵＣＨＬＩ、およびＣＹＰ２Ｄ６遺伝子における突然変異；特にαシヌクレイン遺伝子の位置３０および５３での突然変異を含む。現在、パーキンソン病を患う個体は、静止時振戦、筋強剛、動作緩慢および姿勢不安定を含むその臨床症状から認識できる。

無症候性患者では、治療は任意の年齢で（例えば、１０、２０、３０）開始できる。通常、しかしながら、患者が４０、５０、６０または７０に到達するまで治療を始める必要はない。治療は典型的には、ある期間にわたって複数回投与を必要とする。治療は、抗体、または治療薬（例えば、αシヌクレインペプチドの切断型）に対する活性化されたＴ−細胞またはＢ−細胞応答を時間と共にアッセイすることによりモニタできる。応答が降下すると、ブースター投与が示唆される。

抗体は、患者における有益な治療反応（例えば、患者における神経突起および／または軸索αシヌクレイン凝集物の低減、神経炎性ジストロフィーの低減、認知機能の改善、および／または認知低下の逆転、治療または防止）を生成させる条件下での投与により、患者においてレビー小体病を治療する、またはその予防を実施するために使用できる。いくつかの方法では、新皮質および／または基底核のニューロピルにおける神経炎性ジストロフィーの面積は、対照集団に比べ治療患者では、平均して少なくとも１０％、２０％、３０％、または４０％だけ低減させることができる。

認知障害、認知機能の進行性の低下、脳形態の変化、および脳血管機能の変化は、レビー小体病を患う、またはそのリスクがある患者で一般に観察される。本抗体の投与は、そのような患者において認知機能の低下を阻止または遅延させることができる。

発明はまた、シナプス密度および／または樹状突起（ｄｅｎｔｒｉｔｉｃ）密度を保存または増加させる方法を提供する。シナプスまたは樹状突起（ｄｅｎｔｒｉｔｉｃ）密度の変化指数は、シナプス形成（シナプトフィジン）および／または樹状突起（ＭＡＰ２）のマーカーにより測定できる。いくつかの方法では、シナプスまたは樹状突起（ｄｅｎｔｒｉｔｉｃ）密度は、健康な被験体におけるシナプスまたは樹状突起（ｄｅｎｔｒｉｔｉｃ）密度のレベルまで回復させることができる。いくつかの方法では、治療患者におけるシナプスまたは樹状突起（ｄｅｎｔｒｉｔｉｃ）密度の平均レベルは、未治療対照患者の集団と比べて、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％またはそれを超えて上昇させることができる。

ＶＩＩ．治療方法
予防的適用では、抗体または抗体を誘導するための薬剤またはこれを含む製剤が、疾患にかかりやすい、またはそのリスクがある患者に、リスクを低減し、重症度を軽減し、または疾患の少なくとも１つの徴候または症状の発症を遅延するのに有効なレジーム（投与の用量、頻度および経路）で投与される。いくつかの予防的適用では、レジームは、脳内でのαシヌクレインおよび切断フラグメントの蓄積を阻止または遅延する、および／またはその毒性効果を阻止または遅延するおよび／または行動の欠陥の発症を阻止／または遅延するのに有効である。治療的適用では、抗体または抗体を誘導するための薬剤が、レビー小体病の疑いがある、またはすでにこれを患う患者に、疾患の少なくとも１つの徴候または症状を寛解させるまたはそのさらなる悪化を少なくとも阻止するのに有効なレジーム（投与の用量、頻度および経路）で投与される。いくつかの治療的な適用では、レジームは、αシヌクレインおよび切断フラグメントのレベル、関連する毒性および／または行動の欠陥を低減するかそのさらなる増加を少なくとも阻止するのに有効である。

レジームは、個々の治療患者が、発明の方法により治療されていない同等患者の対照集団の平均転帰よりも好ましい転帰を達成した場合、または、より好ましい転帰が対照臨床試験（例えば、第ＩＩ相、第ＩＩ／ＩＩＩ相または第ＩＩＩ相試験）において治療患者対対照患者において、ｐ＜０．０５または０．０１またはさらに０．００１レベルで証明された場合、治療的にまたは予防的に有効であると考えられる。

有効な用量は多くの異なる因子によって変動し、因子としては投与手段、標的部位、患者の生理的状態、例えばレビー小体病の型、患者がＡｐｏＥキャリアかどうか、患者がヒトか動物か、投与された他の薬剤、および治療が予防的か治療的か、が挙げられる。

抗体の例示的な投与量範囲は約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。抗体は、そのような用量で毎日、一日置きに、毎週、２週間ごとに、毎月、年４回、毎年または実験分析により決定される任意の他のスケジュールに従い、投与できる。例示的な治療は、複数回投与での、例えば、少なくとも６ヶ月の長期間にわたる投与を必要とする。追加の例示的な治療レジームは、２週間毎に１回または１ヶ月に１回または３〜６ヶ月毎に１回の投与を必要とする。

抗体は末梢経路を介して投与でき、（すなわち、投与された抗体は血液脳関門を横切り、脳内の対象部位に到達する。投与経路は局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、くも膜下腔内、腹腔内、鼻腔内または筋肉内を含む。抗体の投与のためのいくつかの経路は静脈内および皮下である。この型の注射は最も典型的には、腕または脚筋肉内で実施される。いくつかの方法では、薬剤は、沈着物が蓄積した特定の組織中に直接注射され、例えば頭蓋内注射である。

本レジームは、治療される疾患の治療または予防において有効な別の薬剤と組み合わせて投与できる。例えば、パーキンソン病の場合、αシヌクレインに対する免疫療法ＷＯ／２００８／１０３４７２号、レボドパ、ベンザセリド、カルビドパ、ドーパミンアゴニスト、非麦角系ドーパミンアゴニスト、カテコール−Ｏ−メチル（「ＣＯＭＴ」）阻害剤、例えば、例として、エンタカポン（ｅｎｔａｃｏｐｏｎｅ）またはトルカポン（ｔｏｌｃｏｐｏｎｅ）、モノアミンオキシダーゼ（「ＭＡＯ」）阻害剤、例えば、例として、ラサギリン（ｒａｓａｇａｌｉｎｅ）、アマンタジン、または抗コリン薬が本レジームと組み合わせて使用できる。

有効投与量の、以下でより詳細に記載される医薬製剤のいずれかは、シヌクレイン病を有する、またはそのリスクがあるヒト患者を治療的にまたは予防的に処置するために投与できる。以下で記載される製剤のいくつかは、患者への静脈内投与、例えば４週毎の投与に好適な注入バッグに添加できる。患者の中には、パーキンソン病と診断されている者もいる。本明細書で記載される製剤は、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇまたは約３０ｍｇ／ｋｇヒト化９Ｅ４原薬の用量で投与できる。何人かの患者においては、用量は、耐性、安全性、薬物動態、効力および経験的に決定できる他のパラメータに従い、さらに調整できる。

ＶＩＩＩ．製剤
発明の製剤（医薬組成物としても知られている）は抗体（例えば、マウス９Ｅ４（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−８２２１）のキメラ、ベニヤ化またはヒト化バージョン）またはその抗原結合性フラグメント、バッファー、１つ以上の糖および／またはポリオールおよび界面活性剤を含み、約５〜約７．５の範囲内のｐＨを有する。製剤は、液体形態または凍結乾燥形態で貯蔵するために調製できる。凍結乾燥形態で貯蔵される場合、製剤は、本明細書で記載される濃度および特性に、液体（例えば、滅菌水）を用いて再構成できる。凍結乾燥組成物が、水の添加により特定の成分濃度およびｐＨの製剤を生成するように再構成できると言われる場合、凍結乾燥製剤は単に水を添加するだけで（すなわち、追加の量の成分を供給したり、ｐＨを変化させるために酸または塩基を添加したりせずに）、そのように再構成できることを意味する。凍結乾燥される前の（ｐｒｅｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）液体製剤の濃度および特性はまた、凍結乾燥製剤が製剤凍結乾燥前と同じ体積に再構成される場合、以下で記載されるものと一致していてよい。体積が異なる場合、製剤の濃度は比例的に調整されなければならない。例えば、再構成される体積が凍結乾燥前体積の半分である場合、凍結乾燥前製剤中の成分の濃度は再構成される製剤中の濃度の半分であるはずである。

任意で、ＣＨＯ細胞培養から精製された９Ｅ４抗体を以下で記載されるように製剤中に再懸濁し、凍結乾燥前貯蔵の間一時的に凍結し、凍結乾燥し、凍結乾燥前と同じ濃度へと水で再構成する。そのような製剤は好ましくは、凍結、凍結乾燥、貯蔵、および再構成を通して抗体を安定化しなければならず、ならびに、非経口投与に好適である。例示的なワークフローでは、精製抗体は約４０ｍｇ／ｍｌで製剤３（表１０）中に再懸濁され、−４０℃でバッグ内で凍結保存される。バッグは室温で３時間解凍され、内容物がプールされる。製剤は０．２ミクロン滅菌濾過器（ｓｔｅｒｉｌｅ ｆｉｌｅｒ）を通して滅菌濾過される。バイアルに５．４ｍｌの製剤を充填し、凍結乾燥する。凍結乾燥したバイアルを２−８℃で貯蔵する。凍結乾燥したバイアルを、滅菌水（例えば、製剤によって、およそ５．０〜５．４ｍｌの滅菌水）を添加することにより再構成する。５ｍｌの再構成した製品をその後、患者への静脈内注入のための２０−１００ｍｌの生理食塩水、乳酸リンゲル液、または５％デキストロース溶液などを含むＩＶバッグの出入り口に添加する。

いくつかの製剤は増量剤を含み、これは、糖／ポリオール成分と同じであってもよく、またはそうでなくてもよい。典型的には、製剤は、例えば、０．２μｍまたは０．２２μｍフィルタを用いた除菌により達成されるように、無菌である。いくつかの製剤は≦約３ＣＦＵ／３０ｍＬのバイオバーデンを有する。いくつかの製剤は≦約０．１ＥＵ／ｍｇの細菌エンドトキシンを含む。発明の製剤はまた一般に、以下でさらに規定されるように、凍結解凍に際しフラグメント化および／または凝集が低い〜検出不能なレベルで安定している。さらに他の製剤は凍結乾燥したケーキの再構成後、少なくとも３ヶ月間、摂氏４０度で安定である。いくつかの製剤では、抗体の約１０％未満が製剤中で凝集物として存在する。いくつかの製剤では、抗体の約５％以下が製剤中で凝集物として存在する。

いくつかの製剤では、抗体は、約５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度で存在する。いくつかの製剤では、抗体は、約５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度で存在する。いくつかの製剤では、抗体は、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度で存在する。例えば、抗体は約３５−４５ｍｇ／ｍｌまたは約４０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。抗体は、約５０ｍｇ／バイアル〜約５００ｍｇ／バイアルの、またはそれを超える量の無菌液体剤形で存在し得る。抗体は、約４０ｍｇ／バイアル〜約５００ｍｇ／バイアルの凍結乾燥剤形で存在し得る。例えば、抗体は、約２５０−３５０ｍｇ／バイアルまたは約２００ｍｇ／バイアルの無菌液体または凍結乾燥剤形で存在し得る。

開示される製剤中で使用される抗体は、治療的部分、例えば細胞傷害性薬物、放射線治療薬、免疫調節物質、二次抗体（例えば、抗体ヘテロコンジュゲートを形成するため）、または製剤化された抗体（例えば、キメラ、ベニヤ化またはヒト化９Ｅ４）の活性を促進または増強する任意の他の生物活性剤と結合させてよい。代表的な治療的部分としては、レビー小体病またはシヌクレイン病の症状の治療、管理、または寛解に有用であることが知られている薬剤が挙げられる。

製剤化された抗体は以上で記載される抗体９Ｅ４のキメラ、ベニヤ化またはヒト化バージョンのいずれかを含んでよい。例えば、抗体は、配列番号：４の３つのＫａｂａｔ ＣＤＲを含む軽鎖可変領域および配列番号：１１の３つのＫａｂａｔ ＣＤＲを含む重鎖可変領域を含んでよい。製剤は配列番号：３、配列番号：４、または配列番号：５のいずれか１つ含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および／または配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、または配列番号：１１のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体を含有してよい。いくつかの製剤は配列番号：５を含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体を含有する。いくつかの製剤は、配列番号：１０を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体を含有する。例えば、製剤化された抗体は配列番号：５を含むアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号：１０を含むアミノ酸配列を有する重鎖を含んでよい。

バッファー、例えば、例として、ヒスチジン、コハク酸塩、およびクエン酸塩バッファーが、抗体に対して好適なｐＨを達成するために、開示される製剤で使用される。いくつかの製剤は約５．５〜約７の範囲内のｐＨ、例えば、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０のｐＨを有する。いくつかの製剤は、約５．５〜約６．５の間のｐＨを有する。いくつかの製剤は約６．０のｐＨを有し、他の製剤は約６．５のｐＨを有する。いくつかの製剤では、クエン酸塩バッファーまたはコハク酸塩バッファーは約１０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲内の濃度で、例えば、約１５−２５ｍＭまたは約２０ｍＭの濃度で存在する。いくつかのクエン酸塩バッファーは、クエン酸ナトリウム無水物およびクエン酸一水和物を、それぞれ、約１５ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲内および約２ｍＭ〜約６ｍＭの範囲内の濃度で含む。

製剤のための好適な糖および／またはポリオールとしては、トレハロース、スクロース、マンニトール、またはそれらの組み合わせが挙げられる。糖／ポリオールは、増量剤、凍結保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、および／または張度調整剤として機能する。例えば、いくつかの製剤は、約２２０ｍＭ〜約２６０ｍＭの範囲内の濃度で存在するトレハロース、約２２０ｍＭ〜約２６０ｍＭの範囲内の濃度で存在するスクロース、または約２０ｍＭ〜約４０ｍＭの範囲内の濃度で存在するスクロースおよび約２００ｍＭ〜約２２０ｍＭの範囲内の濃度で存在するマンニトールの混合物を含む。いくつかの製剤は約２３０ｍＭまたは２４０ｍＭの濃度で存在するトレハロースを含む。他の製剤は約２３０ｍＭまたは２４０ｍＭの濃度で存在するスクロースを含む。他の製剤は、約５０ｍＭの濃度で存在するスクロースおよび約２００ｍＭの濃度で存在するマンニトールの混合物を含む。別の製剤は、約２８ｍＭの濃度で存在するスクロースおよび約２１２ｍＭの濃度で存在するマンニトールの混合物を含む。いくつかのそのような製剤は約２５０−４００、３００−４００、または３００−３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の浸透圧、例えば、３３５ｍＯｓｍ／ｋｇなどにより特徴付けられる。

製剤は好ましくは、抗体の凝集および表面への吸収を低減するために界面活性剤を含む。好適な界面活性剤としては、約０．００５重量％〜約０．０５重量％の範囲内の濃度で存在するポリソルベート２０（ＰＳ２０）が挙げられる。ＰＳ２０は、そうでなければ９Ｅ４抗体の製剤中で起こるであろう凝集または濁度の著しい増加に対して保護する。ポリソルベート２０は約０．０１％〜約０．０５％の範囲内の濃度で存在し得る。例えば、濃度は０．００５％、０．０１％、０．０１５％、０．０２％、０．０２５％、０．０３％、０．０３５％、０．０４％、０．０４５％、または０．０５％であってよい。あるいは、いくつかの製剤では、ポリソルベート２０は、約０．０５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．１５ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．２５ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．３５ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．４５ｇ／Ｌ、または０．５ｇ／Ｌの範囲内の濃度で存在する。いくつかの製剤は、ポリソルベート２０を０．２ｇ／Ｌの濃度（すなわち、０．１６３ｍｍｏｌ／Ｌ）で含む。

例示的な製剤（液体、凍結乾燥前または凍結乾燥後再構成される）は、約５．５〜約７の範囲内のｐＨにより特徴付けられ、下記を含む：（ａ）約１０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの範囲内の濃度での、抗体９Ｅ４のキメラ、ベニヤ化、またはヒト化バージョン、または抗原への結合に関し９Ｅ４と特異的に競合するそのフラグメント；（ｂ）約１０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲内の濃度で存在するクエン酸塩バッファーまたはコハク酸塩バッファー；（ｃ）約２２０ｍＭ〜約２６０ｍＭの範囲内の濃度で存在するトレハロース、約２２０ｍＭ〜約２６０ｍＭの範囲内の濃度で存在するスクロース、および約２０ｍＭ〜約４０ｍＭの範囲内の濃度で存在するスクロースおよび約２００ｍＭ〜約２２０ｍＭの範囲内の濃度で存在するマンニトールの混合物から選択される１つ以上の糖およびポリオール（「糖／ポリオール」）；ならびに（ｄ）約０．００５重量％〜約０．０５重量％の範囲内の濃度で存在するポリソルベート２０。例えば、製剤は、下記を含んでよい：（ａ）配列番号：２９として明記されるアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号：３２として明記されるアミノ酸配列を含む重鎖（Ｃ末端リジンありまたはなし）を含み、約４０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する抗体；（ｂ）約２０ｍＭの濃度でのクエン酸塩バッファー；（ｃ）約２３０ｍＭの濃度でのトレハロース；（ｄ）約０．０２％の濃度でのポリソルベート２０；ならびに約６．０のｐＨ。

いくつかの凍結乾燥製剤は下記を含む：（ａ）抗体９Ｅ４のヒト化バージョンまたはその抗原結合性フラグメント；（ｂ）クエン酸塩；（ｃ）トレハロース；ならびにポリソルベート２０。凍結乾燥製剤は約２００ｍｇの抗体を含んでよい。いくつかの凍結乾燥製剤は、滅菌水で再構成させることができる。いくつかの凍結乾燥製剤は１００−３００または１５０−２５０ｍｇの９Ｅ４抗体、１５−３５または２０−２５ｍｇのクエン酸ナトリウム無水物、１．６５−２．７５または２−２．３ｍｇのクエン酸一水和物、３６０−５００または４００−４７０ｍｇのトレハロース無水物、および０．５〜１．５ｍｇまたは０．７５〜１．２５ｍｇのポリソルベート２０を含む。例示的な凍結乾燥製剤は２００ｍｇの９Ｅ４抗体（例えば、ヒト化９Ｅ４抗体）、２５ｍｇのクエン酸ナトリウム無水物、２．１５ｍｇのクエン酸一水和物、４３５ｍｇのトレハロース無水物、および１ｍｇのポリソルベート２０を含む。別の例示的な凍結乾燥製剤は２００ｍｇの９Ｅ４抗体（例えば、ヒト化９Ｅ４抗体）、２５ｍｇのクエン酸ナトリウム無水物、３．１５ｍｇのクエン酸一水和物、４３５ｍｇのトレハロース無水物、および１ｍｇのポリソルベート２０を含む。そのような製剤は、好ましくは約５ｍｌの体積に再構成される。他の凍結乾燥製剤は同じ成分をこの段落で開示されるいずかと同じ割合で、しかし異なる量で含む（例えば、４００ｍｇの抗体、５０ｍｇのクエン酸ナトリウム、４．３ｍｇのクエン酸一水和物、８７０ｍｇのトレハロース無水物、および２ｍｇのポリソルベート２０）。

凍結乾燥製剤は、好ましくは、約３０−５０または３５−４５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約４０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度；（ｂ）約１０−３０または１５−２５ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭの濃度で存在するクエン酸塩バッファー；（ｃ）約１６０−３３０または２００−２６０ｍＭ、好ましくは約２３０ｍＭの濃度で存在するトレハロース；（ｄ）約０．１−０．３または０．１５〜０．２５ｇ／Ｌ、好ましくは約０．２ｇ／Ｌの濃度で存在するポリソルベート２０；ならびに（ｅ）約５．５−６．５、好ましくは約６．０のｐＨに、再構成される。

液体または再構成された凍結乾燥製剤は、好ましくは実質的に等張であり、約２５０−３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ水の浸透圧を意味する。いくつかの製剤は、約３３５ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。いくつかの製剤は、２７０−３００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。液体または再構成された凍結乾燥製剤はまた、高浸透圧性＞３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ水または低浸透圧性（＜２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ水）であってよい。

いくつかの凍結乾燥製剤は、白色から黄色がかった粉末に見える。いくつかの液体または再構成された凍結乾燥製剤は、実際には異物を含まない溶液に見え、少数の半透明、白色から白みがかった製品に典型的な粒子を含み得る。いくつかの液体または再構成された凍結乾燥製剤は、≦約６，０００の顕微鏡でないと見えない粒子≧１０μｍ／バイアル（体積＝５ｍｌ）および／または≦約６００の顕微鏡でないと見えない粒子≧２５μｍ／バイアルを含む。いくつかの液体または再構成された凍結乾燥製剤は、無色から淡黄色に見える（≦参照溶液ＢＹ３）。いくつかの液体または再構成された凍結乾燥製剤は、透明からわずかに乳白色に見える（≦参照懸濁液ＩＩＩ）。

記載される製剤のいずれも、本明細書で成分であると記載されるもの以外の、医薬賦形剤、担体などなしで製造できる。そのような製剤は、列挙された成分で構成され、または、製剤の特性に影響しないわずかな量の他の成分が存在する場合、列挙された成分で本質的に構成されると記載できる。製剤は、好ましくはヒトに投与するための薬物の調製のためにＦＤＡにより認可されたまたは承認可能な適正製造基準（ＧＭＰ）下で製造される。

開示される製剤で使用される抗体はまた、例えば、シヌクレイン病を診断する、シヌクレイン病の進行をモニタする、および／または治療の効力を評価するのに有用な検出可能な標識と結合されてよい。記載されるように製剤化された抗体は、シヌクレイン病、例えばパーキンソン病を有するまたはこれにかかりやすい被験体における、またはそのような被験体から得られる適切な生体試料におけるそのような決定を実施するのに特に有用である。ヒト化９Ｅ４抗体に結合または連結させることができる代表的な検出可能な標識としては、下記が挙げられる：様々な酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族、例えばストレプトアビジンビオチン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｌｂｉｏｔｉｎ）およびアビジン／ビオチン；蛍光材料、例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリン；発光材料、例えばルミノール；生物発光材料、例えばルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリン；放射性材料、例えば限定はされないがヨウ素（^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^１２１Ｉ）、炭素（^１４Ｃ）、硫黄（^５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム（^１１５Ｉｎ、^１１３Ｉｎ、^１１２Ｉｎ、^１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（^９９Ｔｃ）、タリウム（^２０１Ｔｉ）、ガリウム（^６８Ｇａ、^６７Ｇａ）、パラジウム（^１０３Ｐｄ）、モリブデン（^９９Ｍｏ）、キセノン（^１３３Ｘｅ）、フッ素（^１８Ｆ）、^１５３Ｓｍ、^１７７Ｌｕ、^１５９Ｇｄ、^１４９Ｐｍ、^１４０Ｌａ、^１７５Ｙｂ、^１６６Ｈｏ、^９０Ｙ、^４７Ｓｃ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１４２Ｐｒ、^１０５Ｒｈ、^９７Ｒｕ、^６８Ｇｅ、^５７Ｃｏ、^６５Ｚｎ、^８５Ｓｒ、^３２Ｐ、^１５３Ｇｄ、^１６９Ｙｂ、^５１Ｃｒ、^５４Ｍｎ、^７５Ｓｅ、^１１３Ｓｎ、および^１１７Ｔｉｎ；様々なポジトロン断層撮影を使用するポジトロン放出金属、非放射性常磁性金属イオン、および放射標識されたまたは特定の放射性同位体にコンジュゲートされた分子。

治療的部分および／または検出可能な物質はマウス、キメラ、ベニヤ化、またはヒト化９Ｅ４抗体に直接、または間接的に、中間物（例えば、リンカー）を介して、当技術分野で知られている技術を使用して結合またはコンジュゲートされる。例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．， ‘‘Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ’’， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， ｐｐ． ２４３−５６ （Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９８５）； Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， ‘‘Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ’’， ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ （２ｎｄ Ｅｄ．）， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， ｐｐ． ６２３−５３ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ． １９８７）； Ｔｈｏｒｐｅ， ‘‘Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ’’， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ８４： Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， ｐｐ． ４７５−５０６ （１９８５）； ‘‘Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｒｅｓｕｌｔｓ， Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ’’， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， ｐｐ． ３０３−１６ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．， １９８２， ６２：１１９−５８を参照されたい。

開示される製剤で使用される抗体はまた、マウス、キメラ、ベニヤ化、またはヒト化９Ｅ４抗体の修飾形態を含み、これらは、対応する未修飾抗体に比べ増加したインビボ半減期を有する。そのような修飾形態は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合により調製できる。１つの例として、抗体半減期延長のための代表的な方法はＷＯ０２／０６０９１９号において記載される。

本発明は、少なくとも約３０日間３８℃−４２℃で安定である（例えば、高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）により評価される）抗体製剤、２０℃−２４℃で少なくとも約１年間安定性を有する製剤、および２℃−４℃で少なくとも約３年間安定性を有する製剤を包含する。凍結乾燥製剤の安定性は、凍結乾燥状態での貯蔵に関して評価される。製剤は、時間および温度のこれらの特定の組み合わせの１つ以上でのインキュベーション後に、低い〜検出不能のフラグメント化および／または低い〜検出不能の凝集として下記定義を満たす場合、安定であると考えられる。より特定的には、開示される製剤は低い〜検出不能レベルの抗体凝集および／またはフラグメント化、または抗体フラグメント化および／または凝集において初期レベルを超える低いまたは検出不能な増加（例えば、約１０％未満の凝集）を示す。いくつかの製剤は、≦約５％の合わせた凝集および／またはフラグメント化を示す。低い〜検出不能レベルのフラグメント化を有する製剤は、総タンパク質の少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％を、例えば、高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）により決定すると単一ピークに、または還元型キャピラリーゲル電気泳動（ｒＣＧＥ）により２つのピーク（１つが、抗体重鎖および抗体軽鎖の各々に対応する）に含み、分解されていない抗体を表し、かつ、それぞれ５％を超える、４％を超える、３％を超える、２％を超える、１％を超える、または０．５％を超える総タンパク質を有する他の単一ピークを含まない。低い〜検出不能レベルの凝集を有する製剤は、高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）により測定すると、約１５重量％以下、約１０重量％以下、約５重量％以下、約４重量％以下、約３重量％以下、約２重量％以下、約１重量％以下、または約０．５重量％以下の凝集タンパク質を含む。例えば、いくつかの製剤では、抗シヌクレイン抗体の約１０％未満が凝集物として存在する。発明の安定な製剤はまた、キメラ、ベニヤ化またはヒト化９Ｅ４の生物活性（複数可）をほとんど、または全く損失しておらず、例えば、ＥＬＩＳＡおよび／または追加の機能アッセイにより測定可能な結合親和性を有し、これは、初期の測定可能値の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％である。いくつかの製剤は、参照材料の初期の測定可能値の約６０％〜約１４０％である結合親和性を有する。

ＩＸ．医薬製剤の調製
本発明はまた、医薬製剤を調製する方法を提供する。発明の１つの態様では、そのような方法は下記を含む：（ａ）細胞が抗体を細胞培地中に分泌するように、それらのゲノムに、マウス抗体９Ｅ４（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−８２２１）の軽鎖および重鎖、またはそのキメラ、ベニヤ化、またはヒト化バージョンをコードする核酸を安定に組み込んだ哺乳類細胞を培養すること、；（ｂ）抗体を細胞培地から精製すること；ならびに（ｃ）以上で記載される製剤のいずれかを調製すること。

医薬製剤の調製は、物理的安定性、化学的安定性、および生物活性からなる群より選択される、製剤中の抗体の少なくとも１つの特性を評価する追加の工程を含んでよい。

例えば、哺乳類細胞は抗体の産生のために培養でき、ここで、哺乳類細胞は、それらのゲノムに、ヒト化９Ｅ４抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸を安定に組み込んでいる。この目的のために有用な哺乳類細胞は、それらのゲノムに配列番号：２９として明記される抗体軽鎖および配列番号：３１または３２として明記される抗体重鎖をコードする核酸配列を安定に組み込んでいる宿主細胞を含む。

抗体の産生のために、開示される核酸はベクター中に含まれる。いくつかの実施例では、ベクターは、宿主細胞においてＤＮＡの発現を引き起こすことができる好適な制御配列に作動可能に連結される、マウス９Ｅ４抗体、またはそのキメラ、ベニヤ化、またはヒト化バージョンをコードする核酸を含む。そのような制御配列は、転写を引き起こすプロモーター（例えば、当技術分野で知られている構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター）、そのような転写を制御する任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、および転写および翻訳の終了を制御するための配列を含む。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子（例えば、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス、アデノ随伴−ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクチニアウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルスおよびサイトメガロウイルスベクター）、または単純にゲノムインサートであってもよい。好適な宿主にトランスフォームされると、抗体核酸は宿主のゲノム中に組み込まれ、またはベクターは宿主ゲノムとは独立に複製して機能し得る。

開示される核酸は、ベクターに単独で、または組み合わせて（例えば、抗体軽鎖をコードする核酸および抗体重鎖をコードする核酸の組み合わせ）含まれる。

発明の抗体製剤を調製するために有用な宿主細胞としては哺乳類細胞が挙げられ、ヒト起源の細胞、ヒト胚性腎臓細胞、サル腎臓細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞、マウスセルトリ細胞、ヒト子宮頸癌（ＨｅＬａ）細胞、イヌ腎臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝臓細胞、マウス乳房腫瘍細胞、およびＮＳ０細胞が含まれる。

あるいは、キメラ、ベニヤ化、またはヒト化９Ｅ４抗体は、化学合成により調製でき、その後、開示される製剤で使用できる。

開示される製剤を調製するために使用される抗体は、典型的には単離または精製され、すなわち、細胞材料またはそれらが産生される細胞由来の他の混入タンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成される場合、化学的前駆体または他の化学薬品を実質的に含まない。例えば、細胞材料を実質的に含まない抗体は約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、５％、２％、１％、０．５％、０．１％、またはそれ未満（乾燥重量による）より少ない混入タンパク質を有する抗体の調製物を含む。抗体が組換えで生成される場合、これはまた、培地を実質的に含まず、よって、培地は約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、５％、２％、１％、０．５％、０．１％、またはそれ未満より少ないタンパク質調製物の体積に相当する。抗体が化学合成により生成される場合、抗体は好ましくはタンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学薬品を実質的に含まず、またはこれらから分離されている。したがって、そのような抗体調製物は、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、５％、２％、１％、０．５％、０．１％、またはそれ未満（乾燥重量による）より低い化学的前駆体または抗体原薬以外の化合物を有する。例えば、抗体原薬のいくつかの調製物は、下記アッセイにより決定される下記純度を有する：プロテインＡ ＥＬＩＳＡ（≦約２５ｎｇ／ｍｇ）、ＣＨＯＰ ＥＬＩＳＡ（≦約１００Ｕ^２／ｍｇ）、ＩＧＦ−１ ＥＬＩＳＡ（≦約１ｎｇ／ｍｇ）、インスリン ＥＬＩＳＡ（≦約１ｎｇ／ｍｇ）、およびＤＮＡｑＰＣＲ（≦約３ｐｇ／ｍｇタンパク質）。抗体原薬のいくつかの調製物は、≦約１０ＣＦＵ／ｍＬのバイオバーデンを有する。抗体原薬のいくつかの調製物は、≦約０．５ＥＵ／ｍｇの細菌エンドトキシンを含む。組換えで発現される抗体の精製は、当技術分野で知られている多くの方法のいずれか、例えば、例として、アフィニティークロマトグラフィー、酸処理、深層濾過、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ナノ濾過、限外濾過、透析およびダイアフィルトレーションを利用できる。

精製された抗体原薬は、本明細書で記載される製剤のいずれかを含む溶液に調整され、所望の濃度に希釈され、使える状態になるまで貯蔵され得る。任意で、製剤は使える状態になるまで濃縮形態で貯蔵できる。

液体製剤は、それらの安定性プロファイルによって、凍結形態で、冷蔵下で、または室温で貯蔵でき、それは経験的に決定できる。場合によっては、さらなる濾過工程が適用される。本明細書で記載される製剤のいくつかは凍結乾燥され、粉末形態で貯蔵され得る。凍結乾燥製剤は、それらの安定性プロファイルによって、凍結形態、冷蔵下でまたは室温で貯蔵でき、それは経験的に決定できる。例えば、凍結乾燥製剤は、約２℃〜８℃の温度で貯蔵され得る。そのような場合、製剤は患者への投与前に再構成され、本明細書で記載される濃度で存在する抗体および賦形剤を有する液体製剤が得られる。場合によっては、製剤は滅菌水中で再構成される。場合によっては、製剤は再構成され、患者に投与するための注入バッグに添加される。再構成された製剤は、患者への投与前に、安定性プロファイルと一致する期間の間、冷蔵下でまたは室温で貯蔵され得る。凍結乾燥および再構成技術は当技術分野で知られており、実施例で記載される。

液体製剤または再構成された凍結乾燥製剤のいずれかは、患者に投与する前に、希釈剤、例えば生理食塩水またはリンゲル液を含む注入バッグに添加できる。注入バッグの体積は、液体製剤または構成された凍結乾燥製剤の体積（例えば、１−１０ｍｌ）に比べて、通常比較的大きい（例えば、５０ｍｌ〜１Ｌ、または１００−５００ｍｌ）。いくつかの液体、例えば生理食塩水、乳酸リンゲル液、または５％デキストロース溶液は注入バッグ中で使用でき、その各々は実質的に等張である。例示的なレジームでは、約５ｍｌの液体または再構成された凍結乾燥製剤が生理食塩水の１００−ｍｌバッグの出入口を介して注射され、ｉｖ注入により、約１時間の期間にわたって約１．７５ｍｌ／分の流速で投与される。

このように、本発明はまた、凍結乾燥した抗体原薬ならびに再構成および使用のための説明書を含む医薬品を包含する。いくつかの医薬品は下記を含む：（ａ）約４０〜約２００ｍｇの抗体を粉末形態で含むバイアル；ならびに（ｂ）抗体の再構成のための説明書。例示的な医薬品は下記を含み：（ａ）粉末形態で、約２００ｍｇの抗体、約２５ｍｇのクエン酸ナトリウム無水物、約３．１５ｍｇのクエン酸一水和物、約４３５ｍｇのトレハロース無水物および約１ｍｇのポリソルベート２０を含むバイアル；（ｂ）再構成のための説明書；ならびに（ｃ）注入のために再構成された製剤を調製するための説明書、ここで、（ｉ）抗体は、配列番号：２９として明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号：３２として明記されるアミノ酸配列を含む重鎖（Ｃ末端リジンありまたはなし）を含み；ならびに（ｉｉ）再構成説明書は、５ｍＬの抽出可能な体積への注射のための水を用いた再構成を要求する。

実施例
下記実施例は、発明の形態を説明するために含められている。下記実施例のある一定の態様は、発明の実施において功を奏するように、本共同発明者により見出された、または企図された技術および手順の観点から記載される。本開示および当技術分野における一般レベルの技術を考慮すると、当業者は、下記実施例は例示にすぎないことが意図されること、ならびに多くの変更、改変、および修正が発明の範囲から逸脱せずに使用可能であることを認識する。

実施例１：発現ベクターの調製
重鎖および軽鎖両方の可変領域のヒト化９Ｅ４特異配列（それぞれ、配列番号：３２および２９）を、高生産の強化を可能にする遺伝要素（例えば、転写増強エレメント（ＴＳ）、ポリアデニル化シグナル、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ変異体）を含む発現ベクターにサブクローニングした。

プラスミドｐＣＥＴＨｕ９Ｅ４ＶＬｖ３．ｈＣＫを鋳型として使用して、軽鎖の可変領域をＰＣＲにより単離し、フラグメントの５’端にＥｃｏＲＶ制限部位および３’端にＫｐｎＩ制限部位を導入し、同じ制限酵素で消化したベクターｐＢＩ−６０およびｐＢＩ−９０にサブクローニングした。これらのベクターはヒトκ鎖のゲノム定常領域を含んだ。加えて、ベクターｐＢＩ−６０およびｐＢＩ−９０は、選択中の高生産の強化のために、減弱された選択マーカーネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする。ｐＢＩ−６０はネオマイシンホスホトランスフェラーゼのＦ２４０Ｉ変異体をコードし、ベクターｐＢＩ−９０はＤ２２７Ｖ変異体をコードする。

プラスミドｐＣＥＴＨｕ９Ｅ４ＶＨｖ３．ｈｌｇＧ１を鋳型として使用して、ヒト化９Ｅ４重鎖の可変領域をＰＣＲにより単離し、サブクローニングのために、５’端にＭｆｅＩ制限部位および３’端にＢｌｐＩ制限部位を導入した。可変領域を、Ｇ１ｍ（３）アロタイプのヒトＩｇＧ１のゲノム定常領域を含む、ＭｆｅＩおよびＢａｍＨＩで消化した真核生物発現ベクターｐＢＩ−６１にクローニングした。ベクターはハムスター由来の選択可能なマーカーであるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする。
実施例２：ヒト化９Ｅ４抗体の産生

プラスミドｓｐＢＩ−６１／９Ｅ４ＨＣおよびｐＢＩ−６０／９Ｅ４ＬＣを、無血清増殖培地にあらかじめ適応させたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に同時トランスフェクトした。細胞を合成培地中、ウシ由来成分なしで増殖させた。樹立細胞株のための培地は下記の通りとした：

接種前（ｐｒｅｉｎｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）培地の調製：
１）ＷＦＩ開始体積 総体積の８０％；開始温度２８〜３５℃
２）リスト（上記）に従い、各々の前の成分が完全に溶解するとすぐに、成分を１つずつ添加。
３）ＷＦＩ残りの体積０．１７６Ｌ／Ｌ培地
４）濾過前、ｐＨを７．００〜７．２０に調整
５）濾過前、モル浸透圧濃度は２８０〜３２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである

接種後添加物：
栄養分供給培地
３％グルタミン溶液
グルコース溶液（５００ｇ／Ｌ）
１Ｍ炭酸ナトリウム溶液
２％消泡剤エマルジョン

栄養分供給培地の調製：
１）ＷＦＩ開始体積 総体積の７０％；開始温度３０〜４０℃
２）リスト（上記）に従い、各々の前の成分が完全に溶解するとすぐに、成分を１つずつ添加
３）ＷＦＩ残りの体積０．１７９Ｌ／Ｌ培地
４）濾過前、ｐＨを６．９０〜７．１０に調整
５）濾過前、浸透圧は１１８５〜１５８５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである

培地濾過：
プレフィルタ−０．２μｍフィルタ
最終フィルタ−０．１μｍフィルタ

抗体を、産生細胞株が最終的に誘導された安定なトランスフェクト細胞からプールした。プール由来材料をプロテインＡ−アフィニティークロマトグラフィーおよび他の精製技術により、以下で記載されるように精製した。

実施例３：抗体精製
プロテインＡは、ヒト化、ベニヤ化、またはキメラ９Ｅ４抗体の親和性精製のために使用される細菌タンパク質である。プロテインＡクロマトグラフィーは典型的には、澄んだ細胞培養上清をカラム上にｐＨ６−８にて通過させることを含み、この条件下では抗体が結合し、望まれない成分、例えば宿主細胞タンパク質、細胞培地成分、および推定ウイルスはカラムを素通りする。任意的な中間洗浄工程を実施して非特異的に結合した不純物をカラムから除去でき、続いて、ｐＨ２．５−４で生成物を溶離できる。それらの樹脂バックボーン組成に基づき分類されるプロテインＡ樹脂の型としては、ガラスまたはシリカ系、例えば、Ｐｒｏｓｅｐ ｖＡ、Ｐｒｏｓｅｐ ｖＡ Ｕｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；アガロース系、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；ならびに有機ポリマ系、例えば、ポリスチレン−ジビニルベンゼンＰｏｒｏｓ ＡおよびＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が挙げられる。いくつかの溶離バッファー成分、例えば酢酸、クエン酸、リン酸、アルギニンＨＣｌおよびグリシンＨＣｌを使用できる。

ウイルスは、数ある方法の中でも特に、低いｐＨでの処理または濾過により除去できる。現在のウイルス保持フィルタは非常に小さな細孔を有するウルトラフィルタまたはマイクロフィルタである。ウイルス濾過膜は親水性ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、親水性ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）および再生セルロースから製造される。

デプスフィルタは細胞培養ブロスの清澄化において使用され、膜フィルタ上の容量が維持され、またはクロマトグラフィーカラムまたはウイルスフィルタが保護される。デプスフィルタは典型的には、セルロース、珪藻土などの多孔性濾過助剤およびイオン荷電樹脂バインダから製造される。デプスフィルタはサイズ排除および吸着結合の両方を使用して分離を達成できる。

イオン交換クロマトグラフィーは、所定のバッファー系におけるそれらの正味荷電に基づきタンパク質に結合する正電荷または負電荷を持つ樹脂を使用する。高い特異度で標的抗体を結合し、放出する条件（例えば、ｐＨおよびイオン強度）を決定できる。反対に、抗体以外のほとんど全ての他の試料成分に結合する条件を見出すことができる。アニオン交換クロマトグラフィーは正電荷を持つ基（弱塩基性、例えばジエチルアミノエチル、ＤＥＡＥまたはジメチルアミノエチル、ＤＭＡＥ；または強塩基性、例えば四級アミノエチル、Ｑまたはトリメチルアンモニウムエチル、ＴＭＡＥまたは四級アミノエチル、ＱＡＥ）を使用する。

カチオン交換クロマトグラフィーは、負電荷を持つ官能基で修飾された樹脂を使用する。それらは強酸性リガンド、例えばスルホプロピル、スルホエチルおよびスルホイソブチル基または弱酸性リガンド、例えばカルボキシル基であってよい。カチオン交換クロマトグラフィーは、中性〜塩基性の範囲のｐＩを有する多くのｍＡｂに対する精製プロセスのために適用されている。抗体はローディング工程中に樹脂上に結合され、溶離バッファー中の導電率を増加させる、またはｐＨを増加させることにより溶離される。負電荷を持つプロセス関連不純物、例えばＤＮＡ、いくつかの宿主細胞タンパク質、浸出されたプロテインＡおよびエンドトキシンは、ロードおよび洗浄画分で除去される。カチオン交換クロマトグラフィーはまた、脱アミド生成物、酸化種およびＮ末端切断型、ならびに所望の抗体由来の高分子量種を分離できる。抗体のカチオン交換樹脂上での結合は、ｐＨおよび導電率、および樹脂の型に依存する。ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦおよびＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬは２つの一般的な市販樹脂である。

限外濾過は、抗体濃縮およびバッファー交換のための圧力駆動の膜プロセスである。限外濾過はサイズに基づく分離であり、この場合、膜細孔より大きな種は保持され、より小さな種は自由に通過する。限外濾過における分離は、所定の圧力駆動力下での、異なる成分の膜を横切る濾過率の違いにより達成される。バッファー交換はダイアフィルトレーションモードを用いて達成され、この場合、最終の所望の組成物のバッファーは残余分系に同じ速度で添加され、ここで、濾液は除去され、よって、一定の残余分体積が維持される。１〜２０ｎｍの範囲の膜細孔を有する限外濾過は、５００ダルトン〜１，０００キロダルトンの分子量の範囲の種の分離を提供できる。

９Ｅ４抗体生成物を収集濾液から、ｒＰｒｏｔｅｉｎ−Ａアフィニティークロマトグラフィーにより、ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ製のＭａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂を使用して捕獲した。生成物は、プロテインＡ樹脂に中性ｐＨで結合し、１００ｍＭ酢酸ナトリウムでのイソクラチックモードにてｐＨ３．０で溶離される。宿主細胞不純物および細胞培地成分のほとんどがこの工程中に低減される。半ＰＡＩＮバッファー（５００ｍＭ ＮａＣｌ、１．３４ｍＭＫＣｌ、４ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４×２Ｈ_２Ｏ、０．７３５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ４×２Ｈ_２Ｏ、０．１２５％ＰＶＰ＝コリドン１７、７．５％イソプロパノール、４．３ｍＭ ＮａＯＨ、２５０ｍＭ Ｌ−アルギニン−ＨＣＬ、ｐＨ７．４、導電率４５ｍＳ／ｃｍ）を用いた別の洗浄工程を実施し、カラム上に依然として残る成分を除去し、中和ＡＴ生成物プール中の濁度を最小に抑えた。プロテインＡ工程を、収集プールを同様のロードで分割することにより最大３のサイクルで実施した。カラムを、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４×２Ｈ２Ｏ、８．０３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏ １３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌを用いてｐＨ７．４±０．２および導電率１６±３ｍＳ／ｃｍに平衡化して貯蔵溶液を除去し、ローディングのためのカラムを準備した。カラムにその後、最大３０ｇ／Ｌの収集濾液をロードし、洗浄し（それぞれ、３バッファー、３カラム体積）、溶離した。溶離後、カラムを０．１Ｍリン酸によりストリッピングし、次のサイクルのために平衡化し、または、その後のサイクルが次の日に実施される場合、完全に再生して貯蔵する。０．１Ｍリン酸（ストリップ）、６Ｍ尿素および１Ｍ酢酸による完全再生を最後のサイクル後に実施する。

プールして０．２μｍ濾過したＭａｂＳｅｌｅｃｔ生成物プールを、１Ｍ酢酸によりｐＨ３．５に調整し（撹拌）、６０−７０分間室温でウイルス不活性化のためにインキュベートする（撹拌なし）。撹拌下での中和を、１Ｍトリス塩基の添加により実施し、ｐＨ５．５０±０．２０とする。

酸処理した生成物プールは直ちに、次の深層濾過工程に回される。Ｃｕｎｏ Ｚｅｔａ Ｐｌｕｓ ６０ＺＡによる深層濾過は、濁度の除去のための工程である。ウイルス不活性化された生成物プールを、０．２μｍＰＥＳ膜フィルタと直列の以上で言及されるデプスフィルタ材料から構成される二段階プロセスにより濾過する。

深層濾過生成物プールを、ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ製のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂を用いるアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）により、フロースルーモードでさらに精製した。ＡＥＸ工程は、残留宿主細胞ＤＮＡを低減し、ウイルスを除去する。カラムを、Ｑ平衡化バッファー（４２．８ｍＭトロメタモール−ＨＣｌ７．２ｍＭトリス塩基、３９ｍＭ ＮａＣｌ）によりｐＨ７．５０±０．２０および導電率８．０±１．０ｍＳ／ｃｍに平衡化して貯蔵溶液を除去し、ローディングのためのカラムを準備した。ローディング中、生成物はカラムを通って流れ、一方で不純物は樹脂に結合した。ローディング／溶離後、カラムをＱ平衡化バッファーで洗浄し、カラム上の移動相中に残る生成物を回収した。生成物回収後、カラムを再生して最後に保存した。

調整したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ生成物プールを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＰｏｒｏｓ ＨＳ５０を用いるカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によりさらに精製した。生成物は低塩濃度条件下で（３６．２ｍＭ ＣＨ_３ＣＯＯＮａ×３Ｈ_２Ｏ、１３．８ｍＭ ＣＨ_３ＣＯＯＨ、５８．５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．１、導電率８ｍＳ／ｃｍ）カラムに結合し、その後、イソクラチックモードで、高塩濃度条件下で（３８ｍＭ ＣＨ_３ＣＯＯＮａ×３Ｈ_２Ｏ、１２ｍＭ ＣＨ_３ＣＯＯＨ、２２８ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．１、導電率２５．５ｍＳ／ｃｍ）溶離した。中間の塩量（３７．２ｍＭ ＣＨ_３ＣＯＯＮａ×３Ｈ_２Ｏ、１２．８ｍＭ ＣＨ_３ＣＯＯＨ、１０２．５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．１、導電率１３．５ｍＳ／ｃｍ）による追加の洗浄工程を実施し、混入物質、例えば宿主細胞タンパク質、高分子量生成物バリアントおよび浸出されたプロテインＡを除去した。ＣＥＸ工程を最大２サイクルで実施した。そのような場合、調整したＡＥＸプールは２つの等体積に分けられ、個々にＣＥＸカラム上で処理される。

ウイルス濾過（ＶＦ）は、ウイルス粒子の除去のための第２の直交法を特定的に提供し、これは、２０ｎｍより大きな粒子（例えばパルボウイルス）を除去するように設計された。ウイルス濾過は、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ５０生成物プールの、直列の０．１μｍプレフィルタおよびウイルスフィルタ（Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎ、Ａｓａｈｉ Ｋａｓｅｉ）を通る圧力移動により、ナノフィルタを横切る１．０ｂａｒ圧力降下を用いて達成された。ウイルスフィルタの完全性試験を使用前（リークテスト）および使用後（リークテストおよび金粒子試験）に実施した。

ナノ濾過した生成物プールを、約２０ｇ／Ｌ（ＵＦ１）まで濃縮し、その後、≧６体積のダイアフィルトレーションバッファー（１７ｍＭ Ｃ_６Ｈ_５Ｎａ_３Ｏ_７×２Ｈ_２Ｏ、３ｍＭＣ_６Ｈ_８Ｏ_７×Ｈ_２Ｏ、ｐＨ６、導電率４ｍＳ／ｃｍ）に対して一定体積で透析濾過する。ダイアフィルトレーション後、プールを、約７５ｇ／Ｌ（ＵＦ２）まで濃縮した。最後に、残余分をＵＦ／ＤＦ系から、ダイアフィルトレーションバッファーでフラッシングすることにより除去し、約５２ｇ／Ｌの濃度（＝「３０ｋＤ生成物プール」）とした。

３０ｋＤ生成物プールを比４＋１で５倍トレハロース／Ｔｗｅｅｎ２０（ポリソルベート２０）スパイクバッファー（１７ｍＭ Ｃ_６Ｈ_５Ｎａ_３Ｏ_７×２Ｈ_２Ｏ、３ｍＭ Ｃ_６Ｈ_８Ｏ_７×Ｈ_２Ｏ、１１５０ｍＭトレハロース×２Ｈ_２Ｏ、１ｇ／Ｌポリソルベート２０、ｐＨ５．９、導電率１．０ｍＳ／ｃｍ）と混合し、製剤バッファー（１７ｍＭ Ｃ_６Ｈ_５Ｎａ_３Ｏ_７×２Ｈ_２Ｏ、３ｍＭ Ｃ_６Ｈ_８Ｏ_７×Ｈ_２Ｏ、２３０ｍＭトレハロース×２Ｈ_２Ｏ、０．２ｇ／Ｌポリソルベート２０、ｐＨ６．０、導電率３．３０ｍＳ／ｃｍ）で希釈し、４０．０±２．０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を得た。

バルク材料を、直列につながれた０．２μｍプールフィルタおよび０．２μｍバッグフィルタを通して濾過した。０．２μｍフィルタへの追加のプレフィルタが粒子除去のために実装され得る。０．２μｍプールフィルタを完全性に対して試験した。プールフィルタが試験で不合格な場合、各バッグフィルタを別々に、完全性に対して試験する。

実施例４：製剤開発
この実施例を通して、配列番号：２９の軽鎖配列および配列番号：３２の重鎖配列を有するヒト化９Ｅ４抗体を使用した。

物理化学的キャラクタリゼーション
可能性のある製剤成分の選択を容易にするために、ヒト化９Ｅ４抗体の熱（ｔｅｒｍａｌ）特性を決定した。示差走査熱量測定（「ＤＳＣ」）、直角光散乱（「ＲＡＬＳ」）および内部蛍光（「ＩＦ」）技術を分析で使用した。精製抗体を最初に１０℃から７１℃まで加熱し、その後７１℃から１０℃まで冷却し、その後再び１０℃から８３℃まで加熱し、その後再び、８３℃から１０℃まで、冷却し、最後に再び１０℃から９５℃まで加熱した。ＤＳＣサーモグラムから２つの転移が明らかになり、１番目は７１℃で、２番目は８３℃であった。図１を参照されたい。７１℃の転移は、実験条件下で可逆であった。ＲＡＬＳおよびＩＦサーモグラムにより、中間温度で単一の転移が明らかになった。

ｐＨ最適化
ヒト化９Ｅ４の安定性を次に、３．５〜８．０の範囲のｐＨ値を有する混合バッファー系で分析した。再び、ＤＳＣ、ＲＡＬＳ、およびＩＦ技術を分析において使用した。前述の様に、２つの転移がＤＳＣサーモグラムにおいて検出され（ｐＨ３．５で検出された第３の転移を除いて）および単一の中間転移がＲＡＬＳおよびＩＦサーモグラム（ｔｅｒｍｏｇｒａｍ）において検出された。ＤＳＣ分析における第１の熱転移は６．５のｐＨまでｐＨの増加と共に増加し、そこで、約７１℃で横ばい状態になった（表４、下記、および図２）。ＤＳＣ分析における第２の熱転移は５．０と６．５の間のｐＨで、約８３℃でピークとなった。ＲＡＬＳ分析における熱転移は、４．５−８．０のｐＨ範囲で約７７℃のままであり、ＩＦ熱転移は同じｐＨ範囲にわたり７５℃と７７℃の間で変動した（図２）。結果に基づき、５．５〜７．０のｐＨ範囲がヒト化９Ｅ４抗体に対して最大安定性を提供すると決定された。

バッファー選択
ヒト化９Ｅ４抗体に関するｐＨ依存性安定性の結果に基づき、非経口使用のために薬学的に許容され、ｐＨ５．５と７．０の間のｐＨ範囲で十分な緩衝能を提供できるバッファー系を同定した。これらのバッファー系は２０ｍＭクエン酸塩バッファー（ｐＨ５．５；６．０）、２０ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ６．０；６．５；７．０）、および２０ｍＭコハク酸塩バッファー（ｐＨ６．５）を含んだ。２０ｍＭコハク酸塩および２０ｍＭヒスチジンバッファー中でのヒト化９Ｅ４抗体の熱安定性をＤＳＣ、ＲＡＬＳ、およびＩＦにより試験した。ＤＳＣにより決定されるように、５．５と６．０の間のｐＨで、クエン酸塩バッファー中のヒト化９Ｅ４抗体は、ヒスチジンバッファー中のヒト化９Ｅ４抗体と比べて著しく高い第２の熱転移（Ｔｍ２）を示した（表５、下記）。反対に、６．５と７．０の間のｐＨで、ヒスチジンバッファー中のヒト化９Ｅ４抗体は、クエン酸塩バッファー中のヒト化９Ｅ４抗体と比べて、より高い第１の熱転移（Ｔｍ１）を示した。（表５）。ＲＡＬＳ技術を使用すると、ヒスチジン緩衝抗体について熱転移は検出されなかった。しかしながら、クエン酸塩で緩衝された抗体は、ｐＨ５．５および６．０で、７８℃で熱転移を示した。

コハク酸塩緩衝ヒト化９Ｅ４抗体（ｐＨ６．５）をまた、ＤＳＣおよびＲＡＬＳにより分析し、結果をクエン酸塩緩衝（ｐＨ６．５）およびヒスチジン緩衝（ｐＨ６．５）抗体と比較した。ＤＳＣ分析では、クエン酸塩およびコハク酸塩バッファー中の第２の熱転移（Ｔｍ２）は、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｎｄｅ）バッファー中よりもおよそ１℃高く、試験された条件下でのタンパク質のわずかに高い安定性が示された。ｐＨ６．５のコハク酸塩およびクエン酸塩バッファーに関し、ＲＡＬＳにより同等な転移温度が検出された。

これらの研究結果に基づき、２０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６．０）および２０ｍＭコハク酸塩（ｐＨ６．５）バッファーを、凍結乾燥医薬品を生成させ、その長期安定性を試験するのに使用するために選択した。

糖／ポリオール選択
フリーズドライ製剤におけるヒト化９Ｅ４抗体の安定性を増加させることを目的に、抗体の熱安定性に対する糖およびポリオールの影響を分析した。評価した糖／ポリオールはトレハロース、スクロース、またはスクロースおよびマンニトールの混合物を含んだ。２４０ｍＭトレハロース、２４０ｍＭスクロース、および５０ｍＭスクロース／２００ｍＭマンニトールをそれぞれ、２０ｍＭコハク酸塩（ｐＨ６．５）、２０ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．５）、および２０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６．５）バッファーに添加した。ヒト化９Ｅ４抗体の安定性をその後、ＤＳＣにより、製剤の各々について評価した。ＤＳＣ結果により、様々な糖／ポリオールが、第１および第２の熱転移をより高い温度にシフトさせたことが明らかになり、安定化効果が示された（表６、下記）。しかしながら、トレハロース製剤が一貫して最も高い熱転移を有した（表６）。加えて、ヒスチジン製剤における第２の転移温度（Ｔｍ２）はクエン酸塩およびコハク酸塩製剤よりも低かった（表６）。

ＲＡＬＳ測定もまた、様々な糖／ポリオールを用いて、コハク酸塩またはクエン酸塩バッファー（ｐＨ６．５０）中で製剤化されたヒト化９Ｅ４抗体に対して実施した。コハク酸塩バッファーでは、２４０ｍＭトレハロース製剤は最も高い転移温度（７７℃）を有し、２４０ｍＭスクロース製剤は中間転移温度（７６℃）を有し、５０ｍＭスクロース／２００ｍＭマンニトール製剤は最も低い転移温度（７５℃）を有した。クエン酸塩バッファーでは、２４０ｍＭトレハロース製剤および５０ｍＭスクロース／２００ｍＭマンニトール製剤は同じ転移温度（７８℃）を有し、２４０ｍＭスクロース製剤はより低い転移温度（７７℃）を有した。クエン酸塩製剤に関する熱転移でのたった１℃の差は試験変動性内であった。

界面活性剤
熱安定性に対するポリソルベート２０（「ＰＳ２０」）の効果をＤＳＣを使用して試験し、ヒト化９Ｅ４抗体の転移温度に影響しないことが決定された。しかしながら、ＰＳ２０のプラス効果が振盪ストレスに関して観察された。２つの製剤を、振盪ストレスに対するそれらの反応に関して試験した：（Ａ）２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６．０、２３０ｍＭトレハロース、０．０２％（ｗ／ｗ）ＰＳ２０；ならびに（Ｂ）２５ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６．０、２３０ｍＭトレハロース。ＰＳ２０を有する製剤（製剤Ａ）は、より低い程度の泡形成および２４時間の振盪後であっても一定の濁度レベルを提供した。製剤Ｂは強い泡形成を有し、３時間の振盪後に濁度が増加した。いずれの製剤でも、振盪研究中、視認可能な粒子の生成は得られなかった。

次に、振盪により誘導される製剤濁度に対するＰＳ２０の効果を評価した。製剤Ａの濁度は２４時間の振盪後であっても増加しなかった。対照的に、製剤Ｂの濁度はほとんど２倍となり、振盪前１７ＦＮＵ（ホルマジン比濁分析単位）から、２４時間の振盪後３２ＦＮＵに増加した（表７）。

振盪前後の抗体凝集の測定は同様にＰＳ２０の安定化効果を証明する。製剤ＡおよびＢ中の単量体抗体および凝集した抗体の量を、高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）により、振盪前、振盪の３、６、および２４時間後に評価した。製剤Ａ中のＰＳ２０の存在は、凝集した抗体の量のわずかな増加（０．２％）（表８）および単量体抗体の量の対応する減少（０．２％）（表９）と相関した。対照的に、製剤Ｂ（ＰＳ２０あり／なし）は、凝集した抗体の４倍高い増加を示し（表８）、それに応じて単量体抗体の量の高められた減少（０．９％）を示した（表９）。

このように、振盪研究の結果により、ＰＳ２０は、ヒト化９Ｅ４抗体製剤において濁度および抗体凝集の望ましくない増加を防止することが明らかになった。

凍結乾燥実行可能性研究
前記分析に基づき、製剤１−４（表１０、下記）をヒト化９Ｅ４抗体の凍結乾燥形態での貯蔵の実行可能性を評価するために選択した。

凍結乾燥サイクルを開発する際の初期工程として、凍結したＦ１−Ｆ４製剤の熱特性を研究した。Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＤＳＣ ８２１機器を使用して、製剤の各々のガラス転移（Ｔｇ’）温度を決定した。下記凍結／解凍サイクルの間測定を実施した：
凍結：５Ｋ／分で５℃から７０℃まで。
保持：−７０℃で３分。
加熱：５Ｋ／分で−７０℃から２５℃まで。
表１１はこのように同定されたガラス転移温度を列挙する。製剤２および４（スクロースおよびマンニトールを含む）はトレハロース製剤と比べてより低いＴｇ’を示し、一方、異なるバッファーの使用はＴｇ’に著しく影響しなかった。それらのより高いＴｇ’のために、トレハロース製剤（製剤１および３）は一次乾燥中、より高い製品温度に耐えることができ、これはフリーズドライプロセスにとって好ましい。

決定したガラス転移温度に基づき、２つの異なる凍結乾燥サイクルを開発し、試験した。第１のサイクルは、−１０℃（棚温度）で実施される一次乾燥工程を含む（表１２）。第２のサイクルにおける一次乾燥工程は、−２０℃（棚温度）で実施する（表１３）。

凍結乾燥実行可能性研究を小規模で、Ｅｐｓｉｌｏｎ ２−１２Ｄ、ＧＴ−１２−Ｂ凍結乾燥機（Ｃｈｒｉｓｔ）を用いて実施した。０．２μｍ濾過後、製剤化された抗体の５．４ｍｌ±０．２ｍｌアリコートを２０ｍｌバイアルに添加した（Ｉ型透明ガラスバイアル、２０／２５ｍＬ、Ｂｌｏｗ Ｂａｃｋ、Ｓｃｈｏｔｔ製）。得られたバイアルは５．０ｍｌの公称充填容積および２００ｍｇ／バイアルの公称投与量を有した。凍結乾燥後の意図される再構成体積は５．０ｍｌ水であった。バイアルを手作業で凍結乾燥機にロードし、サイクル１またはサイクル２に従い凍結乾燥した。製品温度をバイアルに入れたＰＴ１００センサを使用してモニタした。サイクルをずれなく実施した。製剤を水の結晶化前に−６．５℃の最低温度まで過冷却し、その後、製剤を−５０℃まで凍結させた。一次乾燥相では、０．１０ｍｂａｒの真空（キャパシタンスマノメータ）を、−１０℃（サイクル１）または−２０℃（サイクル２）の棚温度で適用した。サイクル１では、これらのパラメータにより、昇華中−２８℃〜−２５℃の平均製品温度が得られた。サイクル２では、これらのパラメータにより昇華中−３０℃未満の平均製品温度が得られた。一次乾燥の実際の持続期間は両方のサイクルで約４０時間であった。一次乾燥後、棚温度を３０℃（二次乾燥）まで増加させ、未凍結水の脱離を可能にした。二次乾燥相は、凍結乾燥製剤が約１％の最終水分レベルを有するという目的で、８時間の期間に設定した。凍結乾燥後、バイアルに栓をし（Ｓｔｅｌｍｉ Ｃ１４０４ ６７２０ＧＣ ６ ＴＰ３、２０ｍｍ）、密閉した（アルミニウムフリップオフシール、２０ｍｍ）。

トレハロース含有製剤は凍結乾燥後完全にアモルファスとなり、いくらかの縮みを示した。対照的に、マンニトール含有製剤は部分的に結晶であり、縮みを示さなかった。製剤全てについてケーキ高さは約１１ｍｍであった。ケーキ質量は約６８５ｍｇ（Ｆ１）、５１６ｍｇ（Ｆ２）、７００ｍｇ（Ｆ３）、および５２０ｍｇ（Ｆ４）であった。全ての製剤で、ケーキは淡黄色を有した。

水分レベル、再構成時間、顕微鏡でないと見えない粒子の数を含む、サイクル１およびサイクル２により生成された凍結乾燥製剤の特性を分析し、比較した。表１４（下記）を参照されたい。加えて、凍結乾燥製剤の品質を、凍結乾燥前の製品品質と比較した。試験した追加の特性としては、透明性、ｐＨ、モル浸透圧濃度、モノマー対凝集物の量、密度、ＨＩＣパターン、および活性（データ示さず）が挙げられる。全体としては、製品品質に対するマイナス影響は、凍結乾燥および再構成後に観察されず：製品外観、色、視認可能な粒子レベル、透明性、ｐＨ、モル浸透圧濃度、タンパク質量、モノマ量、ＨＩＣパターン、および活性は凍結乾燥プロセスにより著しく変化しなかった。さらに、サイクル１（１００−１４０秒）およびサイクル２（１００−１７０秒）の両方により凍結乾燥した製剤に関する再構成時間は許容可能であり、かつ測定された顕微鏡でないと見えない粒子レベルは薬局方規格未満であった。

凍結乾燥サイクル２が、マンニトールおよびスクロースを含む製剤に対するより長い再構成時間およびわずかに高い顕微鏡でないと見えない粒子レベル（２−１０μｍ）をもたらすという傾向のため、サイクル１の改定に基づく凍結乾燥サイクルを促進安定性研究での使用のために選択した。改定された凍結乾燥サイクルは６０時間ではなく４０時間のより短い一次乾燥相（工程８）、８時間ではなく１２時間の延長した二次乾燥相（工程１０）を含んだ。凍結乾燥製剤中の水分レベルをさらに低減させるためにより長い二次乾燥相が含まれた。

凍結乾燥製剤の促進安定性研究
製剤Ｆ１−Ｆ４（表１０で示される、上記）を、表１５で示される凍結乾燥サイクル（下記）を使用したことを除き、以上で記載される通り凍結乾燥した。促進安定性研究では、凍結乾燥製剤を４０℃にて、７５％相対湿度（ＲＨ）で、１、２、または３ヶ月の期間貯蔵した。貯蔵後、製剤を水（５．０ｍｌ）で再構成し、再構成された製剤の特性を調査し、凍結乾燥の直後に再構成した製剤の特性（「初期値」）と比較した。

凍結乾燥製剤のケーキ色は淡黄色であり、凍結乾燥実行可能性研究における観察と一致した。ケーキ外観は全ての場合において許容可能であり、トレハロース製剤（Ｆ１＆Ｆ３）は、凍結乾燥製品のアモルファス特性（Ｘ線粉末回折により確認）により縮む傾向があった。マンニトール（ｍｏｎｎｉｔｏｌ）含有凍結乾燥製剤（Ｆ２＆Ｆ４）は部分的に結晶であり、本質的に縮みを示さなかった。ケーキ外観および製剤の色は３ヶ月間の４０℃での貯蔵にわたって変化しなかった。

再構成前の凍結乾燥製剤の水分レベルは４０℃では３ヶ月後に著しく変化しなかった。凍結乾燥直後の製剤では水分レベルは０．９０％〜１．３６％の範囲であり；３ヶ月後、それらは０．８４％〜１．４７％の範囲であった。表１６（下記）を参照されたい。同じ製剤の異なる試料において観察された水分レベルの違いは、試験方法の変動に起因する。しかしながら、スクロースおよびマンニトールを含む製剤は、一貫してトレハロースを含む製剤よりも、高いレベルの水分を含んだ。

凍結乾燥製剤の全てについて再構成時間は許容可能であり、４９〜９７秒で変動した。再構成製剤の全ての外観は同等であり、４０℃では３ヶ月後であっても視認可能な粒子はなかった。加えて、製剤の色は、前凍結乾燥製剤と比べて、同じ期間にわたって不変のままであった（＜ＢＹ５）。

タンパク質濃度、モル浸透圧濃度およびｐＨにおいて関連する変化は、４０℃での３ヶ月後、製剤のいずれについても観察されなかった（データ示さず）。しかしながら、濁度における増加差異が観察された。表１７で示されるように（下記）、マンニトール含有製剤（Ｆ２＆Ｆ４）は、濁度のより大きな増加を示した（３ヶ月にわたって６−７ＦＮＵ）が、トレハロース含有製剤（Ｆ１＆Ｆ３）はより小さな増加を示した（たった２ＦＮＵ）。

再構成された製剤中の顕微鏡でないと見えない粒子をマイクロフローイメージング（ＭＦＩ）法により測定した。２つの個々の試料を製剤および時間点毎に測定した。凍結乾燥直後（すなわち、４０℃での貯蔵なし）の製剤再構成に関し、顕微鏡でないと見えない粒子のレベルを表１８（下記）に示し、対応する棒グラフを図３に示す。１ヶ月、２ヶ月、または３ヶ月間４０℃で貯蔵された製剤中で検出される顕微鏡でないと見えない粒子のレベルを表１９−２１に、それぞれ示し（下記を参照されたい）、対応する棒グラフを図４−６に、それぞれ示す。

ＭＦＩ分析により、試験した製剤中の顕微鏡でないと見えない粒子レベルは凍結乾燥直後には同等であったが、マンニトールおよびスクロース含有製剤（Ｆ２およびＦ４）中のレベルは、１ヶ月後に劇的に増加し、その後、増加し続けたことが明らかになった。その結果、製剤２は、ちょうど１ヶ月後に、１０ミクロン以上の顕微鏡でないと見えない粒子（≧１０．００μｍ）および２５ミクロン以上の顕微鏡でないと見えない粒子（≧２５．００μｍ）に関する薬局方限度を超え、製剤４は２ヶ月の４０℃での貯蔵後に顕微鏡でないと見えない粒子に関する薬局方限度を超えた。対照的に、トレハロース含有製剤（Ｆ１およびＦ３）は粒子形成の著しい増加を示さず、４０℃で少なくとも３ヶ月の間、顕微鏡でないと見えない粒子に関する薬局方限度未満のままであった。

４つの製剤中の顕微鏡でないと見えない粒子をまた、２ヶ月の４０℃での貯蔵後に光オブスキュレーション（ｏｂｓｃｕｒａｔｉｏｎ）により測定した。光オブスキュレーションは、ＭＦＩ測定とは異なる結果を与えることが知られている技術であり、典型的にはより低くなる傾向がある。表２２で示される（下記）ように、製剤２は、光オブスキュレーションにより検出される最も高いレベルの顕微鏡でないと見えない粒子を有し、一方、他の製剤はより低い、より同等なレベルの顕微鏡でないと見えない粒子を有する。

製剤をまた、高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）により分析し、凍結乾燥状態で４０℃での貯蔵後の凝集およびモノマー形態の抗体のパーセンテージを決定した。表２３で示されるように（下記）、凝集した抗体のパーセンテージは、マンニトールおよびスクロース含有製剤において２．５％〜４．４％だけ増加したが、一方、トレハロース含有製剤ではほんの１．０％〜１．１％だけの増加となった。凝集した抗体のレベルが製剤中で増加するにつれ、単量体抗体のパーセンテージはそれに応じて減少した。表２４を参照されたい。製剤および４０℃での貯蔵の時間の関数としての単量体抗体の量のグラフ表示を図７に示す。

製剤をまた、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により、それらの４０℃での貯蔵にわたって特徴付けた。各製剤に関して、プレピーク（比較的親水性）、主ピーク、およびポストピーク（比較的疎水性）をＨＩＣにより検出できる。時間に伴うタンパク質構造の変化は、起こるピークの各々の面積変化によりモニタできる。ＨＩＣ分析の結果を表２５−２７で示す（下記）。プレピークの面積の変化は、製剤の各々に関して同等であった。主ピークおよびポストピーク面積の変化はより著しく、トレハロース含有とマンニトール／スクロース含有製剤の間で異なった。特に、マンニトール／スクロース含有製剤（Ｆ２およびＦ４）は、３ヶ月の貯蔵期間にわたって、それぞれ、主ピーク面積において８．４％および５．４％減少を示した。対照的に、トレハロース含有製剤（Ｆ１およびＦ３）は同じ期間にわたって、それぞれ、主ピーク面積において４．７％および４．５％減少を示した。以前はマンニトール／スクロース含有製剤の主ピークにあったタンパク質のほとんどが疎水性ポストピークへシフトし、製剤Ｆ２およびＦ４のポストピーク面積は、それぞれ、６．４％および４．６％だけ増加した。

製剤をまた、等電点電気泳動およびキャピラリーイメージング（ｉＣＥ）により特徴付けた。製剤の各々は３つのピークパターンを示し、酸性ピーク、主ピーク、および塩基性ピークを含んだ。表２８で示されるように、製剤１はピークパターンにおいて、３ヶ月の４０℃での貯蔵中、最小の変化を示し、一方、製剤２−４は塩基性ピーク面積において、時間に伴い大きな増加を示した。

製剤の各々における抗体の抗原結合活性もまた、調査した。抗体は、３ヶ月の４０℃での貯蔵を通して、製剤に関係なく、高い抗原結合活性を保持した。

製剤をまた、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ処理）中の凝集物形成に関して試験した。製剤３は最小量の凝集物形成を示し、製剤２は最大を示し；製剤１および４は中間量の凝集を示した（データ示さず）。

促進安定性データの全てを考慮すると、製剤Ｆ１およびＦ３は、３ヶ月の貯蔵後、製剤Ｆ２およびＦ４と比べて優れた安定性を示す。これは、製剤Ｆ２およびＦ４（マンニトール／スクロース含有製剤）が、濁度、ＨＰ−ＳＥＣ、顕微鏡でないと見えない粒子、ＨＩＣ、およびｉＣＥにより検出されるように、比較的不十分な安定性を示すという事実を反映している。製剤Ｆ１およびＦ３を比較すると、１つの著しい違いは、Ｆ１は、限外濾過／ダイアフィルトレーション処理中、Ｆ３よりもわずかに多い凝集物を生成する傾向があるということである。そのため、Ｆ３を好ましい製剤として選択した。

凍結解凍に関する製剤安定性
製剤Ｆ３を、その凍結解凍に関してヒト化９Ｅ４抗体を安定化させる能力について次に試験した。この目的を達成するために、ヒト化９Ｅ４抗体を精製し、製剤Ｆ３中で再懸濁した。ヒト化９Ｅ４を４０ｍｇ／ｍｌで含む２０ｍｌのＦ３をその後、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｆｌｅｘｂｏｙ ３０ｍｌバッグに充填し、バッグを−４０℃で凍結した。５サイクルまでの凍結／解凍サイクルを１バッグにつき実施した。製剤Ｆ３中のヒト化９Ｅ４抗体の分析試験を凍結前ならびに１、３および５凍結／解凍サイクル後に実施した。３サイクルまでの凍結−解凍サイクル後では、著しい変化は検出されなかった。５凍結／解凍サイクル後、凝集した抗体のレベルのわずかな増加（０．２％）が検出され、ＨＩＣおよびｉＣＥパターン（ｐａｔｔｅｒｓ）の小さな変化が観察された。全ての他のアッセイ結果、例えば、色および視認可能な粒子の目視検査（ｖｉｓｕａｌ ｉｎｓｅｐｅｃｔｉｏｎ）、透明性、ＵＶ走査、ＨＰ−ＳＥＣ、浸透圧、ｐＨ、顕微鏡でないと見えない粒子数、および抗体活性は、５凍結−解凍サイクル後変化しなかった。

形態および細部の様々な変更がそれらにおいて、本発明の精神および範囲から逸脱せずに可能である。文脈から別様に明らかにならない限り、任意の実施形態、態様、要素、特徴、工程などは他と組み合わせて使用できる。引用と関連する情報が時間と共に変化する可能性がある場合、最も早い有効出願日での引用と関連する情報が意味され、引用のための最も早い有効出願日は、本出願または引用を開示するより早い優先出願の出願日を意味する。この明細書本体内で引用される全ての参考文献、登録特許および特許出願は、これにより、その全体が、全ての目的のために、参照により組み込まれる。任意の実施形態、態様、特徴、要素、工程などは、文脈により別様に示されない限り、他と組み合わせることができる。組成物がある一定の特定成分を含むように言われる場合、出願は、文脈により別に要求されない限り、選択的に、組成物は、特定成分から構成され得る、または本質的に構成される得ることを開示すると、読まれるべきである。例えば、抗体鎖が特定された配列番号を含むアミノ酸配列を有するように言われている場合、文脈により別に要求されない限り、選択的に、抗体鎖は、配列番号から構成できる、または本質的に構成できると理解されるべきである。

Claims (3)

1. ＣＨＯ細胞から発現され、配列番号：２９を含むアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号：３２を含むアミノ酸配列を有する重鎖（Ｃ末端リジンありまたはなし）と、を含む抗体を精製する方法であって、
   （ａ）前記抗体を発現する細胞由来の培地をプロテインＡカラム上にローディングし、前記抗体を前記カラムに結合させ、およびｐＨを６〜８から２．５〜３．５に低減して前記抗体を含む画分を溶離すること、
   （ｂ）工程（ａ）からの画分を酸性条件下でインキュベートしてウイルスを不活性化すること、
   （ｃ）工程（ｂ）後の前記画分を深層濾過に供して粒子を低減すること、
   （ｄ）前記抗体を含む工程（ｃ）から得られた濾液を、ｐＨ７．５０±０．２０および導電率８．０±１．０ｍＳ／ｃｍに平衡化された第４級アンモニウム官能基で修飾された樹脂においてアニオン交換固相クロマトグラフィーに供し、前記画分中の不純物を前記カラムに結合させ前記抗体を前記カラムから溶離させること、
   （ｅ）前記抗体を含む工程（ｄ）由来の画分を、ｐＨ５．１±０．２０および導電率８±１．０ｍＳ／ｃｍに平衡化されたスルホプロピル官能基で修飾された樹脂においてカチオン交換固相クロマトグラフィーに供し、前記抗体を前記カラムに結合させ塩濃度を上げることにより溶離させること、
   （ｆ）前記抗体を含む工程（ｅ）からの画分をウイルス濾過に供すること、ならびに
   （ｇ）工程（ｆ）からの前記抗体を含む濾液を限外濾過／ダイアフィルトレーションに供して前記抗体を濃縮し再懸濁すること
   を含む、方法。
2. 工程（ｂ）はｐＨ３．５で実施される、請求項１に記載の方法。
3. 工程（ｆ）におけるフィルタは０．１ミクロンフィルタである、請求項１に記載の方法。

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