JP2022531979A - 神経系における抗原結合タンパク質の発現 - Google Patents

Abstract

２価結合メンバーを発現する組換えベクター、およびベクターを使用し、神経系の細胞を改変して、神経疾患、例えば、神経変性疾患を有する患者の脳において結合メンバーを発現させる方法を本明細書において提供する。

Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにより電子的に提出された配列表を含み、その全体を参照によって本明細書に組み入れられる。２０２０年４月３０日に作成されたこのＡＳＣＩＩコピーは、０２２５４８＿ＷＯ０６０＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられており、７，６１２バイトのサイズである。

アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶障害および認知機能の低下を生じる進行性神経変性により特徴づけられる。この病理学的特徴は、細胞外アミロイドプラークおよび神経細胞内タウ線維の蓄積を含む。アミロイドベータ（Ａβ）を標的とする療法は、ＡＤにおける遺伝学的および病理学的関与のため長年、活発な調査の途上にある（非特許文献１）。アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）およびＡβのレベルの上昇は、ＡＤ病態形成と関連するが、Ａβペプチドは、種々の立体構造および線維状態で存在し、治療的利点のためにいずれの種を標的とすべきか、は不明である（非特許文献２）。

この不確実性にもかかわらず、Ａβの種々の形態に対する受動免疫療法は、臨床において大規模に試験されているが、このような手法は、さらなる問題により阻まれている。第１に、血液脳関門（ＢＢＢ）によって大型生体分子の輸送が制限され、脳において治療上適切なレベルに達するのに、末梢における高用量の注射が必要とされる。高用量では、臨床試験において、いくつかの抗Ａβ抗体によって、アミロイド関連画像異常（ＡＲＩＡ）に代表される有害反応が生じたが、このような有害反応は、血管アミロイド部位における抗体の蓄積により生じ、Ｆｃ依存性エフェクター機能により局所炎症を引き起こすと考えられる（非特許文献３）。第２に、最小治療用量を超えるレベルを維持する必要性が存在し、患者の協働および服薬遵守、ならびに著しい実質的経済負担を必要とする長期の受動免疫療法が必要とされる。

中枢神経系（ＣＮＳ）への遺伝子導入により、神経細胞における治療タンパク質の生成が可能となり、これによりＢＢＢを回避する。全免疫グロブリン（ＩｇＧ）または一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のいずれかのＡＡＶ媒介発現がＣＮＳにおいて試みられているが、このような手法の両方は、固有の限界を有している（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。ＣＮＳにおけるＩｇＧの重および軽鎖発現のみが、単一プロモーターカセットから両鎖を生成する自己切断Ｆ２Ａ配列を使用して達成されている。Ｆ２Ａペプチドは、重または軽のいずれかの鎖に結合したままとなり、潜在的に免疫原性である（非特許文献１１）。一方、ｓｃＦｖタンパク質の遺伝子に基づく送達は、結合価が低下するため、親和性の実質的低下を伴うことが多い。また、Ｆｃ領域を除去すると、ＦｃＲｎ結合が減少して、末梢において半減期が短縮され、逆トランスサイトーシスにより脳からの抗原（Ａｇ）結合ｓｃＦｖの流出が減少する（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）。したがって、ＣＮＳ疾患、例えば、アルツハイマー病のための抗体療法は、有望であるが、治療タンパク質を罹患脳に導入する問題により制限されている。よって、抗体に基づく療法のために中枢神経系へのアクセスを向上させる必要性が存在する。

ＴｃｗおよびＧｏａｔｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ．（２０１７）７（６）：ｐｉｉ ａ０２４５３９ Ｂｅｎｉｌｏｖａら、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２０１２）１５：３４９～５７ Ｍｏら、Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｎｅｕ．（２０１７）４：９３１～４２ Ｓｕｄｏｌら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２００９）１７：２０３１～４０ Ｒｙａｎら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２０１０）１８：１４７１～８１ Ｌｅｖｉｔｅｓら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００６）２６：１１９２３～２８ Ｌｅｖｉｔｅｓら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２０１５）３５：６２６５～７６ Ｋｏｕら、ＪＡＤ．（２０１１）２７：２３～３８ Ｆｕｋｕｃｈｉら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏ Ｄｉｓ．（２００６）２３：５０２～１１ Ｌｉｕら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２０１６）３６：１２４２５～３５ Ｓａｕｎｄｅｒｓら、Ｊ Ｖｉｒ．（２０１５）８９：８３３４～４５ Ｄｅａｎｅら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００５）２５：１１４９５～５０３ Ｂｏａｄｏら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．（２００７）１８：４４７～５５ Ｚｈａｎｇら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍ．（２００１）１１４：１６８～７２ Ｓｃｈｌａｃｈｅｔｚｋｉら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（２００２）８１：２０３～６

本開示では、神経系の細胞において２価結合メンバーを発現させる方法であって、抗体重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）、抗体軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）およびＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドをコードする発現カセットを細胞に導入する工程を含む、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌが、標的タンパク質に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチドの２つの分子が、細胞内で発現すると、標的タンパク質に特異的なジスルフィド結合ホモ２量体２価結合メンバーを形成する、方法を提供する。

一部の実施形態では、神経系の細胞は、ニューロン、グリア細胞、上衣細胞または脳上皮細胞である。さらなる実施形態では、グリア細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、周皮細胞、シュワン細胞および小グリア細胞から選択される。一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト患者の脳における細胞である。

一部の実施形態では、標的タンパク質は、脳において発現されるタンパク質であり、アミロイドベータペプチド（Ａβ）、タウ、ＳＯＤ－１、ＴＤＰ－４３、ＡｐｏＥまたはαシヌクレインであり得る。

一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に（ｉ）Ｖ_Ｈ、ペプチドリンカーおよびＶ_Ｌ；またはＶ_Ｌ、ペプチドリンカーおよびＶ_Ｈ、ならびに（ｉｉ）ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む。さらなる実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳの配列（配列番号３）を含み、例えば、ペプチドリンカーは、［Ｇ_４Ｓ］_３の配列（配列番号２）を有する。

一部の実施形態では、本開示の２価結合メンバーは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合するが、ＩｇＧ Ｆｃ領域における１つまたはそれ以上の変異のため、Ｆｃガンマ受容体には結合しない。

一部の実施形態では、本方法は、発現カセットを含むウイルスベクターを投与する工程を含む。ウイルスベクターは、組換えウイルスベクターであり得る。さらなる実施形態では、組換えウイルスは、頭蓋内注射、くも膜下腔内注射または大槽内注射により患者の脳に導入される。組換えウイルスは、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、例えば、血清型１または２のｒＡＡＶであり得る。

一部の実施形態では、ポリペプチドの発現は、構成的活性プロモーターまたは誘導性プロモーターの転写制御下にある。

本方法は、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、脳アミロイド血管症、シヌクレイン病、タウオパシーまたは筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する患者を治療するために使用し得る。

別の態様では、本開示の２価結合メンバーを発現する本明細書に開示のウイルスベクターを含む治療有効量の組成物を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、神経変性疾患を治療する方法を本開示において提供する。

別の態様では、それを必要とする患者の治療における使用のための２価結合メンバー、およびそれを必要とする患者の治療のための医薬の製造のための２価結合メンバーの使用を本開示において提供し、ここで、患者は、例えば、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、脳アミロイド血管症、シヌクレイン病、タウオパシーまたはＡＬＳを有する。

本発明の他の特徴、対象および利点は、以下の詳細な説明により明らかである。しかし、この詳細な説明が本発明の実施形態および態様を指示しているが、制限ではなく例示のみの目的で示されていることが理解されるべきである。本発明の範囲内の種々の変化および改変は、この詳細な説明から当業者に明らかとなるであろう。

ＡＡＶ－ＩｇＧベクターの構築および特性決定を示す図である。重および軽鎖の十分な発現のためのベクターデザインを示す。ゲノムのサイズを示す。 ＡＡＶ－ＩｇＧベクターの構築および特性決定を示す図である。左パネルは、ＰＢＳ注射対照マウスから測定したｈｕＩｇＧと比較した場合の、脳からのＡＡＶ－αＡβＩｇＧの耐久的発現および分泌を示す。グラフに描いた点は、平均値＋／－ＳＥＭを表し、１群あたりｎ＝８マウスである。右のパネルは、脳におけるＡＡＶ－αＡβＩｇＧ対伝統的末梢投与αＡβＩｇＧのＡＡＶ媒介発現の動態を示す。グラフは、平均値＋／－ＳＥＭを示す。＊＊ｐ＜０．０１、注射から７週後の一元配置分散分析、１時点あたりｎ＝５マウス。 ＡＡＶ－ＩｇＧベクターの構築および特性決定を示す図である。ｈｕＩｇＧ導入遺伝子を海馬の至る所に発現するニューロンのカラー顕微鏡写真を示し（ＣＡ２は詳細を示す）、一部の近くのＧＦＡＰ＋アストロサイトもｈｕＩｇＧを発現している。Ｃｃ＝脳梁。緑色：ヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）。赤色：グリア細胞線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）。青色：ＤＡＰＩ。 アルツハイマー病のマウスモデルにおけるＡＡＶ－αＡβＩｇＧによる抗原結合を示す図である。頭蓋内（ＡＡＶ－αＡβＩｇＧまたはＡＡＶ－ＩｇＧ対照）および末梢投与量（αＡβＩｇＧ）の試験デザインを示す。 アルツハイマー病のマウスモデルにおけるＡＡＶ－αＡβＩｇＧによる抗原結合を示す図である。海馬および覆っている皮質の至る所におけるＡＡＶ－αＡβＩｇＧまたはＡＡＶ－ＩｇＧ対照の発現を示す。右パネルの画像は、前頭皮質におけるプラークへのＩｇＧ結合を示す。スケールバー＝１０μｍ。青色：ＤＡＰＩ。緑色：ｈｕＩｇＧ。赤色：４Ｇ８＋ＧＦＡＰ。 ＡＡＶ－αＡβＩｇＧ神経細胞発現および神経毒性の評価を示す図である。左パネルは、ＰＢＳを注射した動物（偽）と比較した、ＡＡＶ－αＡβＩｇＧを注射したＳＣＩＤマウスの半脳ライセート、またはＡＡＶ－αＡβＩｇＧ群におけるレベルと等価なレベルのｈｕＩｇＧを添加した偽脳ホモジネートのｈｕＩｇＧ重および軽鎖から検出したペプチドを示す。右パネルは、ＳＣＩＤマウスにおいて中枢的または末梢的に発現した全ｈｕＩｇＧと比較した、機能性ｈｕＩｇＧの定量を示す。データは、平均値＋／－ＳＥＭとして提示する。＊＊ｐ＜０．０１、独立ステューデントｔ検定。 ＡＡＶ－αＡβＩｇＧ神経細胞発現および神経毒性の評価を示す図である。左パネルは、１６週間の海馬内ＡＡＶ－αＡβｍｓＩｇＧ発現後のＣ５７ＢＬ／６マウス脳海馬のＨ＆Ｅ染色をＰＢＳ対照と比較して示す。挿入図は、詳細を示し、矢印は、代表的ヒアリン包含を指す。スケールバー＝１００μｍ。結果は、右パネルの表に、この病態の有無で点数化した動物の数として要約する。 ＡＡＶ－αＡβＩｇＧ神経細胞発現および神経毒性の評価を示す図である。免疫組織化学的（ＩＨＣ）グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）解析による神経炎症の証拠をＰＢＳと比較して示す。左パネルは、ＧＦＡＰ＋領域についての定量的ＩＨＣを示す。右パネルでは、各円は、１匹のマウスを表す。バーは、ＰＢＳに対して正規化したＧＦＡＰ＋領域の群平均値＋／－ＳＥＭを示す。＊＊＊ｐ＜０．００１、独立ステューデントｔ検定、１群あたりｎ＝８マウス。 ＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧベクターの構築および特性決定を示す図である。左パネルは、ｓｃＦｖ－ＩｇＧデザインの模式図を示す。中央パネルは、精製ｓｃＦｖ－ＩｇＧの還元または非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析により、タンパク質の純度および適切なジスルフィド依存性２量体形成が実証されたことを示す。右パネルの表では、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ対ＩｇＧフォーマットの抗原結合親和性（Ｍ）を比較する。 ＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧベクターの構築および特性決定を示す図である。左パネルは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのＡＡＶの末梢ＩＶ注射から１か月後に抗原酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した場合のＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧの血清発現を示す。右パネルは、ＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧの脳発現を示す。＊＊＊ｐ＜０．００１、独立ステューデントｔ検定、ｎ＝頭蓋内注射について１群あたり５マウス、ＩＶ注射について１群あたり２マウス。 ＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧベクターの構築および特性決定を示す図である。左パネルは、図４Ｂの右パネルと同一の動物から採取したマウス脳の矢状切片に対するＩＨＣ後のベクターの海馬標的化およびその海馬形成中の形質導入を示す。右パネルは、ＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧの両側海馬注射後の種々の解剖脳領域におけるｓｃＦｖ－ＩｇＧのＥＬＩＳＡに基づく定量を示す。Ｈｉｐｐ＝海馬。Ｃｔｘ＝覆っている皮質領域。Ｓｔｒ＝線条体。 抗ＡβｓｃＦｖ－ＩｇＧの発現、拡散およびプラーク結合を示す図である。抗ＡβＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧによる注射から１か月後の成体マウスの海馬および覆っている皮質の全スキャンを示す。切片は、Ａβプラーク（４Ｇ８、赤色）および６ｘＨｉｓ（配列番号９）（緑色）について免疫染色した。スケールバー＝３００μｍ。Ｃｃ＝脳梁。右パネルの画像は、注射部位から近位（１）～遠位（６）の個々のプラークＲＯＩを示す（Ａで付番）。大量のプラーク形成が皮質の至る所に観察され（左パネル）、抗Ｈｉｓ抗体による染色がプラークと共局在した（右パネル）。関心領域（ＲＯＩ）は、直径１５０μｍである。赤色：４Ｇ８。緑色：抗ＨＩＳ抗体。青色：ＤＡＰＩ。 抗ＡβｓｃＦｖ－ＩｇＧの発現、拡散およびプラーク結合を示す図である。左パネルは、試験デザインの概略を示す。右パネルの画像は、ＡＡＶ注射マウスの冠状切片の海馬を示す。ＩＨＣにより、注射した側（赤色矢印）の海馬の至る所における標識が明らかとなり、これは、対側海馬にさらなる形質導入をも有した。空ＡＡＶ注射脳は、いかなる抗Ｈｉｓ標識をも示さなかった。スケールバー＝１ｍｍ。 抗ＡβｓｃＦｖ－ＩｇＧの発現、拡散およびプラーク結合を示す図である。各群それぞれの動物の皮質および海馬におけるプラーク堆積の定量を示す。１群あたりｎ＝１０～１３動物、１動物あたり３切片。＊＊＊ｐ＜０．００１、多重比較による一元配置分散分析。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。

本開示では、現在の発現方法に見られる副作用を有せずに、神経系の細胞において２価結合メンバーを発現させる方法を提供する。神経系の細胞は、天然では抗体を発現しない。これまでの研究では、脳における完全抗体の発現により神経毒性が生じることが示された。脳細胞において野生型ＩｇＧを発現させる従来の方法と比較して、本開示の発現方法では、予想外に高い収率（例えば、２倍またはそれよりも高い）および低い毒性（例えば、注射部位において検出可能な神経細胞内ヒアリンタンパク質の蓄積がないことにより示される）がもたらされる。理論に拘束されることなく、発明者らは、神経系における細胞が、天然抗体を効率的に発現および構築する能力を備えていないこと、ならびに不対抗体鎖が、細胞に対して毒性の封入体を形成すると考えているが、しかし、本発現方法によって、ポリペプチド鎖の数を減少させて２つから１つに発現させることにより、この問題を克服する。また、本方法によって、より高い結合活性およびより良い薬物動態プロファイル（例えば、半減期）を有する結合分子の発現が可能となるため、本発現方法は、脳においてｓｃＦｖを発現させるこれまでの方法に対して有利である。

神経系の細胞
本開示では、神経系、例えば、脳および脊髄を含む中枢神経系において発現する標的タンパク質に対して特異的な２価分子を神経系の細胞に発現させる（例えば、分泌を含む）方法を提供する。本開示の結合メンバーを発現させるための神経系の細胞は、神経系の任意の細胞型、例えば、脳における任意の細胞型であり得る。例えば、本方法では、神経細胞（例えば、介在ニューロン、運動ニューロン、感覚ニューロン、脳ニューロン、ドパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロンまたはセロトニン作動性ニューロン）；グリア細胞（例えば、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、周皮細胞、シュワン細胞または小グリア細胞）；上衣細胞または脳上皮細胞における結合メンバーを発現させ得る。一部の実施形態では、このような細胞は、ヒト細胞である。また、細胞は、ヒト脳の任意の標的領域、例えば、海馬、皮質、基底核、中脳または後脳に位置するものであり得る。

２価結合メンバー
本開示では、神経系の細胞において発現し、神経系、例えば、脳において発現される標的抗原に結合する２価結合メンバーを提供する。標的抗原は、例えば、神経疾患、例えば、神経変性疾患を媒介するタンパク質であり得る。目的の抗原は、アミロイドベータペプチド（Ａβ）、タウ、ＳＯＤ－１、ＴＤＰ－４３、ＡｐｏＥおよびαシヌクレインを含むが、これらに限定されない。

２価結合メンバーは、ポリペプチド鎖のホモ２量体であり、ここで、ポリペプチド鎖は、抗体の抗原結合ドメインおよび定常領域（例えば、ＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を含む。したがって、ホモ２量体は、抗体の２つの抗原結合部位およびＦｃドメインを含む。

一部の実施形態では、ポリペプチド鎖の抗原結合ドメインは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ドメインである。ｓｃＦｖドメインは、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ＶＨおよびＶＬは、場合により、ペプチドリンカーによって分離され、相互作用して抗原結合部位を形成する。目的の抗原に対するｓｃＦｖポリペプチドを得る方法は、当技術分野において周知である。例えば、一方法では、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングして、高親和性で抗原に結合するＶＨおよびＶＬの組合せを得ることができ、または一方法では、抗原に特異的に結合する既存の抗体からＶＨおよびＶＬ配列を得ることができる。

抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖドメインは、ペプチドリンカー（例えば、９－Ｇｌｙ反復リンカー（配列番号７）を含む、本明細書において例証するもののような）を用いるか、または用いずに、抗体の定常領域に融合させることができ、ここで、２つのポリペプチド鎖の定常領域によって、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を介して抗体Ｆｃドメインが形成される。本明細書において使用する場合、「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」の用語は、免疫グロブリンの１つまたはそれ以上の定常ドメインの２量体会合により形成される天然免疫グロブリンの一部分を指す。

一部の実施形態では、Ｆｃドメインの各ポリペプチド配列は、パパイン切断部位のちょうど上流のヒンジ領域において始まり、Ｉｇ重鎖のＣ末端で終わる単一の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖の部分を含み得る。Ｆｃドメインは、免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３を含み得る。Ｆｃドメインが由来するＩｇアイソタイプに応じて、Ｆｃドメインは、さらなる定常ドメイン（例えば、ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ４ドメイン）を含み得る。Ｆｃドメインは、野生型配列と比較して、例えば、融合２量体タンパク質の安定性（例えば、半減期）を増強し、および／または融合２量体タンパク質のエフェクター機能を改変する変異を含み得る。変異は、１つまたはそれ以上のアミノ酸の付加、欠失または置換であり得る。

一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧに由来し、任意のＩｇＧサブタイプ、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプであり得る。このような場合では、本開示のｓｃＦｖ－Ｆｃは、ｓｃＦｖ－ＩｇＧとも呼ぶ。Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ヒンジ領域のヒンジ領域全体またはこの一部のみを含み得る。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１に由来し、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ変異（「ＬＡＬＡ」）（ＥＵナンバリング）を含むことにより、Ｆｃドメインが高親和性Ｆｃガンマ（γ）受容体（複数可）に結合せず、ＡＤＣＣ／ＣＤＣエフェクター機能が低下した。ヒトＩｇＧ１に導入し得る他のＦｃ変異は、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｃ２２０Ｓ／Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｐ２３８Ｓ、Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５ＡおよびＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（ＥＵナンバリング）を含むが、これらに限定されない。例えば、Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ．（２０１８）９（１）：６３～７３；Ｓｔｒｏｈｌ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００９）２０（６）：６８５～９１；Ｊｏｈｎｓｏｎら、ＮａｔＭｅｄ．（２００９）１５（８）：９０１～６を参照されたい。一部の実施形態では、結合メンバーは、ヒトＩｇＧ４由来のヒンジ領域を有し、ここで、ヒンジ領域は、結合メンバーの２つのポリペプチド鎖の解離を減少させるＳ２２８Ｐ変異（ＥＵナンバリング）を含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ４に由来し、Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅ変異（ＥＵナンバリング；ＫａｂａｔナンバリングにおけるＳ２４１ＰおよびＬ２４８Ｅに対応する）を含み、これによりＦｃγ半分子交換およびエフェクター機能がそれぞれ低下する（Ｒｅｄｄｙら、Ｊ Ｉｍｍ．（２０００）１６４：１９２５～３３）。ＡＤＣＣ／ＣＤＣエフェクター機能が喪失または低下すると、細胞毒性が生じるか、または神経系における望まない炎症が誘発されることなく、結合メンバーを標的抗原に結合させることが可能となる。さらなる実施形態では、改変Ｆｃドメインは、新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎに結合する能力を保持する。ＦｃＲｎ結合能が保持されると、ＦｃＲｎ媒介逆トランスサイトーシスにより、神経系、例えば、脳から、抗原に結合した結合メンバーを除去することが可能となる。

一部の実施形態では、ｓｃＦｖ－Ｆｃ結合メンバーのＶＨおよびＶＬドメイン、ならびに／または結合メンバーのｓｃＦｖおよびＦｃドメインは、ペプチドリンカーを介して結合させる。適するペプチドリンカーは、当技術分野において周知である。例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４２：４２３～２６；およびＨｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ．（１９８８）８５：５８７９～８３を参照されたい。ペプチドリンカーは、グリシンおよび／またはセリンにおいて豊富であり得る。ペプチドリンカーの例は、Ｇ、ＧＧ、Ｇ_３Ｓ（配列番号１）、Ｇ_４Ｓ（配列番号３）および［Ｇ_４Ｓ］ｎ（ｎ＝１、２、３または４；配列番号４）である。一部の実施形態では、本開示のｓｃＦｖ－ＩｇＧフォーマットにおいてｓｃＦｖをＩｇＧ部分に結合させるために９－Ｇｌｙ反復リンカー（配列番号７）を使用する。

特定の実施形態では、［Ｇ_４Ｓ］_３型ペプチドリンカー（配列番号２）を使用し、ペプチドリンカーを介して可変ドメイン結合させるように本開示のｓｃＦｖ－ＩｇＧをデザインする。［Ｇ_４Ｓ］_３型リンカー（配列番号２）は、ｓｃＦｖ構造において可変ドメインを結合させるのに、広範に使用されている（Ｈｕｓｔｏｎ、上記参照）。本明細書において使用する場合、［Ｇ_４Ｓ］_３型リンカー（配列番号２）は、［Ｇ_４Ｓ］_３（配列番号２）またはこの機能性バリアント（例えば、［Ｇ_４Ｓ］_３（配列番号２）の最大４つのアミノ酸改変（例えば、挿入、欠失および／または置換）を有するペプチドリンカー）を指す。例として、［Ｇ_４Ｓ］_３（配列番号２）の機能性バリアントは、ＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳのアミノ酸配列（配列番号５）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＸＧＧＧＧＹＧＧＧＧＳのアミノ酸配列（Ｘ＝Ｓ、ＡまたはＮ、およびＹ＝ＡまたはＮ；配列番号６）であり得る。

一部の実施形態では、リンカーのアミノ酸配列は、改変され得る。改変は、リンカー長を変化させる（例えば、可動性を調整するため）欠失もしくは挿入、または例えば、ＧｌｙからＳｅｒへ、もしくはこの逆を含む、アミノ酸の置換を含み得る。

Ａβに対するｓｃＦｖ－Ｆｃポリペプチドは、ｓｃＦｖ－Ｆｃポリペプチドの一フォーマットを単に例示するために、以下に示す。下記の配列は、Ｎ末端からＣ末端に、シグナルペプチド（イタリック体）、ＶＬ、［Ｇ_４Ｓ］_３リンカー（配列番号２）（下線）、ＶＨ、Ｇ_９（配列番号７）（囲み）、ＩｇＧ１ヒンジおよびＦｃドメイン、ならびに６ｘＨｉｓタグに結合する短いリンカー（配列番号９）（太字）を含む。

神経系における結合メンバーの発現
結合メンバーの発現カセットを含む発現構築物は、周知の方法により神経系の細胞に導入され得る。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの送達では、ウイルスベクターを使用できる。一部の実施形態では、発現ベクターは、細胞に安定なエピソームとしての存在を維持する。他の実施形態では、発現ベクターは、細胞のゲノム内に組み込まれる。発現ベクターは、結合メンバーのコード配列の神経系の細胞における発現を可能とする発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写シグナル配列および転写終結配列を含み得る。適するプロモーターは、レトロウイルスＲＳＶ ＬＴＲプロモーター（場合により、ＲＳＶエンハンサーを有する）、ＣＭＶプロモーター（場合により、ＣＭＶエンハンサーを有する）、ＣＭＶ最初期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）プロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＥＦｌαプロモーター、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーターおよびＣＭＶエンハンサー／ニワトリβアクチン／ウサギβグロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター；Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ（１９９１）１０８（２）：１９３～９）を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒトβグルクロニダーゼプロモーター、またはニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターに結合するＣＭＶエンハンサーを含む。プロモーターは、構成的、誘導性または抑制性プロモーターであり得る。

エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性もしくはアニオン性リポソーム、核局在化シグナルと組み合わせたリポソーム、天然に存在するリポソーム（例えば、エキソソーム）またはウイルス形質導入を含むが、これらに限定されない、ヌクレオチド配列を細胞に導入する任意の方法を利用してもよい。

結合メンバーの発現カセットのｉｎ ｖｉｖｏでの送達では、ウイルス形質導入を使用し得る。当技術分野において公知の様々なウイルスベクターが、本開示における使用のために当業者により改良されることがあり、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えポックスウイルス、組換えレンチウイルス等が挙げられる。一部の実施形態では、本発明において使用するウイルスベクターは、ｒＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、分裂および非分裂細胞の両方に感染し、長期発現に安定なエピソーム構造として存在し、免疫原性が非常に低いため、ＣＮＳ遺伝子送達に特に適する（Ｈａｄａｃｚｅｋら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２０１０）１８：１４５８～６１；Ｚａｉｓｓら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００８）１５：８０８～１６）。適する任意のＡＡＶ血清型が使用され得る。例えば、ＡＡＶ血清型１、２または９が使用され得る。ＡＡＶは、カプシドタンパク質のヒトにおける免疫原性が低下するように改変され得る。一部の実施形態では、ＡＡＶ１の血清型が実質における優れた伝播を示しており、神経細胞への形質導入が（ほとんどのＡＡＶベクターのように）優位を占めるが、この血清型は、アストロサイトにも形質導入し、これにより、高レベルのタンパク質発現および分泌に特に適し得るため、ＡＡＶ１が使用される。

本明細書に記載するウイルスベクターは、当技術分野において公知の方法を使用して生成され得る。適する任意の許容またはパッケージング細胞を利用して、ウイルス粒子を生成できる。例えば、哺乳動物または昆虫細胞をパッケージング細胞系として使用してもよい。

発現構築物、例えば、組換えＡＡＶウイルスは、頭蓋内注射、くも膜下腔内注射または大槽内注射により患者の脳に導入され得る。

適用
本開示の発現方法は、治療的結合メンバーを患者の神経系に送達するために使用され得る。次いで、結合メンバーは、神経系におけるトランスフェクト／形質導入細胞から発現および分泌させ、この治療活性を神経系、例えば、脳において局所的に発揮させることになる。これらの方法は、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病（例えば、ＡβおよびＡｐｏＥ）、脳アミロイド血管症、シヌクレイン病（例えば、αシヌクレイン）、タウオパシー（例えば、タウ）またはＡＬＳ（例えば、ＳＯＤ－１およびＴＤＰ－４３（Ｐｏｚｚｉら、ＪＣＩ（２０１９）ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ１２３９３１））、パーキンソン病（例えば、αシヌクレイン）、認知症（例えば、タウ（Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎ、Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ．（２０１８）６６（２）：８５５～６））、レビー小体症候群（例えば、αシヌクレイン（Ｇａｍｅｓら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２０１４）３４（２８）：９４４１～５４））、ハンチントン病（例えば、ハンチンチン（ＷＯ第２０１６０１６２７８号））および多系統萎縮症（例えば、Ｐ２５αおよびαシヌクレイン（Ｇａｍｅｓ、上記参照））における病原性抗原を標的とするために使用することができる。特定の実施形態では、神経変性疾患は、アルツハイマー病である。神経系において局所的に発現する結合メンバーは、病原性抗原を標的とし、神経系、例えば、脳から除去することとなる。

したがって、本開示では、神経系の細胞において活性の転写制御エレメント（複数可）に動作可能に結合する標的抗原のための結合メンバーのコード配列を含む、治療有効量（例えば、所望の治療作用を生じるのに十分な結合メンバーの発現が可能となる量）のウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶ）を、対象の神経系に導入する工程を含む、それを必要とする対象、例えば、ヒト患者において神経疾患（例えば、神経変性疾患）を治療する方法を提供する。

医薬組成物
一部の実施形態では、ｓｃＦｖ－Ｆｃ結合メンバーの発現カセットを組換えゲノム中に含むウイルスベクター、例えば、組換えｒＡＡＶを含む、医薬組成物を本開示において提供する。医薬組成物は、薬学的に許容される担体、例えば、水、食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水）、デキストロース、グリセリン、スクロース、ラクトース、ゼラチン、デキストラン、アルブミンまたはペクチンをさらに含み得る。加えて、組成物は、補助物質、例えば、湿潤および乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤または医薬組成物の有効性を増強させる他の試薬を含み得る。医薬組成物は、送達媒体、例えば、リポソーム、ナノカプセル、微小粒子、ミクロスフェア、脂質粒子およびベシクルを含み得る。

ｒＡＡＶの対象への送達は、例えば、静脈内投与により、達成し得る。特定の例では、ｒＡＡＶを脳組織、脊髄、脳脊髄液（ＣＳＦ）、神経細胞、グリア細胞、髄膜、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、間質腔等に局所的に送達することが望ましいことがある。一部の場合では、脳室領域、ならびに線条体および神経筋接合部、または小脳葉への注射により、組換えＡＡＶをＣＮＳに直接送達し得る。ＡＡＶは、ニードル、カテーテルまたは関連する装置により、当技術分野において公知の神経外科的技術を使用して、例えば、定位注射により、送達され得る（例えば、Ｓｔｅｉｎら、Ｊ Ｖｉｒ．（１９９９）７３：３４２４～９；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、ＰＮＡＳ．（２０００）９７：３４２８～３２；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．（１９９３）３：２１９～２３；ならびにＡｌｉｓｋｙおよびＤａｖｉｄｓｏｎ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２０００）１１：２３１５～２９を参照）。

投与経路は、脳内、くも膜下腔内、頭蓋内、脳内、脳室内、くも膜下腔内、大槽内、静脈内、鼻腔内または眼内投与を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、例えば、くも膜下腔内および／もしくは脳内注射、または大槽内注射による、脳脊髄液（ＣＳＦ）への直接投与後にＣＮＳ組織の至る所に伝播させる。他の実施形態では、ウイルスベクターは、血液脳関門を通過し、静脈内投与後に対象のＣＮＳ組織の至る所に広範な分布を達成する。一部の態様では、ウイルスベクターは、特徴的なＣＮＳ組織標的化能（例えば、ＣＮＳ組織指向性）を有し、これにより安定かつ無毒性の遺伝子導入が高い効率で達成される。

例として、医薬組成物は、例えば、患者の前脳の脳室領域、例えば、右側脳室、左側脳室、第三脳室または第四脳室への、脳室内投与により患者に提供され得る。医薬組成物は、脳内投与、例えば、大脳、髄質、脳橋、小脳、頭蓋内腔、髄膜、硬膜、くも膜もしくは脳軟膜へ、またはこの付近への組成物の注射により患者に提供され得る。脳内投与は、一部の場合では、脳周囲のくも膜下腔の脳脊髄液（ＣＳＦ）への薬剤の投与を含み得る。

一部の場合では、脳内投与は、定位固定法を使用する注射を含む。定位固定法は、当技術分野において周知であり、特定の脳内領域、例えば、脳室領域への注射をガイドするためにともに使用する、コンピュータおよび３次元スキャン装置の使用を典型的に含む。また、マイクロインジェクションポンプ（例えば、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社による）も使用され得る。一部の場合では、マイクロインジェクションポンプは、ウイルスベクターを含む組成物を送達するために使用される。一部の場合では、組成物の注入速度は、１μｌ／分～１００μｌ／分の範囲である。当業者により理解されるであろう通り、注入速度は、例えば、対象の種、対象の年齢、対象の体重／サイズ、ＡＡＶの血清型、必要とする投与量および標的とする脳内領域を含む、様々な因子に依存することとなる。したがって、他の注入速度は、特定の状況において当業者により適切と判断され得る。

本明細書において他に定義しない限り、本開示に関連して使用する科学的および技術的用語は、当業者により一般に理解される意味を有するものとする。例となる方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載するものに類似または等価の方法および材料も、本開示の実行または試験において使用することができる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書により規制する。一般には、本明細書において記載する、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、有機合成化学、医薬品化学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションと関連して使用する命名法およびこれらの技術は、当技術分野において周知かつ一般に使用されるものである。酵素反応および精製技術は、当技術分野において一般に達成されるか、または本明細書に記載するように、製造者の仕様書に従って実施する。さらに、文脈上他に必要としない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数を含むものとする。本明細書および実施形態を通して、「ｈａｖｅ（有する）」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」または変形、例えば、「ｈａｓ」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」の単語により、定める整数または整数の群を包含するが、他のいかなる整数または整数の群をも除外しないことを意味することが理解される。「約」は、定める値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％以内であるとして理解することができる。文脈から他に明らかでない限り、本明細書において提供するすべての数値は、「約」の用語により修飾する。本明細書において記載する本発明の態様および変形が、態様および変形「からなる」および／または「から本質的になる」ことを含むことが理解される。本明細書において言及するすべての公表文献および他の参照は、その全体を参照によって組み入れられる。多数の文書を本明細書において引用するが、この引用は、このような文書のいずれかが当技術分野における一般常識の一部を形成するという承認とはならない。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先されることとなる。加えて、材料、方法および例は、単なる例示であり、制限することを意図しない。

本発明がより良く理解され得るために、下記の実施例を記載する。このような実施例は、単なる例示のためのものであり、本発明の範囲の制限として、いかなる方法によっても解釈されるべきではない。

以下の実施例では、発明者らは、ＦｃＲｎ結合を維持するがＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）結合を欠くＦｃドメインに融合し、サイレントｓｃＦｖ－ＩｇＧと呼ばれる一本鎖抗体（Ａｂ）が、ＡＡＶによる遺伝子導入後に発現しＣＮＳに放出可能であることを示す。ＦｃをｓｃＦｖ－ＩｇＧデザインに組み込むことにより、分子において、凝集アミロイドのような多量体標的に対する高い結合活性をもたらす正準ＩｇＧの２価性が回復し、必要に応じてＦｃ依存性シグナル伝達を調節する能力がもたらされる。脳血液関門におけるＦｃＲｎへのＦｃ結合の保存は、ｓｃＦｖ単独によりこれまでに見られるアミロイド病態の減少時に、脳からのＦｃＲｎ媒介流出により抗体－抗原クリアランスが可能となることによって向上し得る。脳における正準ＩｇＧ発現により神経毒性の徴候が生じたが、この改変抗体（Ａｂ）は、神経細胞から効率的に分泌され、標的特異性を保持した。脳の安定状態レベルは、Ａｂの静脈内注射により得られたピークレベルを上回った。進行性のアミロイドプラーク蓄積の遺伝子導入ＴｈｙＡＰＰｍｕｔマウスモデルでは、このｓｃＦｖ－ＩｇＧのＡＡＶ発現により、対照と比較して、皮質および海馬プラークの負荷が減少した。このような知見により、サイレント抗ＡβｓｃＦｖ－ＩｇＧのＣＮＳ遺伝子送達が、適切な疾患モデルにおいて耐容性が良く、耐久的に発現し、機能性であることが示唆され、このモダリティのアルツハイマー病および他の神経疾患の治療への可能性が実証される。

下記の実施例に記載する試験において使用する材料および方法は、以下に記載する。

試験デザイン
この試験は、アルツハイマー病の治療のため、脳へのＡＡＶ媒介送達のための抗ＡβＩｇＧをデザインするために開始した。このようなＩｇＧ構築物をデザインし、最初にｉｎ ｖｉｔｒｏで２～４回試験して、適切な発現、会合および抗原結合活性を確認した後、ｉｎ ｖｉｖｏでの実験を行った。Ｃ５７ＢＬ／６またはＳＣＩＤ動物試験のサンプルサイズは、ＡＡＶの定位固定送達を使用して導入遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで発現させるこれまでの実験から観察された可変性に基づいて設定し、各実験について定義した。ｉｎ ｖｉｖｏでの発現を試験する試験は、２～３回実施した。アミロイドプラーク負荷の定量のためのＴｈｙＡＰＰｍｕｔマウスのサンプルサイズは、プラーク形成において動物間で予想される可変性を考慮して設定した。この系統を使用するこれまでの試験に基づいて、有効性試験をｎ≧１０の１群あたり１回実施した。動物は、すべての試験について、各群にランダムに割り当てた。自動画像解析のためのＲＯＩ同定は、実験条件について目隠しした研究者により実施した。すべての動物試験は、適切なガイドラインに従って実施した。

ＡＡＶ－ＩｇＧのデザイン
可変領域は、特許出願ＷＯ第２００９／０６５０５４号およびＷＯ第２０１０／１３０９４６号にそれぞれ記載のように、オリジナルの１３Ｃ３マウス（ＡＡＶ－αＡβｍｓＩｇＧに対し）またはヒト化配列（ＡＡＶ－αＡβＩｇＧに対し）（Ｓｃｈｕｐｆら、ＰＮＡＳ（２００８）１０５：１４０５２～７）のいずれかからの抗Ａβ抗体に由来していた。ｈｕＩｇＧ発現ベクターを、半分子（Ｓ２４１Ｐ）およびエフェクター機能（Ｌ２４８Ｅ）を減少させることが記載されている２つのアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４重鎖（Ｒｅｄｄｙら、Ｊ Ｉｍｍ．（２０００）１６４：１９２５～３３）ならびにカッパ軽鎖のコード配列を２重プロモーターカセットに挿入することにより生成した（図１Ａに示す２Ａペプチド切断配列を必要とせずに）。マウスＩｇＧ１フレームワークを必要とする実験では、オリジナルの１３Ｃ３抗体（Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．（２０１６）６：２０９５８）を、Ｎ２９７Ａ変異を重鎖に加えることにより使用して、エフェクター機能を低下させた。ＡＡＶ対照ＩｇＧベクターは、非哺乳動物抗原を標的とするｈｕＩｇＧ４ＰＥアイソタイプ対照抗体をコードした。

ｓｃＦｖ－ＩｇＧのデザイン
ｓｃＦｖ－ＩｇＧのデザインを示す（図４Ａ；配列番号８）。簡潔には、１３Ｃ３抗アミロイドベータ親抗体の可変軽および可変重鎖領域を、可動性Ｇ_４Ｓリンカー（配列番号２）の３つの反復により結合させて、ＶＬ－ＶＨｓｃＦｖを形成した。ｓｃＦｖ配列は、天然マウスＩｇＧ１ヒンジならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有することによりｓｃＦｖ－ＩｇＧのＦｃ領域を含む、さらなる９反復グリシンリンカー（配列番号７）を後に伴っていた（Ｂａｌａｚｓら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４８１：８１～４）。ＡＡＶ－αＡβｍｓＩｇＧと同様に、Ｆｃのアスパラギン２９７をアラニン（Ｎ２９７Ａ）に変異させて、エフェクター機能を減弱した（Ｃｈａｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｎｖｅｓｔ．（２００９）３８：７６～９２）；Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（１９９８）１６３：５９～７６）。Ｃ末端６ｘＨｉｓエピトープタグ（配列番号９）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの精製およびマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの検出の両方を促進させるように含んだ。ｓｃＦｖ－ＩｇＧの発現は、ＴｂｇｈポリＡを有するｈＣＭＶ／ｈＥＦ１ａプロモーター発現カセットにより駆動した。

免疫寛容
免疫寛容を誘導するために、０、２および１０日目にマウスに７．５ｍｇ／ｋｇのＧＫ１．５抗ＣＤ４モノクローナル抗体（Ｂｉｏｘｃｅｌｌ社）をＩＰ注射した。ＣＤ４Ｔ細胞の枯渇を確認するために、１２日目に、後眼窩サンプリングにより血液をヘパリンコーティングチューブ内に採取した。標準プロトコールを使用したＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ上でのＦＡＣＳ解析を使用し、ＣＤ４５－ＦＩＴＣ（クローン１０４ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ（商標）），ＣＤ３ｅ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（クローン１７Ａ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）およびＣＤ４－ＰＥ（ＲＭ４－４クローン、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）抗体を用いてＣＤ４＋Ｔリンパ球を定量した。ＧＫ１．５処置動物では、処置マウスにおけるＣＤ４＋リンパ球／全ＣＤ３＋リンパ球の割合０．０４＋／－０．００８（平均値＋／－ＳＥＭ）によって、無処置マウスの０．４７＋／－０．００３と比較して明らかなように、ＣＤ４が減少した。

細胞培養、タンパク質発現および精製
Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ社）をＥｘｐｉ２９３Ｔ（商標）無血清培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈ社）中で継代し、タンパク質発現に使用した。発現プラスミドを脂質トランスフェクション（Ｆｅｃｔｏｐｒｏ、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）によりＥｘｐｉ２９３（商標）細胞にトランスフェクトし、４日後に分泌タンパク質を含む細胞培養培地を採取した。滅菌濾過後、６ｘＨｉｓ（配列番号９）タグ化タンパク質を固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製した。簡潔には、タンパク質をバッチでコバルト樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））に一晩４℃で吸着させ、１０カラム容量のリン酸緩衝食塩水で洗浄し、次いで、５００ｍＭのイミダゾールで溶出した。タンパク質をＨＥＰＥＳ緩衝食塩水中に一晩透析し、濃縮し（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標））、－８０℃で使用まで凍結した。

ＥＬＩＳＡ
９６ウェルのＩｍｍｕｌｏｎ（商標）ＩＩＨＢ（Ｔｈｅｒｍｏ社）プレートを、抗原ＥＬＩＳＡのために１μｇ／ｍＬのＡβ_１－４２（Ｂａｃｈｅｍ社Ｈ－１３６８）、または１μｇ／ｍＬのマウス抗ｈｕＩｇＧポリクローナルＡｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ社２０９－００５－０８８）のいずれかでコーティングして、全ｈｕＩｇＧを炭酸緩衝液中に一晩２５℃で捕捉した。ウェルをＴＢＳ－０．５％ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）で５回洗浄し、ＴＢＳＴＢ（ＴＢＳＴ＋１．５％ＢＳＡ）中で１時間ブロッキングした。精製タンパク質を使用する標準曲線を、血清または脳ホモジネートと並行して実行し、結合したｓｃＦｖ－ＩｇＧまたはｈｕＩｇＧの定量を可能とした。サンプルを２．５時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄し、次いで、ＨＲＰコンジュゲート２次抗体とともに１時間インキュベートした。５回のＴＢＳＴ洗浄後にウェルをＴＭＢ基質とともに５分間インキュベートした後、０．５ＭのＨ_２ＳＯ_４でクエンチした。プレート結合シグナルは、４５０ｎｍにおける吸光度により定量した（ＳｐｅｃｔｒａｍａｘＭ５）。すべてのサンプルは、三連で実行した。

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ実験は、ＮａｎｏＡｃＱｕｉｔｙ ＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ社）を備えたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））上で行った。組織ホモジネートのＩｇＧを、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＨｕＩｇＧ親和性樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）により特異的に濃縮して単離した。濃縮したＩｇＧは、ＤＴＴ還元およびアルキル化後にトリプシン／Ｌｙｓ－Ｃ（１：１００ｗ／ｗ）による一晩３７℃のインキュベーションによって分解した。分解は、１％のギ酸（ＦＡ）の追加により終止させた。生じたトリプシンペプチド混合物をミクロキャピラリーカラム（ｉｄ７５μｍ、ＨＳＳＴ３ １５ｃｍ、１．８μｍ、Ｗａｔｅｒｓ社）に充填して分割した。データは、ＰＲＭモードで、解像度７０，０００（ｍ／ｚ２００）、ＡＧＣ標的５×１０^６および最大注入時間５００ｍｓにより取得した。予定包含リストを、対照ＩｇＧのプロファイリングデータに基づいて作成した。ＰＲＭ方法では、標的イオンの単離を２Ｄａ単離ウインドウにより利用し、正規化衝突エネルギー（ＮＣＥ）２５により断片化した。ＭＳ／ＭＳスキャンは、出発質量範囲１００ｍ／ｚにより取得し、プロファイルスペクトルデータ型として取得した。前駆および断片イオンは、Ｓｋｙｌｉｎｅ（ＭａｃＣｏｓｓ Ｌａｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を使用して定量した。

表面プラズモン共鳴
１ｍｇ／ｍＬのＡβ_１－４２ペプチド（Ｂａｃｈｅｍ社Ｈ－１３６８）を１０ｍＭのＨＣｌ中に一晩３７℃で、６００ｒｐｍで振盪させながらインキュベートした。生じる線維溶液を、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上にアミン結合により直接固定化した。ＰＢＳ－＋Ｐ緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）中に５０、３０、２０、１０および５ｎＭで作製した抗体またはｓｃＦｖ－ＩｇＧ溶液を、相対的に高い流量（５０μＬ／分）で注入して、結合活性作用を制限した。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して処理し、ブランク表面および緩衝液のみの注入の差し引きにより２重参照した後、１：１結合モデルへのデータのグローバルフィッティングを行った。

ＡＡＶ ＩＴＲプラスミドおよびアデノ随伴ウイルスベクターの調製
ＩｇＧまたはｓｃＦｖ－ＩｇＧの発現カセットを、必要に応じて、適切なパッケージングのためのＡＡＶゲノムサイズを維持するＡ１ＡＴスタッファーＤＮＡを保持する、ＡＡＶ２－ＩＴＲ含有プラスミドにサブクローニングした。２重プロモーターＩｇＧ ＩＴＲプラスミドの場合では、カセットが既に、効率的パッケージングに許容される最大サイズであったため、スタッファーＤＮＡは含まなかった。ＡＡＶ空ベクターは、ＣＢＡプロモーター、ＴｂｇｈポリＡおよびＡ１ＡＴスタッファーＤＮＡからなった。ＡＡＶ２／１ウイルスは、一過性トランスフェクションにより生成した。簡潔には、３つのプラスミド（ＩＴＲ、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐおよびＡｄヘルパーを含む）の比率１：１：１でＰＥＩ（ポリエチレンイミン）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。Ａｄヘルパープラスミド（ｐＨｅｌｐｅｒ）は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）から入手した。精製は、これまでに記載されているように（Ｂｕｒｎｈａｍら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１５）２６：２２８～４２）、カラムクロマトグラフィーを使用して実施した。ウイルスは、ポリＡ配列に対してｑＰＣＲを使用して力価を試験し、ＡＡＶは、１８０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（５ｍＭの１塩基性＋５ｍＭの２塩基性）、０．００１％のＦ６８、ｐＨ７．３中に８０℃で使用まで保存した。

動物
使用する動物は、他に明示しない限り２か月齢のジャクソン研究所（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、米国）から入手したＣ５７ＢＬ／６の雄であった。２か月齢の成体ＳＣＩＤマウスは、ジャクソン研究所から入手した（Ｂ６．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ／ＳｚＪ）。Ｃ５７ＢＬ／６に戻し交配したＴｈｙＡＰＰｍｕｔ遺伝子導入マウスについては、Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．（２００３）１８４：２４７～６３に記載されている。手術群は、単独で飼育して、脳外科手術からの適切な回復を可能とした。マウスは、１２時間の明／暗サイクルで維持し、食物および水を自由に摂取可能とした。動物は、種々の群にランダム化し、処置群について目隠ししたオペレーターにより分析を実施した。

定位固定注射
動物実験委員会により承認された手順に従って、外科手術を実施した。混合物（容量１０ｍｌ／ｋｇ）：ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ；Ｉｍａｌｇｅｎｅ；Ｍｅｒｉａｌ社、仏国）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ；Ｒｏｍｐｕｎ；Ｂａｙｅｒ社、仏国）の腹腔内注射により、マウスに深く麻酔した。動物を定位固定フレーム（ＫｏｐｆＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、米国）に配置する前に、マウスの頭皮を剪毛してＶｅｔｉｄｉｎｅ（Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ社、仏国）で消毒し、局所麻酔薬ブピバカイン（２ｍｇ／ｋｇ、容量５ｍｌ／ｋｇ；Ａｇｕｅｔｔａｎｔ社、仏国）を頭蓋の皮膚上に皮下注射し、エムラ（Ｌｉｄｏｃａｉｎｅ、Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ社）を耳内に塗布した。手術の間、ビタミンＡ Ｄｕｌｃｉｓにより眼を光から保護し、加温毛布により体温を３７℃で一定に維持した。

サンプルを１分あたり０．５マイクロリットルの速度で注射した。ニードルは、２分以内放置してニードル路からのサンプルの逆流を防ぎ、次いで、脳から緩徐に引き上げた。ＴｈｙＡＰＰｍｕｔマウスにおける一側海馬への注射、または他のすべてのマウスにおける両側への注射を実施した。海馬注射の座標は、ＡＰ－２．０、ＤＶ－２．０およびＭＬ＋／－１．５であった。マウスは、手術後、保温してカプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ、容量５ｍｌ／ｋｇ、Ｒｉｍａｄｙｌ（登録商標）、Ｚｏｅｔｉｓ社）の皮下注射に供し、回復するまで持続的に観察した。試験の終わりに、Ｅｕｔｈａｓｏｌ（登録商標）（ＵＳＡ）またはケタミン／キシラジン（仏国）による麻酔の過量投与によって、マウスを安楽死させた。過量投与の後、マウスを氷冷ＰＢＳにより灌流するまで保温した。

免疫組織化学的検査
冷ＰＢＳによる灌流の後、脳組織を１０％の中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中に固定した。ホルマリン固定組織をパラフィンに包埋し、次いで、５μｍの矢状または冠状面に薄片を作製した。すべての組織を、Ｌｅｉｃａ ＢＯＮＤ ＲＸ自動染色装置を使用して染色した。免疫蛍光染色では、熱媒介抗原回復を、エピトープ回復溶液１（ＥＲ１；クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０）を使用して１０分間実施した。次いで、組織をヤギ血清＋０．２５％トリトンＸ－１００によりブロッキング／透過処理し、次いで、１次抗体とともに１時間ＲＴでインキュベートしてＴＢＳＴで洗浄し、次いで、２次抗体とともに３０分間インキュベートした。核は、Ｓｐｅｃｔｒａｌ ＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ社）を使用して検出した。プラークの定量では、ビオチンコンジュゲート４Ｇ８抗体（４Ｇ８クローン、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社８００７０１）を用いて、抗原回復およびギ酸抽出をせずに製造者の指示に従いＶｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）ＡＢＣ（ＰＫ－７１００）キットを使用して、組織を免疫染色した。

抗体
６ｘＨｉｓ（配列番号９）（Ａｂｃａｍ社Ａｂ９１０８、１：１０００ ＩＨＣ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｒ９３１－２５、１：１０００ウエスタン、ＥＬＩＳＡ）ＧＦＡＰ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、４１－９８９２－８２、１：２００またはＡｂｃａｍ社Ａｂ４６７４、１：５００ ＩＨＣ）４Ｇ８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社８００７０１、１：５００ ＩＨＣ）。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の２次抗体：Ｃｙ３ヤギ抗マウス、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ヤギ抗ウサギ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ニワトリ；すべて１：５００。アミロイドＤＡＢ：４Ｇ８－ビオチン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社８００７０５ １：２５０）。

画像解析
免疫組織化学的検査スライドを拡大率２０×で、Ｓｃａｎｓｃｏｐｅ（登録商標）ＸＴ明視野画像スキャナ（Ａｐｅｒｉｏ社、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）またはＡｘｉｏＳｃａｎＺ１（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＧｍＢＨ社、独国）を使用してスキャンした。ＧＦＡＰ ＩＨＣの全スライド画像（ＷＳＩ）を見て、ＨＡＬＯ（商標）画像解析ソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ社、Ｃｏｒｒａｌｅｓ、ＮＭ、米国）を使用して解析した。各ＷＳＩでは、海馬領域を手動でアノテートし、ＧＦＡＰ免疫陽性領域について、ＨＡＬＯの自動領域定量アルゴリズムを使用して解析した。各サンプルでは、選択されたＲＯＩについて、ＧＦＡＰ陽性領域を全組織領域によって割り、免疫陽性領域のパーセントを得た。プラーク解析では、５μｍの冠状脳切片を、６か月齢ＴｈｙＡＰＰｍｕｔマウスから３つの異なるレベルで５０μｍ離れて採取した。皮質および海馬のＲＯＩは、手動でアノテートした。アミロイドプラーク負荷は、ＺＥＮ２ソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＧｍＢＨ社、独国）を使用して開発したカスタム画像解析アルゴリズムを使用して、％ＤＡＢ＋組織領域として定量した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、米国）を使用してプロットした。

統計
統計学的解析は、３つ以上の群による実験について多重比較（ダネット）による一元配置分散分析を使用するＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ６およびｖ７）を使用して実施した。独立ステューデントｔ検定を２つの群の比較に使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。サンプルサイズは様々であり、各実験について明示している。

実施例１：βアミロイドを標的とするＡＡＶ－ＩｇＧベクターの構築および特性決定
抗体の遺伝子に基づく発現を発生させるために、発明者らは、２重プロモーター発現カセットを使用して、Ｓｃｈｕｐｆ、上記参照に記載のように単量体形態に対して親和性を有しない原線維性および線維性Ａβに結合する１３Ｃ３抗体のヒト化バージョンを発現させた。ＩｇＧ４重鎖は、Ｆｃγエフェクター機能および半分子交換を低下させるＳ２２８ＰおよびＬ２４８Ｅ変異を含んだ（Ｙａｎｇら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）３０：２２５～９；Ｒｅｄｄｙら、Ｊ Ｉｍｍ．（２０００）１６４：１９２５～３３）。

重および軽鎖は、種々のプロモーターから発現させ、カセット全体は、ＡＡＶゲノムパッケージング制限に適合するようにデザインした（図１Ａ）。ここで使用する２重プロモーターデザインでは、単一プロモーターを使用するが、Ｆ２Ａ切断配列または内部リボソーム侵入部位のバイシストロン性発現のための使用を必要としない、他のデザインによって誘導される潜在的免疫原性または発現傾向が回避される（Ｓａｕｎｄｅｒｓ、上記参照；Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２０００）１：３７６～８２）。ＡＡＶ１の血清型が実質における優れた伝播を示しており、神経細胞への形質導入が（ほとんどのＡＡＶベクターのように）優位を占めるが、その血清型は、アストロサイトにも形質導入し、これにより、高レベルのタンパク質発現および分泌に特に適し得るため、このカセットをＡＡＶ１カプシド内にパッケージングして脳への直接注射を行った（ＡＡＶ－αＡβＩｇＧ）。ＡＡＶ－αＡβＩｇＧ発現を試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６－ＳＣＩＤ（ＳＣＩＤ）マウスを使用して、導入遺伝子の発現と干渉し得る抗ｈｕＩｇＧ免疫応答を防いだ。抗体は、逆トランスサイトーシスにより脳外に能動的に輸送される。したがって、発明者らは、隔週の血清採取によりＡＡＶ－αＡβＩｇＧの脳発現を監視した。血清は、ＡＡＶ－αＡβＩｇＧのＳＣＩＤマウス海馬への両側注射（１側あたり２Ｅ１０ＧＣ）の後に２週間隔で１６週間導出した。Ａβ_１－４２線維結合イムノアッセイを使用して、２Ｅ１０ＧＣのＡＡＶ－αＡβＩｇＧの両側海馬注射後の機能性抗体の発現レベルを測定した。

ベクターにより、最大１６週間の安定な発現が実証された（図１Ｂ、左）。脳におけるＡＡＶ媒介抗体発現が、受動免疫療法の標準的手法により観察されるレベルとどのように匹敵するかの洞察を得るために、２０ｍｇ／ｋｇのαＡβＩｇＧの単回静脈内（ＩＶ）ボーラス注射に供した別の群と並行して、ＳＣＩＤマウスの海馬におけるｈｕＩｇＧレベルを種々の時点で測定した。ＳＣＩＤマウスに、２Ｅ１０ＧＣのＡＡＶ－αＡβＩｇを海馬の両側に１回、または２０ｍｇ／ｋｇの精製ＩｇＧを１回ＩＶ注射した後、指示時間に組織を採取し、脳をＩｇＧに曝露して時間経過を見た。同側の海馬をホモジナイズし、ｈｕＩｇＧについて抗原ＥＬＩＳＡにより定量した。抗原ＥＬＩＳＡにより測定した場合、ＡＡＶ－αＡβＩｇＧベクターにより、ほぼ３００ｎｇ／ｇの海馬における発現が時間経過の間持続した（図１Ｂ、右）。ＩＶ注射から２４時間後の海馬におけるＩｇＧのレベルは２００ｎｇ／ｇに近づいたが、ＩｇＧが脳から除去されたため（既知の血清半減期を有する系統において）、このレベルは低下し、７週までにＡＡＶ－αＡβＩｇＧと比較して１１分の１に低下した。

図１Ｃは、ＡＡＶ－ＩｇＧの神経細胞内およびグリア細胞発現が、海馬において検出可能であったことを示す。詳細には、ニューロンおよびアストロサイトの両方における発現がｈｕＩｇＧ発現産物に対するＩＨＣにより確認され、ニューロンは、海馬のＣＡ２における形態学により容易に同定可能であり、ＧＦＡＰによる共局在によって、アストロサイト発現が示された（図１Ｃ）。

このようなデータによって、ＡＡＶ－αＡβＩｇＧベクターにより、脳における抗体の定常状態レベルが、伝統的受動免疫療法プロトコールにより達成可能なレベルよりも有意に高く維持され得ることが示される。

実施例２：アルツハイマー病のマウスモデルにおけるＡＡＶ－αＡβＩｇＧによる抗原結合
次いで、発明者らは、変異アミロイド前駆タンパク質を発現するアミロイドプラークマウスモデル（ＴｈｙＡＰＰｍｕｔ）においてＡＡＶ－αＡβＩｇＧを発現させて、脳形質導入の程度を評価し、抗体が細胞外空間に分泌されてプラークに結合するかどうかをｉｎ ｖｉｖｏで判定した。このモデルは、約２～３か月齢から皮質において進行性のアミロイドプラーク蓄積を示す（Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．（２００３）１８４：２４７～６３）。抗ｈｕＩｇＧ抗体応答を防ぐために、ベクター投与前後にＣＤ４枯渇抗体により動物を免疫寛容化した（図２Ａ）。簡潔には、マウスにおいてＩｇＧを容易に検出するために、発明者らは、２か月齢の雄ＴｈｙＡＰＰｍｕｔマウスの海馬内にＡＡＶ－αＡβＩｇＧまたはアイソタイプ対照ＩｇＧを発現するＡＡＶ（ＡＡＶ－ＩｇＧ対照）を注射した。ＴｈｙＡＰＰｍｕｔマウスは、２～１０日目の間にＣＤ４Ｔ細胞枯渇により免疫寛容化した。ＡＡＶ－αＡβＩｇＧまたはアイソタイプ対照ベクターＡＡＶ－ＩｇＧ対照は、４～５日目に海馬の両側に注射した（１注射あたり２Ｅ１０ＧＣ）。別の群は、１０ｍｇ／ｋｇの精製αＡβｈｕＩｇＧを試験の間、プラーク結合活性の陽性対照として毎週ＩＰ注射した。８週後、５μｍの矢状脳切片を採取し、免疫染色した。このαＡβＩｇＧ用量およびＩＰ送達範例により、ｉｎ ｖｉｖｏでＴｈｙＡＰＰｍｕｔ動物においてプラーク結合が生じることがこれまでに示されていた（Ｐｒａｄｉｅｒら、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ＆Ｄｅｍｅｎｔｉａ（２０１３）９（４）：８０８～８０９ページ）。

注射から２か月後、このような動物が前頭皮質におけるプラークの堆積を示す年齢において、脳の矢状切片をＩＨＣ処理した。詳細には、ｈｕＩｇＧ ＩＨＣ染色により、ニードル路周囲の海馬および覆っている皮質の至る所における発現が明らかとなった。関心領域（ＲＯＩ）（５００μｍ幅）の拡大により、ニューロン、および海馬の神経網におけるｈｕＩｇＧ発現の詳細が示される。対照的に、アミロイドプラークに限定して染色したＩＰ注射αＡβＩｇＧ群は、細胞体においていかなる発現をも示さなかった（図２Ｂ、左）。ｈｕＩｇＧ、ＡβプラークおよびＧＦＡＰの蛍光ＩＨＣにより、ＡＡＶ－αＡβＩｇＧおよびＩＶαＡβＩｇＧの両群においてｈｕＩｇＧの皮質プラークとの共局在が示されたが、ＡＡＶ－ＩｇＧ対照群では示されなかった。詳細には、ＡＡＶ－αＡβＩｇＧおよび末梢送達αＡβＩｇＧは、４Ｇ８＋アミロイド堆積物への明らかな結合を呈し、一方、ＡＡＶ－ＩｇＧ対照は、検出可能な結合を呈しなかった（図２Ｂ、右）。

このようなデータにより、ＡＡＶ－αＡβＩｇＧが、細胞外空間に分泌され、注射部位から遠位の脳領域においてＡβプラークに結合可能であったことが示される。

実施例３：ＡＡＶ－αＡβＩｇＧ神経細胞発現および神経毒性の評価
神経細胞は、ＩｇＧのような大型の高分子ではなく、神経伝達に関連する因子を分泌するように高度に特殊化されている。ＩｇＧの効率的プロセシングおよび分泌が、このような細胞において生じ得るかどうかは不明である。神経性発現ＩｇＧの不適切なプロセシングが存在するかどうかを判定するために、発明者らは、質量分析を実施して、ＳＣＩＤマウスにおいてＡＡＶ－αＡβＩｇＧ発現から１か月後に脳における重および軽鎖の全体のレベルを測定した。海馬におけるＡＡＶ－αＡβＩｇＧの発現は、精製αＡβＩｇＧを添加した食塩水注射脳ライセートと同様に、重鎖では、予想レベルであったが、添加した対照と比較した場合、同族軽鎖では、予想外に低量であった（図３Ａ）。この知見によって、脳細胞におけるＡＡＶ－αＡβＩｇＧ発現により、不十分な軽鎖の生成が生じ、このため重および軽鎖の割合における不均衡が生じたことが示唆された。

また、発明者らは、ＥＬＩＳＡを使用して全ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ鎖）対抗原（Ａｇ）に結合可能なこの集団のパーセントを定量した。詳細には、ＡＡＶ－αＡβＩｇＧ発現ＳＣＩＤマウス由来の脳抽出物における機能性Ａβ抗体のレベルを、抗原ＥＬＩＳＡにより定量し、汎ｈｕＩｇＧ ＥＬＩＳＡと並行して比較した。発明者らは、脳から発現した全ＩｇＧ（全２Ｅ１０ＧＣを海馬へ注射）の約２０％が機能性であり、一方、ベクターのＩＶ注射により末梢組織から発現したＡＡＶ－αＡβＩｇＧ（全１Ｅ１２ＧＣをＩＶ注射）が、全ＩｇＧ／機能性ＩｇＧにおいて不均衡を有しなかったことを観察した。詳細には、抗原に結合したｈｕＩｇＧのレベルが、脳から発現した場合、全ｈｕＩｇＧのわずか２１％を占めたが、この矛盾は、ベクターの末梢発現から１か月後に血清においては検出されなかった（図３Ａ、右）。

次いで、発明者らは、ＩｇＧ発現の結果として神経毒性の証拠が存在したかどうかを調査した。ＡＡＶ－αＡβＩｇＧベクターの発明者らによる最初の特性決定では、発明者らは、ヒトに対するさらに直接的な翻訳能を有するこの抗体のｈｕＩｇＧバージョンを使用し、マウスにおける明らかな検出を可能とした。しかし、脳ＩｇＧ発現と関連し得る任意の毒性または神経炎症を、異種間ｈｕＩｇＧ曝露の交絡変数を存在させずに試験するために、発明者らは、αＡβＩｇＧのオリジナルマウスバージョンを発現する、ＡＡＶ－αＡβｍｓＩｇＧと呼ぶＡＡＶベクターを使用した（Ｓｃｈｕｐｆ、上記参照；Ｐｒａｄｉｅｒ、上記参照；Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．（２０１６）６：２０９５８）。このベクターは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの海馬に注射し、脳組織は、１か月後に処理して組織学的検査を行った。病理組織学的解析により、海馬の神経細胞におけるヒアリン／好酸球の細胞質堆積物の高い発生率が明らかとなり、これは、糖タンパク質の高発現を暗示していた（図３Ｂ）。糖タンパク質蓄積を暗示する、神経細胞における好酸球対ヒアリン様物質の包含は、抗体発現ベクターを注射した脳においてのみ観察された。このような構造は、ＡＡＶ－ＩｇＧ対照を注射したマウス（６／１２マウス）の海馬においても観察され、この毒性が、αＡβＩｇＧ発現に特異的ではないことを示した。このようなヒアリン堆積物は、ＡＡＶ１空ベクターまたはＰＢＳ単独を注射したマウスの海馬においては、まったく観察されなかった（図３Ｂ）。

また、発明者らは、ＰＢＳと比較した免疫組織化学的ＧＦＡＰ解析による神経炎症の証拠を観察した。この実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＰＢＳまたはＡＡＶ－αＡβｍｓＩｇＧのいずれか（２Ｅ１０ＧＣを海馬へ）を注射し、１６週後に５μｍの矢状脳切片を採取した（図３Ｃ）。また、ＡＡＶ１空ベクターは、ＰＢＳと比較して有意なグリオーシスを誘発せず（１．１１＋／－０．１２、５マウス、ＰＢＳ ＧＦＡＰ＋領域に対して正規化した平均値＋／－ＳＥＭ）、神経炎症がＩｇＧ発現に起因することを示唆した。

このようなデータにより、脳細胞がＩｇＧを発現および分泌し得るが、このＩｇＧの約２０％のサブセットのみが、機能性かつ抗原を結合可能であり、この発現により、検出可能な神経炎症が形質導入領域の至る所で誘導されることが示される。

実施例４：ＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧベクターの構築および特性決定
発明者らによるベクターによって送達されたＩｇＧが、アミロイドプラークをｉｎ ｖｉｖｏで分泌および結合した一方で、発明者らは、選択的Ｉｇフォーマットにより、ＡＡＶ－ＩｇＧにより誘導される誤対合および神経毒性を最小化可能であると仮定した。同一のマウスαＡβ抗体に基づいて（Ｓｃｈｕｐｆ、上記参照）、発明者らは、ＣＯＯＨ末端（Ｃ末端）によりマウスＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに結合する重鎖可変領域に融合したＩｇＧ軽鎖の可変領域を有する改変一本鎖Ｆｖを合成した（図４Ａ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ）。Ｆｃ領域の炎症促進作用を最小化するために、マウスＩｇＧ１Ｆｃドメインを変異させてアスパラギン２９７におけるグリコシル化を排除し（Ｎ２９７Ａ）、これにより、すべてのＦｃγＲへの結合を防いだ（Ｊｏｈｎｓｏｎ、上記参照；Ｃｈａｏ、上記参照）。詳細には、ｓｃＦｖ－ＩｇＧを、可動性ＧＧＧＧＳ（配列番号３）リンカー配列の３つの反復を介して結合するマウス抗ＡβＩｇＧの可変領域を有するようにデザインした。ｓｃＦｖは、９－Ｇｌｙ反復リンカー（配列番号７）を介してマウスＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ Ｆｃに結合させた。６ｘＨｉｓタグ（配列番号９）をＣ末端に付加した。ｓｃＦｖ－ＩｇＧは、Ｅｘｐｉ２９３細胞において発現し、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により、Ｃ末端ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ配列を使用して精製した。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる解析によって、このタンパク質が、ジスルフィド結合２量体に効率的に会合したことが確認された（図４Ａ）。このｓｃＦｖ－ＩｇＧは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、親抗体に匹敵する線維性Ａβ_１－４２への結合を呈した。親和性（Ｍ）は、ＳＰＲによって、ｓｃＦｖ－ＩｇＧまたはＩｇＧを種々のモル濃度で固定化Ａβ_１－４２線維上に流動させて、結合動態を解析することにより判定した。親ＩｇＧは、ｓｃＦｖ－ＩｇＧによるわずかに低い結合親和性の５．２×１０^－１０と比較して、１．３×１０^－１０Ｍの明らかな解離定数（Ｋ_Ｄ）を呈した（図４Ａ、表）。

この発現カセットをＡＡＶ１ベクターに挿入して、改変ＩｇＧがｉｎ ｖｉｖｏで合成可能かどうかを判定した。末梢組織がＩｇＧ分子の発現および分泌について良好に検証されているため、ＡＡＶのＩＶ注射を発明者によるウイルスの活性についての陽性対照として使用した（Ｓａｕｎｄｅｒｓ上記参照；Ｓｈｉｍａｄａら、ＰｌｏＳ ＯＮＥ（２０１３）８：ｅ５７６０６；Ｈｉｃｋｓら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．（２０１２）４：１４０ｒａ１８７；Ｃｈｅｎら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．（２０１７）７：４６３０１；Ｂａｌａｚｓら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４８１：８１～４；Ｂａｌａｚｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１３）３１：６４７～５２；Ｂａｌａｚｓら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１４）２０：２９６～３００）。ＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧ（全１Ｅ１２ＧＣ）のＩＶ注射から１か月後、血清レベルが６３μｇ／ｍＬに達し、末梢組織において強いＡＡＶベクター活性が実証された（図４Ｂ、左）。

ベクターの脳発現を評価するために、ＡＡＶ全２Ｅ１０ＧＣのＣ５７ＢＬ６マウスへの海馬注射から１か月後に、半脳と呼ぶ、１つの脳矢状半に由来する抽出物からｓｃＦｖ－ＩｇＧレベルを定量した。発現レベルは、平均約６００ｎｇ／ｇに達した（図４Ｂ、右）。注目すべきことには、この濃度は、２０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧのＩＶ注射から２４時間後に観察された濃度よりも３倍を超えて高く、ＡＡＶ－αＡβＩｇＧにより観察された濃度よりも２．５倍高かった（図１Ｂ）。組織学的解析により、ＡＡＶ－αＡβＩｇＧベクターよりも脳における高いレベルの発現を有するにもかかわらず、ＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧ形質導入では、注射した海馬において（０／５マウス）、いかなる検出可能な神経細胞内ヒアリンタンパク質蓄積も生じなかったことが明らかとなり、ｓｃＦｖ－ＩｇＧが、神経細胞によって、ＩｇＧよりも効率的にプロセシングされたことが示唆された。

ｓｃＦｖ－ＩｇＧ形質導入細胞の脳分布を明らかとするために、Ｈｉｓタグに対する抗体を使用する海馬注射から１か月後にＤＡＢ－６ｘＨｉｓＩＨＣ（「６ｘＨｉｓ」配列番号９として開示）を矢状切片に対して実施した。ＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧベクターは、全海馬に形質導入し、ニードル路周囲の海馬および海馬台を覆っている皮質領域において形質導入は低密度であった（図４Ｃ）。陰性対照である空ＡＡＶ（ＡＡＶ対照）ベクターを形質導入した脳は、検出可能な抗Ｈｉｓ免疫染色を示さなかった（図４Ｃ）。分泌されたいかなる細胞外ｓｃＦｖ－ＩｇＧも、利用可能な抗原の欠如が原因で洗い流された可能性があるため、Ｃ５７ＢＬ６マウスにおける抗Ｈｉｓ ＩＨＣによってのみ細胞内発現が検出されることに留意するべきである。

細胞内および細胞外の両ｓｃＦｖ－ＩｇＧの発現を、注射部位から近位および遠位両方の同側脳領域において生物化学的に評価した。ＡＡＶ注射から１か月後、３匹のマウスの脳領域を解剖して、各脳領域について抗原ＥＬＩＳＡにより発現タンパク質を定量し、ＰＢＳ注射脳ホモジネートを使用してバックグラウンドシグナルを差し引いた。詳細には、海馬、これを覆っている皮質、および線条体を解剖し、ホモジナイズしてｓｃＦｖ－ＩｇＧを抗原ＥＬＩＳＡにより定量した（図４Ｃ、右）。濃度勾配を観察し、最も高いレベルを注射部位（海馬）において観察し、漸進的に低いレベルをより遠位の脳領域において観察した（図４Ｃ、右）。注射部位と比較して低いレベルを有するにもかかわらず、線条体組織におけるｓｃＦｖ－ＩｇＧの濃度は、受動ＩｇＧ注入によっては典型的に達成されない脳の定常状態レベルである２００ｎｇ／ｇ付近を維持した。

実施例５：βアミロイド症のマウスモデルにおけるｓｃＦｖ－ＩｇＧによる抗原結合
発明者らは、ＡＡＶ送達ｓｃＦｖ－ＩｇＧが細胞外空間に分泌され、ｉｎ ｖｉｖｏで抗原に結合し得るかどうかを判定した。ＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧベクターを、それらが既に新皮質の至る所にプラークを発症した年齢である５か月齢の雌ＴｈｙＡＰＰｍｕｔマウス（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ、上記参照）の海馬に注射した。ＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧベクター１μＬ（全１Ｅ１０ＧＣ）による一側注射から１か月後に脳の５μｍの矢状切片をＩＨＣ処理し、Ｈｉｓタグ反応性およびＡβプラークについて染色した。右の画像は、注射部位から近位（１）～遠位（６）の個々のプラークＲＯＩを示す（Ａで付番）。画像は、６ｘＨｉｓ（配列番号９）免疫染色（緑色）およびＤＡＰＩ（青色）と重ね合わせた（図５Ａ）。予想したように、大量のプラーク形成が皮質の至る所に観察され（図５Ａ、左）、抗Ｈｉｓ抗体による染色がプラークと共局在した（図５Ａ、右）。注目すべきことには、ＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧが発現した海馬および後頭皮質領域からより遠位のプラークに対する６ｘＨｉｓ（配列番号９）標識の強度に、漸進的であるが広範囲に及ぶ低下が見られ、これによりプラーク結合ｓｃＦｖ－ＩｇＧの明らかな濃度勾配が存在することが示され、海馬から遠位のプラークでは、注射部位に近いプラークよりも漸進的に低いレベルの結合ｓｃＦｖ－ＩｇＧが示された。このようなデータによって、抗ＡβｓｃＦｖ－ＩｇＧが、海馬の細胞から発現および分泌され、これにより注射部位から遠位のプラークに結合することが可能となることが示される。

データによって、ウイルスベクターにより送達されたｓｃＦｖ－ＩｇＧが、生理学的に適切な標的にｉｎ ｖｉｖｏで結合する証拠がもたらされた。次いで、発明者らは、アミロイド症のこのマウスモデルにおける長期発現により、プラーク形成が減少し得るかどうかを判定した。以下は、試験デザインの概略である。２か月齢のＴｈｙＡＰＰｍｕｔ雄マウス（プラークが形成を開始するおよその年齢）の４つの群の海馬に、ＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＡＡＶ対照ベクター、ＡβＩｇＧまたは対照アイソタイプＩｇＧのいずれかを一側注射した。このような群は、１０ｍｇ／ｋｇのマウス抗Ａβ抗体（ＡβＩｇＧ）またはアイソタイプ対照抗体の毎週のＩＰ注射による受動免疫療法で処置した動物と比較した（図５Ｂ、左）。処置から１６週（４か月）後に脳を採取し、冠状切片をアミロイドプラークまたは６ｘＨｉｓ（配列番号９）について免疫染色し、導入遺伝子発現について解析した。ＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧは、注射した海馬の至る所に発現し、細胞体のαＨｉｓ染色によって明らかなように、ベクターの対側海馬台への明らかな輸送も存在した（図５Ｂ、右）。皮質および海馬におけるＡβプラーク負荷を、冠状脳切片における抗Ｈｉｓ ＩＨＣにより定量した。両半球のＲＯＩは、複合して定量し、プラーク負荷は、ＤＡＢ陽性染色として、組織ＲＯＩ領域のパーセントとして表した。これらのそれぞれの対照と比較して、対照群間のプラーク負荷における差にもかかわらず、ＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧの単回注射により、αＡβＩｇＧ評価基準と同一規模のプラークの減少が海馬において生じた（図５Ｃ）。プラークの減少は皮質においても有意に低下し（図５Ｃ）、ｓｃＦｖ－ＩｇＧが発現部位から拡散して遠位のプラークに結合する証拠と一致した。

このような結果によって、アミロイドマウスモデルにおけるＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧの単回注射により、注射部位から耐久的に発現および分泌されて、脳の至る所でプラークに結合することが実証された。１６週間毎週の１０ｍｇ／ｋｇの抗ＡβＩｇＧの典型的受動免疫療法レジメンでは、ＴｈｙＡＰＰｍｕｔ動物におけるアミロイドプラーク形成の有意な減少が生じた。対照的に、ＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧの単回頭蓋内注射では、発現から４か月後に、匹敵する有効性が生じた。

要約すると、上記の試験では、ｓｃＦｖ－ＩｇＧは、アミロイドプラーク負荷をｉｎ ｖｉｖｏで減少させる原線維性および線維性Ａβ種に特異的な抗体に由来した。発明者らによるｓｃＦｖ－ＩｇＧは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで良好に発現し、精製および後続のＳＰＲによる抗原結合親和性の解析が可能となった。ＩｇＧ型と比較して、ｓｃＦｖ－ＩｇＧは、抗原に同程度まで結合した。ＡＡＶ１は、このカプシドによって実質注射後にＣＮＳにおけるベクターの伝播が促進されるため、この効能のための血清型として選択された。この血清型は、神経細胞に主に感染するが、一部の非神経細胞型にも形質導入し、導入遺伝子発現に利用可能な細胞の潜在的レパートリーが拡大する。相対的に高い投与量（海馬に１Ｅ１０ＧＣ）を使用すると、注射部位における定常状態レベルは、発明者らが比較のために選択した受動ＩｇＧ評価基準により最大限に達成し得るレベルよりも３～４倍高くなった（２０ｍｇ／ｋｇの精製ＩｇＧのＩＶ注射から２４時間後の脳における抗体レベル）。末梢におけるＩＶによる約６０ｍｇ／ｋｇの投与量が、ＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧベクターにより達成されるレベルに達するのに必要とされる。

単回注射の後、海馬における発現は、少なくとも４か月間持続し、タンパク質濃度は、注射部位から数ミリメートル遠位の脳領域であっても、受動免疫療法評価基準を上回った。６ｘＨｉｓ（配列番号９）陽性細胞が、注射部位またはニードル路を遥かに超えて見出されなかったため（データ非提示）、形質導入細胞が、注射部位から遊走して海馬から遠位の領域においてタンパク質を分泌するとは考えにくい。ＴｈｙＡＰＰｍｕｔマウスにおけるこのベクターの長期発現により、皮質（５２％減少）および海馬（８７％減少）の両方におけるプラークの減少が生じた。これは、ｓｃＦｖを利用する他の試験により観察されたものよりも効率的な減少であり、ここで、プラークの減少は０～６０％の範囲に及んだ（Ｌｅｖｉｔｅｓ、２００６、上記参照；Ｌｅｖｉｔｅｓ、２０１５、上記参照；Ｋｏｕ、上記参照；Ｆｕｋｕｃｈｉ、上記参照；およびＷａｎｇら、Ｂｒａｉｎ、Ｂｅｈａｖｉｏｒ，ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０１０）２４：１２８１～９３）。ＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧの単回頭蓋内注射により処置した動物におけるプラーク減少の観察された規模は、１０ｍｇ／ｋｇの抗Ａβ抗体の４か月間毎週のＩＶ注射により処置した動物と同様であり、長期治療範例に対する遺伝子送達の有用性に光を当てた。

Claims (18)

1. 神経系の細胞において２価結合メンバーを発現させる方法であって、抗体重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）、抗体軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）およびＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドをコードする発現カセットを該細胞に導入する工程を含み、該Ｖ_Ｈおよび該Ｖ_Ｌが、標的タンパク質に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、該ポリペプチドの２つの分子が、細胞内で発現すると、該標的タンパク質に特異的なジスルフィド結合ホモ２量体２価結合メンバーを形成する、前記方法。
2. 神経系の細胞が、ニューロン；場合により、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、周皮細胞、シュワン細胞および小グリア細胞から選択されるグリア細胞；上衣細胞、ならびに脳上皮細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 細胞がヒト細胞である、請求項２に記載の方法。
4. 細胞が、患者の脳における細胞である、請求項３に記載の方法。
5. 標的タンパク質が、脳において発現されるタンパク質である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. タンパク質が、アミロイドベータペプチド（Ａβ）、タウ、ＳＯＤ－１、ＴＤＰ－４３、ＡｐｏＥまたはαシヌクレインである、請求項５に記載の方法。
7. ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端に
   （ｉ）Ｖ_Ｈ、ペプチドリンカーおよびＶ_Ｌ；またはＶ_Ｌ、ペプチドリンカーおよびＶ_Ｈ、ならびに
   （ｉｉ）ＩｇＧ Ｆｃ領域
   を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. ペプチドリンカーが、ＧＧＧＧＳの配列（配列番号３）を含む、請求項７に記載の方法。
9. ２価結合メンバーが、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合するが、ＩｇＧ Ｆｃ領域における１つまたはそれ以上の変異のため、Ｆｃガンマ受容体には結合しない、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 導入する工程が、発現カセットをゲノム中に含む組換えウイルスを投与する工程を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 組換えウイルスが、頭蓋内注射、くも膜下腔内注射または大槽内注射により患者の脳に導入される、請求項１０に記載の方法。
12. 組換えウイルスが、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項１０または１１に記載の方法。
13. 組換えＡＡＶが、血清型１または２の組換えＡＡＶである、請求項１２に記載の方法。
14. ポリペプチドの発現が、構成的活性プロモーターまたは誘導性プロモーターの転写制御下にある、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 患者が神経変性疾患を有する、請求項４～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 患者が、アルツハイマー病、脳アミロイド血管症、シヌクレイン病、タウオパシーまたは筋萎縮性側索硬化症を有する、請求項１５に記載の方法。
17. 請求項４～１６のいずれか１項に記載の方法における、それを必要とする患者の治療における使用のための２価結合メンバー。
18. 請求項４～１６のいずれか１項に記載の方法における、それを必要とする患者の治療のための医薬の製造のための２価結合メンバーの使用。

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