KR100819184B1 - 약물전달용 인체유래 재조합 젤라틴 나노입자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연 가교제를 사용하여 가교 결합으로 제조되는, 인체유래 재조합 젤라틴을 이용한 약물전달용 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르는 유전자 재조합 젤라틴 나노입자는 내용물의 변형이 적고, 분자량이 균일하며, 동물유래 젤라틴과는 달리 독성이 최소화되고, 체내에서 장기간 지속적으로 목적 성분을 방출하는 약물 전달 시스템으로 적당하다.

약물 전달 시스템, 인체유래 재조합 젤라틴, 나노입자, 천연 가교제

Description

약물전달용 인체유래 재조합 젤라틴 나노입자{RECOMBINANT HUMAN GELATIN NANOPARTICLES FOR DRUG DELIVERY}

본 발명은 젤라틴을 포함하는 나노입자에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 천연 가교제를 사용하여 가교 결합으로 제조되는, 인체유래 유전자 재조합 젤라틴을 포함하는 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.

중합체 나노기술은 최근 나노입자의 지속적으로 방출하는 특성(sustained-release properties), 세포보다 작은 크기(sub-cellular size), 안전성(stability), 및 특정 세포 또는 기관에 대한 표적성(targetability)의 이유로 펩티드, 단백질, 핵산 등의 생물학적 분자로 이루어진 약물 전달 시스템으로서 큰 잠재력이 있음을 보여 주고 있다(J.K. Vasir 등, Current Nanoscience. 1 (2005) 47-64). 나노 입자의 세포내 흡수(cellular uptake)는 마이크로 크기의 입자 보다 더 효과적이며, 100nm 크기 입자는 1 ㎛ 크기 입자 보다 2.5배, 10㎛ 입자 보다 6배 더 효과적이다 (M.P. Desai 등, Pharm. Res. 14 (1997) 1568-1573). 대부분 200-600nm 범위인 인간 말초 종양(peripheral human tumor)에 효과적인 세공(pore) 크기 때문에, 침투 및 지속성 증강 효과(EPR effect)에 의하여 암치료를 위해 400nm 이하 나노입자들을 효과적으로 전달할 수 있다 (F. Yuan 등, Cancer Res. 55 (1995) 3752-3756; 및 W.L. Monsky 등, Cancer Res. 59 (1999) 4129-4135).

천연 중합체에 기초한 나노입자에 상당한 관심이 모아지고 있다(C. Coester 등, Eur. J. Pharm. Biopharm. 62(3) (2006) 306-14 참조). 특히, 젤라틴 나노입자가 연구되어왔다 (K. Zwiorek 등, J. Pharm. Pharm. Sci. 7(4) (2005) 22-8 참조). 1978년부터 다양한 제조 방법이 개발되어 왔지만, 두 가지 큰 문제가 남아있다 (J.J. Marty 등, Pharm Acta Helv. 53 (1978) 17-23 참조). 첫째, 제약업에서 안정화제 및 캡슐 물질로 널리 사용되는 젤라틴은 소나 돼지의 뼈 또는 가죽에서 유래한 크기가 다른 단백질의 불균일한 혼합물이며, 이는 불균일 나노입자 크기 분포를 야기한다 (S. Young 등, J. Control. Release. 109 (2005) 256-274 참조). 둘째, 젤라틴 나노입자 제조에 일반적으로 사용되는 가교제인 글루타르알데히드는 독성이 있다 (H.W. Sung 등, J. Biomed, Mater. Res. 46(4) (1999) 520-530 참조). 고른 크기의 나노입자를 제조하기 위하여는 다양한 크기의 젤라틴에서 특정 분자량의 젤라틴만 모아야 하였다.

더욱이, 젤라틴 나노입자는 종래에 사용되는 제조방법에 의하여 제조하는 경우, pH 2.5로 조절을 요하는 두 단계 탈용매 방법 때문에 높은 pH에서 성질이 변할 가능성이 있다 (C.A. Farrugia 등, J. Pharm. Pharmacol. 51 (1999) 643-649; 및 C.J. Coester 등, J. Microencapsulation. 17(2) (2000) 187-193 참조). 이 방법은 유기용매의 첨가시 유속을 일정하게 유지시키는 등 까다로운 제조공정이 적용되었다.

젤라틴 나노입자의 우수한 약물 전달 잠재성에도 불구하고, 동물유래 젤라틴의 감염 및 과민반응의 문제 그리고 제조방법의 산성조건과 복잡성으로 인하여 이용 범위가 극히 제한되어 있다. 따라서, 그 제조과정에서 단백질 등 생체 물질의 변성을 최소화하고 생체 내 적용시 독성이 문제되지 않는 수준의 젤라틴 나노입자의 필요성이 절실하다.

본 발명자들은 놀랍게도 젤라틴의 분자량 분포를 고르게 하고 천연 가교제를 사용하면, 종래에 사용하던 두 단계 탈용매 공정 중 한 단계를 생략할 수 있으며, 낮은 pH에서 탈용매를 수행하지 않고 단순한 혼합에 의하여도 젤라틴 가교결합이 용이함을 발견하여, 종래의 젤라틴 제조방법에 비하여 간단하고 안전하며 전달 목적물질의 변형도 최소화한 젤라틴 나노입자 제조방법을 개발하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명자들은 인체유래 유전자 재조합 인체 유래 젤라틴(rHG) 및 천연 가교제인 제니핀에 기초하여 나노입자를 제조하는, 간단하면서 안전하고 재현가능한(reproducible) 변형된 탈용매 방법을 도입하였다(H.C. Liang 등, J. Biomed. Mater. Res. 65A (2) (2003) 271-282 참조).

종래 사용되던 A 혹은 B 타입 젤라틴의 단점과 문제점을 극복하기 위해 동일한 크기의 단백질로 된 균일한 rHG 혼합물을 사용하였다. 시중에 판매되는 백신의 동물유래 젤라틴과 같은 복용량 및 훨씬 더 많은 복용량으로 인간 지원자에게 복용시켜 rHG의 안전성을 테스트하였다. 이 연구 도중 측정된 표준 혈청 화학 매개변수에 대해서는 rHG의 큰 변화가 관찰되지 않았다 (http://www.fibrogen.com/programs/fg-5009/ 참조). 게다가, 본 발명에서 사용하는 변형된 탈용매 방법은 낮은 pH 범위로 수성 환경을 조절하지 않아도 된다.

글루타알데히드와 비교하면, 제니핀은 가교결합에 많은 시간이 소요되지만, 독성이 없다 (Z. Lu 등, Clin. Cancer. Res. 10(22) (2004) 7677-7684 및 상기 H.C. Liang 등 참조). 제니핀의 세포독성은 글루타알데히드 보다 약 10000배 낮고, 제네핀으로 배양된 세포의 번식력은 글루타알데히드 보다 약 5000배 높다 (상기 H.W. Sung 등 참조). 또한, 이리도이드 글루코시드(iridoid glucoside)와 비슷하기 때문에, 제니핀은 한약제(herbal medicine) 및 음식물 색소의 제조에 사용되어 왔다. 본 연구의 가설은 rHG 및 제니핀을 이용하여 무독성 나노입자를 제조할 수 있을 것이라는 것이었고, 제니핀의 긴 가교결합 시간과 rHG의 균일한 분자량 때문에 두 단계 탈용매 방법에 의한 가교결합 공정을 변형시켰다.

본 연구는 rHG 나노입자를 제조하는 간단하고 재현가능한 변형된 탈용매 방법을 최적화하였다. 좁고 균일한 크기 분포를 가지는 나노입자와 모델 단백질을 준비하였다. 모델단백질인 플루오레세인 이소티오시안산 우혈청알부민(FITC-BSA; fluorescein isothiocyanate bovine serum albumin)을 나노입자에 봉입하고 크기측정, 봉입률(loading efficiency) 및 시험관 내에서 방출과 같은 다양한 물리 화학적 기술로 특성화 시켰다. 나노입자의 세포독성 및 H9C2로의 세포내 전달능력을 측정하였다.

이하에서는 본 발명을 더 구체적으로 설명한다.

본 발명의 한 양태에서는 천연 가교제를 사용하여 가교 결합으로 제조되는, 유전자 재조합 젤라틴을 포함하는 나노입자 제공한다.

천연 가교제는 젤라틴의 가교결합을 유발할 수 있는 천연 유래의, 독성이 적은 어떤 물질도 무방하다. 바람직하게는 천연 가교제는 식물유래이다. 더 바람직하게는 천연 가교제는 제니핀이다.

유전자 재조합 젤라틴은 일정한 크기의 나노입자를 형성하기 위한 어떠한 종류의 균일한 분자량의 재조합 젤라틴이어도 무방하다. 바람직하게는 유전자 재조합 젤라틴은 인간 유래의 유전자 재조합 젤라틴이다. 나노입자의 크기를 일정 수준 이하로 조절하기 위하여 젤라틴의 분자량을 재조합 기술에 의하여 조절할 수 있다.

바람직하게는 나노입자의 크기는 암세포 특이적 축적이 가능한 크기로 조절될 수 있다. 나노입자의 크기는 바람직하게는 300 nm 이하이다.

본 발명의 다른 양태에서는 전달대상 약물과 유전자 재조합 젤라틴을 혼합하는 단계; 혼합물에 에탄올을 가하여 탈용매시키는 단계; 에탄올 중의 혼합물에 천연 가교제를 첨가하여 가교결합하는 단계; 및 에탄올을 증발시키는 단계를 포함하는 유전자 재조합 젤라틴 나노입자의 제조방법을 제공한다.

본 방법은 종래의 젤라틴 나노입자 제조에서 사용하던 탈용매 단계의 pH나 유속의 제한을 받지 않고 단순한 혼합과 당업자에게 용이한 간단한 최적화 작업에 의하여 가교결합을 수행할 수 있다.

본 발명은 지속 방출, 초기 급속방출의 최소화 및 안전성 측면에서 우수한 잠재성을 가지는 약물 전달 시스템을 제공한다. 본 발명에 따르는 유전자 재조합 젤라틴 나노입자는 내용물의 변형이 적고, 독성이 최소화되고, 체내에서 장기간 지속적으로 목적 성분을 방출하는 약물 전달 시스템으로 적당하다.

따라서, 다양한 단백질, 펩티드, 핵산 등을 포함하는 약물을 적용하여 생체 내 전달하는데 유용하며, 특히 크기가 작기 때문에 암 조직에 특이적인 축적이 가능하다. 다양한 유전자 재조합 단백질 약물전달체 및 유전자 치료를 위한 유전자 전달체로서 유용하다.

그 밖에도 특정 부위에 전달을 요하는 각종 질병, 예를 들어 심근경색 류머치스 관절염, 암의 치료에 유용하다.

1. 인체유래 유전자 재조합 젤라틴(rHG) 나노입자 제조의 최적화

탈용매제로 에탄올을, 가교제로 제니핀을 사용하는 변형된 탈용매 방법으로 rHG의 나노입자를 제조하였다. rHG의 낮고 균일한 분자량 분포 특성 때문에 종래의 탈용매 방법인 제 1단계를 생략하였다.

나노입자 제조를 위한 최적의 조건을 연구하기 위해, rHG, 에탄올 및 제니핀의 다양한 농도를 실험하였다(데이터 나타내지 않음). 다분산지수 및 안전성에 기초하여, rHG의 최적 농도가 0.05%임을 관찰하였고 다음의 실험에 사용하였다.

도 1에서 보여진 바와 같이, 에탄올 농도를 59에서 62%(v/v)로 증가시키면 나노입자 크기가 유의하게 증가된다. 다분산지수가 0.10 미만인 상태에서 59% 에탄 올에서 49nm인 입자 크기가 62% 에탄올에서 85nm로 변형된다. 나노입자는 단봉형(unimodal)이 아니거나 59%미만 또는 62% 이상의 에탄올 농도에 적합하지 않다. 최저 다분산지수, 형태, 재생산가능성 및 안전성에 기초하여, 에탄올의 최적 농도는 60%이었다.

나노입자 형성 가교결합에 대한 제니핀 농도의 영향을 연구하였다. 3시간 및 72시간 동안 가교결합된 나노입자의 다분산지수와 크기를 측정하였을때, 0.05%(w/v) 미만의 제니핀 농도에서는 충분한 가교결합을 관찰할 수 없었다. 한편, 0.05% 이상의 농도의 가교결합에 있어서, 크기와 다분산지수에 변화가 없었으며, 이는 0.05% 제니핀이 적합한 나노입자를 제조하기위한 최소 농도라는 것을 증명한다. 비록 나노입자의 크기는 제니핀과의 가교결합한 3시간 후에 안정된 상태에 도달하지만, 72시간에 달하는 좀더 긴 배양시간이 나노입자의 분해(disintegration)를 방지하는데 필요하다.

2. FITC-BSA를 봉입한 rHG 나노입자의 제조 및 특성

나노입자의 봉입률(loading efficiency), 시험관내 방출, 및 세포내 전달능력을 측정하기위해 FITC-BSA 모델단백질을 rHG 나노입자 내에 봉입시킨다. 도 2에 보여지는 바와 같이 나노입자의 크기는 에탄올 농도와 함께 증가하며 FITC-BSA의 양에 비례한다(데이터 나타내지 않음). 부가적으로, 59% 에탄올 농도에서, FITC-BSA를 봉입한 나노입자는 이를 봉입하지 않은 rHG 나노입자(도 1)와 비교하면 크기가 49nm에서 230nm로 증가하였다.

3. 주사 전자 현미경(SEM)

동적 광산란기로 측정된 FITC-BSA가 봉입된 rHG 나노입자의 평균 크기는 230nm이고 이 평균 표면은 -21.8mV였다. 도 3에 보여진 바와 같이, FITC-BSA가 봉입된 rHG 나노입자는 구형이며 크키 분포가 균일하다. 나노 입자의 평균 지름은 광산란자료와 매우 흡사하다.

4. 나노입자 표면상의 자유 아미노기의 정량

제니핀이 나노입자 표면의 아미노기들 사이에서 가교결합할 때, 가교결합의 정도와 잔여 아미노기의 정도를 이해하는 것이 중요하다. 나노입자의 생분해성, 혈 반감기 및 동시 순환 시간은 가교결합의 정도에 의하여 영향을 받는다. 게다가, 잔여 자유 아미노기는 생체활성 분자를 나노입자에 접합시키는데 이용될 수 있다. FITC-BSA가 봉입된 rHG 나노입자의 자유 아미노기 함량을 TNBS 반응으로 정량하였고, 그 함량은 약 20% (80% 가교결합)였다.

낮은 다분산 지수는 나노입자의 크기분포가 좁다는 것을 의미하였고, 나노입자 중 응집체보다 입자상의 아미노기와 제니핀이 반응하였음을 나타내었다. 게다가, 나노입자의 제타포텐셜은 나노입자 응집을 방지할 수 있다(S. Azarmi et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 9(1) (2006)124-132).

5. rHG 나노입자로부터의 FITC-BSA의 시험관 내 방출

나노입자로부터의 FITC-BSA의 시험관 내 방출은 유의한 초기 돌발방출 없이 이(二)상 및 40일을 넘는 지속방출을 나타내었다(도 4-a, 10일 동안 50% 방출). 젤라틴 나노입자의 표면상의 자유 아미노기 사이의 가교결합을 형성시키는 제니핀의 첨가는 아마도 수성 환경 내의 나노입자의 재용해를 방지였고 FITC-BSA의 지속 방출을 유도하였다. FITC-BSA의 봉입률은 약 80%였다.

방출된 FITC-BSA의 응집 또는 변성을 관찰하기 위하여 SDS-PAGE를 수행하였다 (도 4-b). 표준 및 방출된 FITC-BSA의 밴드는 동일한 위치에서 나타났는데, 이는 방출 동안 물리적 또는 화학적 변형이 없었다는 것을 나타낸다.

가교결합 소요 시간이 나노입자의 안정도 및 동시 방출률에 영향을 준다는 가설 하에, 나노입자를 24, 48 및 72 시간 동안 가교결합한 후, 안정성 및 방출률을 비교하였다. 가교결합 후에, 나노입자를 에탄올 증발, 원심분리, 고주파 분해 및 동결건조에 의하여 정제하였다. 에탄올 증발 전에는 가교 소요시간에 관계없이 나노입자의 크기는 유사하고 균일하였다. 그러나, 에탄올 증발 후에는, 샘플을 24시간 및 48 시간 동안 가교결합시켰을 때 크기의 유의한 다양성이 관찰되었다(데이터 게재하지 않음). 이러한 크기의 변화는, rHG 나노입자의 효율적 가교결합에 72 시간 미만의 가교결합 시간은 불충분하다는 것을 나타낸 것이다.

6. 나노입자의 시험관 내 세포 독성 및 세포내 전달률

플레이트에 부착한 생존 세포를 계수하여 세포부착에 대한 나노입자의 영향을 연구하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 나노입자 처리를 한 경우와 처리하지 않 은 경우 세포부착에 유의한 차이점이 없었다. 다양한 나노입자 농도로 인큐베이션 24 시간 후에, H9C2 세포의 생존률을 MTT 검정을 통하여 측정하였다. MTT 검정은 생물학적 물질의 독성을 평가하는 용도로 광범위하게 사용되며, 대사활성 및 세포 생존에 영향을 주는 미토콘드리아 활성에 기초한 것이다(A.K. Gupta et al., J. Control. Release. 95(2) (2004) 197-207 참조). 나노입자의 농도가 증가할수록 H9C2 세포의 생존률은 감소하였다 (도 5b 참조). 대조군 세포와 비교할 때, 나노입자 농도 62.5 ㎍/ml에서 약 90% 세포가 생존하였는데, 이는 세포 내 전달률을 유동 세포계측에 의하여 검출하는데 충분한 것이었다.

유동 세포계측을 사용하여 나노입자의 세포 내 전달률을 정량적으로 분석하였다 (도 6a). 24시간 후에 약 97%의 세포가 나노입자를 흡수하였다. 효율적인 흡수를 CLSM를 사용하여 선명하게 가시화하였다. FITC의 녹색 형광 및 PI의 적색 형광은 나노입자가 핵이 아닌 세포질에 편재함을 나타내었다 (도 6b). 유의한 세포독성은 관찰되지 않았고, rHG 나노입자는 효율적으로 세포를 통과하였다.

요약하면, 수정된 탈용매 방법을 사용하여 간단하고, 안전하면서도 재현가능하게 약물 전달용의 rHG 나노입자를 제조하였고, 모델 단백질인 FITC-BSA는 rHG 나노입자로부터 초기 돌발방출 없이 이(二)상의 양상으로 및 지속 방출 패턴으로 방출되었다. rHG 및 천연 가교 결합제에 기초한 최적화된 나노입자를 최초로 제조하였고, 지속 방출, 초기 돌발방출의 최소화 및 안전성 측면에서 우수한 잠재성을 가지는 약물 전달 시스템을 제공한다. 결론적으로, 이들 결과는 rHG 나노입자가 독성 이 최소화된 약물 전달 시스템으로 적당하다는 것을 시사한다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하려는 의도는 아니다.

<실시예>

재료 및 시약

A타입 젤라틴(돼지 가죽에서 채취), 피크릴술폰산(picrylsulfonic acid)(TNBS), 콜라게나제 및 FITC-BSA를 Sigma(St. Louis, MO)에서 구입하였다. 제니핀은 Challenge Bioproducts (Taichung, Taiwan)에서 입수하였다. rHG(MW: 100kDa)는 Fibrogen (San Francisco, CA)에서 구입하였다. 투석막(MWCO: 100000)은 Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA)에서 입수하였다. Bio-Safe Coomassiestain은 Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA)에서 구입하였다. 모든 다른 시약들은 분석용 등급(analytical grade)이다.

실시예 1. FITC-BSA를 봉입한 인체유래 유전자 재조합 젤라틴(rHG) 나노입자의 제조

제니핀을 가교제로 사용하는 변형된 탈용매 방법으로 rHG 나노입자를 조제하였다. rHG는 분자량이 작고 균일한 분포를 갖기 때문에, 제 1 탈용매 단계를 생략하였다. FIC-BSA이 봉입된 rHG 나노입자를 제조하기 위해, 2.5mg FIT-BSA를 0.05% rHG 수용액 40ml에 첨가하고 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 다양한 부피비의 에탄올로 탈용매시키고 37℃ 에탄올에서 제니핀으로 가교결합 시켰다. 72시간 후, 회전 증발기(N-1000,EYELA, Tokyo, Japan)로 열과 회전을 가하여 에탄올을 증발시켰다. 가교 결합된 rHG 나노 입자를 정제하기 위해, 분산물을 12000×g에서 20분간 원심분리 시켰다. 침전물을 탐침 고주파 분해기(probe sonicator)(Digital Sonifier 450, BRANSON, Danbury, CT)를 이용하여 증류수에 재 분산 시켰다. 입자 크기는 Zetasizer(Nano ZS, Malvern instruments, Worcestershire, UK)를 이용하여 동적광산란으로 측정하였다.

실시예 2. 나노입자의 주사 전자 현미경( SEM ) 관찰

종래의 주사 전자 현미경(SEM) (JSM 6340F, JEOL, Tokyo, Japan)에 15.0kV의 전압을 가속시켜 크기 분포, 입자 크기 및 나노입자 형태를 관찰하였다. 동결건조된 나노입자를 탄소 코팅 구리 격자 및 탄소 코팅(carbon coated)에 떨어뜨려 SEM 표본을 제조하였다.

실시예 3. 나노입자 표면에 있는 자유 아미노기 함량의 정량화

TNBS 반응(C. Weber 등, Int. J. Pharm. 194(1) (2000) 91-102)을 이용하여 FITC-BAS를 봉입한 rHG 나노입자의 표면에 있는 아미노기를 정량화하였다. 동결건조된 나노입자를 물(0.73 mg/ml)에 분산시키고 나노입자 분산물 500㎕를 같은 부피의 물로 희석시켰다. pH 8.5인 4% 탄산수소나트륨 용액 1ml, 및 같은 부피의 0.1% TNBS 수용액을 나노입자 분산물에 가하였다. 나노입자를 얻기 위해 이 혼합물을 500rpm으로 두 시간동안 40℃에서 교반시키고, 13000×g에서 30분동안 원심분리시켰다. 상층액(560㎕)을 1ml의 물로 희석시키고 미반응 TNBS를 위해 UV/VIS 분광 광도계(DU 730, Beckman, Fullerton, CA)로 349nm에서 측정하였다. 나노입자 표면에 있는 아미노기의 함유량을 나노입자 분산물 대신 물을 사용한 TNBS 표준과 상대적으로 비교하여 계산하였다.

실시예 4. rHG 나노입자의 봉입률 측정

FITC-BSA를 봉입한 나노입자를 분산시킨 후 콜라게나제(20U/ml)를 함유한 PBS 1ml에 침지시키고 진탕항온수조(shaking water bath)를 이용하여 150rpm으로 24시간동안 37℃에서배양시켰다. 효소처리 후 나노입자의 분해를 동적광산란을 이용하여 크기를 측정하였다. 나노입자가 방출시키는 FITC-BSA의 양을 UV/VIS 분광 광도계를 이용하여 495nm에서 측정하였다.

실시예 5. 시험관내 rHG 나노입자의 FITC - BSA 방출 특성

시험관 내에서 셀룰로오스 에스테르 투석막을 이용하여 방출 연구를 수행하였으며, 이는 FITC-BSA이 투석 주머니에서 방출 배지로 확산되도록 한다. 동결건조된 FITC-BSA 나노입자를 pH 7.4 PBS에 분산 시키고 투석막 내에 봉입시켰다. 막 주머니를 PBS 용액이 든 유리병에 넣고 정해진 간격에서 방출 배지를 수집하고 새로운 용액으로 교체하였다. 방출된 FITC-BSA을 측정하기 위해, 수집된 배지의 흡광 도를 UV/VIS 분광광도계를 이용하여 495nm에서 측정하였다. 각각의 실험을 세차례 수행하였다. 나노입자에서 방출된 FITC-BSA의 상태(integrity)를 황산 도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)으로 확인하였다.

실시예 6. 시험관내 세포부착 및 생존능력 연구

세포 부착 효과를 나노입자와 함께 또는 나노입자 없이 배양된 세포 현탁액과 비교하여 관찰하였다. H9C2세포를 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)의 6 웰 플레이트(well plate)에 5×10⁴ 세포/웰 밀도로 접종(seed)하고, 10% 우태혈청(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙트아비딘(Gibco, Carlsbad, CA)을 가하였다. 세포를 5% CO₂ 배양기(VS-9108MS, Vision Scientific Co., Yeoju, Korea) 37℃에서 0.1 mg/ml 농도의 나노입자와 또는 나노입자 없이 접종하였다. 24시간 후, 배양 배지를 제거하고 세포를 PBS로 두 차례 세척하여 트립신화 시켰다. 세포를 수확하여, 배양 매개물에 다시 현탁시키고 광학현미경으로 계수하였다.

생존률을 측정하기 위해, H9C2 세포를 96-웰 플레이트에 5×10³ 세포/웰 밀도로 접종시키고, 24시간 동안 배양시켰다. 배양 후, 정해진 농도 범위 또는 대조군에 있어서 모든 배양 배지를 나노입자를 포함하는 새로운 배지 200㎕로 교체하였다. 24시간 후, MTT 용액(5mg/ml in PBS, pH 7.4) 20㎕를 각 웰에 첨가하였다. 4시간 동안 배양 후, 모든 배지를 제거하고 포르마잔 결정(formazan crystal)을 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide) 100㎕에 용해시켰다. 플레이트를 37℃에서 30분 간 배양시키고 강력하게 교반시켜 결정을 완전히 용해시켰다. 각 웰의 흡광도를 UV/Fluorescence microplate reader(SpectraMax M2e, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 540nm에서 측정하였다.

세포 생존률(%)=(N-D)/(C-D)×100

상기 방정식을 이용하여 상대적인 세포 생존률(%)를 계산하였으며 N 및 C는 나노입자로 처리된 표본 및 나노입자 없이 처리된 표본의 흡광도 값이고, D는 세포가 없는 블랭크(blank)의 흡광도값이다. 대조 흡광도를 100% 세포 생존률로 가정하였다. 8번 반복되는 실험을 차례 번 실행하여 생존률 값을 구하였다.

실시예 7. FITC - BSA 를 봉입한 나노입자의 세포내 전달력

H9C2세포를 6 웰 플레이트에 1.0×10⁵ 세포/웰 밀도로 접종시키고 24시간 동안 배양시켰다. 나노입자의 세포내 전달을 측정하기 위해, 정해진 농도범위 또는 대조군 내에서 배양 배지를 나노입자를 포함하는 새로운 배지 2ml로 교체시켰다. 세포배양 24시간 후, 배양 배지를 제거, 플레이트를 PBS로 두 차례 세척하고 세포를 트립신화하여 수집하였다. 수집된 세포를 2% FBS 및 0.02% sodium azide/PBS 로 세 차례 세척하고 4% formaldehyde/PBS에 고정시켰다. FITC-BSA 나노입자를 세포내 전달력을 양적으로 측정하는 마커로써 사용하였고, 유세포분석기(flow cytometry)(FACSCalibur, BD Biosciences, Mountain Biew, CA)로 분석하였다.

FITC-BSA를 봉입한 rHG 나노입자의 세포내 전달력을 공초점 레이저 주사현미경 (CLSM)( Delta Vision RT, Applied Precision, Issaquah, WA)으로도 관찰하였다. H9C2 세포를 Lab-Tek 챔버 커버 유리 시스템(Lab-Tek chamber cover glass sysem)(Nalge Nunc International, Rochester, NY)에 1.0×10⁴ 세포/웰 밀도로 24시간 동안 접종시켰다. 나노입자의 세포내 전달력을 관찰하기 위해, 배양 배지를 나노입자를 포함하는 새로운 배지 2ml로 대체시켰다. 세포배양 24시간 후, 배양 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세 차례 세척하고, 4% 포름알데히드로 30분간 고정시킨 뒤 PBS로 세척하였다. 현미경 분석 및 염색을 위해, 챔버 글래스(chambered glass)에 VECTRASHIELD 한 방울과 배지를 포함하는 프로피디움 요오드화물(PI)(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)을 떨어뜨리고 커버 슬립으로 덮었다. 표본을 빛에 노출되는 것을 막기 위해 덮어서 하룻밤 보관하였다. 세포질과 세포핵을 PI로 염색시키면 핵산 나선 내로 삽입되고 붉은 형광성을 띄게 된다. rHG 나노입자의 세포내 전달을 FICT에 대해 490 및 528nm, PI에 대해 555 및 617nm 파장에서 CLSM으로 시각화하였다.

도 1은 봉입되지 않은 rHG 나노입자의 크기 편차를 나타낸다. 가로축: 에탄올 농도, 세로축: 나노입자의 크기 (지름)

도 2는 FITC-BSA가 봉입된 rHG 나노입자의 크기 편차를 나타낸다. 가로축: 에탄올 농도, 세로축: 나노입자의 크기 (지름)

도 3은 FITC-BSA가 봉입된 rHG 나노입자의 주사전자현미경 (SEM) 이미지이다.

도 4는 rHG 나노입자로부터의 FITC-BSA의 방출 프로파일 및 SDS-PAGE 분석결과이다. (평균 ± 표준편차, n=3)

도 5는 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션 후 배양 플레이트에 부착한 세포수 백분률 (5a) 및 나노입자의 농도를 증가시키면서 24 시간 동안 인큐베이션 한 후 MTT 검정에 의하여 측정된 H9C2 세포 생존률(5a)을 나타낸 그래프이다.

도 6은 대조군으로서 나노입자 없이 배양한 H9C2 세포 (a) 및 나노입자와 함께 배양한 H9C2 세포의 FACS 분석(b) 및 FITC-BSA가 봉입된 rHG 나노입자와 함께 24 시간 동안 배양한 H9C2 세포의 공초점 현미경 이미지(c, green channel), 그 세포를 PI (d, red channel) 및 merged (e)에 의하여 염색한 세포의 형태를 나타낸다.

Claims (6)

1. 제니핀을 사용하여 가교 결합으로 제조되는, 인체유래 유전자 재조합 젤라틴을 포함하는 나노입자.
2. 제 1 항에 있어서, 젤라틴 사슬 사이 공간에 약물이 봉입된 것을 특징으로 하는 나노입자.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 나노입자의 크기는 50 내지 300 나노미터인 것을 특징으로 하는 나노입자.
4. (a) 전달대상 약물과 인체유래 유전자 재조합 젤라틴을 혼합하는 단계;

   (b) 혼합물에 에탄올을 가하여 탈용매시키는 단계;

   (c) 에탄올 중의 혼합물에 제니핀을 첨가하여 가교결합하는 단계; 및

   (d) 에탄올을 증발시키는 단계를 포함하는 유전자 재조합 젤라틴 나노입자의 제조방법.
5. 삭제
6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 나노입자의 크기는 50 내지 300 나노미터인 것을 특징으로 하는 유전자 재조합 젤라틴 나노입자의 제조방법.

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