JP6853788B2 - ゼラチン粒子、ゼラチン粒子の製造方法、ゼラチン粒子内包細胞、およびゼラチン粒子内包細胞の製造方法 - Google Patents
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Description
[1]平均粒子径が0.010μm以上5.0μm以下であって、粒子を構成するゼラチンが自己架橋しており、アスペクト比が1.0以上1.4以下であり、造影剤を担持している、ゼラチン粒子。
[2]フーリエ変換型赤外分光光度計(FT−IR)で測定して得られるスペクトルにおけるCOOHとCONHとのピーク強度比が、0.46以上1.0以下である、[1]に記載のゼラチン粒子。
[3]前記平均粒子径は0.010μm以上2.0μm以下である、[1]または[2]に記載のゼラチン粒子。
[4]前記造影剤は前記ゼラチン粒子の内部に存在している、[1]〜[3]のいずれかに記載のゼラチン粒子。
[5][1]〜[4]のいずれかに記載のゼラチン粒子を細胞膜の内側に有する、ゼラチン粒子内包細胞。
[6][1]〜[4]のいずれかに記載のゼラチン粒子と細胞とを液体に添加して前記細胞の活動により前記ゼラチン粒子を前記細胞の細胞膜の内側に取り込ませる、ゼラチン粒子内包細胞の製造方法。
本実施形態は、ゼラチン粒子およびゼラチン粒子の製造方法に係る。
本実施形態に係るゼラチン粒子は、粒子径が5.0μm以下であり、かつ、粒子を構成するゼラチンが自己架橋しているゼラチン粒子である。上記構成を有するゼラチン粒子は、後述するように細胞に取り込まれやすいという特徴を有しているため、本明細書においては、「易取込性ゼラチン粒子」ともいう。上記易取込性ゼラチン粒子は、単一の粒子でもよく、複数のゼラチン粒子からなる集合体でもよい。
ゼラチンの自己架橋は、次の2つの反応により進行する。
反応(1): −COOH+−NH2 → −CONH+H2O
反応(2): 構成アミノ酸側鎖の酸化による−COOHの生成
反応(1)では、COOH基が消費されて、CONH基が生成されるため、上記ピーク強度比は小さくなる。しかしながら、反応(2)の反応速度の方が反応(1)よりも速いため、−COOHの生成が−COOHの消費を上回り、結果として、上記ピーク強度比は上昇する。
上記易取込性ゼラチン粒子は、ゼラチンを粒子状に形成し、その後自己架橋させる公知の方法で製造することができる。
本実施形態は、易取込性ゼラチン粒子を細胞膜の内側に有する細胞、およびそのような細胞の製造方法に係る。
本実施形態に係る細胞(以下、単に「ゼラチン粒子内包細胞」ともいう。)は、易取込性ゼラチン粒子を細胞膜の内側に有する細胞である。
ゼラチン粒子内包細胞は、易取込性ゼラチン粒子を上記細胞に導入して、製造することができる。ゼラチン粒子を細胞に導入する方法の例には、液体中にゼラチン粒子と細胞とを添加して、エンドサイトーシスによる取り込みなどの細胞自らの活動によって取り込ませる方法、および外部からの操作によって導入する方法が含まれる。細胞自らの活動によって取り込ませる方法の例には、ゼラチン粒子と細胞とを液中で撹拌する方法や、ゼラチン粒子が含まれる細胞培養液中で細胞を培養する方法が含まれる。なお、上記易取込性ゼラチン粒子は、細胞自らによる取り込み効率が高いため、細胞への取り込みを促進するために他の成分との複合体を形成させる操作は特に必要ない。細胞の活性の低下を最小限に抑える観点からは、上記のうち、易取込性ゼラチン粒子と細胞とを液中で混合し培養する方法が好ましい。上記外部からの操作によって導入する方法の例には、エレクトロポレーション法およびマイクロインジェクション法が含まれる。これらのうち、ゼラチン粒子を導入させる際に細胞の活性を低下させにくくする観点からは、細胞自らの活動によって導入する方法が好ましく、上記複合体を形成せずに細胞に取り込ませる方法がより好ましい。
1−1.原料溶液の調製
ゼラチン(新田ゼラチン株式会社製、G−2613P)、純水、Fe2O3粉末(コアフロント社製3310DX(α−Fe2O3))を混合し、ゼラチンとFe2O3粉末との体積比が(ゼラチン:Fe2O3粉末=10:1)の原料溶液を調製した。ゼラチンおよびFe2O3粉末の量は、上記原料溶液中の濃度がそれぞれ表1に記載した数値になるよう調整し、純水に対する固形分の含有比率が異なる複数種類の原料溶液を得た。
100℃に加熱した加熱管の内部に、鉛直方向上方から下方に向けて3L/minの空気流を送流した。インクジェットヘッド(コニカミノルタ社製、512S)から、40℃に加熱した上記各原料溶液の4pLまたは42pLの液滴を吐出周波数5KHzで上記空気流の中に滴下し、インクジェットヘッドの200cm下方に設けた親水化処理された四フッ化エチレン樹脂(PTFE)のフィルタ(メルク(日本ミリポア)社製ミリポア、0.45メッシュ)に上記滴下した液滴を着弾させた。上記滴下を5時間行ったのち、フィルタ上に捕集されたゼラチン粒子を回収した。
スプレードライヤー(株式会社プリス製、スプレーボーイ)を用いて、上記各原料溶液のうち所定のものを二流体ノズル方式のノズルから1kg/hで200℃に加熱した乾燥室内に噴霧し、乾燥室の下部でゼラチン粒子を捕集し、回収した。
上記作製された未架橋の各ゼラチン粒子を、真空状態にした加熱炉(ヤマト科学株式会社社製、真空角型乾燥機ADP200)内で表1に記載の時間160℃で加熱し、自己架橋したゼラチン粒子1〜9およびゼラチン粒子12〜18を得た。
2−1.平均粒子径およびアスペクト比
上記作製したゼラチン粒子1〜18を走査型電子顕微鏡(SEM)で撮像し、撮像された画像をMountech社製画像解析式粒度分布ソフトウェアMac−Viewを用いて解析することにより、任意に選択した20個のゼラチン粒子の短径および長径を測定し、その平均値をそれぞれのゼラチン粒子の短径および長径とした。上記ゼラチン粒子の短径と長径との平均値をそれぞれのゼラチン粒子の平均粒子径とした。また、任意に選択した10個のゼラチン粒子のアスペクト比を測定し、その平均値をそれぞれのゼラチン粒子のアスペクト比とした。
上記作製したゼラチン粒子13〜18をフーリエ変換型赤外分光光度計(FT−IR)で測定し、横軸に波数、縦軸に吸光度をプロットしたスペクトルを得た。尚、以下の測定条件を使用した。
測定装置:フーリエ変換型赤外分光光度計Nicolet380(Thermo Fisher Scientific社製)
FT−IR測定条件 :1点反射型ATR法
検出範囲 :4000−700cm−1
スキャン回数:32回
使用窓材 :Ge
分解能 :4
ビームスプリッタ:KBr
ゲイン :2
光源 :IR
検出器 :DTGS KBr
表4に、ゼラチン粒子13〜18のCOOH/CONHを示す。
3−1.細胞内への導入
Life Technologies社製細胞培養液MEM Alpha basic(1X)500mlにウシ胎児血清(Fetal bovne serum)50mlを加えたものを細胞培養液として使用した。3mlの細胞培養液に、それぞれ1mgのゼラチン粒子1〜18を加え、マウス骨芽由来の細胞(MC3T3E1)を6000cells/mlになるように添加し、細胞添加後の細胞培養液を24時間40℃で保温して、18個の評価用サンプルを作製した。
更にゼラチン粒子1〜12については、細胞と共に保温する時間を48時間に延長した評価用サンプルを12個作製した。
上記評価用サンプルから、それぞれの細胞分散液の一部を取り出し、以下の手順によって、細胞膜の内側に取り込まれたゼラチンが確認できるか否かを観察し、以下の基準によって判定した。
培養した細胞に1%パラホルムアルデヒド1mlを加えて細胞固定化処理を行った。次いで、下記組成のFe染色液1mlを加えてFeを染色した。さらに、下記の濃度に調整した核染色液1mlを加えて細胞を染色した。
下記の2液を同体積混合してFe染色液を調製した。
・20体積% HCL(濃塩酸を5倍希釈したもの)
・10質量% K4(Fe(CN6))水溶液(100mg/ml)
硫酸アンモニウム5質量部と、Nuclear fast red 0.1質量部とを、蒸留水100質量部に混合して核染色液を調製した。
染色された細胞を光学顕微鏡で観察して、任意に選択された細胞20個の中に青く染色されたFeが含まれているかどうかを評価した。
○ 上記20個の細胞のうち、10%以上50%未満(2個以上10個未満)の細胞で、細胞膜の内側にゼラチンが取り込まれていることが確認できた
△ 上記20個の細胞のうち、10%未満(2個未満)の細胞で、細胞膜の内側にゼラチンが取り込まれていることが確認できた
× 上記20個の細胞のうち、ゼラチンが取り込まれている細胞は確認できなかった
ゼラチン粒子1〜12の評価サンプルを用いて、各ゼラチン粒子を取り込んだ細胞の生死を評価した。
上記の各評価用サンプルを40℃に保ち、1週間後に一度細胞培養液を新しいものに交換して、2週間培養した。タカラバイオ社製Live/Dead Cell Staining Kit IIを用いて、上記培養後の培地に見られる細胞のうち任意に選択した20個の細胞の生死を観察し、以下の基準によって判定した。
× 上記20個の細胞のうち、生きている細胞は70%未満(14個未満)であった
ゼラチン粒子13〜18の評価サンプルを用いて、細胞内の酵素によってゼラチン粒子が分解されるのにかかる時間を、以下の方法で測定した。
12穴のマルチウェルプレート(Corning社)のウェル内に細胞分散培地を1mlずつ添加し、ウェル当たりの細胞数が5×10細胞となるように細胞を播種した。尚、細胞を播種するウェルの数は、各粒子当たり、17ウェルとした。
細胞を40℃で24時間インキュベートした後、培地を除去し、ゼラチン粒子を含有する培地(ゼラチン粒子が200μg/ml)を1mlずつ添加した。更に40℃で24時間インキュベートした後、培地を除去し、細胞をPBS(Gibco社)で3回洗浄した。
ウェル内の細胞に、0.25質量%のトリプシン−EDTA溶液(0.25%トリプシン−EDTA(1×),フェノールレッドを含む)(Gibco社)を1mlずつ添加し、ウェルから細胞を剥離した。剥離した細胞を次に新たな12穴のマルチウェルプレートに再播種し、40℃でインキュベートした。インキュベートの開始から、0、1、3、5、7、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60日後に、細胞内のFe濃度を下記手法で測定した。
細胞をインキュベートしたウェルから培地を取り除き、細胞をPBSで3回洗浄した。次に、1M塩酸(和光純薬工業社製)溶液を細胞に加え、5分間放置し、細胞を溶解させた。ウェル内の細胞溶解液をエッペンチューブに回収し、原子吸光光度計A4-6800(島津製作所製)でFeを定量した。
インキュベート後0日の細胞から得られたFe量を基準値(初期Fe量)とし、測定されるFe量が初期Fe量の10%以下になるまでに掛かった時間を、酵素による分解時間と定義した。
Claims (6)
- 平均粒子径が0.010μm以上5.0μm以下であって、粒子を構成するゼラチンが自己架橋しており、アスペクト比が1.0以上1.4以下であり、造影剤を担持している、ゼラチン粒子。
- フーリエ変換型赤外分光光度計(FT−IR)で測定して得られるスペクトルにおけるCOOHとCONHとのピーク強度比が、0.46以上1.0以下である、請求項1に記載のゼラチン粒子。
- 前記平均粒子径は0.010μm以上2.0μm以下である、請求項1に記載のゼラチン粒子。
- 前記造影剤は前記ゼラチン粒子の内部に存在している、請求項1に記載のゼラチン粒子。
- 請求項1に記載のゼラチン粒子を細胞膜の内側に有する、ゼラチン粒子内包細胞。
- 請求項1に記載のゼラチン粒子と細胞とを液体に添加して前記細胞の活動により前記ゼラチン粒子を前記細胞の細胞膜の内側に取り込ませる、ゼラチン粒子内包細胞の製造方法。
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