JP6850292B2 - 分岐アルデヒドの製造方法 - Google Patents

Description

本発明はフレーバー物質の分野に属し、分岐アルデヒド、特に１２−メチルトリデカナールの新規な製造方法に関する。

分岐アルデヒドは自然界に広くみられる興味深い香りの良いフレーバー物質である。特に１２−メチルトリデカナールは本格的な牛肉風味の味にとって重要な成分であり、現在化学合成によってのみ商業的に製造することができる（Ｋｅｒｓｃｈｅｒ， ｅｔ． ａｌ．， Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ４８（６）， ｐ．２３８７−２３９０， ２０００を参照）。

したがって、製造工程に基づくと、欧州風味法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｆｌａｖｏｒ ｌｅｇｉｓｌａｔｉｏｎ）の観点からは天然であると示すことはできない。一方、市場では、性質が同一であることを示せるのみではなく、明示的に天然であることを示すことができるフレーバーに特別な関心がある。この宣言の選択は重要な購入及び価格の根拠をも意味する。

したがって本発明の目的は、一般的な分岐アルデヒドの製造方法を提供し、更に、特に１２−メチルトリデカナールのバイオテクノロジー及びひいては天然手段による製造方法を提供することである。

種々のコニディオボラス属株からの脂質抽出物の合計脂肪酸含有量に基づく脂肪酸の画分を示す図である。 分解方法に応じた脂肪含有量を示す図である。 脂肪酸分布をＧＣにより測定した結果を示す図である。 １２−メチルトリデカナールの標準質量分析スペクトル及びＮｓｐ−ＣＡＲを用いた還元後の標準質量分析スペクトルを示す図である。 加水分解された脂肪抽出物のＭＳ／ＭＳ解析を示す図である。 α−ジオキシゲナーゼを用いた還元を示す図である。 球管式蒸留前に得られたアルコールの組成を示す図である。 球管式蒸留後に得られたアルコールの組成を示す図である。 球管式蒸留前に得られたアルデヒドの組成を示す図である。 球管式蒸留後に得られたアルデヒドの組成を示す図である。 分離管式蒸留後に得られたアルデヒドの組成を示す図である。

本発明の第一の目的は、分岐アルデヒド、好ましくは１２〜１８個の炭素原子を含み、及び／又はメチル分岐を有する分岐アルデヒド、特に１２−メチルトリデカナール、１２−メチルテトラデカナール、１４−メチルペンタデカナール、１６−メチルオクタデカナール又はこれらの混合物の製造方法に関するものであり、前記方法は、
（ａ）コニディオボラス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属の１以上の糸状菌の培養物を用意し、遊離及び／又は結合型の分岐カルボン酸を含むバイオマスを生成する工程と、
（ｂ）工程（ａ）からのバイオマスを抽出して遊離及び／又は結合カルボン酸を含む第一中間体を生成する工程と、
（ｃ）第一中間体からの結合カルボン酸を化学的、酵素的、微生物的な加水分解を任意で行ってもよい工程と、
（ｄ）化学型還元剤を用いて第一中間体を処理して、遊離及び／又は結合カルボン酸を対応するアルコールに転換し、妨害副生物から１以上のアルコールを任意で分離し、混合物として又は富化型のこれらのアルコールを含む化学的に生成した第二中間体を生成する工程と、
（ｅ）生物学型還元剤を用いて第一中間体を処理して、遊離及び／又は結合カルボン酸を前記遊離及び／又は結合カルボン酸と同じ炭素原子数を有する対応アルデヒドに転換するか、又は前記遊離及び／又は結合カルボン酸と比較して少ない炭素原子数を有する対応アルデヒドに転換し、これらのアルデヒドを含む生物学的に生成した第二中間体を生成する工程と、
（ｆ）化学型酸化剤を用いて化学的に生成した第二中間体を処理して、遊離及び／又は結合アルコールを対応するアルデヒドに転換する工程と、
（ｇ）工程（ｄ）及び／又は工程（ｅ）及び／又は工程（ｆ）後に得られる画分から妨害副生物の除去を任意で行ってもよい工程を含むものである。

驚くべきことに、以前はほとんど注目を受けていなかったコニディオボラス属の糸状菌が、一般的な分岐アルデヒド及び特に１２−メチルトリデカナールの製造の好適な出発材料をこの微生物に出現させる脂肪酸パターンを有することが明らかとなった。最終生成物は生物学的還元剤及び／又は化学的還元剤並びに化学的酸化剤を用いる最適化された一連の処理によって高収率かつ高純度で得られる。酸化生成物は分岐アルデヒドの混合物であり、鎖状の種も含まれる。これら混合物を直接用ることができるが、目的とする処理により、特に所望とする生成物である１２−メチルトリデカナールを得ることもできる。

生物
その生物は、それらが生成する脂肪酸スペクトルに起因して、所望の鎖長の分岐脂肪酸の生成に対する好適なバイオリアクターとして機能し、枯れた植物材を分解するか、又は土壌中に生きている腐生生物で主に構成される糸状菌の特別な属、すなわちコニディオボラス属に属する。２つの好ましい種Ｃ．デナエオスポラス（ｄｅｎａｅｏｓｐｏｒｕｓ）及びＣ．ヘテロスポラス（ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）が山楡（秋楡）の葉の分解に関連して記載される。分類学的に、２つの属は以下のように分類される。
界：糸状菌
亜門：ハエカビ亜門（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）
目：ハエカビ目（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａｌｅｓ）
科：アンキリステス科（Ａｎｃｙｌｉｓｔａｃｅａｅ）

これらの生物の概要は、１９６８年〜１９７６年にＤ．Ｔｙｒｒｅｌにより発行された（“Ｔｈｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍｅ Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａｃｅａｅ． ＩＩ． ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｏｎｄｉｏｂｏｌｕｓ ｄｅｎａｅｓｐｏｒｕｓ” Ｌｉｐｉｄｓ ３（４）， ｐ．３６８−３７２（１９６８）； “Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍｅ Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａｃｅａｅ． ＩＩＩ” Ｃａｎ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １７（８）， ｐ．１１１５−１１１８（１９７１）；及び“Ｔｈｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍｅ Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａｃｅａｅ． ＩＶ． Ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ”． Ｃａｎ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２２（７）， ｐｐ．１０５８−１０６０（１９７６））。

培養
真菌の菌糸体は、固体又は液体培養において好適な栄養培地を用いて公知の手法で培養することができる。麦芽エキス及び酵母エキスの栄養溶液を用いて製造される寒天プレートは、その価値が証明された。

抽出
培養物が十分な量のバイオマスを形成した後、必要であれば、例えば遠心分離、濾過又はその他好適な分離手法によってバイオマスを栄養溶液から分離する。次いで遊離又は結合型のカルボン酸の抽出が行われる。凍結乾燥後に得られるような固体培養物は、直接抽出することができる。

更に、抽出物について言及がなされている限り、それらはそれ自体公知の手法で製造されてもよい。すなわち、例えば、培養物それ自体又はそれらから得られる乾燥塊の水、アルコール若しくは水−アルコールによる抽出である。全ての通常の抽出方法が好適であり、例えば浸漬、再浸漬、温浸、運動浸漬、ボルテックス抽出、超音波抽出、向流抽出、パーコレーション、再パーコレーション、エバコレーション（ｅｖａｃｏｌａｔｉｏｎ）（減圧下での抽出）、ディアコレーション（ｄｉａｃｏｌａｔｉｏｎ）又は連続的還流下での固−液抽出が挙げられる。パーコレーション法は大スケールの使用にとって有利である。有機溶媒、水（好ましくは８０℃を超え、特には９５℃を超える温度の熱水）又は有機溶媒と水の混合物、特に多少高含量の水と低分子量のアルコールの混合物を、抽出を実行するための溶媒として用いてもよい。

メタノール、エタノール、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、アセトン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、酢酸エチル及びこれらの混合物並びにそれらの水性混合物を用いた抽出が特に好ましい。抽出は通常２０〜１００℃、好ましくは３０〜９０℃、特には６０〜８０℃で行う。好ましい実施形態において、抽出は抽出物の活性成分の酸化を回避するために不活性ガス雰囲気中で行う。これは４０℃を超える温度での抽出にとって特に重要である。抽出時間は、出発材料、抽出方法、抽出温度、原料に対する溶媒の比等に依存するため当業者によって設定される。

抽出後、得られる粗抽出物は精製、濃縮及び／又は脱色等の更なる通常の工程を経てもよい。必要であれば、この方法で形成される抽出物は、例えば個々の望ましくない成分を選択的に分離処理することができる。抽出は任意の抽出程度で起きることができるが、通常完全に実行される。乾燥バイオマスの抽出における典型的な収率（＝使用した原料の量に基づく抽出物の乾燥物質の量）は３〜１５質量％、特には６〜１０質量％の範囲である。本発明は抽出条件及び最終抽出物の収率が、いずれかの所望の応用分野に従って当業者により選択されることができるという発見を包含する。これらの抽出物は、通常０．５〜１０質量％の範囲の活性物質含有量（＝固体含量）を含み、そのまま使用することができるが、乾燥、特に噴霧乾燥又は凍結乾燥により溶媒を完全に除去することもできる。

抽出物は、以下第一中間体ともいうが、水性調製物及び／又は有機溶媒に溶解した調製物としてのみならず、噴霧乾燥された又は凍結乾燥された、無水固体として存在してもよい。これに関連して、１〜６個の炭素原子を有する脂肪族アルコール若しくは分岐アルコール（例えばエタノール、２−メトキシ−２−メチルプロパン）、ケトン（例えばアセトン）、ハロゲン化炭化水素（例えばクロロホルム又は塩化メチレン）、低級エステル又はポリオール（例えばグリセロール又はグリコール）は、可能性のある有機溶媒である。

加水分解
必要であれば、グリセリドとして結合した脂肪酸の画分を遊離するため、抽出物を還元の前に加水分解処理することができる。加水分解は化学的に起こすことができるが、生物学的代替が好ましい。これら加水分解はより穏やかで、しかも調節の利点を与えるため、この代替は微生物学的、すなわち生存微生物を用いるのみならず酵素的に起こすことができる。カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、特にカンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）又はカンジダ・シリンドラセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）からの加水分解酵素が、生物学的代替として好適である。

還元
抽出後、グリセリドとして結合することもできる、様々な鎖状及び分岐の、飽和及び不飽和の脂肪酸の混合物の第一中間体が得られる。そのような混合物は例えば、以下の代表物である、トリデカン酸、１２−メチルトリデカン酸、テトラデカン酸、１２−メチルテトラデカン酸、ペンタデカン酸、１４−メチルペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘキサデセン（９）酸、１５−メチルヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、エライジン酸、オレイン酸及びアラキドン酸を含んでもよい。

その後、脂肪酸又は脂肪酸グリセリドの混合物を還元処理する。加水分解と同様に、これは化学的に行うことができるが、好ましくは生物学的代替が選ばれる。これは欧州風味法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｆｌａｖｏｒｉｎｇ ｌｅｇｉｓｌａｔｉｏｎ）の観点からの天然だと考えられる製造方法へと導くからである。好ましい生物学的代替は、酵素のみならず、還元に必要な酵素活性を有する細胞溶解物、細胞抽出物又は全細胞を用いて行うことができる。この工程の後、反応生成物を当業者に知られた抽出方法を用いて反応混合物から抽出することができる。抽出剤の除去の後、得られる濃縮物を、選択した溶媒を用いて所望の濃度に溶解することができる。

脂肪酸又は脂肪酸グリセリドの混合物の化学的還元は、水素化ホウ素ナトリウムを用いて行うことができるが、水素化アルミニウムリチウムを好ましく用いるべきである。この変換の過程で、酸又はエステル官能基は水酸基へ還元される。その結果、第二の、この場合には化学中間体は、鎖状及び分岐カルボン酸の対応するアルコールを完全に又は少なくとも大部分含む。約３時間の反応時間内で、理論収率の８５％〜９５％の収率が達成され、もし例えば還元の後に球管式（バルブ・ツー・バルブ；Ｋｕｇｅｌｒｏｈｒ）蒸留のような他の蒸留工程を行えば、収率を向上させることができる。１２−メチルトリデカン酸の還元生成物としての、特に所望の生成物である１２−メチルトリデカノールの量に基づいて、収率は還元生成物の合計量に対して約２５〜３５％である。副反応として、還元はまた、混合物に含まれる不飽和種の飽和をも引き起こす。

水素化物を用いた還元方法は調製有機化学者の標準反応に属し、教科書の知識を代表するため、更なる総合的な説明を必要としない。還元は好ましくは、１５〜２５℃の範囲の温度で行われ、予想通り、一時的な温度上昇が反応の初期に起こる。

酸化
第二化学中間体は次の酸化のための出発材料としての機能を果たし、その酸化の間にアルコールは対応するアルデヒドに転換される。ＴＥＭＰＯが酸化剤として好ましく用いられる。ＴＥＭＰＯは２，２，６，６−テトラメチルピペリジニルオキシルを表す。

このラジカルは熱力学的に安定ではないが、その比較的高い持続性は、立体効果を通して有効寿命に影響を与える置換基に起因する。置換基は無酸素の溶液中で１分の平均寿命を持つようにラジカル電子の近傍に位置している。アルコールの２相酸化のための好適な共酸化剤と共にＴＥＭＰＯを使用することは、ＡｎｅｌｌｉらのＪ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ５２， ｐ．２５５９−２５６２（１９８７）（“Ａｎｅｌｌｉ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ”）に記載されており、例えばＯｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ， Ｃｏｌｌ． Ｖｏｌ． ８， ｐ．３６７（１９９３）；Ｖｏｌ． ６９ ｐ．２１２（１９９０）で用いられている。

本発明の目的で、ＴＥＭＰＯを２つの共酸化剤、すなわち臭化アルカリ及び次亜塩素酸アルカリと組み合わせて用いることが有利であると分かった。ここでは臭化カリウム及び次亜塩素酸ナトリウムの組み合わせが好ましい。約１：（２〜１０）：（１０〜４０）、特には約１：（２〜１０）：（１０〜４０）、より特には約１：（４〜８）：（１５〜３０）であるＴＥＭＰＯ、臭化アルカリ及び次亜塩素酸アルカリのモル比は、その価値が証明された。反応は高発熱であるため、反応温度を−５〜＋１０℃の範囲内に維持することが推奨される。

これらの条件下、用いたアルコールに基づいて８５〜９７％の範囲の収率が得られる。好ましい目標生成物である１２−メチルトリデカナールに関して、収率は３０〜３５％であり、約９５％の純度が達成される。

酸化の場合においても、生成物を球管式（Ｋｕｇｅｌｒｏｈｒ）蒸留又は分離管式（Ｓｐａｌｔｒｏｈｒ）等の蒸留工程で処理することにより、純度を更に改善することができる。

生物学的還元のための酵素的工程を選択する際、商業的に入手可能なアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ、ＥＣ１．２．１．ｘ）及び、例えばノカルディア（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）属（Ａｉｍｉｎ Ｈｅ， Ｔａｏ Ｌｉ， Ｌａｃｙ Ｄａｎｉｅｌｓ， Ｉａｎ Ｆｏｔｈｅｒｉｎｇｈａｍ， Ｊｏｈｎ Ｐ． Ｎ． Ｒｏｓａｚｚａ Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００４ Ｍａｒ； ７０（３）： １８７４−１８８１）及び／又はマイコバクテリウム・マリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）（Ｍ． Ｋａｌｉｍ Ａｋｈｔａｒ， Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｊ． Ｔｕｒｎｅｒ， Ｐａｔｒｉｋ Ｒ． Ｊｏｎｅｓ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１３ Ｊａｎ ２； １１０（１）： ８７−９２）からのカルボン酸レダクターゼ等の酵素が利用できる。カルボン酸レダクターゼは、ノカルディア属又はマイコバクテリウム属、特にノカルディア・イオネンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｉｏｗｅｎｓｉｓ）の同種発現によるのみならず、特に大腸菌のような好適な宿主生物中での組み換え発現によって異種的に得られるが、好ましくはノカルディア・イオネンシスを培養することによっても得ることができる。ノカルディア・イオネンシスは、いわゆる野生型菌株も酵素を発現する。実際の転換にとって、酵素が精製された形で存在するかどうか、部分的にのみ濃縮されているかどうか、粗細胞抽出物中又は天然若しくは組み換え細胞中に存在するかどうかは関係ない。

産業の適用性
本発明の更なる目的は、上述した方法により得ることができる１２〜１８個の炭素原子を有するメチル分岐アルデヒドの濃縮物に関し、濃縮物はメチル分岐アルデヒドを１０〜１００質量％、好ましくは２５〜９５質量％、特には約４０〜約６０％含むことができる。濃縮物は化学的に形成した第二中間体（ｆ）、生物学的に形成した第二中間体（ｅ）、又は、好適な乾燥方法、好ましくは噴霧乾燥や凍結乾燥等の穏やかな乾燥方法により完全に又は部分的に精製した生成物（ｇ）に基づいて直接的に得ることができる。１００質量％までの差分は、基材及び／又は他のフレーバー物質に起因してもよい。代替として、濃縮水溶液を販売することもできる。

本発明の最終的な目的は、上述したプロセスにより直接的に得られる濃縮物又は代替生成物のフレーバー成分として、特に牛肉のフレーバーを与えるための食料品に対するフレーバー成分としての使用に関する。

実施例１
真菌株の培養
用いた真菌株
以下の表１は、検討した真菌の概要、それらの正確な名称、株収集番号（ＣＢＳ番号）、単離基質及び単離場所を表す。

表１
真菌の評価

固体培地上での培養
真菌株を麦芽エキス寒天プレート上で培養した。プレートを製造するために、培地成分を秤量し（表２）、蒸留水で満たして１リットルにし、オートクレーブした（１２０℃、２０分）。菌糸で覆われた１ｃｍ²の寒天片を、プレート培養の重要な周辺領域から寒天プレートの中央上に配置し、パラフィルムでペトリ皿を密閉し、２４℃で光の存在下、好ましくは光の不存在下、インキュベータ中でインキュベートした。約５日後（ＣＨＥＴ−Ｎ）及び１４日後（ＣＨＥＴ−Ｕ及びＣＤＥ）、前培養物を、約４分の３が過成長したプレートから植菌した。並行して、次の前培養のための更なる寒天プレートを同様の原理に従って植菌した。表２はコニディオボラス属株の培養に対する麦芽エキス−酵母エキス−寒天の組成を示す。

表２
寒天の組成

液内前培養のために複合栄養培地を使用した。培地を表３に示す。
表３
標準複合培地の組成

液内培養中での培養のために、外側の菌糸体の１ｃｍ²の寒天片を、無菌条件下で、１００ｍＬの培養培地で満たされた２５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコに移し、ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ分散ロッドを用いて処理（３０秒、９８００ｒｐｍ）した。前培養物をインキュベータ中で、光の不存在下、２４℃でインキュベートした（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ、Ｉｎｆｏｒｓ社製、Ｅｉｎｓｂａｃｈ；２４℃、１５０ｒｐｍ、振幅２５ｍｍ）。

本培養：本培養物の培養のため、前培養物を、無菌条件下で、ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ分散ロッドを用いて処理（３０秒、９８００ｒｐｍ）した。この懸濁液の２０ｍＬを５００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中の２００ｍＬの新鮮な培養培地に加えた。培養をインキュベーション振とう器中（２４℃、１５０ｒｐｍ、振幅２５ｍｍ）で、光を排除して２４℃で行った。

実施例２
細胞採取及び脂肪抽出
培養期間の終了時、本培養物を、濾紙（８〜１２μｍの保持範囲）を通して濾過した。残渣を約２００ｍＬの４ＭのＨＣｌと混合し、沸点まで加熱し、沸騰熱で３０分間分解した。それから溶液が熱いうちにひだ付き濾紙で濾過し、洗浄水が無色になるまで熱水で洗浄した。乾燥庫（１００℃）で１〜２時間乾燥した後、濾紙を、ソックスレー装置を用いて石油ガソリン（沸点範囲４０〜６０℃）で４時間抽出した。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した後、脂肪含有量を質量測定法で測定した。

代替として、培養期間の終了時に本培養物を、濾紙（８〜１２μｍの保持範囲）を通して濾過し、それから凍結乾燥することができる。それから凍結乾燥物を、精製砂を用いて粉砕し、３回それぞれ約７５ｍＬのヘキサンで混合し、Ｂｕｃｈｉ製のＳｐｅｅｄＥｘｔｒａｃｔｏｒ中で、４０〜１２０ｂａｒの圧力で抽出した。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した後、脂肪含有量を重量測定法で測定した。

発酵的に製造されたバイオマスの最適な処理方法を特定するために、種々のアプローチが調査された。凍結乾燥の後よく粉砕することが最適な方法だと特定された。図１は、種々のコニディオボラス属株からのエステル交換された脂質抽出物の合計脂肪酸含有量に基づく脂肪酸の画分を示す。全ての脂肪酸を脂肪酸メチルエステルとしてガスクロマトグラフィーにより測定した。分解方法に応じた脂肪含有量を図２に示す。

実施例３
リパーゼを用いた酵素的加水分解
バイオマスの抽出後に得られる脂質抽出物の約５０ｍｇを、種々の濃度を有するリパーゼ酵素溶液であるＡｍａｎｏの“Ｌｉｐａｓｅ ＡＹ”（カンジダ・シリンドラセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）から）１０〜１００μＬ、リン酸緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ７．６）１００〜１９０μＬ及び水１００μＬと混合し、ｔｈｅｒｍｏｂｌｏｃｋ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中で一晩インキュベートした（４５℃、８００ｒｐｍ）。緩衝液を調製するため、０．２ＭのＮａ₂ＨＰＯ₄溶液を調製し、ｐＨが７．０である溶液が得られるように０．２ＭのＫＨ₂ＰＯ₄溶液と混合した。検討した濃度比を表４に示す。次いで、サンプルを２ｍＬのヘキサンを用いて振とうし、ＧＣにより脂肪酸分布を測定（事前のメチル化なし）（図３）するため上層（有機層）をガラスバイアルに注入した。未処理の脂肪画分に遊離脂肪酸は存在しなかった。リパーゼを用いた加水分解により、使用した酵素の量に強く依存して脂肪酸が遊離された（３Ｕの酵素を用いたときは非常に少量のみだったが、３０Ｕの酵素を用いた場合は実質的により多かった）。合計１４％の１２−メチルトリデカン酸が検出された。１００Ｕ及び３００Ｕの酵素を用いた実験を繰り返すことにより、合計２５質量％の１２−メチルトリデカン酸が測定された。

表４
脂肪抽出物の加水分解のための反応調製物

実施例４
α−ジオキシゲナーゼを用いた１２−メチルトリデカン酸の転換
α−ジオキシゲナーゼの製造は国際公開第２０１２／０２５６２９号に記載の方法に基づく文献の参照に従って行われた。１μＬのプラスミドを細胞形質転換のために大腸菌コンピテントセル［ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｎｏｖａｇｅｎ］にピペットで加た。冷却段階（氷上に３０分間）の後、サンプルを２分間ウォーターバス中で加熱（４２℃）し、再度冷却した。培養のために１５０μＬのＬＢ−カナマイシン培地（表５）を加え、１時間インキュベートした（３７℃、２００ｒｐｍ、振幅２５ｍｍ）。細胞懸濁液を予備乾燥及び馴化されたＬＢ−カナマイシン寒天プレートに適用し、３７℃で一晩インキュベートした。

表５
ＬＢ−カナマイシン培地の組成

α−ジオキシゲナーゼを用いた転換のために、この酵素を国際公開第２０１２／０２５６２９号に従ってＬＢ培地上の大腸菌細胞［ＢＬ２１（ＤＥ３）］中で発現させた。０．５ｃｍ長さのスメアを、イノキュレーションループを用いて菌叢から取り出し、３ｍＬのＬＢ−カナマイシン培地に移し、ＯＤ₆₀₀が０．５〜０．８の間になるまで振とう器中でインキュベートした（３７℃、１５０ｒｐｍ、振幅２５ｍｍ）。イソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加え（０．５ｍＭ）、サンプルを更に振とう器中で１６〜１８時間インキュベートした（２４℃、１５０ｒｐｍ、振幅２５ｍｍ）。サンプルを遠心分離し（４０００ｒｐｍ、３７２４ｘｇ、１０分、４℃）、上澄みを廃棄して細胞ペレットを凍結した（−２０℃）。

上記のように製造された凍結細胞ペレットをリン酸緩衝液中に溶解させ、同じ緩衝液中で洗浄し、遠心分離し、０．５％グルコース一水和物が添加された２ｍＬのリン酸緩衝液中に再懸濁した。細胞懸濁液１ｍＬに、５０μＬの１２−メチルトリデカン酸（ＤＭＳＯ中の７．５ｍｇｍＬ^-1）を添加した。サンプルを３７℃で１時間インキュベートし（１５０ｒｐｍ、振幅２５ｍｍ）、それから１ｍＬのヘプタンで抽出した。硫酸ナトリウムで有機層を乾燥させた後、サンプルをガスクロマトグラフィーにより試験した。

実施例５
α−ジオキシゲナーゼを用いた脂質抽出物の転換
転換を実施例４と同等にして行い、１２−メチルトリデカン酸を用いた標準溶液を用いた。大腸菌が再懸濁されたリン酸緩衝液２ｍＬに、実施例２からの真菌培養物の脂肪抽出物１０μＬを加え、実施例４のように抽出し、それからガスクロマトグラフィーにより試験した。

実施例６
リパーゼ及びα−ジオキシゲナーゼを用いた同時転換
実施例２からのＣ．デナエオスポラス（ｄｅｎａｅｏｓｐｏｒｕｓ）の脂質抽出物１４５ｍｇを１０ｍＬのバイアルに秤量し、実施例３からのリパーゼ酵素溶液２００μＬ、リン酸緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ７．６）２００μＬ及び水２００μＬと混合した。実施例４からのα−ジオキシゲナーゼを生成する大腸菌細胞２００ｍｇを、リン酸緩衝液（２００ｍＭ；ｐＨ７．６）で洗浄し、０．５％のグルコース一水和物を含む４ｍＬのリン酸緩衝液中に再懸濁させ、準備した１０ｍＬのバイアルに加えた。反応調製物を一晩インキュベートした（２２時間、２４℃、１５０ｒｐｍ、振幅２５ｍｍ）。転換された脂肪を３回、それぞれ２ｍＬヘプタンを用いて抽出し、有機層を合わせた。希釈後（１：５０）、サンプルをガスクロマトグラフィーにより解析した。

実施例７
アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）を用いた転換
アルデヒドデヒドロゲナーゼ（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＡＬＤＨ、１０．５Ｕｍｇ^-1のタンパク質）を用いた転換のために、約１５ｍｇの１２−メチルトリデカン酸を５００μＬのトリトンＸ−１００溶液（２．２ｇＬ^-1）を用いて乳化した。転換はＢｏｓｔｉａｎらのＳｉｇｍａ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｅｓｔ１（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ １７３、 ７７３−７８６（１９７８））に従って行った。酵素添加後、サンプルを振とう器中でインキュベートし（３０分、２４℃、１５０ｒｐｍ、振幅２５ｍｍ）、それからそれぞれ１ｍＬのペンタン／ジエチルエーテル（１：１．１２、ｖ／ｖ）で２回振とうした。ガスクロマトグラフ解析に先立ち、サンプルを５０μＬの内部標準物質（７５０ｍｇＬ^-1のチモール）と混合した。代替として、図６に示されるように、更なる実験においてα−ジオキシゲナーゼを用いた還元が行われた。

実施例８
カルボン酸レダクターゼを用いた１２−メチルトリデカン酸の還元
Ｎｓｐ−ＣＡＲ及びＭｍＦａｄ９のタンパク質発現を、組み換え型の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中で行った。このために、５０ｍｌのＬＢ培地を、マスターストックから１ｍＬあたり３０μｇのカナマイシンと共に植菌し、ＯＤ₆₀₀が約０．６〜０．８を達成するまで３７℃及び１３０ｒｐｍでインキュベートした。この値に到達したとき、１ｍＭのＩＰＴＧを誘導のために加え、培養物を室温で一晩成長させ続けた。それから得られたバイオマスを１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、更なる使用まで細胞ペレットを−２０℃で保管した。

タンパク質を回収するために、−２０℃で保管されているペレットを解凍し、ペレット１グラムあたり４ｍＬのＢ−ＰＥＲ試薬と共に再懸濁した。１ｍＬあたり５０μｇのリゾチーム及び１ｍＬあたり２．５Ｕのデオキシリボヌクレアーゼを加えた後、サンプルを室温で１５分間インキュベートし、それから１００００ｒｐｍ及び４℃で１０分間遠心分離して全タンパク質抽出物を得た。続いてＨｉｓＰｕｒ Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いた酵素の精製後、精製酵素のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ｎｓｐ−ＣＡＲに対し９．９２ｍｇ／ｍｌ及びＭｍＦａｄ９に対し２６．４３ｍｇ／ｍｌ）に従い測定した。

合計体積が１．１ｍｌとなるように、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．５）、２０ｍＭの基質、１０ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＮＡＤＰＨ、１００ｍＭのＭｇＣｌ₂及び１ｍｇの精製酵素を用いて酵素アッセイを行った。室温で２４時間のインキュベート期間後、水性混合物を３回、それぞれ１：１のヘキサンで振とうし、上層の有機層をＧＣバイアルへ移動させた。得られた結果を表６にまとめる。図４（左：ＣＡＲを用いた還元による同一源の酸から生じる１２−メチルトリデカナールのマススペクトル、右：１２−メチルトリデカナールの標準のマススペクトル）は、１２−メチルトリデカナールの標準質量分析スペクトル（右部分）及びＮｓｐ−ＣＡＲを用いた還元後の標準質量分析スペクトル（左部分）を表す。

表６
酵素的転換の１２−メチルトリデカン酸及び１２−メチルトリデカナール含有量

実施例９
（Ｎｓｐ−ＣＡＲ又はＭｍＦａｄ９のいずれかを発現可能な生存大腸菌ＢＬ２１細胞を用いた）生体内変換における１２−メチルトリデカン酸の還元
レダクターゼの触媒活性がタンパク質ＢｓＳｆｐの存在により積極的に影響を受け得るというＡｋｈｔａｒらが記載した事実（Ｐ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１３；１１０：８７−９２）により、対応する大腸菌株を３７℃及び１５０ｒｐｍで一晩ＬＢ培地の中で並行して成長させ、生体内変換調製物に加えた。

レダクターゼを発現する大腸菌細胞及び補助酵素は、まずＯＤが約２に到達するように培養した。各調製物について、補助タンパク質を含むか、又は含まずに各リダクターゼが一度存在するように生体内変換調製物を調製した。また、各レダクターゼに１００μｌの安息香酸溶液を添加した各調製物をポジティブコントロールとして調製した。大腸菌株の発現に必要な各約１ｍＬの体積に加えて、５μｌのＩＰＴＧ（調製物の最終濃度は１ｍＭ）、１００μｌのエタノール性の１２−メチルトリデカン酸溶液（調製物の最終濃度は２ｍＭ）及び完了後の調製物の最終体積が５ｍｌで約０．５のＯＤを有するように約３〜４ｍｌの新鮮なＬＢ培地を各調製物に添加した。このように調製された調製物を室温で２４時間、１５０ｒｐｍの振とう周波数で２つ培養した。その後、各調製物を１：１の比のヘキサンを用いて２回抽出した。生体内変換の結果を表７にリスト化する。

表７
１２−メチルトリデカナールの形成に対する生体内変換の結果

実施例１０
リパーゼを用いたコニディオボラス・ヘテロスポラスの脂質画分の加水分解及び続いて１２−メチルトリデカナールを形成するためのカルボン酸レダクターゼであるＭｍＦａｄ９又はＮｓｐ−ＣＡＲを用いた転換
加水分解は、実施例３の記載に従って、実施例２の記載に準じて得られる、混合された脂質抽出物を用いて行われた。加水分解された脂肪抽出物１５０ｍｇを、表８に示される反応混合物１０１０μｌと混合した。図５（上段：脂質抽出物の酵素的転換のブランク値（熱不活性化したＣＡＲ）のＭＳ／ＭＳクロマトグラム（ＴＩＣ、Ｑ１におけるスキャン）、中段：リパーゼ未添加での脂質抽出物の反応、下段：リパーゼ及びＣＡＲを用いた脂質抽出物の転換）に示されるＭＳ／ＭＳ解析は、１２−メチルトリデカナールが加水分解された及び加水分解されていない脂肪抽出物の両方と同一であり得ることを示した。

表８
加水分解された脂肪抽出物の還元のための反応混合物の組成

実施例１１
１２−メチルトリデカナールの製造のためのノカルディア・イオネンシスの生細胞を用いたコニディオボラス・ヘテロスポラスの脂肪抽出物の還元
低温保存されたノカルディア・イオネンシス（ＤＳＭ ４５１９７）から１ｍＬを採取し、１０ｍｌのＬＢ培地及び０．０５％のＴｗｅｅｎ８０を含む１００ｍｌフラスコに移した。フラスコを振とう振幅５０ｍｍで約７２時間、２８℃、及び１３０ｒｐｍで培養した。その後、よく発育した培養物から１ｍｌを採取し、１０ｍｌの同じ新鮮な培地が入った１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに移した。Ｔ． Ｌｉら（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． Ｊｕｎ １９９７；１７９（１１）：３４８２−３４８７）と同様にして、１ｍｌあたり５ｍｇの安息香酸を誘導のために加え、フラスコを更に２４時間、２８℃、及び１３０ｒｐｍでインキュベートした。次いで、生体触媒反応を表９のまとめに従って行った。誘導段階の後、基質を加え調製物を更に２４時間、２８℃、及び１５０ｒｐｍでインキュベートした。それからサンプルを２：１のヘキサンを用いて抽出し、有機層をサンプル容器に移し、１２−メチルトリデカン酸及び１２−メチルトリデカナールについてガスクロマトグラフィーにより試験した。結果を表９にまとめる。

表９
生体触媒試験の実験結果

実施例１２
Ｃ．ヘテロスポラスからの脂肪抽出物の１２−メチルトリデカナールへの化学的転換
これまでに得られた脂肪抽出物を２つの質（ｑｕａｌｉｔｉｅｓ）に分けた。１ｇ／Ｌより少ない脂肪含有量と、それより多い脂肪含有量である。転換は２段階で起こった。まず水素化アルミニウムリチウムを用いた還元が、それからＴＥＭＰＯ／ＫＢｒ／ＮａＯＣｌを用いた酸化が起こった。反応条件を下記表１０に示す。

表１０
反応条件^*

＊）０７８：＜１ｇ／Ｌを２７．４ｇ、０８３：＞１ｇ／Ｌを１７．８ｇ、０８１：＜１、０８５：＞１

１２−メチルトリデカン酸又は対応するグリセリドの含有量に基づき、水素化アルミニウムリチウムを用いた還元は、＜１ｇ／Ｌの実験では８９％の収率であり、＞１ｇ／Ｌの実験では９３％の収率であった（いずれの場合も球管式蒸留後）。二重結合の割合はそれぞれ２２％から６％、及び２９％から２２％へと減少した。図７Ａ及び７Ｂは、０７８（＜１ｇ／Ｌ）及び０８３（＞１ｇ／Ｌ）の番号がつけられた２つの調製物について球管式蒸留前後での得られたアルコールの組成を示す。

ＴＥＭＰＯを用いた続く酸化により、１２−メチルトリデカン酸又は対応するグリセリドの含有量に基づき、＜１ｇ／Ｌの場合は９７％（０８１）の収率で、＞１ｇ／Ｌの場合は９４％（０８５）の収率でアルデヒドを与えた（いずれの場合も球管式蒸留前）。結果を図７Ｃに示す。

得られたアルデヒド画分（＃０８１及び＃０８５）を混合し、再度球管式で蒸留した。１２−メチルトリデカン酸又は対応するグリセリドの量に基づき、７７％の収率に相当する１９．６ｇ（ＧＣ純度４４．８％）が測定された。結果を図８Ａに示す。得られた蒸留液を分離管式（Ｓｐａｌｔｒｏｈｒ）で更に蒸留した（７２〜８３℃、０．５ｍｂａｒ）。９５％以上の純度の種々の画分が得られた（図８Ｂ）。組成を表１１に示す。

表１１
分離管式蒸留の画分の純度

画分５〜１２（４．１ｇ、純度９４．７％）の２つの混合した質の酸化の合計収率は、アルコール混合物に基づき３８％であった（１７ｇが純度３７．４％であり、１０．５ｇが純度３７．２％であった）。

両工程（３０．４ＧＣ％の１２−メチルトリデカン酸メチルエステルを用いた２７．４ｇの＜１ｇ／Ｌでの脂肪抽出物及び２７．１ＧＣ％のエステルを用いた１７．８ｇの＞１ｇ／Ｌでの脂肪抽出物の還元及び酸化）に基づき、１２−メチルトリデカナールの収率は、画分５〜１２（４．１ｇ、純度９４．７％）に基づき、３４％であった。

純度９５％の画分５、７及び９〜１２（３．６ｇ）に基づき、両工程後の収率は３０％であった。

Claims (19)

1. 分岐アルデヒドの製造方法であって、
   （ａ）コニディオボラス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属の１以上の糸状菌の培養物を用意し、遊離及び／又は結合型の分岐カルボン酸を含むバイオマスを生成する工程、及び
   （ｂ）工程（ａ）からのバイオマスを凍結乾燥及び粉砕し、次いで粉砕したバイオマスを抽出して遊離及び／又は結合カルボン酸を含む第一中間体を生成する工程を含み、
   （ｃ）第一中間体からの結合カルボン酸を化学的、酵素的、又は微生物的な加水分解を行う工程を任意で含んでいてもよく、
   下記工程（ｄ）又は工程（ｅ）の少なくともいずれか１つの工程を含み、
   （ｄ）化学型還元剤を用いて第一中間体を処理して、遊離及び／又は結合カルボン酸を対応するアルコールに転換し、妨害副生物から１以上のアルコールを任意に分離し、混合物として又は富化型のこれらのアルコールを含む化学的に生成した第二中間体を生成する工程、
   （ｅ）生物学型還元剤を用いて第一中間体を処理して、遊離及び／又は結合カルボン酸を前記遊離及び／又は結合カルボン酸と比較して同じ炭素原子数を有する、対応する分岐アルデヒドに転換するか、又は前記遊離及び／又は結合カルボン酸と比較して少ない炭素原子数を有する、対応する分岐アルデヒドに転換する工程、
   工程（ｄ）を含む場合には、（ｆ）前記化学的に生成した第二中間体を、化学型酸化剤を用いて処理して、遊離及び／又は結合アルコールを対応する分岐アルデヒドに転換する工程を含み、
   （ｇ）工程（ｄ）、工程（ｅ）又は工程（ｆ）後に得られる画分から妨害副生物の除去を行う工程を任意で含んでいてもよい、前記方法。
2. 分岐アルデヒドが１２〜１８個の炭素原子を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 分岐アルデヒドが分岐としてメチル基を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
4. アルデヒドが１２−メチルトリデカナール、１２−メチルテトラデカナール、１４−メチルペンタデカナール、１６−メチルオクタデカナール又はこれらの混合物を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. Ｃ．デナエオスポラス（ｄｅｎａｅｏｓｐｏｒｕｓ）又はＣ．ヘテロスポラス（ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）の糸状菌を用いることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 工程（ｄ）又は（ｅ）の還元前に第一中間体を加水分解処理することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 工程（ｄ）の還元を水素化アルミニウムリチウム又は水素化ホウ素ナトリウムを用いて行うことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 工程（ｅ）を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
9. 工程（ｅ）の還元を商業的に入手可能なアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ、ＥＣ１．２．１．ｘ）を用いて行うことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
10. 工程（ｅ）の還元をα−ジオキシゲナーゼを用いて行い、この場合１炭素原子短いアルデヒドを同時に形成できることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
11. 工程（ｅ）の還元を、カルボン酸レダクターゼを用いて行うことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
12. 工程（ｅ）の還元を、カルボン酸レダクターゼを発現する細胞の全細胞抽出物を用いて行うことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
13. 工程（ｅ）の還元を、カルボン酸レダクターゼを発現可能な生細胞を用いて行うことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
14. 工程（ｄ）又は（ｅ）の還元を１５〜２５℃の範囲の温度で行うことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 工程（ｆ）の化学型酸化剤としてＴＥＭＰＯを用いることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. ＴＥＭＰＯを臭化アルカリ及び次亜塩素酸アルカリと共に用いることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
17. ＴＥＭＰＯ、臭化アルカリ及び次亜塩素酸アルカリを、約１：（２〜１０）：（１０〜４０）のモル比で用いることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
18. 工程（ｆ）の酸化を−５〜＋１０℃の範囲の温度で行うことを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 更なる工程として、還元生成物、酸化生成物又は両方を蒸留工程で処理することを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。

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