CN108474011A - 用于制备支链醛的方法 - Google Patents

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Abstract

提出一种用于制备支链醛的方法，所述方法包括下列步骤：(a)提供耳霉属的一种或多种真菌的培养物，并且产生具有呈游离和/或结合形式的支链羧酸成分的生物质；(b)提取出自步骤(a)的生物质，以产生第一中间产物，所述第一中间产物包含游离的羧酸和/或结合的羧酸；(c)可选地化学水解、酶水解或微生物水解出自第一中间产物的结合的羧酸；(d)用化学性质的还原剂处理第一中间产物，以将游离的羧酸和/或结合的羧酸转化成相应的醇以及可选地将一种或多种醇与干扰性的副组份分离，并且产生以化学方式产生的第二中间产物，所述第二中间产物包含作为混合物或呈富集形式的该醇；(e)用生物性质的还原剂处理第一中间产物，以将游离的羧酸和/或结合的羧酸转化成具有与游离的羧酸和/或结合的羧酸相比相等数量的碳原子的相应的醛或转化成具有与游离的羧酸和/或结合的羧酸相比数量减少一的碳原子的对应的醛，并且产生以生物方式产生的第二中间产物，所述第二中间产物包含该醛；(f)用化学性质的氧化剂处理以化学方式产生的第二中间产物，以将游离的醇和/或结合的醇转化成相应的醛；以及必要时(g)从在步骤(d)和/或步骤(e)和/或(f)之后获得的馏份中去除干扰性的副组份。

Description

用于制备支链醛的方法
技术领域
本发明涉及调味物领域并且涉及一种用于制备支链醛，尤其12-甲基十三醛的新的方法。
背景技术
支链醛是自然界中广泛散布的令人感兴趣的气味和调味物。尤其12-甲基十三醛是用于真正有味道的牛肉香精的重要组成部分并且目前仅能通过化学合成商业制备(参见Kerscher,et.al.,J.Agric.Food Chem.,48(6),S.2387-2390,2000)
基于制备过程，由此，就欧洲香料法规而言，所述支链醛不能够声明为是天然的。另一方面，市场上存在对如下香料的特别的兴趣，所述香料能够被宣布为等同天然的，而且强调为天然的；该声明可行性特别也是重要的购买和价格依据。
发明内容
因此，本发明的目的在于，提供一种用于制备的方法，借助所述方法能够以生物技术进而视为天然的途径制备一般性的支链醛和尤其12-甲基十三醛。
本发明的第一主题涉及一种用于制备支链醛，优选包括12个至18个碳原子和/或具有甲基支链的支链醛，尤其12-甲基十三醛，12-甲基十四醛，14-甲基十五醛，16-甲基十八醛或其混合物的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)提供耳霉属的一种或多种真菌的培养物，并且产生具有呈游离和/或结合形式的支链羧酸成分的生物质；
(b)提取出自步骤(a)的生物质，以产生第一中间产物，所述第一中间产物包含游离的羧酸和/或结合的羧酸；
(c)可选地化学水解、酶水解或微生物水解出自第一中间产物的结合的羧酸；
(d)用化学性质的还原剂处理第一中间产物，以将游离的羧酸和/或结合的羧酸转化成相应的醇，以及可选地将一种或多种醇与干扰性的副组份分离，并且产生以化学方式产生的第二中间产物，所述以化学方式产生的第二中间产物包含作为混合物或呈富集形式的该醇；
(e)用生物性质的还原剂处理第一中间产物，以将游离的羧酸和/或结合的羧酸转化成具有与游离的羧酸和/或结合的羧酸相比相等数量的碳原子的相应的醛或转化成具有与游离的羧酸和/或结合的羧酸相比数量减少一的碳原子的相对应的醛，并且产生以生物方式产生的第二中间产物，所述以生物方式产生的第二中间产物包含该醛；
(f)用化学性质的氧化剂处理以化学方式产生的第二中间产物，以将游离的醇和/或结合的醇转化成相应的醛；以及必要时
(g)从在步骤(d)和/或步骤(e)和/或步骤(f)之后获得的馏份中去除干扰性的副组份。
令人惊讶地发现：迄今不太重视的真菌属、即耳霉属具有脂肪酸模式，所述脂肪酸模式使这些微生物显得作为对于制备一般的支链醛并且尤其12-甲基十三醛适合的原材料。通过用生物还原剂和/或化学还原剂和化学氧化剂的最佳处理顺序能够以足够的产率和高的纯度获得目标产物。氧化产物是支链醛的混合物，所述混合物也还包含线性物质。这些混合物能够直接使用，然而，通过有针对性地后处理来获得尤其渴望的产物12-甲基十三醛同样是可行的。
生物
由于由其产生的脂肪酸图谱而用作为用于获得期望链长度的支链脂肪酸的适合的生物反应器的组织是真菌的特定属、即耳霉属，所述耳霉属主要包括腐生生物，所述腐生生物降解死亡的植物材料或生活在土壤中。两种优选的物质双孢耳霉属和异形孢耳霉属在中国榆树(榔榆)的树叶的分解的上下文中描述。分类学上，这两个属如下分类：
界：真菌
门：虫霉霉亚纲
目：虫霉目
科：新月霉科
D.Tyrrell在1968年至1976年发表了关于所述生物的概述：“The fatty acidcomposition of some Entomophthoraceae.II.The occurrence of branched-chainfatty acids in Condiobolus denaesporus”Lipids 3(4),S.368-372(1968)；“Fattyacid composition of some Entomophthoraceae.I II.”Can J Microbiol 17(8),S.1115-1118(1971)；和“The fatty acid composition of someEntomophthoraceae.IV.The occurrence of branched-chain fatty acids inConidiobolus species”.Can J Microbiol 22(7),S.1058-1060(1976).
培养物
一种或多种真菌菌丝的培养能够以已知的方式利用适合的营养培养基在固体培养物或液体培养物中执行。用由麦芽提取物和酵母提取物构成的营养液制备的琼脂平板被证明为有效的。
提取
在培养物产生足够量的生物质之后，——如果需要——，那么将所述生物质与营养液例如通过离心分离、过滤或其他适合的分离方法分离。紧接着，提取呈其游离或结合形式的羧酸。能够直接提取固体培养物，如其例如在冷冻干燥之后获得。
此外，如果提及提取物，那么其制备能够以已知的方式进行，也就是说，例如通过培养物本身或从其中获得的干物质的水代法、醇代法或水-醇代法进行。全部常规的提取方法，例如，浸渍，再浸渍，加热浸提，振荡浸渍，漩涡提取，超声提取，逆流提取，渗滤，再渗滤，抽真空(在降低的压力条件下提取)，浸泡或在连续的回流条件下固液提取。渗滤方法对于大规模的使用是有利的。有机溶剂，水(优选高于80℃并且尤其高于95℃的温度的热水)或由有机溶剂和水构成的混合物，尤其具有或更多或更少含水量的低分子量的醇能够用作用于执行提取的溶剂。
尤其优选用甲醇，乙醇，戊烷，己烷，庚烷，丙酮，丙二醇，聚乙二醇以及乙酸乙酯以及由其构成的混合物以及其含水的混合物进行提取。提取通常在20℃至100℃，优选30℃至90℃，尤其60℃至80℃下执行。在优选的实施方式中，提取在惰性气体气氛下执行，以避免提取物的有效成分氧化。这尤其在温度高于40℃下提取的情况下是重要的。本领域技术人员根据原材料、提取方法、提取温度、溶剂与原材料的比例等调节提取时间。
在提取之后，获得的粗提取物必要时能够经受其他常规步骤，即例如，提纯、浓缩和/或脱色。如果期望，那么以该方式制备的提取物例如能够经受跟别不期望的内含物质的选择性的分离。提取能够进行直至任意的提取程度，但通常执行直至耗尽。在提取生物干物质时典型的产率(＝提取物的干物质量相对于使用的原材料量)在3重量％至15重量％，尤其6重量％至10重量％的范围中。本发明包括认识：本领域技术人员能够根据期望的使用领域选择提取条件以及最终提取物的产率。能够使用通常具有在0.5重量％至10重量％的范围中的活性物质含量(＝固体含量)的这些提取物本身，然而同样可行的是：通过干燥，尤其通过喷雾干燥或冷冻干燥完全去除溶剂。
在下文中也称作第一中间产物的提取物能够作为含水配制品和/或溶于有机溶剂的配制品和喷雾干燥的或冷冻干燥的、无水的固体存在。在该上下文中，例如具有1个至6个碳原子的脂肪醇或支链醇(例如乙醇，2-甲氧基-2-甲基丙烷)，酮(例如丙酮)，卤代烃(例如氯仿或二氯甲烷)，低级酯或多元醇(例如甘油或乙二醇)考虑作为有机溶剂。
水解
在需要的情况下，在还原之前，提取物能够经受水解，以便释放作为甘油酯结合存在的脂肪酸的份额。在此，水解能够以化学方式进行，然而，优选选择生物替选方案。所述生物替选方案能够以微生物方式、即借助活的微生物，和以酶法进行，因为所述生物替选方案更温和地进行并且还提供调节方面的优点。例如源自念珠菌属，尤其皱褶念珠菌或筒状念珠菌的水解酶适合于生物替选方案。
还原
在提取之后获得由不同的线性的和支链的、饱和的和不饱和的脂肪酸构成的混合物作为第一中间产物，所述混合物也能够作为甘油酯以结合的方式存在。这样的混合物例如能够包括下列代表：十三烷酸，12-甲基十三烷酸，十四烷酸，12-甲基十四烷酸，十五烷酸，14-甲基十五烷酸，十六烷酸，十六碳烯酸，15-甲基十六酸，十七烷酸，反油酸，油酸和花生四烯酸。
脂肪酸或脂肪酸甘油酯的混合物现在经受还原。如同水解，所述还原能够以化学方式进行，然而，优选选择生物替选方案，因为所述生物替选方案引起就欧洲香料法规而言视为天然的生产过程。在此，优选的生物替选方案能够用酶和细胞裂解液，细胞提取物或还有完整的细胞执行，它们具有对于还原所需的酶活性。在该步骤之后，还原产物能够用本领域技术人员已知的提取方法从反应混合物中提取。在去除提取剂之后，于是，获得的浓缩物能够以期望的浓度用选择的溶剂吸收。
脂肪酸或脂肪酸甘油酯的混合物的化学反应能够借助硼氢化钠进行，但优选应当使用氢化锂铝。在该反应期间，酸官能团或酯官能团还原为羟基基团；因此，在该情况下化学的第二中间产物完全或至少主要包含线性羧酸和支链羧酸的相应的醇。在大约3小时的反应时间之内，实现理论值的85％至95％附近的产率，如果在还原后还紧接着有蒸馏处理步骤，例如球管蒸馏，那么能够提高所述产率。关于作为12-甲基十三烷酸的还原产物的尤其期望的产物12-甲基十三醛的量，按还原产物的总量计，产率为大约25％至35％。在还原时，也引起包含在混合物中的不饱和的物质变为饱和作为副反应。
使用氢化物的还原方法属于制备有机化学的标准方法并且是公知常识，因此，不需要对其进一步全面阐述。还原优选在15℃至25℃的范围中的温度下执行，其中根据预期在反应开始时出现短暂的温度升高。
氧化
化学的第二中间产物用作用于后续的氧化的原材料，其中醇转化为相应的醛。优选TEMPO用作氧化剂。TEMPO代表2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物。
虽然该自由基是热力学不稳定的，但其相对高的持久性归因于由空间效应影响寿命的取代基。取代基处于自由基电子附近，使得所述取代基在不含氧的溶液中具有一分钟的平均寿命。TEMPO与适合的助氧化剂共同用于醇的双相氧化被Anelli等在J OrganicChemistry.52,S.2559-2562(1987)中描述(“Anelli-Oxidation”)并且例如在OrganicSyntheses,Coli.Vol.8,S.367(1993)；Vol.69S.212(1990)应用。
就本发明而言，证实为有利的是：TEMPO与两种助氧化剂、即碱式溴化物和碱式次氯酸盐共同使用。在此，优选的是溴化钾和次氯酸钠的组合。在此，大约1:(2至10):(10至40)的TEMPO、碱式溴化物和碱式次氯酸盐的摩尔使用比例，尤其大约1:(2至10):(10至40)并且尤其大约1:(4至8):(15至30)的TEMPO、碱式溴化物和碱式次氯酸盐的摩尔使用比例尤其证明为是可靠的。因为反应强烈放热，所以建议将反应温度保持在大约-5℃至+10℃的范围中。
在这些条件下，获得按使用的醇计在85％至97％的范围中的产率。按优选的目标产物12-甲基十三醛计，产率为30％至35％，其中达到大约95％的纯度。
在氧化情况下，通过产物经受蒸馏处理，例如球管蒸馏或使用裂化炉管的方式，也能够进一步改进纯度。
在选择用于生物还原的酶法工艺的情况下，能够使用酶，如可商购的醛脱氢酶(ALDH，EC 1.2.1.x)和羧酸还原酶，例如源自诺卡氏菌属(Aimin He,Tao Li，LacyDaniels，lan Fotheringham，John P.N.Rosazza Appl Environ Microbiol.2004Mar；70(3):1874-1881)和/或海分枝杆菌(M.Kalim Akhtar，Nicholas J.Turner，Patrik R.JonesProc Natl Acad Sei USA.2013Jan 2；110(1):87-92)。羧酸还原酶能够通过在诺卡氏菌属或分枝杆菌属、尤其艾阿华诺卡氏菌中的同源性表达以及异源性地通过在适合的宿主生物体、尤其大肠杆菌中重组表达获得，但也优选通过培植华诺卡氏菌获得，所述诺卡氏菌作为所谓的野生型菌株同样表达酶。在此，酶是否呈纯化的形式，是否仅部分浓缩，是否存在于细胞粗提取物或天然细胞或重组细胞中，对于原理反应无关紧要。
工业应用性
本发明的另一主题涉及一种根据上述方法获得的、具有12个至18个碳原子的甲基支链醛的浓缩物，所述浓缩物能够包含在10重量％至100重量％，优选25重量％至95重量％并且尤其大约40重量％至大约60重量％的量的所述甲基支链醛。浓缩物能够直接基于以化学方式产生的第二中间产物(f)以及以生物方式产生的第二中间产物(e)或完全或部分纯化的产物(g)通过适合的，优选温和的干燥方法、即例如喷雾干燥或尤其冷冻干燥获得。在此，载物和/或调味物能够占有与100％的差值。替选地，浓缩的水溶液也能够购得。
本发明的最后一个主题涉及浓缩物或替选的如上描述的直接的方法产物作为调味组份，尤其用于食品的调味组份的应用，以便给所述浓缩物或方法产物给予牛肉味道。
具体实施方式
实例1
真菌菌株的培养
使用的真菌菌株
在紧接着的表1中说明关于研究的真菌、其准确的名称、菌株保藏的编号(CBS号)、离析底物以及离析位置的概览。
表1
研究的真菌
生物 CBS号 离析底物，离析位置 缩写
双孢耳霉属 137.57 榔榆的分解的树叶，(US) CDE
异形孢耳霉属 333.74 农业土壤(NL) CHET-N
异形孢耳霉属 138.57 森林树叶秸秆(US) CHET-U
在固体培养基上的培养
真菌菌株在麦芽提取物琼脂平板上培养。为了制备平板，称重培养基组分(表2)，用蒸馏水填充至1升并且高压灭菌(120℃，20min)。居中地将出自平板培养物的有生命力的边缘区域中的、用菌丝覆盖的1cm2大小的琼脂块定位到琼脂平板上，用石蜡膜封闭皮氏培养物皿，并且紧接着，在24℃下在培养物箱中用光或优选无光孵育。在大约5天(CHET-N)或14天(CHET-U和CDE)之后，从覆盖至大约3/4的平板中接种预培养物。并行地，根据相同的原理持续接种用于下一预培养物的其他的琼脂平板。表2示出用于培植耳霉属菌株的麦芽提取物-酵母提取物-琼脂的成分：
表2
琼脂成分
将表3中描述的复合营养培养基用于浸没的预培养物：
表3
标准复合培养基的成分
培养基组分 浓度[g L-1]
麦芽提取物 30
酵母提取物 3
为了在浸没培养物中培养，在无菌条件下将外部菌丝体的1cm2大的琼脂块转移到填充有100mL营养培养基的250mL的锥形瓶中，并且用Ultraturrax分散棒处理(30s，9800Umin-1)。预培养物在24℃下排除光条件下在孵育器(Multitron，Infors，Einsbach；24℃，150U min-1，偏转25mm)中孵育。
主培养物：为了培植主培养物，预培养物在无菌条件下用Ultraturrax分散棒处理(30s，9800U min-1)处理。将20mL该悬浮液在500mL锥形瓶中加入到200mL新鲜的营养培养基中。培养在24℃下在排除光条件下在孵育器(24℃，150U min-1，偏转25mm)中进行。
实例2
细胞收集和脂肪提取
在培养持续时间结束时，主培养物通过滤纸(拦截范围8μm至12μm)过滤。残余物掺有大约200mL的4M的HCl，加热直至沸腾并且在沸点即热下消化30min。紧接着，溶液在仍热的状态下通过折纸漏斗过滤并且用热水冲洗，直至冲洗水为中性。在干燥箱(100℃)中干燥1h至2h之后，滤纸在索氏抽提器上用石油醚(沸点范围40℃至60℃)提取4h。在借助旋转蒸发器去除溶剂之后，重力测定脂肪含量。
替选于此，在培养持续时间结束时，主培养物物能够通过滤纸(拦截范围8μm至12μm)过滤并且紧接着冷冻干燥。然后，用清洁过的沙子涂抹冷冻干燥物，掺入有各大约75ml的己烷3次并且用40巴至120巴的压力在Büchi公司的SpeedExtactor中提取。在借助旋转蒸发器去除溶剂之后，重力测定脂肪含量。
为了鉴定以发酵方式制成的生物质的最适合的后处理方法，研究不同的方案。在此，冷冻干燥与紧接着精细分割/研磨鉴定为最适合的方法。图1示出脂肪酸占不同的耳霉属菌株的酯交换的脂质提取物的总脂肪酸含量的份额；全部脂肪酸以气象色谱法确定为脂肪酸甲酯。在图2中描述脂肪含量与消解方法的相关性。
实例3
借助脂肪酶酶法水解
大约50mg的提取生物质之后获得的脂质提取物与10μL至100μL不同浓度的(源自筒状念珠菌属的)Amano的“脂肪酶AY”的脂肪酶-酶溶液和100μL至190μL的磷酸缓冲液(200mM，pH 7.6)和100μL的水混合，并且在Thermoblock(Eppendorf)中孵育过夜(45℃，800U min-1)。为了制备缓冲液，制备0.2M的Na2HPO4溶液进而与0.2M的KH2PO4溶液混合，设定pH值为7.0。表4中描述研究的浓度比例。紧接着，样本用2mL的己烷振荡萃取并且上方(有机)相转注到玻璃瓶中，以便借助GC(无需上述甲基化)确定脂肪酸分布(图3)。在未处理的脂肪馏份中不存在游离的脂肪酸。通过用脂肪酶水解来释放脂肪酸，其与使用的酶量强烈地相关(用3U的酶仅非常少量地释放，反之，用30U的酶明显更多地释放)。发现总共14％的12-甲基十三烷酸。在分别用100U和300U的酶重复试验时，证实总共25重量％的12-甲基十三烷酸。
表4
用于水解脂肪提取物的反应制剂
A B C D
脂肪馏份 50mg 50.4mg 51mg 51.3mg
脂肪酶溶液(10mg/ml) 10μL 100μL
脂肪酶溶液(100mg/ml) 20μL 100μL
脂肪酶量(U脂肪酶) 3 30 100 300
磷酸盐缓冲液(200mM)，pH 7 190μL 100μL 180μL 100μL
H2O 100μL 100μL 100μL 100μL
实例4
12-甲基十三烷酸与α-双加氧酶的反应
α-双加氧酶的生产基于专利申请WO2012025629A1中详细描述的方法按照文献说明进行。为了细胞转化，将1μL的质粒移液至感受态的大肠杆菌细胞[BL21(DE3)，Novagen]。在冷却阶段(在冰上30min)之后，样本在水浴(42℃)中加热2min并且重新冷却。为了培养，添加150μL的LB卡那霉素培养基(表5)并且孵育1h(37℃，200U min-1，偏转25mm)。细胞悬浮液施加到预先干燥并且顺化的LB卡那霉素琼脂平板上并且在37℃下孵育过夜。
表5
LB卡那霉素培养基的成分
量 组份
10g L-1 胰蛋白胨
5g L-1 酵母提取物
10g L-1 NaCl
25mg L-1 卡那霉素(未高压灭菌，而是以无菌过滤的方式添加)
对于与α-双加氧酶的反应，该酶对应于WO 2012 025629A1的说明在LB培养基中的大肠杆菌细胞[BL21(DE3)]中表达。借助接种环将大约0.5cm长的涂片从菌苔中取出，转移到3mL的LB卡那霉素培养基中，并且在摇床(37℃，150U min-1，偏转25mm)中孵育直至OD600在0.5至0.8之间。添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(0.5mM)并且样本在摇床(24℃，150U/min，偏转25mm)中继续孵育16h至18h。离心分离样本(4000U/min，3.724×g，10min，4℃)，丢弃上清液并且冷冻细胞团粒(-20℃)。
如上述制备的冷冻的细胞团粒置于磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.6)中，以相同的缓冲液冲洗，离心分离并且在2mL的、添加了0.5％的葡萄糖单水合物的磷酸盐缓冲液中重悬浮。将50μL的12-甲基十三烷酸(在DMSO中7.5mg mL-1)添加至1mL的细胞悬浮液。样本在37℃下孵育(150U/min，偏转25mm)1h，紧接着，用1mL的庚烷提取。在有机相经由硫酸钠干燥之后，以气象色谱法研究所述有机相。
实例5
脂质提取物与α-双加氧酶的反应
反应类似于实例4进行，其中使用具有12-甲基十三烷酸的标准溶液。将10μL的出自实例2的真菌培养物的脂肪提取物添加至2mL的重悬浮于磷酸缓冲液中的大肠杆菌细胞，如实例4中那样提取，紧接着，以气象色谱法研究。
实例6
与脂肪酶和α-双加氧酶同时反应
将145mg的出自实例2的双孢耳霉属的脂质提取物称入到10mL的管形瓶中，并且掺入有200μL的出自实例3的脂肪酶-酶溶液，200μL的磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.6)和200μL的水。200mg的出自实例4的产生α-双加氧酶的大肠杆菌细胞用磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.6)冲洗并且在4mL的包含0.5％的葡萄糖单水合物的磷酸盐缓冲液中重悬浮并且放入预先准备的10mL的管形瓶中。反应制剂过夜孵育(22h，24℃，150Umin-1，偏转25mm)。反应后的脂肪用2mL的庚烷提取3次并且合并有机相。在稀释(1:50)之后，气象色谱法分析样本。
实例7
与醛脱氢酶(ALDH)反应
为了与醛脱氢酶(源自啤酒酵母菌的ALDH，10.5U mg-1的蛋白质)反应，将大约15mg的12-甲基十三烷酸与500μL的Trion-X-100溶液(2.2g L-1)乳化。反应依照Bostian等，(1978)Biochemical Journal 173，773-786根据Sigma Quality Control Test1进行。在添加酶之后，样本在摇床中孵育(30min，24℃，150U min-1，偏转25mm)并且紧接着用各1mL的戊烷/乙醚(1:1.12，v/v)振荡萃取两次。在气象色谱分析之前，样本掺入有50μL的内部标准物(750mg L-1的麝香草酚)。替选于此，根据图6在另一试验中执行用α-双加氧酶还原。
实例8
12-甲基十三烷酸用羧酸还原酶还原
Nsp-CAR以及MmFad9的蛋白质表达在重组大肠杆菌BL21(DE3)细胞中执行。为此，给50mL的LB培养基混入(angeimpft)了出自母液的30μg的卡那霉素/mL并且在37℃和130Upm下孵育，直至达到大约0.6至0.8的OD600。在达到该值时，通过添加1mM的IPTG诱导并且在室温下进一步使培养物过夜。以该方式获得的生物质在10000Upm下离心分离10分钟并且细胞团粒在-20℃下贮藏直至进一步应用。
为了获得蛋白质，解冻在-20℃下贮藏的团粒并且用每克团粒4mL的B-PER反应剂重悬浮。在添加50μg溶菌酶/ml和2.5U去氧核糖核酸酶/ml之后，样本在室温下孵育15分钟，紧接着，在10000Upm和4℃下离心分离10分钟，以便如此获得总蛋白质提取物。在随后借助HisPur Ni-NTA柱纯化酶之后，纯化的酶的蛋白质浓度根据Bradford确定(对于Nsp-CAR为9.92mg/ml并且对于MmFad9为26.43mg/ml)。
酶测定用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5)，20mM的底物，10mM的ATP，10mM的NADPH，100mM的MgCl2和1mg纯化的酶执行，使得总体积为1.1ml。在室温下24h的孵育时间之后，含水混合物分别用己烷以1:1振荡萃取3次，并且上方的有机相转移到GC瓶中。在表6中总结所获得的结果。在图41中示出12-甲基十三醛的标准的质谱图(右部分)和在用Nsp-CAR还原之后的质谱图(左部分)。
表6
酶反应的12-甲基十三烷酸和12-甲基十三醛含量
1图4：左边：通过借助CAR还原从同源性酸中生成的12-甲基十三醛的质谱图；右边：12-甲基十三醛的标准的质谱图
实例9
在(用能够表达Nsp-CAR或MmFad9的活的大肠杆菌BL21细胞)生物转化中还原12-甲基十三烷酸
通过由Akhtar等(P Natl Acad Sci USA 2013；110:87-92)描述的那样通过存在蛋白质BsSfp能够正面地影响还原酶的催化活性，为此，相应的大肠杆菌菌株在LB培养基中同时在37℃和150Upm下过夜并且添加给生物转化制剂。
首先，由表达还原酶和辅酶的大肠杆菌细胞生长培养物，使得所述培养物达到大约2的OD。随后，生物转化制剂配制成，使得对于每个制剂存在一次具有或没有辅助蛋白质的还原酶以及每一制剂作为阳性对照存在，其中给每个还原酶添加100μL的苯甲酸。除对于表达的大肠杆菌菌株需要的分别大约1ml的体积之外，为每种制剂还添加5μL的IPTG(制剂中1mM的最终浓度)，100μL的12-甲基十三烷酸乙醇溶液(制剂中2mM的最终浓度)以及大约3mL至4mL的新鲜的LB培养基，使得在制成之后制剂在5mL的最终体积中具有大约0.5的OD。以该方式制备的制剂在室温下在150Upm的摇床频率下培养24h作为双重测定。紧接着，制剂与己烷以1:1的比例提取各2次。在表7中总结出自生物转化的结果。
表7
用于形成12-甲基十三醛的生物转化的结果
实例10
借助脂肪酶水解异形孢耳霉属的脂肪馏份并且紧接着与羧酸还原酶MmFad9或Nsp-CAR反应来形成12-甲基十三醛
用如能够从说明书实例2中获得的、合并的脂质提取物根据说明书实例3执行水解。150mg的以该方式水解的脂肪提取物掺入有1010μL的如表8中示出的反应混合物。借助图52中示出的MS/MS分析能够显示出，用水解的脂肪提取物和用非水解的脂肪提取物都能够鉴定出12-甲基十三醛。表8
用于还原水解的脂肪提取物的还原混合物的成分
底物 使用的量
出自实例8的CAR蛋白质溶液 900μL
ATP二钠盐 1mM
NADPH四钠盐 1mM
MgCl2*6H2O 10mM
最终体积 1.010mL
2图5：上方：脂质提取物的酶反应的空白值(热灭活的CAR)的MS/MS色谱图(TIC，Q1中扫描)；中间：不添加脂肪酶的脂质提取物的反应；下方：脂肪提取物与脂肪酶和CAR的反应
实例11
用艾阿华诺卡氏菌的活细胞还原异形孢耳霉属的脂肪提取物来制备12-甲基十三醛
从艾阿华诺卡氏菌的冷冻保藏物中取出1mL并且转移到100mL的烧瓶中，所述烧瓶包含10mL的LB培养基和0.05％的吐温80。烧瓶在28℃和130rpm下在50mm的摇床幅度下培养物大约72h。接着，从良好覆盖的培养物中取出1mL并且转移到同样具有10mL相同的、新鲜的培养基的100mL的锥形瓶中。类似于T.Li等(J Bacteriol.Jun 1997；179(11):3482-3487)，然后，用5mg的苯甲酸/ml诱导并且烧瓶在28℃和130rpm下继续孵育24h。接着，根据在表9中的汇总执行生物催化。在诱导阶段之后，添加底物并且制剂在28℃和150Upm下继续孵育24h。紧接着，样本与己烷以2:1提取，有机相转移到样本器皿中并且以气相色谱法研究12-甲基十三烷酸和12-甲基十三醛。在表9中总结结果。
表9
从生物催化试验中的试验结果
实例12
提取自异形孢耳霉的脂肪提取物化学反应成12-甲基十三醛
先前获得的脂肪提取物划分为两个质量：具有小于1g/L的脂肪含量的脂肪提取物和具有更高含量的脂肪提取物。反应分两个步骤进行、即首先借助氢化锂铝还原并且紧接着用TEMPO/KBr/NaOCl氧化。在下列表10中描述反应条件：
表10
反应条件*
*)078：＜1g/L的27.4g，083：＞1g/L的17.8g，081：＜1，085：＞1
用氢化锂铝还原，按12-甲基十三烷酸或相应的甘油酯计(分别在球管中蒸馏之后)，对于＜1g/L的试验得出89％的产率并且对于＞1g/L的试验得出93％的产率。在此，双键份额从22％减小到6％或从29％减小到22％。图7A和图7B对于具有名称078(＜1g/L)或083(＞1g/L)的两种制剂描述在球管蒸馏之前和在球管蒸馏之后产生的醇的成分。
紧接着用TEMPO氧化，按12-甲基十三烷酸或相应的甘油酯计(分别在球管中蒸馏之前)，对于＜1g/L(081)的情况得出97％的醛的产率并且对于＞1g/L的情况(085)得出94％的醛的产率。在图7C中描述结果。
合并获得的醛馏份(#081和#085)并且再次在球管中蒸馏。基于12-甲基十三烷酸或相应的甘油酯的量，对应于77％的产率测定19.6g(GC纯度44.8％)。在图8A中描述结果。产生的蒸馏物在裂化炉管中经受进一步纯化(72℃至83℃，0.5毫巴)。获得具有高于95％的纯度的不同的馏份(图8B)。在表11中描述成分。
表11
出自裂化炉管蒸馏中的馏份的纯度
基于醇混合物(17g具有37.4％的纯度并且10.5g具有37.2％的纯度)，用于由馏份5至馏份12(4.1g，纯度94.7％)构成两种合并的质量的氧化的总产率为38％。
基于两个步骤(27.4g＜1g/L的脂肪提取物与30.4GC-％的12-甲基十三烷酸和17.8g＞1g/L的脂肪提取物与27.1GC-％的酯的还原和氧化)的12-甲基十三醛的产率基于馏份5至馏份12(4.1g，纯度94.7％)为34％。
基于95％纯度的馏份5、7以及馏份9至馏份12(3.6g)，在两个步骤之后的产率为30％。

Claims (21)

1.一种用于制备支链醛的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)提供耳霉属的一种或多种真菌的培养物并且产生具有呈游离和/或结合形式的支链羧酸成分的生物质；
(b)提取出自步骤(a)的生物质，以产生第一中间产物，所述第一中间产物包含游离的羧酸和/或结合的羧酸；
(c)可选地化学水解、酶水解或微生物水解出自所述第一中间产物的结合的羧酸；
(d)用化学性质的还原剂处理所述第一中间产物，以将所述游离的羧酸和/或所述结合的羧酸转化成相应的醇，以及可选地将一种或多种醇与干扰性的副组份分离，并且产生以化学方式产生的第二中间产物，所述以化学方式产生的第二中间产物包含有作为混合物或呈富集形式的所述醇；
(e)用生物性质的还原剂处理所述第一中间产物，以将所述游离的羧酸和/或所述结合的羧酸转化成具有与所述游离的羧酸和/或所述结合的羧酸相比相等数量的碳原子的相应的醛或转化成具有与所述游离的羧酸和/或所述结合的羧酸相比数量减少一的碳原子的相对应的醛，并且产生以生物方式产生的第二中间产物，所述以生物方式产生的第二中间产物包含所述醛；
(f)用化学性质的氧化剂处理以所述化学方式产生的第二中间产物，以将所述游离的醇和/或所述结合的醇转化成相应的醛；以及可选地
(g)从在步骤(d)和/或步骤(e)和/或步骤(f)之后获得的馏份中去除干扰性的副组份。
2.根据权利要求1所述的方法，
其特征在于，
所述支链醛具有12个至18个碳原子。
3.根据1和/或2所述的方法，
其特征在于，
所述支链醛具有甲基基团作为支链。
4.根据权利要求1至3中至少一项所述的方法，
其特征在于，
所述醛是12-甲基十三醛，12-甲基十四醛，14-甲基十五醛，16-甲基十八醛或其混合物。
5.根据权利要求1至4中至少一项所述的方法，
其特征在于，
使用物质双孢耳霉和异形孢耳霉的真菌。
6.根据权利要求1至5中至少一项所述的方法，
其特征在于，
所述第一中间产物在还原之前经受水解。
7.根据权利要求1至6中至少一项所述的方法，
其特征在于，
用氢化锂铝或硼氢化钠执行所述还原。
8.根据权利要求1至6中至少一项所述的方法，
其特征在于，
借助生物体系执行所述还原。
9.根据权利要求8所述的方法，
其特征在于，
用可商购的醛脱氢酶(ALDH，EC 1.2.1.x)执行所述还原。
10.根据权利要求8所述的方法，
其特征在于，
用α-双加氧酶执行所述还原，其中在此同时能够产生缩短了一个C原子的醛。
11.根据权利要求8所述的方法，
其特征在于，
用纯化的酶Nsp-CAR和/或MmFad9执行所述还原。
12.根据权利要求8所述的方法，
其特征在于，
用由表达Nsp-CAR和/或MmFad9的细胞构成的全细胞提取物执行所述还原。
13.根据权利要求8所述的方法，
其特征在于，
用活细胞执行所述还原，所述活细胞能够表达酶Nsp-CAR和/或MmFad9。
14.根据权利要求1至13中至少一项所述的方法，
其特征在于，
在15℃至25℃范围中的温度下执行所述还原。
15.根据权利要求1至14中至少一项所述的方法，
其特征在于，
将TEMPO用作氧化剂。
16.根据权利要求15所述的方法，
其特征在于，
TEMPO与碱式溴化物和碱式次氯酸盐一起使用。
17.根据权利要求16所述的方法，
其特征在于，
以大约1:(2至10):(10至40)的摩尔比例使用TEMPO、碱式溴化物和碱式次氯酸盐。
18.根据权利要求1至17中至少一项所述的方法，
其特征在于，
在-5℃至+10℃范围中的温度下执行氧化。
19.根据权利要求1至18中至少一项所述的方法，
其特征在于，
作为另一步骤，将还原产物、氧化产物或这两者经受蒸馏处理。
20.一种具有12个至19个碳原子的甲基支链醛的浓缩物，该支链醛能按照根据权利要求1至13所述的方法获得。
21.一种根据权利要求14所述的浓缩物的应用，其用作为香味组份。
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