KR20220009986A - 신경계에서의 항원 결합 단백질의 발현 - Google Patents

신경계에서의 항원 결합 단백질의 발현 Download PDF

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Abstract

본원에서는 2가 결합 멤버를 발현하는 재조합 벡터, 및 신경 퇴행성 질환과 같은 신경 질환을 갖는 환자의 뇌에서 결합 멤버를 발현하도록 신경계의 세포를 개질하기 위해 벡터를 사용하는 방법이 제공된다.

Description

신경계에서의 항원 결합 단백질의 발현
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 이의 전문은 본원에서 참고로 포함된다. 2020년 4월 30일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 022548_WO060_SL.txt로 명명되고, 7,612 바이트의 크기를 갖는다.
알츠하이머병(AD)은 기억 상실 및 인지 기능 저하를 초래하는 진행성 신경 퇴행을 특징으로 한다. 이의 병리학적 특징은 세포 외 아밀로이드 플라크 및 뉴런 내 tau 섬유소의 축적을 포함한다. 아밀로이드 베타(Aβ)를 표적화하는 요법은 AD에서의 이의 유전적 및 병리학적 연관성으로 인해 오랜 세월 동안 활발하게 연구가 이루어져 왔다(문헌[Tcw and Goate, Cold Spring Harb Perspect Med. (2017) 7(6): pii a024539]). 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 및 Aβ의 수준 증가가 AD 병인과 연관되어 있지만, Aβ 펩타이드는 상이한 구도 및 섬유질 상태로 존재하며, 어떠한 종이 치료 이점을 위해 표적화되어야 하는지 명확하지 않다(문헌[Benilova et al., Nat Neurosci. (2012) 15: 349~57]).
이러한 불확실성에도 불구하고, 다양한 형태의 Aβ에 대항하는 수동 면역 요법이 진료소에서 광범위하게 시험되고 있었지만, 이들 접근법은 추가적인 문제로 인해 방해받고 있다. 먼저, 혈액-뇌 장벽(BBB)은 대형 생체 분자의 수송을 방해하여, 뇌에서의 치료적 관련 수준에 도달하도록 말초부에서의 높은 용량의 주사가 필요하게 된다. 높은 용량에서, 임상 시험에서 몇몇 항-Aβ 항체는 아밀로이드-관련 영상 이상(ARIA)으로 대표되는 역반응을 야기하고; 혈관 아밀로이드 부위에서 항체 축적에 의해 이들 역반응이 야기되어 Fc 의존성 효과기 기능을 통한 국소 염증을 촉발하는 것으로 여겨진다(문헌[Mo et al., Ann Clin Transl Neu. (2017) 4: 931~42]). 둘째로, 최소 치료 용량을 초과하는 수준을 유지할 필요가 있으며, 이로 인해 상당한 원가 비용뿐만 아니라 환자 참여 및 순응을 요구하는 장기간 수동 면역 요법이 요구된다.
중추 신경계(CNS) 내로의 유전자 전달은 뉴런 세포 내의 치료용 단백질의 생성을 가능케 하여 BBB를 회피한다. 전체 면역 글로불린(IgG) 또는 단쇄 가변 절편(scFv)의 AAV-매개 발현이 CNS 내에서 시도되고 있지만, 이들 접근법 둘 모두는 고유의 한계를 갖는다(문헌[Sudol et al., Mol Ther. (2009) 17: 2031~40]; 문헌[Ryan et al., Mol Ther. (2010) 18: 1471~81]; 문헌[Levites et al., J Neurosci. (2006) 26: 11923~28]; 문헌[Levites et al., J Neurosci. (2015) 35: 6265~76]; 문헌[Kou et al., JAD. (2011) 27: 23~38]; 문헌[Fukuchi et al., Neurobio Dis. (2006) 23: 502~11]; 문헌[Liu et al., J Neurosci. (2016) 36: 12425~35]). CNS에서의 IgG의 중쇄 및 경쇄 발현은 오직 단일 프로모터 카세트로부터 사슬 둘 모두를 생성하기 위해 자가 개열성 F2A 서열을 사용하여 달성되었다. F2A 펩타이드는 중쇄 또는 경쇄에 부착된 상태로 남아 있으며, 잠재적으로 면역원성이다(문헌[Saunders et al., J Vir. (2015) 89: 8334~45]). 반면, scFv 단백질의 유전자 기반 전달은 종종 원자가의 손실로 인해 실질적인 친화도 손실을 동반한다. 또한, Fc 영역의 제거는 FcRn 결합 손실을 초래하여, 말초부에서의 반감기 단축 및 역 트랜스사이토시스(reverse transcytosis)를 통한 뇌로부터의 항원(Ag) 결합형 scFv의 유출 감소를 야기한다(문헌[Deane et al., J Neurosci. (2005) 25: 11495~503]; 문헌[Boado, et al., Bioconjug Chem. (2007) 18: 447~55]; 문헌[Zhang et al., J Neuroimm. (2001) 114: 168~72]; 문헌[Schlachetzki et al., J Neurochem. (2002) 81: 203~6]). 이로 인해, 알츠하이머병과 같은 CNS 질환에 대한 항체 요법은 전망은 있지만, 치료용 단백질을 병든 뇌에 도입하는 문제로 인해 제한되어 왔다. 따라서, 항체 기반 요법에 대한 중추 신경계 접근성을 향상시킬 필요가 있다.
본 개시내용은 신경계의 세포에서 2가 결합 멤버를 발현하는 방법을 제공하는 것으로, 이 방법은 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 IgG Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 카세트를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하며, 이때 VH 및 VL은 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, 세포에서의 발현 시 폴리펩타이드의 2개의 분자는 표적 단백질에 특이적인 이황화-결합된 단독 이량체성 2가 결합 멤버를 형성한다.
일부 실시형태에서, 신경계의 세포는 뉴런, 교질 세포, 뇌실막 세포 또는 뇌 상피세포이다. 추가의 실시형태에서, 교질 세포는 희소돌기아교세포, 성상세포, 혈관주위세포, 슈반 세포 및 미세아교세포로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포는 인간 세포, 예를 들어 인간 환자의 뇌에 있는 세포이다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질은 뇌에서 발현되는 단백질이며, 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ), tau, SOD-1, TDP-43, ApoE 또는 α-시누클레인일 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는, N 말단에서 C 말단까지, (i) VH, 펩타이드 링커 및 VL; 또는 VL, 펩타이드 링커 및 VH; 및 (ii) IgG Fc 영역을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 펩타이드 링커는 서열: GGGGS(서열 번호 3)을 포함하고; 예를 들어, 펩타이드 링커는 [G4S]3의 서열(서열 번호 2)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 2가 결합 멤버는 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합하지만, 이는 IgG Fc 영역 내의 하나 이상의 돌연변이로 인해 Fc 감마 수용체에는 결합하지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 발현 카세트를 함유하는 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함한다. 바이러스 벡터는 재조합 바이러스일 수 있다. 추가의 실시형태에서, 재조합 바이러스는 두개 내 주사, 경막 내 주사 또는 대수조 내 주사를 통해 환자의 뇌에 도입된다. 예를 들어, 재조합 바이러스는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV), 예를 들어 혈청형 1 또는 2의 rAAV일 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드의 발현은 구성적 활성 프로모터 또는 유도성 프로모터의 전사 조절 하에 있다.
본 발명의 방법은 신경 퇴행성 질환, 예를 들어 알츠하이머병, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 시누클레오병증, 타우병증 또는 근위축성 측색 경화증(ALS)을 갖는 환자를 치료하는데 사용될 수 있다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 신경 퇴행성 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것으로, 이 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 본 개시내용의 2가 결합 멤버를 발현하는, 본원에 개시되어 있는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 이를 필요로 하는 환자를 치료하는데 사용하기 위한 2가 결합 멤버, 및 이를 필요로 하는 환자의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한 2가 결합 멤버의 용도를 제공하며, 이때 환자는, 예를 들어 알츠하이머병, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 시누클레오병증, 타우병증 또는 ALS와 같은 신경 퇴행성 질환을 갖는다.
발명의 기타 특징, 목적 및 이점은 하기 상세한 설명에서 자명하다. 그러나, 상세한 설명이 본 발명의 실시형태 및 양태를 나타낼지라도 예시에 의해서만 제공되며, 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 당업자에게 있어서 본 발명의 범주 내에서의 다양한 변경 및 변형은 상세한 설명으로부터 자명하게 될 것이다.
도 1a 내지 도 1c는 AAV-IgG 벡터의 구축 및 특성분석을 보여준다.
도 1a는 완전한 중쇄 및 경쇄 발현에 대한 벡터 설계를 보여준다. 게놈의 크기가 표시되어 있다.
도 1b의 좌측 패널은 PBS가 주사된 대조군 마우스로부터 측정된 huIgG와 비교할 때 뇌로부터의 AAV-αAβ IgG의 지속적인 발현 및 분비를 보여준다. 그래프의 점은 평균 ± SEM(n = 그룹 당 8 마리의 마우스)을 나타낸다. 우측 패널은 통상의 말초에 투여된 αAβ IgG 대비 뇌에서의 AAV-αAβ IgG의 AAV-매개 발현의 동역학을 보여준다. 그래프는 평균 ± SEM을 보여준다. **p < 0.01, 주사 후 7주째 날의 1-방향 ANOVA, n = 시점 당 5마리의 마우스.
도 1c는 해마 전체에서 huIgG 이식 유전자를 발현하는 뉴런(상세하게 도시된 CA2), 및 인근에서 또한 huIgG를 발현하는 일부 GFAP+ 성상세포의 유색 마이크로그래프를 보여준다. Cc = 뇌량. 녹색: 인간 IgG(huIgG). 적색: 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP). 청색: DAPI.
도 2a 및 도 2b는 알츠하이머병의 마우스 모델에서 AAV-αAβ IgG에 의한 항원 결합을 보여준다.
도 2a는 두개 내 (AAV-αAβ IgG 또는 AAV-IgG 대조군) 및 말초 투여(αAβ IgG)를 위한 연구 설계를 보여준다.
도 2b는 해마 및 상부 피질 전체에서의 AAV-αAβ IgG 또는 AAV-IgG 대조군의 발현을 보여준다. 우측 패널 상의 이미지는 전두 피질에서 플라크에 결합한 IgG를 보여준다. 기준자 = 10 ㎛. 청색: DAPI. 녹색: huIgG. Red: 4G8+ GFAP.
도 3a 내지 도 3c는 AAV-αAβ IgG 뉴런 발현 및 신경 독성을 평가한 것을 보여준다.
도 3a의 좌측 패널은 PBS(모조)가 주사된 동물 또는 AAV-αAβ IgG 그룹에서와 같이 등가 수준의 huIgG가 들어 있는 모조 뇌 균질물과 비교하여 AAV-αAβ IgG가 주사된 SCID 마우스의 반뇌 용해물(hemibrain lysate)에서 유래한 huIgG 중쇄 및 경쇄로부터의 검출된 펩타이드를 보여준다. 우측 패널은 SCID 마우스에서 중심 또는 말초에서 발현된 총 huIgG와 비교하여 기능성 huIgG를 정량화한 것을 보여준다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타나 있다. **p < 0.01, 쌍을 이루지 않은 스튜던트 t-검정(unpaired Student's t-test).
도 3b의 좌측 패널은 PBS 대조군과 비교하여 16주 동안의 해마 내 AAV-αAβ msIgG 발현 이후에 C57BL/6 마우스 뇌 해마에 대한 H&E 염색을 보여준다. 삽도는 세부사항을 보여주며, 화살표는 대표적인 유리질(hyaline) 봉입체를 나타낸다. 기준자 = 100 ㎛. 결과는 이러한 병이 있든지 없든지 점수가 매겨진 동물의 수로서 우측 패널의 표에 요약되어 있다.
도 3c는 PBS 대비 면역 조직 화학(IHC) 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP) 분석에 의한 신경 염증의 증거를 보여준다. 좌측 패널은 GFAP+ 면적에 대한 정량적 IHC를 보여준다. 우측 패널에서, 각각의 원은 한 마리의 마우스를 나타낸다. 막대는 PBS로 정규화된 GFAP+ 면적의 그룹 평균 ± SEM을 나타낸다. ***p < 0.001, 쌍을 이루지 않은 스튜던트 t-검정, n = 그룹 당 8마리의 마우스.
도 4a 내지 도 4c는 AAV-scFv-IgG 벡터의 구축 및 특성분석을 보여준다.
도 4a의 좌측 패널은 scFv-IgG 설계의 개략도를 보여준다. 중앙 패널은 정제된 scFv-IgG의 환원 또는 비환원 SDS-PAGE 분석에 의해 단백질의 순도 및 적절한 이황화물 의존성 이량체화가 증명되었다는 것을 보여준다. 우측 패널의 표는 IgG 포맷과 scFv-IgG의 항원 결합 친화도(M)를 비교한 것이다.
도 4b의 좌측 패널은 AAV를 C57BL/6 마우스 내에 말초 IV 주사한지 1개월 후에 항원 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA)에 측정된 바와 같은 AAV-scFv-IgG의 혈청 발현을 보여준다. 우측 패널은 AAV-scFv-IgG의 뇌 발현을 보여준다. ***p < 0.001, 쌍을 이루지 않은 스튜던트 t-검정, n = 두개 내 주사의 경우에 그룹 당 5마리의 마우스, IV 주사의 경우 그룹 당 2마리의 마우스.
도 4c의 좌측 패널은 벡터의 해마 표적화, 및 도 4b의 우측 패널에서와 같이 동일한 동물에서 채취한 마우스 뇌의 시상 단면에 대한 IHC 이후에 해마 형성체 전반에 걸친 형질 도입을 보여준다. 우측 패널은 AAV-scFv-IgG의 양쪽 해마 주사 이후의 다양한 절개된 뇌 영역에서의 scFv-IgG의 ELISA 기반 정량화를 보여준다. Hipp = 해마. Ctx = 상부 피질 영역. Str = 선조체.
도 5a 내지 도 5c는 항-Aβ scFv-IgG의 발현, 확산 및 플라크 결합을 보여준다.
도 5a는 항-Aβ AAV-scFv-IgG를 이용한 주사 1개월 후의 성체 마우스의 해마 및 상부 피질을 전체 스캐닝한 것을 보여준다. 단면은 Aβ 플라크(4G8; 적색) 및 6x His(서열 번호 9)(녹색)에 대해 면역 염색되어 있다. 기준자 = 300 ㎛. Cc = 뇌량. 우측 패널 상의 이미지는 주사 부위에서의 근위부(1) 내지 원위부(6)에 있는 개개의 플라크 ROI(A로 번호가 매겨짐)를 보여준다. 피질 전반(좌측 패널)에서, 그리고 플라크와 동시 국부화된 항-His 항체에 의한 염색(우측 패널)을 통해 풍부한 플라크 형성이 관찰되었다. 관심 영역(ROI)은 직경이 150 ㎛이다. 적색: 4G8. 녹색: 항-HIS 항체. 청색: DAPI.
도 5b의 좌측 패널은 연구 설계의 개요를 보여준다. 우측 패널 상의 이미지는 AAV가 주사된 마우스의 관상 단면으로부터의 해마를 보여준다. IHC에 따르면 대측성 해마의 추가적인 형질 도입과 함께 주사된 측면 상의 해마 전반에 걸친 표지(적색 화살표)가 나타나 있다. AAV 없이 주사된 뇌는 임의의 항-His 표지를 나타내지 않았다. 기준자 = 1 ㎜.
도 5c는 각각의 개별 그룹으로부터의 동물의 피질 및 해마에서의 플라크 침착을 정량화한 것을 보여준다. N = 그룹 당 10마리 내지 13마리의 동물, 동물 당 3개의 단면. ***p < 0.001 다중 비교 기능이 있는 1-방향 ANOVA. 오차 막대는 평균의 표준 오차(SEM)를 나타낸다.
본 개시내용은 현재의 발현 방법을 이용하여 나타나는 부작용 없이 신경계의 세포에서 2가 결합 멤버를 발현하는 방법을 제공한다. 신경계의 세포는 자연적으로 항체를 발현하지 않는다. 이전 연구에 따르면 뇌에서의 완전한 항체의 발현은 신경 독성을 야기하는 것으로 나타나 있다. 뇌세포에서 야생형 IgG를 발현하는 통상적인 방법과 비교하여, 본 개시내용의 발현 방법은 예상외로 더 높은 수율(예를 들어, 2배 또는 그 이상) 및 더 낮은 독성(예를 들어, 주사 부위에서의 검출 가능한 뉴런 내 유리질 단백질 축적의 결여에 의해 나타나 있는 바와 같음)을 제공한다. 이론과 결부되지 않으면서, 본 발명자들은 신경계 내의 세포가 천연 항체를 효율적으로 발현 및 조립하도록 구비된 것이 아니며, 쌍을 이루지 않은 항체 사슬이 세포에 유해한 봉입체를 형성한다는 것을 고려하고 있지만; 본 발명의 발현 방법은 발현될 폴리펩타이드 사슬의 개수를 2개에서 하나로 줄임으로써 이러한 문제를 극복한다. 또한, 본 발명의 발현 방법은 뇌에서 scFv를 발현하는 이전 방법보다 이점을 갖는데, 이는 본 발명의 방법이 보다 높은 결합력(avidity) 및 보다 양호한 약동학적 프로파일(예를 들어, 반감기)을 갖는 결합 분자의 발현을 가능케 하기 때문이다.
신경계의 세포
본 개시내용은 신경계의 세포가 뇌 및 척수를 포함하는 중추 신경계와 같은 신경계에서 발현되는 표적 단백질에 특이적인 2가 분자를 발현(예를 들어, 분비를 포함함)하도록 하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 결합 멤버를 발현하기 위한 신경계의 세포는 신경계에서의 임의의 세포 유형, 예를 들어 뇌에서의 임의의 세포 유형을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 뉴런 세포(예를 들어, 중간 뉴런, 운동 뉴런, 감각 뉴런, 뇌 뉴런, 도파민 작동성 뉴런, 콜린 작동성 뉴런, 글루탐산 작동성 뉴런, GABA 작동성 뉴런 또는 세로토닌 작동성 뉴런); 교질 세포(예를 들어, 희소돌기아교세포, 성상세포, 혈관주위세포, 슈반 세포 또는 미세아교세포); 뇌실막 세포; 또는 뇌 상피세포에서 결합 멤버를 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 세포는 인간 세포이다. 또한, 세포는 인간 뇌의 임의의 표적화된 영역, 예를 들어 해마, 피질, 기저핵, 중뇌 또는 후뇌에 위치한 것들일 수 있다.
2가 결합 멤버
본 개시내용은 신경계의 세포에서 발현되고, 뇌와 같은 신경계에서 발현된 표적 항원과 결합하는 2가 결합 멤버를 제공한다. 표적 항원은, 예를 들어 신경 퇴행성 질환과 같은 신경 질환을 매개하는 단백질일 수 있다. 관심 항원으로는 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ), tau, SOD-1, TDP-43, ApoE 및 α-시누클레인을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
2가 결합 멤버는 폴리펩타이드 사슬의 단독 이량체이며, 이때 폴리펩타이드 사슬은 항원 결합 도메인 및 항체의 불변 영역(예를 들어, 인간 IgG와 같은 IgG의 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인)을 포함한다. 따라서, 단독 이량체는 2개의 항원 결합 부위 및 항체의 하나의 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 사슬의 항원 결합 도메인은 단쇄 Fv(scFv) 도메인이다. scFv 도메인은 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며, 이때 VH 및 VL은 선택적으로 펩타이드 링커에 의해 분리되고, 상호작용을 하여 항원 결합 부위를 형성한다. 관심 항원에 대한 scFv 폴리펩타이드를 수득하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 당업자라면 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하여 높은 친화도를 갖는 항원에 결합하는 VH 및 VL 조합을 수득할 수 있거나, 당업자라면 항원에 특이적으로 결합하는 기존의 항체로부터 VH 및 VL 서열을 유도할 수 있다.
scFv 도메인과 같은 항원 결합 도메인은 펩타이드 링커(예를 들어, 9-Gly 반복 링커(서열 번호 7)를 포함한, 본원에 예시된 링커)가 있든지 없든지 항체의 불변 영역에 융합될 수 있으며, 이때 2개의 폴리펩타이드 사슬의 불변 영역은 하나 이상의 이황화 결합을 통해 항체 Fc 도메인을 형성한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"이란 용어는 면역 글로불린의 하나 이상의 불변 도메인의 이량체 연합에 의해 형성된 천연 면역 글로불린의 일부를 지칭한다.
일부 실시형태에서, Fc 도메인의 각각의 폴리펩타이드 서열은 파파인 개열 부위의 바로 상류에 있는 힌지 영역에서 시작하여 Ig 중쇄의 C-말단에서 끝나는 단일 면역 글로불린(Ig) 중쇄의 일부를 포함할 수 있다. Fc 도메인은 힌지 영역, 면역 글로불린의 CH2 및 CH3을 포함할 수 있다. Fc 도메인이 유래하는 Ig 동형에 따라 Fc 도메인은 추가의 불변 도메인(예를 들어, IgE 또는 IgM의 CH4 도메인)을 포함할 수 있다. Fc 도메인은, 예를 들어 융합 이량체 단백질의 안정성(예를 들어, 반감기)을 향상시키고/시키거나 융합 이량체 단백질의 효과기 기능을 개질하기 위해 야생형 서열 대비 돌연변이를 함유할 수 있다. 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환일 수 있다.
일부 실시형태에서, Fc 도메인은 인간 IgG와 같은 IgG에서 유래하고, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형과 같은 임의의 IgG 아형을 가질 수 있다. 이 같은 경우, 본 개시내용의 scFv-Fc는 scFv-IgG로도 지칭된다. Fc 도메인은 전체 힌지 영역을 포함할 수 있거나, IgG, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 힌지 영역의 이의 일부만을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1에서 유래하며, Fc 도메인이 고친화도 Fc 감마(γ) 수용체(들)에 결합하지 않고 감소된 ADCC/CDC 효과기 기능을 갖도록 돌연변이 L234A 및 L235A("LALA")(EU 넘버링)를 포함한다. 인간 IgG1에 도입될 수 있는 기타 Fc 돌연변이로는 N297Q, N297A, N297G, C220S/C226S/C229S/P238S, C226S/C229S/E233P/L234V/L235A 및 L234F/L235E/P331S(EU 넘버링)를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Wang et al., Protein Cell. (2018) 9(1): 63~73]; 문헌[Strohl, Curr Opin Biotechnol. (2009) 20(6): 685~91]; 문헌[Johnson et al., Nat Med. (2009) 15(8): 901~6]을 참조한다. 일부 실시형태에서, 결합 멤버는 인간 IgG4에서 유래한 힌지 영역을 가지며, 이때 힌지 영역은 결합 멤버의 2개의 폴리펩타이드 사슬의 해리를 감소시키기 위해 S228P 돌연변이(EU 넘버링)를 함유한다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 인간 IgG4에서 유래하고, Fcγ 반분자 교환 및 효과기 기능을 각각 감소시키는 돌연변이 S228P 및 L235E(EU 넘버링; 카바트 넘버링(Kabat numbering)에서 S241P 및 L248E에 상응함)를 포함한다(문헌[Reddy et al., J Imm. (2000) 164: 1925~33]). ADCC/CDC 효과기 기능의 상실 또는 감소로 인해 결합 멤버는 세포 독성을 야기하거나 신경계에서 원치 않은 염증을 유발하지 않으면서 표적 항원에 결합하게 된다. 추가의 실시형태에서, 개질된 Fc 도메인은 신생아 Fc 수용체인 FcRn에 결합하는 능력을 보유하고 있다. FcRn 결합 능력의 보유로 인해 항원 결합형 결합 멤버는 FcRn-매개 역 트랜스사이토시스에 의해 뇌와 같은 신경계로부터 제거된다.
일부 실시형태에서, scFv-Fc 결합 멤버의 VH 및 VL 도메인 및/또는 결합 멤버의 scFv 및 Fc 도메인은 펩타이드 링커를 통해 연결된다. 적합한 펩타이드 링커는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Bird et al., Science (1988) 242: 423~26]; 및 문헌[Huston et al., PNAS. (1988) 85: 5879~83]을 참조한다. 펩타이드 링커에는 글리신 및/또는 세린이 풍부할 수 있다. 펩타이드 링커의 예로는 G, GG, G3S(서열 번호 1), G4S(서열 번호 3) 및 [G4S]n(여기서, n은 1, 2, 3 또는 4임; 서열 번호 4)이 있다. 일부 실시형태에서, 9-Gly 반복 링커(서열 번호 7)는 본 개시내용의 scFv-IgG 포맷에서 scFv를 IgG 일부에 연결시키기 위해 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 scFv-IgG는 [G4S]3 유형의 펩타이드 링커(서열 번호 2)를 이용하여 펩타이드 링커를 통해 연결된 가변 도메인을 갖도록 설계된다. [G4S]3 유형의 링커(서열 번호 2)는 scFv 구조에서 가변 도메인을 연결하기 위해 광범위하게 사용되고 있다(상기 Huston 문헌). 본원에서 사용된 바와 같이, [G4S]3 유형의 링커(서열 번호 2)는 [G4S]3(서열 번호 2) 또는 이의 기능성 변이체(예를 들어, [G4S]3(서열 번호 2)로부터 최대 4개의 아미노산 변형(예를 들어, 삽입, 결실 및/또는 치환)을 갖는 펩타이드 링커)를 지칭한다. 예로서, [G4S]3(서열 번호 2)의 기능성 변이체는 아미노산 서열: SGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 5) 또는 아미노산 서열: GGGGSGGGGXGGGGYGGGGS(여기서, X는 S, A 또는 N이고, Y는 A 또는 N임; 서열 번호 6)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 링커의 아미노산 서열은 변형될 수 있다. 변형은 (예를 들어, 유연성을 조절하기 위해) 링커 길이가 변경된 결실 또는 삽입, 또는 아미노산 치환(예를 들어, Gly에서 Ser으로의 치환 또는 그 반대를 포함함)을 포함할 수 있다.
단지 scFv-Fc 폴리펩타이드의 하나의 포맷을 예시하기 위해 Aβ에 대항하는 scFv-Fc 폴리펩타이드가 하기에 나타나 있다. 하기 서열은, N-말단에서 C-말단까지, 신호 펩타이드(이탤릭체), VL, [G4S]3 링커(서열 번호 2)(밑줄), VH, G9(서열 번호 7)(박스), IgG1 힌지 및 Fc 도메인, 및 6x His 태그에 부착된 짧은 링커(서열 번호 9)(볼드체)를 함유한다.
Figure pct00001
신경계에서 결합 멤버의 발현
결합 멤버를 위한 발현 카세트를 함유하는 발현 구조체는 잘 알려져 있는 방법에 의해 신경계의 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 생체 내 또는 생체 외 전달을 위해, 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 발현 벡터는 세포에서 안정한 에피솜으로서 존재한다. 기타 실시형태에서, 발현 벡터는 세포의 게놈 내에 도입된다. 발현 벡터는 신경계의 세포에서 결합 멤버에 대한 암호화 서열을 발현하도록 하는 발현 제어 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 전사 신호 서열 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 적합한 프로모터로는 레트로바이러스 RSV LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서를 포함함), CMV 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서를 포함함), CMV 전 초기 프로모터, SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, EFlα 프로모터, MoMLV LTR, CK6 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터(TTR), TK 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), HBV 프로모터, hAAT 프로모터, LSP 프로모터, 키메라 간-특이적 프로모터(LSP), E2F 프로모터, 텔로머라아제(hTERT) 프로모터 및 CMV 인핸서/닭 β-액틴/토기 β-글로빈 프로모터(CAG 프로모터; 문헌[Niwa et al., Gene (1991) 108(2): 193~9])을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 인간 β-글루쿠로니다아제 프로모터, 또는 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터에 연결된 CMV 인핸서를 포함한다. 프로모터는 구성성, 유도성 또는 억제성 프로모터일 수 있다.
전기 천공, 인산칼슘 침전, 마이크로주사, 양이온 또는 음이온성 리포솜, 핵 국부화 신호와 결합된 리포솜, 자연적으로 발생하는 리포솜(예를 들어, 엑소솜) 또는 바이러스성 형질 도입을 들 수 있지만 이에 제한되지 않는, 뉴클레오타이드 서열을 세포 내로 도입하는 임의의 방법이 이용될 수 있다.
결합 멤버를 위한 발현 카세트의 생체 내 전달을 위해, 바이러스성 형질 도입이 사용될 수 있다. 당해 기술분야에 알려져 있는 다양한 바이러스 벡터, 예를 들어, 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV), 재조합 아데노바이러스, 재조합 레트로바이러스, 재조합 수두 바이러스, 재조합 렌티바이러스 등이 본 개시내용에 사용하기 위해 당업자에 의해 개조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에서 사용된 바이러스 벡터는 rAAV 벡터이다. AAV 벡터는 분화 세포 및 비분화 세포 둘 모두를 감염시키고, 장기간 발현을 위한 안정한 에피솜 구조로서 존재하고, 매우 낮은 면역원성을 갖고 있기 때문에 CNS 유전자 전달에 특히 적합하다(문헌[Hadaczek et al., Mol Ther. (2010) 18: 1458~61]; 문헌[Zaiss, et al., Gene Ther. (2008) 15: 808~16]). 임의의 적합한 AAV 혈청형이 사용될 수 있다. 예를 들어, AAV 혈청형 1, 2 또는 9가 사용될 수 있다. AAV는 이의 캡시드 단백질이 인간에서 감소된 면역원성을 갖도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV1은, 이러한 혈청형이 우수한 실질조직 확산을 나타내기 때문에 사용되며, (대부분의 AAV 벡터와 같이) 뉴런 형질 도입이 우세할지라도 이러한 혈청형은 또한 높은 수준의 단백질 발현 및 분비에 특히 바람직할 수 있는 성상세포를 형질 도입한다.
본원에 기술되어 있는 바이러스 벡터는 당해 기술분야에 알려져 있는 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 임의의 적합한 허용 세포 또는 포장 세포는 바이러스 입자를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 포유동물 또는 곤충 세포가 포장 세포주로서 사용될 수 있다.
재조합 AAV 바이러스와 같은 발현 구조체는 두개 내 주사, 경막 내 주사 또는 대수조 내 주사를 통해 환자의 뇌에 도입될 수 있다.
응용
본 개시내용의 발현 방법은 치료용 결합 멤버를 환자의 신경계로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 이어서, 결합 멤버는 신경계에서 형질 감염/형질 도입된 세포로부터 발현 및 분비될 것이며, 뇌와 같은 신경계에서 국부적으로 이의 치료 활성을 발휘할 것이다. 이들 방법은 알츠하이머병(예를 들어, Aβ 및 ApoE), 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 시누클레오병증(예를 들어, α-시누클레인), 타우병증(예를 들어, tau) 또는 ALS(예를 들어, SOD-1 및 TDP-43(문헌[Pozzi et al., JCI (2019) doi:10.1172/JCI123931])), 파킨슨병(예를 들어, α-시누클레인), 치매(예를 들어, tau(문헌[Sigurdsson, J Alzheimers Dis. (2018) 66(2): 855~6])), 루이소체 증후군(예를 들어, α-시누클레인(문헌[Games et al., J Neurosci. (2014) 34(28): 9441~54])), 헌팅턴병(예를 들어, 문헌[Huntingtin(WO2016016278)]) 및 다계통 위축증(예를 들어, P25α 및 α-시누클레인(상기 Games 문헌))과 같은 신경 퇴행성 질환에서 병원성 항원을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 신경 퇴행성 질환은 알츠하이머병이다. 신경계에서 국부적으로 발현되는 결합 멤버는 병원성 항원을 표적화하여 뇌와 같은 신경계 밖으로 제거할 것이다.
따라서, 본 개시내용은 신경 질환(예를 들어, 신경 퇴행성 질환)의 치료를 필요로 하는 인간 환자와 같은 개체에서 신경 질환(예를 들어, 신경 퇴행성 질환)을 치료하는 방법을 제공하며, 이때 이 방법은 신경계의 세포에서 활성을 갖는 전사 조절 요소(들)에 작동 가능하게 연결된 표적 항원에 대한 결합 멤버의 암호화 서열을 포함하는 바이러스 벡터(예를 들어, rAAV)를 개체의 신경계에 치료적 유효량(예를 들어, 목적하는 치료 효과를 야기하기 위해 결합 멤버의 충분한 발현을 허용하는 양)으로 도입하는 단계를 포함한다.
약학 조성물
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 재조합 게놈이 scFv-Fc 결합 멤버를 위한 발현 카세트를 포함하는 재조합 rAAV와 같은 바이러스 벡터를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물은 물, 식염수(예를 들어, 인산 완충 식염수), 덱스트로오스, 글리세롤, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴, 덱스트란, 알부민 또는 펙틴과 같은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 조성물은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정제, 또는 약학 조성물의 효과를 향상시키는 기타 시약과 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 약학 조성물은 리포솜, 나노캡슐, 마이크로입자, 미소구체, 지질 입자 및 소낭과 같은 전달 비히클을 함유할 수 있다.
개체에 대한 rAAV의 전달은, 예를 들어 정맥 내 투여에 의해 달성될 수 있다. 특정한 경우, rAAV를 뇌 조직, 척수, 뇌척수액(CSF), 뉴런 세포, 교질 세포, 뇌척수막, 성상세포, 희소돌기아교세포, 간극 공간 등에 국부적으로 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 경우, 재조합 AAV는 선조체 및 신경근 접합부 또는 소뇌 소엽뿐만 아니라 심실 영역 내로의 주사에 의해 CNS에 직접 전달될 수 있다. AAV는 정위 주사(stereotactic injection)와 같이 당해 기술분야에 알려져 있는 신경 외과적 기법을 이용하여 바늘, 카테터 또는 관련 장치에 의해 전달될 수 있다(예를 들어, 문헌[Stein et al., J Vir. (1999) 73: 3424~9]; 문헌[Davidson et al., PNAS. (2000) 97: 3428~32]; 문헌[Davidson et al., Nat Genet. (1993) 3: 219~23]; 및 문헌[Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther. (2000) 11: 2315~29] 참조).
투여 경로로는 대뇌 내, 경막 내, 두개 내, 대뇌 내, 심실 내, 경막 내, 대수조 내, 정맥 내, 비강 내 또는 안 내 투여를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는, 예를 들어 경막 내 및/또는 대뇌 내 주사 또는 대수조 내 주사를 통한 뇌척수액(CSF) 내로의 직접 투여 이후 CNS 조직 전체로 확산된다. 기타 실시형태에서, 바이러스 벡터는 정맥 내 투여 이후에 혈액-뇌 장벽을 가로지르며, 개체의 CNS 조직 전반에 널리 퍼진 분포를 구현한다. 일부 양태에서, 바이러스 벡터는 특유의 CNS 조직 표적화 능력(예를 들어, CNS 조직 주향성(tissue tropism))을 가지며, 이로 인해 안정하고 독성이 없는 유전자 전달이 높은 효율로 구현된다.
일례로서, 약학 조성물은, 예를 들어 환자의 전뇌의 심실 영역(예를 들어, 우측 측뇌실, 좌측 측뇌실, 제3 뇌실 또는 제4 뇌실) 내로의 심실 내 투여를 통해 환자에 제공될 수 있다. 약학 조성물은 대뇌 내 투여, 예를 들어 뇌의 대뇌, 수질, 뇌교, 소뇌, 두개 내 공동, 뇌척수막, 경뇌막(dura mater), 거미막(arachnoid mater) 또는 연뇌막(pia mater) 내에 또는 그 주변에 조성물의 주사를 통해 환자에 제공될 수 있다. 일부 경우, 대뇌 내 투여는 뇌를 둘러싸는 거미막하 공간(subarachnoid space)의 뇌척수액(CSF) 내로 약제의 투여를 포함할 수 있다.
일부 경우, 대뇌 내 투여는 정위 절차를 이용한 주사를 수반한다. 정위 절차는 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 전형적으로 특정 대뇌 내 영역, 예를 들어 심실 영역으로 주사를 가이딩하기 위해 함께 사용되는 컴퓨터 및 3차원 스캐닝 장치의 사용을 수반한다. 마이크로주사 펌프(예를 들어, 월드 프리시전 인스트루먼츠(World Precision Instruments))가 사용될 수 있다. 일부 경우, 마이크로주사 펌프는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 전달하기 위해 사용된다. 일부 경우, 조성물의 주입 속도는 1 ㎕/분 내지 100 ㎕/분의 범위이다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 주입 속도는, 예를 들어 개체의 종, 개체의 나이, 개체의 체중/크기, AAV의 혈청형, 요구되는 투약량 및 표적화되는 대뇌 내 영역을 비롯한 다양한 인자에 의존할 것이다. 따라서, 기타 주입 속도는 당업자에 의해 특정 상황에서 적절한 것으로 간주될 수 있다.
본원에서 달리 한정하지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자가 흔히 이해하는 의미를 가질 것이다. 예시적인 방법 및 재료는 하기에 기술되어 있지만, 본원에 기술되어 있는 것과 유사하거나 동일한 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 교시에 사용될 수 있다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 일반적으로, 본원에 기술되어 있는 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 의학 및 제약 화학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 이들의 기법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 흔히 사용되는 것이다. 효소 반응 및 정제 기법은, 당해 기술분야에서 흔히 달성되거나 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 제조사의 설명서에 따라 실시된다. 또한, 문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 명세서 및 실시형태 전반에서, "갖는다" 및 "포함한다"란 단어 또는 "갖다", "갖는", "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형 용어는 언급된 정수 또는 일군의 정수를 포함하지만 임의의 기타 정수 또는 일군의 정수를 제외하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. "약"은 언급된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 이내에 있는 것으로 이해될 수 있다. 문맥 상 달리 명백하지 않는 한, 본원에 제공된 모든 수치는 "약"이란 용어로 수식된다. 본원에 기술되어 있는 본 발명의 양태 및 변형예는 양태 및 변형예로 "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진" 것을 포함하는 것으로 이해된다. 본원에 언급된 모든 간행물 및 기타 참고문헌은 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다. 본원에 다수의 문헌이 인용되어 있지만, 이러한 인용은 이들 문헌 중 임의의 것이 당해 기술분야의 일반적인 상식의 일부를 형성하고 있다는 것을 인정하는 것이 성립되지 않는다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 또한 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 제한하기 위한 것이 아니다.
본 발명이 보다 잘 이해되도록 하기 실시예가 개시되어 있다. 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 본 발명의 범주를 임의의 방식으로 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
실시예
하기 작업 실시예에서, 본 발명자들은 FcRn 결합을 보유하고 있지만 Fc 감마 수용체(FcγR) 결합이 결여된 Fc 도메인에 융합된 단쇄 항체(Ab)(침묵 scFv-IgG로 지칭됨)가 AAV를 이용한 유전자 전달 이후에 발현되고 CNS 내로 방출될 수 있다는 것을 보여준다. Fc를 scFv-IgG 설계 내로 혼입시킴으로써 분자는 응집된 아밀로이드와 같은 다중체 표적에 대한 보다 높은 결합력을 제공하는 표준형 IgG의 2가성(bivalency)을 보유하며, 필요한 경우에 Fc 의존성 신호전달을 조정하는 능력을 제공한다. 뇌로부터의 FcRn 매개 유출을 통한 항체-항원 소거를 가능케 함으로써 앞서 scFv 단독에 의해 보여준 아밀로이드 병리상태의 감소 시 뇌-혈액 장벽에서 FcRn에 대한 Fc 결합의 보존이 개선될 수 있다. 뇌에서의 표준형 IgG 발현이 신경 독성의 징후를 초래하지만, 이러한 변형된 항체(Ab)는 뉴런 세포로부터 효율적으로 분비되었으며, 표적 특이성을 보유하고 있었다. 뇌의 정상 상태 수준은 Ab의 정맥 내 주사에 의해 수득된 최고 수준을 초과하였다. 진행성 아밀로이드 플라크 축적의 형질전환 ThyAPPmut 마우스 모델에서, 이러한 scFv-IgG의 AAV 발현은 대조군과 비교하여 피질 및 해마 플라크 부하를 감소시켰다. 이들 연구결과는 관련 질환 모델에서 침묵 항-Aβ scFv-IgG의 CNS 유전자 전달이 잘 용인되고 , 지속적으로 발현되며, 기능성을 갖는다는 것을 시사하며, 이는 알츠하이머병 및 기타 신경 질환의 치료를 위한 이러한 양상의 잠재성을 증명한 것이다.
다음 실시예에 기술되어 있는 연구에 사용된 재료 및 방법이 하기에 기술되어 있다.
연구 설계
본 연구는 알츠하이머병의 치료를 위해 뇌로의 AAV-매개 전달을 위한 항-Aβ IgG를 설계하기 위해 시작되었다. 생체 내 실험 이전에 적절한 발현, 조립 및 항원 결합 활성을 확인하기 위해 이들 IgG 구조체를 설계하고, 초기에 시험관 내에서 2 내지 4회 시험하였다. C57BL/6 또는 SCID 동물 연구를 위한 샘플 크기는 AAV의 정위 전달을 이용하여 이식 유전자를 생체 내에서 발현시킨 이전 실험으로부터 관찰된 가변성을 기준으로 설정되었으며, 각각의 실험에 제한되어 있었다. 생체 내 발현을 시험한 연구를 2회 내지 3회 실시하였다. 아밀로이드 플라크 부하의 정량화를 위한 ThyAPPmut 마우스에 대한 샘플 크기는 플라크 형성 시에 예상되는 동물 내 가변성을 설명하기 위해 설정되었다. 이러한 방침을 이용한 사전 연구에 기초하여, 그룹 당 n ≥ 10마리에 대해 효능 연구를 1회 실시하였다. 모든 연구에 있어서, 동물을 각각의 그룹에 무작위로 배정하였다. 자동화 이미지 분석을 위한 ROI 식별은 실험 조건을 알지 못하는 연구원에 의해 실시되었다. 모든 동물 연구를 관련 지침에 따라 실시하였다.
AAV-IgG 설계
항-Aβ 항체에서 유래하는 가변 영역은, 특허 출원 WO2009/065054 및 WO2010/130946에 각각 기술되어 있는 바와 같이, (AAV-αAβ msIgG에 대한) 원래의 13C3 쥐 서열 또는 (AAV-αAβ IgG에 대한) 인간화 서열(문헌[Schupf et al., PNAS (2008) 105: 14052~7])로부터 유래하였다. 반분자(S241P) 및 효과기 기능(L248E)을 감소시키기 위해 기술된 2개의 아미노산 치환을 함유하는 인간 IgG4 중쇄(문헌[Reddy et al., J Imm. (2000) 164: 1925~33]) 및 카파 경쇄를 위한 암호화 서열을 (도 1a에 나타나 있는 2A 펩타이드 개열 서열의 필요 없이) 이중 프로모터 카세트 내에 삽입함으로써 huIgG 발현 벡터를 생성하였다. 마우스 IgG1 골격이 요구되는 실험에 있어서, 원래의 13C3 항체(문헌[Vandenberghe et al., Sci Rep. (2016) 6: 20958])는 효과기 기능을 감소시키기 위해 중쇄 내에 N297A 돌연변이를 부가하여 사용하였다. AAV-대조군 IgG 벡터는 비-포유동물 항원을 표적화하는 huIgG4 PE 동형 대조군 항체를 암호화하였다.
ScFv-IgG 설계
scFv-IgG의 설계가 나타나 있다(도 4a; 서열 번호 8). 간단히 말하면, 부모 13C3 항-아밀로이드 베타 항체의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역을 가요성 G4S 링커의 3개의 반복서열(서열 번호 2)에 의해 연결하여 VL-VH scFv를 형성하였다. scFv 서열 다음에 scFv-IgG의 Fc 영역을 포함하도록 천연 쥐 IgG1 힌지 및 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 추가의 9개의 반복 글리신 링커(서열 번호 7)(문헌[Balazs et al., Nature (2011) 481: 81~4)가 이어져 있었다. AAV-αAβ msIgG와 같이, Fc의 아스파라긴 297은 알라닌으로 돌연변이되어(N297A) 효과기 기능을 약화시켰다(문헌[Chao et al., Immunol Invest. (2009) 38: 76~92)]; 문헌[Jefferis et al., Immunol Rev. (1998) 163: 59~76]). C-말단 6x His 에피토프 태그(서열 번호 9)는 마우스에서 시험관 내 정제 및 생체 내 검출 둘 모두를 용이하게 하기 위해 포함되었다. scFv-IgG의 발현은 Tbgh 폴리A를 갖는 hCMV/hEF1a-프로모터 발현 카세트에 의해 작동되었다.
면역 관용
면역 관용을 유도하기 위해, 0일, 2일 및 10일째 날에 GK1.5 항-CD4 단클론성 항체(바이오엑스셀(Bioxcell))를 마우스에 7.5 ㎎/㎏으로 IP 주사하였다. CD4 T 세포 고갈을 확인하기 위해, 12일째 날에 후안와 샘플링(retro orbital sampling)에 의해 헤파린이 코팅된 튜브 내에 혈액을 채취하였다. CD45-FITC(클론 104, 비디 파밍겐(BD PharmingenTM)), CD3e-AlexaFluor 647(클론 17A2, 이바이오사이언스(eBioscience)) 및 CD4-PE(RM4-4 클론, 바이오레전드(BioLegend)) 항체를 이용하여 표준 프로토콜을 이용하는 BD Fortessa 상에서 FACS 분석을 이용하여 CD4+ T 림프구를 정량화하였다. GK1.5로 처리된 동물은, 미처리 마우스로부터의 0.47 ± 0.003의 CD4+ 림프구/총 CD3+ 림프구 비율과 비교하여 처리된 마우스에서의 0.04 ± 0.008(평균 ± SEM)의 CD4+ 림프구/총 CD3+ 림프구 비율에 의해 증명된 바와 같이 CD4가 감소하였다.
세포 배양, 단백질 발현 및 정제
Expi293TM 세포(라이프테크(Life Tech))를 Expi293TTM 무혈청 배지(라이프테크)에서 계대 배양하고, 단백질 발현용으로 사용하였다. 발현 플라스미드를 지질 형질 감염(Fectopro, 폴리플러스(Polyplus))을 통해 Expi293TM 세포 내로 형질 감염시키고, 분비된 단백질을 함유하는 세포 배양 배지를 4일 이후에 수집하였다. 멸균 여과 후, 6x His(서열 번호 9)-태깅된 단백질을 고정형 금속-친화도 크로마토그래피(IMAC)를 통해 정제하였다. 간단히 말하면, 단백질을 4℃에서 하룻밤 동안 코발트 수지(써모 사이언티픽TM(Thermo ScientificTM))에 배치 흡착시키고, 10의 칼럼 부피의 인산 완충 식염수로 세척한 후, 500 mM 이미다졸로 용출하였다. 단백질을 하룻밤 동안 HEPES 완충 식염수 내로 투석하고, 농축하고(센트리콘®(Centricon®)), 사용할 때까지 -80℃에서 냉동시켰다.
ELISA
96-웰 ImmulonTM IIHB(써모) 플레이트를 1 ug/㎖의 Aβ1-42(Bachem H-1368; 항원 ELISA용) 또는 1 ㎍/㎖의 마우스 항-huIgG 다클론성 Ab(Jackson 209-005-088)로 코팅하여 25℃에서 하룻밤 동안 탄산 완충액에서 총 huIgG를 포획하였다. 웰을 TBS-0.5% 트윈(TBST)에서 5회 세척하고, TBSTB(TBST + 1.5% BSA)에서 1시간 동안 차단하였다. 정제된 단백질을 이용한 표준 곡선을 혈청 또는 뇌 균질물과 병행하여 결합된 scFv-IgG 또는 huIgG의 정량화를 가능케 하였다. 샘플을 2.5시간 동안 배양하고, TBST에서 3회 세척한 후, 1시간 동안 HRP-접합 이차 항체와 함께 배양하였다. 5회의 TBST 세척 후, 웰을 TMB 기질과 함께 5분 동안 배양한 후, 0.5 M H2SO4를 이용하여 켄칭(quenching)하였다. 플레이트 결합 신호를 450 nm에서의 흡광도에 의해 정량화하였다(Spectramax M5). 모든 샘플을 3회 실험하였다.
LC-MS/MS
NanoAcQuity LC 시스템(워터스(Waters))과 결합된 Q ExactiveTM 질량 분광계(써모 사이언티픽TM) 상에서 LC/MS/MS 실험을 수행하였다. 조직 균질물에서 유래한 IgG를 특이적으로 농축하고, CaptureSelectTM HuIgG 친화도 수지(써모 피셔)를 이용하여 단리하였다. DTT 환원 및 알칼리화 이후에 농축된 IgG를 37℃에서 하룻밤 동안 트립신/Lys-C(1:100(w/w))와 배양하여 분해하였다. 이 분해는 1% 포름산(FA)을 첨가하여 종료하였다. 얻어진 트립신 분해 펩타이드 혼합물을 미세 모세관 칼럼(75 ㎛ id, 15 cm HSST3, 1.8 ㎛; 워터스) 상에 적재하고, 분리하였다. PRM 모드((m/z 200에서의) 분해능: 70,000, AGC 표적: 5 x 106개 및 최대 주사 시간: 500 밀리초)에서 데이터를 얻었다. 대조군 IgG의 프로파일링 데이터를 기준으로 지정된 포함 목록을 생성하였다. PRM 방법은, 25의 정규화된 충돌 에너지(NCE)를 이용하여 단편화된 2 Da 단리 윈도우(isolation window)에 의한 표적 이온의 단리를 이용하였다. 100 m/z의 출발 질량 범위에서 MS/MS 스캔을 얻었으며, 이를 프로파일 스펙트럼 데이터 유형으로서 얻었다. Skyline(맥코스 랩 소프트웨어(MacCoss Lab Software))을 이용하여 전구체 및 단편 이온을 정량화하였다.
표면 플라스몬 공명
Aβ1-42 펩타이드(Bachem H-1368)를 600 rpm에서 진탕하면서 10 mM HCl 중에서 37℃에서 하룻밤 동안 1 ㎎/㎖로 배양하였다. 얻어진 섬유소 용액을 아민 결합을 이용하여 CM5 센서 칩(지이 헬스케어(GE Healthcare)) 상에 직접 고정하였다. PBS-+P 완충액(지이 헬스케어) 중에서 50 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM 및 5 nM로 생성된 항체 또는 scFv-IgG 용액을 상대적으로 높은 유량(50 ㎕/분)으로 주사하여 결합력 효과를 제한하였다. BiacoreTM T200 평가 소프트웨어를 이용하여 데이터를 가공하고, 빈 표면의 삭감(subtraction) 및 완충액 단독 주사에 의해 이중 참조한 후, 데이터를 1:1 결합 모델에 전체 피팅(global fitting)하였다.
AAV ITR 플라스미드 및 아데노-연관 바이러스 벡터의 제조
IgG 또는 scFv-IgG를 위한 발현 카세트를 적절한 패키징을 위한 AAV 게놈 크기를 유지하는데 필요한 만큼 A1AT 스터퍼(stuffer) DNA를 보유하는 AAV2-ITR 함유 플라스미드에 서브클로닝하였다. 이중 프로모터 IgG ITR 플라스미드의 경우, 카세트가 이미 효율적인 패키징을 위해 허용되는 최대 크기이므로 어떠한 스터퍼 DNA도 포함되지 않았다. AAV-부재 벡터(AAV-Empty vector)는 CBA 프로모터, Tbgh 폴리A 및 A1AT 스터퍼 DNA로 이루어져 있었다. AAV2/1 바이러스는 일시적 형질 감염을 통해 생성되었다. 간단히 말해, PEI(폴리에틸렌이민)를 이용하여 HEK293 세포에 3개의 플라스미드(ITR, AAV rep/cap 및 Ad 헬퍼(helper)를 함유함)를 1:1:1의 비율로 형질 감염시켰다. 스트라타젠/애질런트 테크놀로지스(Stratagene/Agilent Technologies); 캘리포니아주 산타클라라)로부터 Ad 헬퍼 플라스미드(p헬퍼)를 수득하였다. 이전에 기술된 바와 같이, 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제를 실시하였다(문헌[Burnham et al., Hum Gene Ther Methods (2015) 26: 228~42]). 폴리A 서열에 대항하는 qPCR을 이용하여 바이러스를 적정하였으며, AAV를 사용할 때까지 180 mM 염화나트륨, 10 mM 인산나트륨(5 mM 1염기성 + 5 mM 2염기성), 0.001% F68(pH 7.3)에서 -80℃로 저장하였다.
동물
달리 명시하지 않는 한, 사용된 동물은 2개월령에 잭슨랩스(Jackson Labs; 미국 바하버(Bar Harbor))로부터 수득된 C57BL/6 수컷이었다. 성체 SCID 마우스를 2개월령에 잭슨랩스(B6.CB17-Prkdcscid/SzJ)로부터 수득하였다. C57BL/6과 역교배된 ThyAPPmut 형질전환 마우스는 문헌[Blanchard et al., Exp Neurol. (2003) 184: 247~63]에 기술되어 있다. 수술 그룹을 한 마리씩 사육하여 뇌수술로부터 적절히 회복되게 하였다. 마우스를 음식과 물을 임의로 이용 가능한 상태에서 12시간 명/암주기로 유지하였다. 동물을 상이한 그룹으로 무작위 분류하고, 처리 그룹을 알지 못하는 작업자에 의해 분석을 실시하였다.
정위 주사
동물 실험 윤리 위원회(animal care and use committee)가 승인한 절차에 따라 수술을 실시하였다. 마우스를 혼합물(부피 10 ㎖/㎏)(케타민(100 ㎎/㎏; 이말진(Imalgene); 프랑스 메리얼(Merial)) 및 자일라진(10 ㎎/㎏; 롬펀(Rompun); 프랑스 바이엘(Bayer)))로 복강 내 주사하여 깊이 마취시켰다. 동물을 정위 프레임(코프 인스트루먼츠(Kopf Instruments); 미국)에 배치하기 전에 마우스 두피를 면도하고, 베티딘(베토퀴놀(Vetoquinol); 프랑스)으로 소독하였고, 국소 마취제인 부피바카인(5 ㎖/㎏의 부피로 2 ㎎/㎏; 프랑스의 아귀탄트(Aguettant))을 두개골 피부에 피하 주사하고, Emla(리도카인; 아스트라제네카(Astrazeneca))를 귀에 도포하였다. 수술 동안, 비타민 A Dulcis로 빛으로부터 눈을 보호하고, 난방 담요로 체온을 37℃로 일정하게 유지하였다.
샘플을 1분 당 0.5 마이크로리터의 속도로 주사하였다. 바늘구멍을 통해 샘플이 역류하는 것을 막기 위해 바늘을 2분 동안 유지한 후, 뇌로부터 천천히 제거하였다. ThyAPPmut 마우스에 대해 일측 해마 주사 및 기타 모든 마우스에 대해 양쪽 주사를 실시하였다. 해마 주사를 위한 좌표는 다음과 같다: AP -2.0, DV -2.0 및 ML ± 1.5. 마우스를 따뜻하게 유지하고, 수술 후 카프로펜(5 ㎖/㎏의 부피로 5 ㎎/㎏; 리마딜®(Rimadyl®), 조에티스(Zoetis))으로 피하 주사를 받았으며, 회복할 때까지 계속하여 관찰하였다. 연구가 끝날 때쯤에, 유타솔®(Euthasol®; 미국) 또는 케타민/자일라진(프랑스)을 이용하여 마우스를 과량의 마취제로 마취시켰다. 과다 복용 이후, 얼음-냉각된 PBS로 관류할 때까지 마우스를 따뜻하게 유지하였다.
면역 조직 화학
차가운 PBS를 이용한 관류 이후, 뇌 조직을 10% 중성 완충 포르말린(NBF)에서 고정하였다. 포르말린-고정된 조직을 파라핀에 포매한 후, 시상면 또는 관상면에서 5 ㎛로 절개하였다. Leica BOND RX 자동 염색기를 이용하여 모든 조직을 염색하였다. 면역 형광 염색을 위해, 에피토프 회수 용액 1(ER1; 시트르산 완충액, pH 6.0)을 이용하여 10분 동안 열-매개 항원 회수를 실시하였다. 이어서, 조직을 염소 혈청 + 0.25% 트리톤 X-100에서 차단/투과시킨 후, 일차 항체로 실온에서 1시간 동안 배양하고, TBST로 세척한 후, 이차 항체로 30분 동안 배양하였다. 스펙트럼 DAPI(라이프(Life))를 이용하여 핵을 검출하였다. 플라크 정량화를 위해, 항원 회수 또는 포름산 추출 없이 제조사의 설명서에 따라 Vectastain® ABC (PK-7100) 키트를 이용하여 조직을 비오틴-접합 4G8 항체(4G8 클론, 바이오레전드 800701)로 면역 염색하였다.
항체
6x His(서열 번호 9)(Abcam Ab9108, 1:1000 IHC, 인비트로젠TM(InvitrogenTM) R931-25, 1:1000 Western, ELISA), GFAP(이바이오사이언시스(Ebiosciences), 41-9892-82, 1:200 또는 Abcam Ab4674, 1:500 IHC), 4G8(바이오레전드 800701, 1:500 IHC). 라이프 테크놀로지스의 이차 항체: Cy3 염소 항-마우스, Alexa Fluor®647 염소 항-토끼, Alexa Fluor®488 염소 항-닭; 모두가 1:500의 비율이다. 아밀로이드 DAB의 경우: 4G8-비오틴(바이오레전드 800705 1:250).
이미지 분석
Scanscope® XT 명시야 이미지 스캐너(아페리오(Aperio); 캘리포니아주 비스타) 또는 AxioScanZ1(칼 짜이스 마이크로스코피 게엠베하(Carl Zeiss Microscopy GmBH); 독일)을 이용하여 면역 조직 화학 슬라이드를 20X 배율로 스캐닝하였다. HALOTM 이미지 분석 소프트웨어(인디카 랩스(Indica Labs), 미국 뉴멕시코 주 코랄레스)를 이용하여 GFAP IHC의 전체 슬라이드 이미지(WSI)를 관찰하고 분석하였다. 각각의 WSI에 있어서, 해마 영역에 수동으로 주석을 달고, HALO의 자동화 면적 정량 알고리즘을 이용하여 GFAP 면역 양성 면적에 대해 분석하였다. 각각의 샘플에 있어서, GFAP 양성 면적을 선택된 ROI에 대한 총 조직 면적으로 나누어 면역 양성 면적(%)을 수득하였다. 플라크 분석을 위해, 5 ㎛의 관상 뇌 단면을 3개의 상이한 수준으로 50 ㎛ 떨어져서 6개월령의 ThyAPPmut 마우스로부터 수집하였다. 관상 및 해마 ROI에 수동으로 주석을 달았다. ZEN 2 소프트웨어(칼 짜이스 마이크로스코피 게엠베하; 독일)를 이용하여 개발된 통상의 이미지 분석 알고리즘을 이용하여 아밀로이드 플라크 부하를 DAB + 조직 면적(%)으로서 정량화하였다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 버전 6(그래프패드 소프트웨어; 미국 캘리포니아주 라호이아)를 이용하여 데이터를 작도하였다.
통계
2개 초과의 그룹을 이용한 실험을 위해 다중 비교 기능이 있는 1-방향 ANOVA(던넷(Dunnett))를 이용하는 그래프패드 프리즘(v6 및 v7)을 이용하여 통계 분석을 실시하였다. 2개 그룹의 비교를 위해 쌍을 이루지 않은 스튜던트 t-검정을 사용하였다. *p < 0.05, **p < 0.01, ******p < 0.001. 샘플 크기는 다양하며, 각각의 실험에 대해 명시되어 있다.
실시예 1: β-아밀로이드를 표적화하는 AAV-IgG 벡터의 구축 및 특성분석
항체의 유전자 기반 발현을 진전시키기 위해, 본 발명자들은 이중 프로모터 발현 카세트를 이용하여, 상기 Schupf 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 단량체 형태에 대한 친화도가 없는 원섬유 및 섬유소 Aβ와 결합하는 13C3 항체의 인간화 버전을 발현시켰다. IgG4 중쇄는 Fcγ 효과기 기능 및 반분자 교환을 감소시키는 S228P 및 L248E 돌연변이를 포함하고 있었다(문헌[Yang et al., Curr Opin Biotechnol. (2014) 30: 225~9]; 문헌[Reddy et al., J Imm. (2000) 164: 1925~33]).
상이한 프로모터로부터 중쇄 및 경쇄를 발현시키고, 전체 카세트를 AAV 게놈 패키징 제한범위 내에서 적합하도록 설계하였다(도 1a). 여기서 사용된 이중 프로모터 설계는 단일 프로모터를 사용하는 기타 설계에 의해 유발되는 잠재적인 면역원성 또는 발현 책임(liability)을 피하지만, 이중시스트론성 발현(bicistronic expression)을 위한 F2A 개열 서열 또는 내부 리보솜 진입 부위의 사용이 요구된다(상기 Saunders 문헌; 문헌[Mizuguchi et al., Mol Ther. (2000) 1: 376~82]). 이러한 카세트는 이러한 혈청형이 우수한 실질조직 확산을 나타내기 때문에 뇌에 직접 주사를 위해 AAV1 캡시드(AAV-αAβ IgG) 내에 패키징하였으며, (대부분의 AAV 벡터와 같이) 뉴런 형질 도입이 우세할지라도 이러한 혈청형은 또한 높은 수준의 단백질 발현 및 분비에 보다 바람직할 수 있는 성상세포를 형질 도입한다. AAV-αAβ IgG 발현을 시험하기 위해, C57BL/6-SCID (SCID) 마우스를 사용하여 이식 유전자의 발현을 방해할 수 있는 항-huIgG 면역 반응을 방지하였다. 역 트랜스사이토시스를 통해 항체를 뇌 밖으로 능동 수송하였다. 따라서, 본 발명자들은 격주의 혈청 수집액을 이용하여 AAV-αAβ IgG의 뇌 발현을 모니터링하였다. SCID 마우스의 해마 내로 AAV-αAβ IgG를 양쪽 주사한 후(측면 당 2E10 GC) 16주 동안 2주 간격으로 혈청을 뽑았다. Aβ1-42 섬유소 결합 면역 검정을 사용하여 2E10 GC의 AAV-αAβ IgG의 양쪽 해마 주사 이후에 발현된 기능성 항체의 수준을 측정하였다.
벡터는 최대 16주 동안 안정한 발현을 나타냈다(도 1b의 좌측). 뇌에서의 AAV-매개 항체 발현을 표준 수동 면역 요법 접근법 이후에 관찰된 수준과 비교하는 방법에 대한 식견을 얻기 위해, 20 ㎎/㎏의 αAβ IgG의 1회의 정맥 내(IV) 볼루스 주사를 받은 별도의 그룹과 병행하여 상이한 시점에 SCID 마우스의 해마에서의 huIgG 수준을 측정하였다. SCID 마우스에는 2E10 GC의 AAV-αAβ IgG를 해마의 양측에 1회 주사하거나, 20 ㎎/㎏의 IV 정제된 IgG로 1회 주사한 후, IgG에 대한 뇌의 노출 시간 경과를 생성하기 위해 표시된 시간에 조직을 수집하였다. 동측성 해마(ipsilateral hippocampus)를 균질화하고, 항원 ELISA에 의해 huIgG에 대해 검정하였다. AAV-αAβ IgG 벡터는 항원 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 시간 경과 기간 동안에 해마에서 거의 300 ng/g의 발현을 유지하였다(도 1b의 우측). IV 주사 후 24시간에 해마에서의 IgG의 수준은 200 ng/g에 근접하였지만, 이들 수준은 뇌로부터 IgG가 소거됨에 따라 (알려져 있는 혈청 반감기와 함께) 감소하였으며, 그 결과 7주째의 AAV-αAβ IgG와 비교하여 11배 감소하였다.
도 1c는 AAV-IgG의 뉴런 내 및 신경교 발현이 해마에서 검출 가능하다는 것을 보여준다. 상세하게는, huIgG 발현 산물에 대항하는 IHC에 의해 뉴런 및 성상세포 둘 모두에서의 발현이 확인되었으며, 이때 뉴런은 해마의 CA2에서의 형태학을 통해 용이하게 식별 가능하며, GFAP를 이용한 공존분석(colocalization)은 성상세포의 발현을 보여준다(도 1c).
이들 데이터에 따르면 AAV-αAβ IgG 벡터는 뇌의 안정 상태 수준의 항체를 통상의 수동 면역 요법 프로토콜에 의해 구현될 수 있는 것보다 훨씬 더 높게 유지할 수 있는 것으로 나타나 있다.
실시예 2: 알츠하이머병의 마우스 모델에서 AAV-αAβ IgG에 의한 항원 결합
이어, 본 발명자들은 뇌 형질도입 정도를 평가하고 항체가 생체 내에서 플라크와 결합하기 위해 세포 외 공간으로 분비되는지를 결정하기 위해 돌연변이 아밀로이드 전구체 단백질(ThyAPPmut)을 발현하는 아밀로이드 플라크 마우스 모델에서 AAV-αAβ IgG를 발현시켰다. 이러한 모델은 대략 2개월 내지 3개월령에 시작하여 피질에서의 진행성 아밀로이드 플라크 축적을 나타낸다(문헌[Blanchard et al., Exp Neurol. (2003) 184: 247~63]). 항-huIgG 항체 반응을 방지하기 위해, 벡터 투여 이전 및 이후에 CD4-고갈 항체를 이용하여 동물이 면역 내성을 갖게 하였다(도 2a). 간단히 말하면, 마우스에서 IgG를 용이하게 검출하기 위해, 본 발명자들은 2개월령의 수컷 ThyAPPmut 마우스에 AAV-αAβ IgG, 또는 동형 대조군 IgG를 발현하는 AAV(AAV-IgG 대조군)를 해마 내 주사하였다. 2일째 날과 10일째 날 사이에 CD4 T 세포 고갈에 의해 ThyAPPmut 마우스가 면역 내성을 갖게 하였다. AAV-αAβ IgG 또는 동형 대조군 벡터 AAV-IgG 대조군을 4일 내지 5일째 날에 해마 양측에 주사하였다(주사 당 2E10 GC). 별도의 그룹에는 플라크 결합 활성에 대한 양성 대조군으로서 연구 기간 동안에 정제된 αAβ huIgG를 매주 10 ㎎/㎏으로 IP 주사하였다. 8주 후, 5 ㎛의 시상 뇌 단면을 수집하고, 면역 염색하였다. ThyAPPmut 동물에서 생체 내에서 플라크 결합을 이끌어 내기 위해 이러한 αAβ IgG 투여 및 IP 전달 패러다임이 이전에 나타나 있었다(문헌[Pradier et al., Alzheimer's & Dementia (2013) 9(4): P808~P809]).
주사 2개월 후, 이들 동물이 전두 피질에 플라크 침착을 나타내는 연령에, 뇌의 시상 단면을 IHC용으로 가공하였다. 상세하게는, huIgG IHC 염색에 따르면 바늘구멍 주변의 해마 및 상부 피질 전체에서 발현이 나타났다. 확대된 관심 영역(ROI)(500 ㎛의 너비)은 뉴런 및 해마의 신경망에서 huIgG 발현에 대한 세부사항을 보여준다. 이에 반해, 아밀로이드 플라크에 제한되게 염색된, IP 주사된 αAβ IgG 그룹은 세포체에서 임의의 발현을 나타내지 않았다(도 2b의 좌측). huIgG, Aβ 플라크 및 GFAP에 대한 형광 IHC에서는 AAV-αAβ IgG 및 IV αAβ IgG 그룹 둘 모두에서 피질 플라크와 huIgG의 공동 국소화를 나타냈지만, AAV-IgG 대조군 그룹에서는 나타내지 않았다. 상세하게는, AAV-αAβ IgG 및 말초에 전달된 αAβ IgG는 4G8+ 아밀로이드 침적물에 대한 확실한 결합을 나타내는 반면, AAV-IgG 대조군은 검출 가능한 결합을 나타내지 않았다(도 2b의 우측).
이들 데이터에 따르면 AAV-αAβ IgG가 세포 외 공간으로 분비되고, 주사 부위에서 원위부에 있는 뇌 영역에서 Aβ 플라크와 결합할 수 있는 것으로 나타나 있다.
실시예 3: AAV-αAβ IgG 뉴런 발현 및 신경 독성 평가
뉴런 세포는 고도로 전문화되어 IgG와 같은 대형의 거대분자가 아닌 신경 전달과 관련된 인자를 분비한다. 이들 세포에서 효율적인 IgG 가공 및 분비가 발생할 수 있는지에 대해서는 알려진 바가 없다. 뉴런에서 발현되는 IgG의 부적절한 가공이 있는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 질량 분광 분석을 실시하여 SCID 마우스에서 AAV-αAβ IgG 발현 1개월 후에 뇌로부터 중쇄 및 경쇄의 전체 수준을 측정하였다. 해마로부터의 AAV-αAβ IgG의 발현은 중쇄의 예상된 수준과 연관이 있었으며, 정제된 αAβ IgG가 첨가된 식염수-주사된 뇌 용해물과 유사하였지만, 첨가된 대조군에 비해 동족의 경쇄의 양이 예상외로 적었다(도 3a). 이러한 연구결과는 뇌세포로부터의 AAV-αAβ IgG 발현이 경쇄의 불충분한 생성을 초래하며, 그 결과 중쇄 및 경쇄의 비율 불균형이 초래한다는 것을 시사한다.
또한, 본 발명자들은 ELISA를 이용하여 항원(Ag)과 결합할 수 있는 개체의 비율(%) 대비 총 IgG(중쇄와 경쇄의 합계)를 정량화하였다. 상세하게는, AAV-αAβ IgG-발현 SCID 마우스로부터의 뇌 추출물에서의 기능성 Aβ 항체의 수준을 항원 ELISA에 의해 정량화하고, pan-huIgG ELISA와 병행하여 비교하였다. 본 발명자들은 뇌로부터 발현된 총 IgG(해마 내에 주사된 총 2E10 GC)의 대략 20%가 기능성인 반면, 벡터의 IV 주사를 통해 말초 조직으로부터 발현된 AAV-αAβ IgG(IV 주사된 총 1E12 GC)는 총 IgG/기능성 IgG에서 불균형을 나타내지 않는다는 것을 관찰하였다. 상세하게는, 항원에 결합된 huIgG의 수준은 뇌에서 발현되는 경우에 총 huIgG의 21%만을 차지하는 반면, 이러한 차이는 벡터의 말초 발현 후 1개월에 혈청에서 검출되지 않았다(도 3a의 우측).
이어, 본 발명자들은 IgG 발현의 결과로서 신경 독성의 증거가 존재하는지를 조사하였다. AAV-αAβ IgG 벡터의 초기 특성분석을 위해, 본 발명자들은 인간의 경우에 보다 직접적인 번역 가능성을 가지며, 마우스에서의 명확한 검출을 가능케 하는 이러한 항체의 huIgG 버전을 사용하였다. 그러나, 외인성 huIgG 노출의 교란 변수(confounding variable) 없이 뇌 IgG 발현과 관련될 수 있는 임의의 독성 또는 신경 염증에 대해 시험하기 위해, 본 발명자들은 원래의 마우스 버전의 αAβ IgG를 발현하는, AAV-αAβ msIgG로 지칭된 AAV 벡터를 사용하였다(상기 Schupf 문헌; 상기 Pradier 문헌; 문헌[Vandenberghe et al., Sci Rep. (2016) 6: 20958]). 이러한 벡터를 C57BL/6 마우스의 해마에 주사하고, 1개월 후 조직 분석을 위해 뇌 조직을 가공하였다. 조직 병리학적 분석은 해마 내의 뉴런 세포에서의 유리질/호산성 세포질 침적물의 높은 발생을 나타내며, 이는 당단백질의 과발현을 연상케 하였다(도 3b). 당단백질의 축적을 연상케 하는 뉴런의 호산구 내지 유리질 유사 봉입체는 항체 발현 벡터가 주사된 뇌에서만 관찰되었다. 이들 구조는 AAV-IgG 대조군이 주사된 마우스(6마리/12마리의 마우스)의 해마에서도 관찰되었으며, 이는 이러한 독성이 αAβ IgG 발현에 특이적이지 않다는 것을 보여준다. 이들 유리질 침적물은 AAV1-부재 벡터 또는 PBS가 단독으로 주사된 마우스의 해마에서는 전혀 관찰되지 않았다(도 3b).
또한, 본 발명자들은 PBS 대비 면역 조직 화학적 GFAP 분석에 의한 신경 염증의 증거를 관찰하였다. 본 실험에서, C57BL/6 마우스에 PBS 또는 AAV-αAβ msIgG(해마에는 2E10 GC)를 주사하고, 16주 후에 5 ㎛의 시상 뇌 단면을 수집하였다(도 3c). 또한, AAV1-부재 벡터는 PBS 대비 유의한 신경아교증을 유발하지 않았으며(1.11 ± 0.12, 5마리의 마우스, PBS GFAP+ 면적으로 정규화된 평균 ± SEM), 이는 신경 염증이 IgG 발현에서 기인한다는 것을 시사한다.
이들 데이터는, 뇌세포가 IgG를 발현하고 분비할 수 있지만 이러한 IgG의 부분집합(약 20%)만이 기능성이고, 항원과 결합할 수 있으며, 이러한 발현이 형질 도입된 영역 전반에서 검출 가능한 신경 염증을 유발한다는 것을 보여준다.
실시예 4: AAV-scFv-IgG 벡터의 구축 및 특성분석
본 발명자의 벡터에 의해 전달된 IgG가 분비되고 생체 내에서 아밀로이드 플라크와 결합하지만, 본 발명자들은 대안적인 Ig 형식이 AAV-IgG에 의해 유발된 미스페어링(mispairing) 및 신경 독성을 최소화할 수 있을 것으로 가정하였다. 동일한 마우스 αAβ 항체(상기 Schupf 문헌)에 기초하여, 본 발명자들은 변형된 단쇄 Fv를 합성하였으며, 여기서 IgG 경쇄의 가변 영역은 COOH-말단(C-말단)에 의해 쥐 IgG1 힌지, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 중쇄 가변 영역에 융합되어 있었다(도 4a; scFv-IgG). Fc 영역의 전염증 효과를 최소화하기 위해, 마우스 IgG1 Fc 도메인을 돌연변이시켜 모든 FcγR에 대한 결합을 방지하는 아스파라긴 297(N297A)에서의 글리코실화를 제거하였다(상기 Johnson 문헌; 상기 Chao 문헌). 상세하게는, scFv-IgG가 가요성 GGGGS(서열 번호 3) 링커 서열의 3개의 반복서열을 통해 연결된 쥐 항-Aβ IgG의 가변 영역을 갖도록 설계하였다. scFv는 9-Gly 반복 링커(서열 번호 7)을 통해 마우스 IgG1 N297A Fc에 연결되었다. 6x His 태그(서열 번호 9)를 C-말단에 부가하였다. scFv-IgG를 Expi293 세포에서 발현하고, C-말단 히스티딘(His) 태그 서열을 이용하는 고정형 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC)에 의해 정제하였다.
SDS-PAGE에 의한 분석에 따르면 이러한 단백질은 효율적으로 이황화물-연결 이량체 내로 조립되는 것으로 확인되었다(도 4a). 이러한 scFv-IgG는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 섬유소 Aβ1-42에 대한 결합을 나타냈으며, 이는 부모 항체와 유사하였다. 결합 속도(binding kinetics)를 분석하기 위해 상이한 몰 농도에서 고정된 Aβ1-42 섬유소 상에 scFv-IgG 또는 IgG를 흘러 보냄으로써 SPR를 통해 친화도(M)를 측정하였다. 부모 IgG는 scFv-IgG가 갖는 5.2 x 10-10의 약간 낮은 결합 친화도와 비교하여 1.3 x 10-10 M의 겉보기 해리 상수(KD)를 나타냈다(도 4a의 표).
이러한 발현 카세트를 AAV1 벡터에 삽입하여 변형된 IgG가 생체 내에서 합성될 수 있는지를 결정하였다. 말초 조직이 IgG 분자의 발현 및 분비에 매우 적합함에 따라 본 발명자의 바이러스의 활성에 대한 양성 대조군으로서 AAV의 IV 주사액을 사용하였다(상기 Saunders 문헌; 문헌[Shimada et al., PloS ONE (2013) 8: e57606]; 문헌[Hicks et al., Sci Transl Med. (2012) 4: 140ra187]; 문헌[Chen et al., Sci Rep. (2017) 7: 46301]; 문헌[Balazs et al., Nature (2011) 481: 81~4]; 문헌[Balazs et al., Nat Biotech. (2013) 31: 647~52]; 문헌[Balazs et al., Nat Med. (2014) 20: 296~300]). AAV-scFv-IgG(총 1E12 GC)의 IV 주사 1개월 후, 혈청 수준은 63 ㎍/㎖에 도달하였으며, 이는 말초 조직에서의 강력한 AAV 벡터 활성을 증명한 것이다(도 4b의 좌측).
벡터의 뇌 발현을 평가하기 위해, C57BL6 마우스에 총 2E10 GC의 AAV를 해마내 주사한 지 1개월 후에 뇌의 하나의 시상 절반부(반뇌로 지칭됨)에서 유래하는 추출물로부터 scFv-IgG 수준을 정량화하였다. 발현 수준은 약 600 ng/g의 평균에 도달하였다(도 4b의 우측). 특히, 이러한 농도는 IgG의 20 ㎎/㎏ IV 주사 이후 24시간에 관찰된 것보다 3배 초과로 높으며, AAV-αAβ IgG에 의해 관찰된 것보다 2.5배 높았다(도 1b). 조직학적 분석에 따르면 AAV-αAβ IgG 벡터보다 높은 뇌에서의 발현 수준을 가질지라도, AAV-scFv-IgG의 형질도입은 주사된 해마에서 임의의 검출 가능한 뉴런 내 유리질 단백질 축적을 야기하지 않은 것으로 나타났으며(0마리/5마리의 마우스), 이는 scFv-IgG가 IgG보다 뉴런 세포에 의해 더 효율적으로 가공되었다는 것을 시사한다.
scFv-IgG가 형질도입된 세포의 뇌 분포를 한정하기 위해, His 태그에 대한 항체를 이용하여 해마 주사 1개월 후에 시상 단면에 대해 DAB-6x His IHC(서열 번호 9로서 개시된 "6x His")를 실시하였다. AAV-scFv-IgG 벡터를 해마 전체에 형질도입하였으며, 바늘구멍 및 구상회(subiculum) 주변의 해마 위에 있는 피질 면적에서 형질도입이 희박하였다(도 4c). 음성 대조군(빈 AAV(AAV-대조군)) 벡터로 형질도입된 뇌는 검출 가능한 항-His 면역 염색을 나타내지 않았다(도 4c). 임의의 분비된 세포 외 scFv-IgG가 이용 가능한 항원의 결여로 인해 세척 제거될 가능성이 있으므로 C57BL6 마우스에서의 항-His IHC에 의해서만 세포 내 발현이 검출된다는 점에의 주의해야 한다.
주사 부위에서 근위부 및 원위부에 있는 동측 뇌 영역에서 세포 내 및 세포 외 scFv-IgG 둘 모두의 발현을 생화학적으로 평가하였다. AAV 주사 후 1개월째 날에, 3마리의 마우스로부터의 뇌 영역을 해부하고, 각각의 뇌 영역에 대해 발현된 단백질을 항원 ELISA에 의해 정량화하였으며, 이때 PBS가 주사된 뇌 균질물은 배경 신호를 제거하기 위해 사용되었다. 상세하게는, 해마, 상부 피질 및 선조체를 해부하고, 항원 ELISA를 통한 scFv-IgG의 정량화를 위해 균질화하였다(도 4c의 우측). 농도 구배를 관찰하였으며, 가장 높은 수준은 주사 부위(해마)에서 검출되었으며, 점점 낮은 수준이 보다 원위부에 있는 뇌 영역에서 관찰되었다(도 4c의 우측). 주사 부위와 비교하여 낮은 수준을 가질지라도 선조체 조직에서의 scFv-IgG의 농도는 200 ng/g 정도로 유지되며, 이는 수동 IgG 주입에 의해 전형적으로는 달성되지 않은 뇌에서의 안정 상태 수준이었다.
실시예 5: β-아밀로이드증의 마우스 모델에서의 scFv-IgG에 의한 항원 결합
이어, 본 발명자들은 AAV-전달된 scFv-IgG가 세포 외 공간으로 분비되고 생체 내에서 항원에 결합할 수 있는지를 결정하였다. AAV-scFv-IgG 벡터를 5개월령의 암컷 ThyAPPmut 마우스의 해마에 주사하였으며(상기 Blanchard 문헌), 이 연령에 이들은 이미 신피질 전반에서 플라크가 발생하였다. 1 ㎕(총 1E10 GC)의 AAV-scFv-IgG 벡터를 일측 주사한지 1개월 후에 IHC용으로 뇌의 5 ㎛의 시상 단면을 가공하고, His 태그 반응성 및 Aβ 플라크에 대해 염색하였다. 우측 이미지는 주사 부위에서 근위부(1) 내지 원위부(6)에 있는 개개의 플라크 ROI(A로 번호가 매겨짐)를 보여준다. 이미지는 6x His(서열 번호 9)의 면역 염색(녹색) 및 DAPI(청색)를 중첩한 것이었다(도 5a). 예상된 바와 같이, 피질 전반에서 풍부한 플라크 형성이 관찰되었으며(도 5a의 좌측), 항-His 항체를 이용함 염색은 플라크와 공동 국소화하였다(도 5a의 우측). AAV-scFv-IgG 발현의 해마 및 후두 피질 면적에서 보다 원위부에 있는 플라크에 대한 6x His(서열 번호 9) 표지 강도에서의 점진적이지만 상당한 감소를 주목하며, 이는 플라크 결합형 scFv-IgG에 대한 명백한 농도 구배가 존재하며, 즉 해마에서 원위부에 있는 플라크는 주사 부위에 보다 근접한 플라크보다 점진적으로 낮은 수준의 결합형 scFv-IgG를 나타낸다는 것을 보여준다. 이들 데이터는 해마 내의 세포에서 항-Aβ scFv-IgG를 발현하고 분비하여, 항-Aβ scFv-IgG가 주사 부위에서 원위부에 있는 플라크와 결합하도록 한다는 것을 보여주었다.
이 데이터는 바이러스 벡터에 의해 전달된 scFv-IgG가 생체 내에서 이의 생리학적으로 관련이 있는 표적과 연합을 한다는 증거를 제공하였다. 이어, 본 발명자들은 아밀로이드증의 이러한 마우스 모델에서 장기간 발현이 플라크 형성을 감소시킬 수 있는지를 결정하였다. 연구 설계의 개요. 2개월령의 ThyAPPmut 수컷 마우스(플라크가 형성하기 시작한 때의 평균 연령)의 4개의 그룹에는 AAV-scFv-IgG, AAV-대조군 벡터, Aβ IgG 또는 대조군 동형 IgG를 해마에 일측 주사하였다. 이들 그룹은 마우스 항-Aβ 항체(Aβ IgG) 또는 동형 대조군 항체를 10 ㎎/㎏으로 매주 IP 주사하는 수동 면역 요법으로 처리된 동물과 비교하였다(도 5b의 좌측). 16주(4개월)간의 처리 후에 뇌를 수집하고, 관상 단면을 아밀로이드 플라크 또는 6x His(서열 번호 9)에 대해 면역 염색하고, 이식 유전자의 발현에 대해 분석하였다. 주사된 해마 전반에서 AAV-scFv-IgG가 발현되었으며, 세포체에 대한 αHis 염색에 의해 증명된 바와 같이, 대측성 구상회 내로의 벡터의 명백한 수송이 또한 있었다(도 5b의 우측). 피질 및 해마에서의 Aβ 플라크 부하를 관상 뇌 단면에서 항-His IHC에 의해 정량화하였다. 정량화를 위해 반구체 둘 모두로부터의 ROI를 조합하고, 플라크 부하를 조직 ROI 면적의 비율(%)로 DAB-양성 염색으로서 나타냈다. 이들 각각의 대조군과 비교하여, AAV-scFv-IgG의 1회 주사에 의해 대조군 그룹들 사이에서의 플라크 부하의 차이에도 불구하고 αAβ IgG 기준점과 동일한 규모로 해마에서의 플라크 감소가 야기되었다(도 5c). 플라크 감소는 또한 피질에서 유의하게 감소하였으며(도 5c), 이는 scFv-IgG가 발현 부위로부터 확산하여 원위부 플라크에 결합한다는 증거와 일치하였다.
이들 결과는, 아밀로이드 마우스 모델에서 AAV-scFv-IgG의 1회 주사가 주사 부위에서 지속적으로 발현되고 분비되어 뇌 전반에서 플라크에 결합하였다는 것을 보여주었다. 16주 동안 매주 10 ㎎/㎏의 항-Aβ IgG의 전형적인 수동 면역 요법 용법에 의해 ThyAPPmut 동물에서는 아밀로이드 플라크 형성에서의 유의한 감소가 야기되었다. 이에 반해, AAV-scFv-IgG의 1회의 두개 내 주사는 4개월간의 발현 이후 비슷한 효능을 초래하였다.
요약하면, 상술한 연구에서, scFv-IgG는 생체 내에서 아밀로이드 플라크 부하를 감소시키는 원섬유 및 섬유소 Aβ 종에 특이적인 항체로부터 유래하였다. 본 발명자의 scFv-IgG는 시험관 내에서 발현이 잘되었으며, 이는 정제 및 SPR에 의한 후속적인 항원 결합 친화도 분석을 가능케 하였다. IgG 형태와 비교하여, scFv-IgG는 항원과 유사한 정도로 결합하였다. AAV1는 이의 캡시드가 실질조직 주사 이후에 CNS에서의 벡터 확산을 용이하게 하기 때문에 이러한 표시용 혈청형으로서 선택되었다. 이러한 혈청형은 주로 뉴런 세포를 감염시키지만, 일부 비-뉴런 세포 유형을 형질 도입시키는데, 이는 이식 유전자의 발현에 이용 가능한 잠재적인 세포 목록을 확장시킨 것이다. 상대적으로 높은 투약(해마에서 1E10 GC)을 이용하여, 주사 부위에서의 안정 상태 수준은 본 발명자들이 비교용으로 선택한 수동 IgG 기준점(정제된 IgG를 20 ㎎/㎏으로 IV 주사한지 24시간 후에 뇌에서의 항체 수준)을 이용하여 최대로 구현할 수 있는 것보다 3배 내지 4배 높았다. AAV-scFv-IgG 벡터에 의해 달성되는 수준에 도달하기 위해 말초에서의 대략 60 ㎎/㎏의 IV 투약이 필요할 것이다.
단일 주사 후, 해마에서의 발현은 적어도 4개월 동안 유지되었으며, 이때 단백질 농도는 주사 부위에서 수 밀리미터 떨어진 원위부에 있는 뇌 영역에서도 수동 면역 요법 기준점을 초과하였다. 6x His(서열 번호 9) 양성 세포가 주사 부위 또는 바늘 구멍으로부터 훨씬 먼 곳에서는 발견되지 않았기 때문에 형질도입된 세포가 주사 부위에서 이동하여 해마에서 원위부에 있는 영역에서 단백질을 분비할 가능성은 없다(데이터 미도시). ThyAPPmut 마우스에서의 이러한 벡터의 장기간 발현은 피질(52% 감소) 및 해마(87% 감소) 둘 모두에서 플라크 감소를 야기하였다. 이는 scFv를 이용한 기타 연구에서 관찰된 것보다 효율적인 감소이며, 이때 플라크 감소는 0% 내지 60%이었다(상기 Levites, 2006 문헌; 상기 Levites, 2015 문헌; 상기 Kou 문헌; 상기 Fukuchi 문헌; 및 문헌[Wang et al., Brain, Behavior, and Immunity (2010) 24: 1281~93]). AAV-scFv-IgG의 1회 두개 내 주사로 처리된 동물에서 관찰된 플라크 감소 규모는 4개월 동안 10 ㎎/㎏의 항-Aβ 항체로 매주 IV 주사에 의해 처리된 동물과 유사하였으며, 이는 장기간 처리 패러다임을 위한 유전자 전달 가치를 강조한 것이다.
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SEQUENCE LISTING <110> SANOFI <120> EXPRESSION OF ANTIGEN-BINDING PROTEINS IN THE NERVOUS SYSTEM <130> 022548.WO060 <140> <141> <150> EP 19306310.4 <151> 2019-10-08 <150> 62/848,659 <151> 2019-05-16 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> SITE <222> (1)..(20) <223> /note="This sequence may encompass 1-4 'Gly Gly Gly Gly Ser' repeating units" <400> 4 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 5 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> /replace="Ala" or "Asn" <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> /replace="Asn" <220> <221> SITE <222> (1)..(20) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 6 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 7 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 8 <211> 530 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 8 Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Pro Gln Gly Val Leu Ala Ser Glu 20 25 30 Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp 35 40 45 Arg Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gly Gln Ser Leu Val His Ser Asn 50 55 60 Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 65 70 75 80 Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp 85 90 95 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 100 105 110 Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn Thr 115 120 125 Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 130 135 140 Thr Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro 165 170 175 Gly Val Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 180 185 190 Asp Tyr Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu 195 200 205 Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Pro 210 215 220 Ser Phe Gln Gly Gln Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr 225 230 235 240 Ala Tyr Met Glu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala Ile Tyr 245 250 255 Tyr Cys Ala Arg Gly Asp Asp Gly Tyr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser 260 265 270 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 275 280 285 Gly Ser Gly Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr 290 295 300 Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 305 310 315 320 Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp 325 330 335 Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp 340 345 350 Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ala 355 360 365 Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp 370 375 380 Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro 385 390 395 400 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala 405 410 415 Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp 420 425 430 Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile 435 440 445 Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn 450 455 460 Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys 465 470 475 480 Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys 485 490 495 Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu 500 505 510 Ser His Ser Pro Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser His His His His 515 520 525 His His 530 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag" <400> 9 His His His His His His 1 5

Claims (18)

  1. 신경계의 세포에서 2가 결합 멤버를 발현하는 방법으로서,
    항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 IgG Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 카세트를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하며, 이때 상기 VH 및 상기 VL은 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, 세포 내에서 발현 시에 폴리펩타이드의 2개의 분자는 상기 표적 단백질에 특이적인 이황화-결합된 단독 이량체성 2가 결합 멤버를 형성하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 신경계의 세포는 뉴런; 희소돌기아교세포, 성상세포, 혈관주위세포, 슈반 세포 및 미세아교세포로부터 선택적으로 선택되는 교질 세포; 뇌실막 세포; 및 뇌 상피세포인 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세포는 환자의 뇌에 있는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 뇌에서 발현되는 단백질인 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단백질은 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ), tau, SOD-1, TDP-43, ApoE 또는 α-시누클레인인 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는, N 말단에서 C 말단까지,
    (i) 상기 VH, 펩타이드 링커 및 상기 VL; 또는 상기 VL, 펩타이드 링커 및 상기 VH; 및
    (ii) 상기 IgG Fc 영역을 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 펩타이드 링커는 서열: GGGGS(서열 번호 3)를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2가 결합 멤버는 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합하지만, 이는 상기 IgG Fc 영역 내에서의 하나 이상의 돌연변이로 인해 Fc 감마 수용에 결합하지 않는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도입 단계는 게놈이 상기 발현 카세트를 함유하고 있는 재조합 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 두개 내 주사, 경막 내 주사 또는 대수조 내 주사(intracisterna-magna injection)를 통해 환자의 뇌에 도입되는 것인 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV)인 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 재조합 AAV는 혈청형 1 또는 2를 갖는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 발현은 구성적 활성 프로모터 또는 유도성 프로모터의 전사 조절 하에 있는 것인 방법.
  15. 제4항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 신경 퇴행성 질환을 갖고 있는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 환자는 알츠하이머병, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 시누클레오병증(synucleopathy), 타우병증(tauopathy) 또는 근위축성 측색 경화증을 갖고 있는 것인 방법.
  17. 제4항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법에서 이를 필요로 하는 환자를 치료하는데 사용하기 위한 2가 결합 멤버.
  18. 제4항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법에서 이를 필요로 하는 환자의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한 2가 결합 멤버의 용도.
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