JP2019500861A - 分岐アルデヒドの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明は、(a)コニディオボラス(Conidiobolus)属の1以上の糸状菌の培養物を用意し、遊離及び/又は結合型の分岐カルボン酸を含むバイオマスを生成する工程と、(b)工程(a)からバイオマスを抽出して遊離及び/又は結合カルボン酸を含む第一中間体を生成する工程と、(c)第一中間体からの結合カルボン酸を化学的、酵素的、微生物的な加水分解を任意で行ってもよい工程と、(d)化学型還元剤を用いて第一中間体を処理して、遊離及び/又は結合カルボン酸を対応するアルコールに転換し、妨害副生物から1以上のアルコールを任意で分離し、混合物として又は富化型のこれらのアルコールを含む化学的に生成した第二中間体を生成する工程と、(e)生物学型還元剤を用いて第一中間体を処理して、遊離及び/又は結合カルボン酸を前記遊離及び/又は結合カルボン酸と比較して同じ炭素原子の数を有する対応アルデヒドに転換するか、又は前記遊離及び/又は結合カルボン酸と比較して少ない炭素原子の数を有する対応アルデヒドに転換し、これらのアルデヒドを含む生物学的に生成した第二中間体を生成する工程と、(f)化学型酸化剤を用いて化学的に生成した第二中間体を処理して、遊離及び/又は結合アルコールを対応するアルデヒドに転換するためのする工程と、(g)工程(d)及び/又は工程(e)及び/又は工程(f)後に得られる画分から妨害副生物の除去を任意で行ってもよい工程と、を含む分岐アルデヒドの製造方法に関する。
【選択図】 図6
Description
(a)コニディオボラス(Conidiobolus)属の1以上の糸状菌の培養物を用意し、遊離及び/又は結合型の分岐カルボン酸を含むバイオマスを生成する工程と、
(b)工程(a)からのバイオマスを抽出して遊離及び/又は結合カルボン酸を含む第一中間体を生成する工程と、
(c)第一中間体からの結合カルボン酸を化学的、酵素的、微生物的な加水分解を任意で行ってもよい工程と、
(d)化学型還元剤を用いて第一中間体を処理して、遊離及び/又は結合カルボン酸を対応するアルコールに転換し、妨害副生物から1以上のアルコールを任意で分離し、混合物として又は富化型のこれらのアルコールを含む化学的に生成した第二中間体を生成する工程と、
(e)生物学型還元剤を用いて第一中間体を処理して、遊離及び/又は結合カルボン酸を前記遊離及び/又は結合カルボン酸と同じ炭素原子数を有する対応アルデヒドに転換するか、又は前記遊離及び/又は結合カルボン酸と比較して少ない炭素原子数を有する対応アルデヒドに転換し、これらのアルデヒドを含む生物学的に生成した第二中間体を生成する工程と、
(f)化学型酸化剤を用いて化学的に生成した第二中間体を処理して、遊離及び/又は結合アルコールを対応するアルデヒドに転換する工程と、
(g)工程(d)及び/又は工程(e)及び/又は工程(f)後に得られる画分から妨害副生物の除去を任意で行ってもよい工程を含むものである。
その生物は、それらが生成する脂肪酸スペクトルに起因して、所望の鎖長の分岐脂肪酸の生成に対する好適なバイオリアクターとして機能し、枯れた植物材を分解するか、又は土壌中に生きている腐生生物で主に構成される糸状菌の特別な属、すなわちコニディオボラス属に属する。2つの好ましい種C.デナエオスポラス(denaeosporus)及びC.ヘテロスポラス(heterosporus)が山楡(秋楡)の葉の分解に関連して記載される。分類学的に、2つの属は以下のように分類される。
界:糸状菌
亜門:ハエカビ亜門(Entomophthoromycotina)
目:ハエカビ目(Entomophthorales)
科:アンキリステス科(Ancylistaceae)
真菌の菌糸体は、固体又は液体培養において好適な栄養培地を用いて公知の手法で培養することができる。麦芽エキス及び酵母エキスの栄養溶液を用いて製造される寒天プレートは、その価値が証明された。
培養物が十分な量のバイオマスを形成した後、必要であれば、例えば遠心分離、濾過又はその他好適な分離手法によってバイオマスを栄養溶液から分離する。次いで遊離又は結合型のカルボン酸の抽出が行われる。凍結乾燥後に得られるような固体培養物は、直接抽出することができる。
必要であれば、グリセリドとして結合した脂肪酸の画分を遊離するため、抽出物を還元の前に加水分解処理することができる。加水分解は化学的に起こすことができるが、生物学的代替が好ましい。これら加水分解はより穏やかで、しかも調節の利点を与えるため、この代替は微生物学的、すなわち生存微生物を用いるのみならず酵素的に起こすことができる。カンジダ(Candida)、特にカンジダ・ルゴサ(Candida rugosa)又はカンジダ・シリンドラセ(Candida cylindracea)からの加水分解酵素が、生物学的代替として好適である。
抽出後、グリセリドとして結合することもできる、様々な鎖状及び分岐の、飽和及び不飽和の脂肪酸の混合物の第一中間体が得られる。そのような混合物は例えば、以下の代表物である、トリデカン酸、12−メチルトリデカン酸、テトラデカン酸、12−メチルテトラデカン酸、ペンタデカン酸、14−メチルペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘキサデセン(9)酸、15−メチルヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、エライジン酸、オレイン酸及びアラキドン酸を含んでもよい。
第二化学中間体は次の酸化のための出発材料としての機能を果たし、その酸化の間にアルコールは対応するアルデヒドに転換される。TEMPOが酸化剤として好ましく用いられる。TEMPOは2,2,6,6−テトラメチルピペリジニルオキシルを表す。
本発明の更なる目的は、上述した方法により得ることができる12〜18個の炭素原子を有するメチル分岐アルデヒドの濃縮物に関し、濃縮物はメチル分岐アルデヒドを10〜100質量%、好ましくは25〜95質量%、特には約40〜約60%含むことができる。濃縮物は化学的に形成した第二中間体(f)、生物学的に形成した第二中間体(e)、又は、好適な乾燥方法、好ましくは噴霧乾燥や凍結乾燥等の穏やかな乾燥方法により完全に又は部分的に精製した生成物(g)に基づいて直接的に得ることができる。100質量%までの差分は、基材及び/又は他のフレーバー物質に起因してもよい。代替として、濃縮水溶液を販売することもできる。
真菌株の培養
用いた真菌株
以下の表1は、検討した真菌の概要、それらの正確な名称、株収集番号(CBS番号)、単離基質及び単離場所を表す。
真菌の評価
真菌株を麦芽エキス寒天プレート上で培養した。プレートを製造するために、培地成分を秤量し(表2)、蒸留水で満たして1リットルにし、オートクレーブした(120℃、20分)。菌糸で覆われた1cm2の寒天片を、プレート培養の重要な周辺領域から寒天プレートの中央上に配置し、パラフィルムでペトリ皿を密閉し、24℃で光の存在下、好ましくは光の不存在下、インキュベータ中でインキュベートした。約5日後(CHET−N)及び14日後(CHET−U及びCDE)、前培養物を、約4分の3が過成長したプレートから植菌した。並行して、次の前培養のための更なる寒天プレートを同様の原理に従って植菌した。表2はコニディオボラス属株の培養に対する麦芽エキス−酵母エキス−寒天の組成を示す。
寒天の組成
表3
標準複合培地の組成
細胞採取及び脂肪抽出
培養期間の終了時、本培養物を、濾紙(8〜12μmの保持範囲)を通して濾過した。残渣を約200mLの4MのHClと混合し、沸点まで加熱し、沸騰熱で30分間分解した。それから溶液が熱いうちにひだ付き濾紙で濾過し、洗浄水が無色になるまで熱水で洗浄した。乾燥庫(100℃)で1〜2時間乾燥した後、濾紙を、ソックスレー装置を用いて石油ガソリン(沸点範囲40〜60℃)で4時間抽出した。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した後、脂肪含有量を質量測定法で測定した。
リパーゼを用いた酵素的加水分解
バイオマスの抽出後に得られる脂質抽出物の約50mgを、種々の濃度を有するリパーゼ酵素溶液であるAmanoの“Lipase AY”(カンジダ・シリンドラセ(Candida cylindracea)から)10〜100μL、リン酸緩衝液(200mM、pH7.6)100〜190μL及び水100μLと混合し、thermoblock(Eppendorf)中で一晩インキュベートした(45℃、800rpm)。緩衝液を調製するため、0.2MのNa2HPO4溶液を調製し、pHが7.0である溶液が得られるように0.2MのKH2PO4溶液と混合した。検討した濃度比を表4に示す。次いで、サンプルを2mLのヘキサンを用いて振とうし、GCにより脂肪酸分布を測定(事前のメチル化なし)(図3)するため上層(有機層)をガラスバイアルに注入した。未処理の脂肪画分に遊離脂肪酸は存在しなかった。リパーゼを用いた加水分解により、使用した酵素の量に強く依存して脂肪酸が遊離された(3Uの酵素を用いたときは非常に少量のみだったが、30Uの酵素を用いた場合は実質的により多かった)。合計14%の12−メチルトリデカン酸が検出された。100U及び300Uの酵素を用いた実験を繰り返すことにより、合計25質量%の12−メチルトリデカン酸が測定された。
脂肪抽出物の加水分解のための反応調製物
α−ジオキシゲナーゼを用いた12−メチルトリデカン酸の転換
α−ジオキシゲナーゼの製造は国際公開第2012/025629号に記載の方法に基づく文献の参照に従って行われた。1μLのプラスミドを細胞形質転換のために大腸菌コンピテントセル[BL21(DE3)、Novagen]にピペットで加た。冷却段階(氷上に30分間)の後、サンプルを2分間ウォーターバス中で加熱(42℃)し、再度冷却した。培養のために150μLのLB−カナマイシン培地(表5)を加え、1時間インキュベートした(37℃、200rpm、振幅25mm)。細胞懸濁液を予備乾燥及び馴化されたLB−カナマイシン寒天プレートに適用し、37℃で一晩インキュベートした。
LB−カナマイシン培地の組成
α−ジオキシゲナーゼを用いた脂質抽出物の転換
転換を実施例4と同等にして行い、12−メチルトリデカン酸を用いた標準溶液を用いた。大腸菌が再懸濁されたリン酸緩衝液2mLに、実施例2からの真菌培養物の脂肪抽出物10μLを加え、実施例4のように抽出し、それからガスクロマトグラフィーにより試験した。
リパーゼ及びα−ジオキシゲナーゼを用いた同時転換
実施例2からのC.デナエオスポラス(denaeosporus)の脂質抽出物145mgを10mLのバイアルに秤量し、実施例3からのリパーゼ酵素溶液200μL、リン酸緩衝液(200mM、pH7.6)200μL及び水200μLと混合した。実施例4からのα−ジオキシゲナーゼを生成する大腸菌細胞200mgを、リン酸緩衝液(200mM;pH7.6)で洗浄し、0.5%のグルコース一水和物を含む4mLのリン酸緩衝液中に再懸濁させ、準備した10mLのバイアルに加えた。反応調製物を一晩インキュベートした(22時間、24℃、150rpm、振幅25mm)。転換された脂肪を3回、それぞれ2mLヘプタンを用いて抽出し、有機層を合わせた。希釈後(1:50)、サンプルをガスクロマトグラフィーにより解析した。
アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)を用いた転換
アルデヒドデヒドロゲナーゼ(サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)からのALDH、10.5Umg-1のタンパク質)を用いた転換のために、約15mgの12−メチルトリデカン酸を500μLのトリトンX−100溶液(2.2gL-1)を用いて乳化した。転換はBostianらのSigma Quality Control Test1(Biochemical Journal 173、 773−786(1978))に従って行った。酵素添加後、サンプルを振とう器中でインキュベートし(30分、24℃、150rpm、振幅25mm)、それからそれぞれ1mLのペンタン/ジエチルエーテル(1:1.12、v/v)で2回振とうした。ガスクロマトグラフ解析に先立ち、サンプルを50μLの内部標準物質(750mgL-1のチモール)と混合した。代替として、図6に示されるように、更なる実験においてα−ジオキシゲナーゼを用いた還元が行われた。
カルボン酸レダクターゼを用いた12−メチルトリデカン酸の還元
Nsp−CAR及びMmFad9のタンパク質発現を、組み換え型の大腸菌BL21(DE3)細胞中で行った。このために、50mlのLB培地を、マスターストックから1mLあたり30μgのカナマイシンと共に植菌し、OD600が約0.6〜0.8を達成するまで37℃及び130rpmでインキュベートした。この値に到達したとき、1mMのIPTGを誘導のために加え、培養物を室温で一晩成長させ続けた。それから得られたバイオマスを10000rpmで10分間遠心分離し、更なる使用まで細胞ペレットを−20℃で保管した。
酵素的転換の12−メチルトリデカン酸及び12−メチルトリデカナール含有量
(Nsp−CAR又はMmFad9のいずれかを発現可能な生存大腸菌BL21細胞を用いた)生体内変換における12−メチルトリデカン酸の還元
レダクターゼの触媒活性がタンパク質BsSfpの存在により積極的に影響を受け得るというAkhtarらが記載した事実(P Natl Acad Sci USA 2013;110:87−92)により、対応する大腸菌株を37℃及び150rpmで一晩LB培地の中で並行して成長させ、生体内変換調製物に加えた。
12−メチルトリデカナールの形成に対する生体内変換の結果
リパーゼを用いたコニディオボラス・ヘテロスポラスの脂質画分の加水分解及び続いて12−メチルトリデカナールを形成するためのカルボン酸リラクターゼであるMmFad9又はNsp−CARを用いた転換
加水分解は、実施例3の記載に従って、実施例2の記載に準じて得られる、混合された脂質抽出物を用いて行われた。加水分解された脂肪抽出物150mgを、表8に示される反応混合物1010μlと混合した。図5(上段:脂質抽出物の酵素的転換のブランク値(熱不活性化したCAR)のMS/MSクロマトグラム(TIC、Q1におけるスキャン)、中段:リパーゼ未添加での脂質抽出物の反応、下段:リパーゼ及びCARを用いた脂質抽出物の転換)に示されるMS/MS解析は、12−メチルトリデカナールが加水分解された及び加水分解されていない脂肪抽出物の両方と同一であり得ることを示した。
加水分解された脂肪抽出物の還元のための反応混合物の組成
12−メチルトリデカナールの製造のためのノカルディア・イオネンシスの生細胞を用いたコニディオボラス・ヘテロスポラスの脂肪抽出物の還元
低温保存されたノカルディア・イオネンシス(DSM 45197)から1mLを採取し、10mlのLB培地及び0.05%のTween80を含む100mlフラスコに移した。フラスコを振とう振幅50mmで約72時間、28℃、及び130rpmで培養した。その後、よく発育した培養物から1mlを採取し、10mlの同じ新鮮な培地が入った100mlのエルレンマイヤーフラスコに移した。T. Liら(J Bacteriol. Jun 1997;179(11):3482−3487)と同様にして、1mlあたり5mgの安息香酸を誘導のために加え、フラスコを更に24時間、28℃、及び130rpmでインキュベートした。次いで、生体触媒反応を表9のまとめに従って行った。誘導段階の後、基質を加え調製物を更に24時間、28℃、及び150rpmでインキュベートした。それからサンプルを2:1のヘキサンを用いて抽出し、有機層をサンプル容器に移し、12−メチルトリデカン酸及び12−メチルトリデカナールについてガスクロマトグラフィーにより試験した。結果を表9にまとめる。
生体触媒試験の実験結果
C.ヘテロスポラスからの脂肪抽出物の12−メチルトリデカナールへの化学的転換
これまでに得られた脂肪抽出物を2つの質(qualities)に分けた。1g/Lより少ない脂肪含有量と、それより多い脂肪含有量である。転換は2段階で起こった。まず水素化アルミニウムリチウムを用いた還元が、それからTEMPO/KBr/NaOClを用いた酸化が起こった。反応条件を下記表10に示す。
反応条件*
*)078:<1g/Lを27.4g、083:>1g/Lを17.8g、081:<1、085:>1
分離管式蒸留の画分の純度
Claims (21)
- 分岐アルデヒドの製造方法であって、
(a)コニディオボラス(Conidiobolus)属の1以上の糸状菌の培養物を用意し、遊離及び/又は結合型の分岐カルボン酸を含むバイオマスを生成する工程と、
(b)工程(a)からのバイオマスを抽出して遊離及び/又は結合カルボン酸を含む第一中間体を生成する工程と、
(c)第一中間体からの結合カルボン酸を化学的、酵素的、微生物的な加水分解を任意で行ってもよい工程と、
(d)化学型還元剤を用いて第一中間体を処理して、遊離及び/又は結合カルボン酸を対応するアルコールに転換し、妨害副生物から1以上のアルコールを任意に分離し、混合物として又は富化型のこれらのアルコールを含む化学的に生成した第二中間体を生成する工程と、
(e)生物学型還元剤を用いて第一中間体を処理して、遊離及び/又は結合カルボン酸を前記遊離及び/又は結合カルボン酸と比較して同じ炭素原子数を有する対応アルデヒドに転換するか、又は前記遊離及び/又は結合カルボン酸と比較して少ない炭素原子数を有する対応アルデヒドに転換し、これらのアルデヒドを含む生物学的に生成した第二中間体を生成する工程と、
(f)化学型酸化剤を用いて化学的に生成した第二中間体を処理して、遊離及び/又は結合アルコールを対応するアルデヒドに転換する工程と、
(g)工程(d)及び/又は工程(e)及び/又は工程(f)後に得られる画分から妨害副生物の除去を任意で行ってもよい工程と、を含む、前記方法。 - 分岐アルデヒドが12〜18個の炭素原子を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 分岐アルデヒドが分岐としてメチル基を含むことを特徴とする、請求項1又は2に記載の製造方法。
- アルデヒドが12−メチルトリデカナール、12−メチルテトラデカナール、14−メチルペンタデカナール、16−メチルオクタデカナール又はこれらの混合物を含むことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- C.デナエオスポラス(denaeosporus)属又はC.ヘテロスポラス(heterosporus)属の糸状菌を用いることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 還元前に第一中間体を加水分解処理することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 還元を水素化アルミニウムリチウム又は水素化ホウ素ナトリウムを用いて行うことを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 還元を生物学的系の手段によって行うことを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 還元を商業的に入手可能なアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH、EC1.2.1.x)を用いて行うことを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 還元をα−ジオキシゲナーゼを用いて行い、この場合1炭素短いアルデヒドを同時に形成できることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 還元を精製酵素Nsp−CAR及び/又はMmFad9を用いて行うことを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 還元をNsp−CAR及び/又はMmFad9を発現する細胞の全細胞抽出物を用いて行うことを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 還元を酵素Nsp−CAR及び/又はMmFad9を発現可能な生細胞を用いて行うことを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 還元を15〜25℃の範囲の温度で行うことを特徴とする、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 酸化剤としてTEMPOを用いることを特徴とする、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- TEMPOを臭化アルカリ及び次亜塩素酸アルカリと共に用いることを特徴とする、請求項15に記載の方法。
- TEMPO、臭化アルカリ及び次亜塩素酸アルカリを、約1:(2〜10):(10〜40)のモル比で用いることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 酸化を−5〜+10℃の範囲の温度で行うことを特徴とする、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 更なる工程として、還元生成物、酸化生成物又は両方を蒸留工程で処理することを特徴とする、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法により得られる12〜19個の炭素原子を有するメチル分岐アルデヒドの濃縮物。
- フレーバー成分としての請求項14に記載の濃縮物の使用。
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