JP6831135B2 - 転移性卵巣癌、子宮内膜癌もしくは乳癌の予防または治療用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、転移性卵巣癌、子宮内膜癌もしくは乳癌の予防または治療用の薬学的組成物または健康機能食品に関する。

卵巣癌は、婦人科がんの中で最も死亡率が高い癌であり、近年、生活様式の西欧化および老齢人口の増加に伴いその頻度が増加し続けている。卵巣癌の場合は、初期には症状が出にくいため、約７０％以上の患者が３期以上の進行卵巣癌の状態で発見され、約７５％以上の患者に初回治療後２年以内に再発及び転移が起こることが報告されている。

卵巣癌の治療方法は、癌の種類及び段階に応じて決定され、手術療法、化学療法などがあるが、再発による転移癌への治療効果は大きくない。これは、癌の転移は、新生血管の生成誘導および細胞の移動を伴うものであるため、癌自体とはその現象が異なることと、癌の転移を防ぐためには、新生血管の生成誘導および細胞の移動まで抑えなければならないので、抗転移の効果と抗癌の効果とは互いに異なることによる。

卵巣癌は、特別な症状なしに進行する場合が多いため、早期発見が難しく、癌が相当進行して腹腔内外に転移した状態で見つかることが多い。また、卵巣は、骨盤内を自由に移動するので、癌細胞が周囲の組織に浸潤するか、他の癌に比べて転移速度が速い特徴がある。この影響で、全卵巣癌患者の約７０〜７５％以上が卵巣癌３期以上の進行卵巣癌と診断されている。特に末期卵巣癌細胞は、腹水（ascetic fluid）中で癌細胞の球形の塊である球形体として存在することが知られている。このような卵巣癌細胞の特異的性質によって、他の癌に効果を示す抗癌剤を適用しても、癌細胞の死滅が効果的に誘導されず、様々な抗癌剤に対して抵抗性を持っているという報告がある。

また、前述のような抗癌剤抵抗性などの問題は、子宮内膜癌、乳癌などにも示される。

そこで、卵巣癌の特異的な転移形態に対しても効果的に抗癌効果を示して転移性卵巣癌細胞を効果的に死滅できる新しい抗癌剤の開発、そして子宮内膜癌、乳癌などに対しても優れた薬効を示す抗癌剤の開発、抗癌剤抵抗性を獲得した癌細胞の抵抗性を克服できる新しい抗癌剤の開発が必要である。

本発明は、腹水中に浮遊し、球形で存在する転移性卵巣癌、そして子宮内膜癌と乳癌を効果的に死滅できる新しい抗癌剤を提供することを目的とする。

本発明は、癌細胞の抗癌剤抵抗性を遮断できる抗癌補助剤を提供することを目的とする。

本発明は、転移性卵巣癌、そして子宮内膜癌と乳癌に対して優れた健康機能性を示すことができる健康機能食品を提供することを目的とする。

本発明は、転移性卵巣癌、そして子宮内膜癌と乳癌の治療方法を提供することを目的とする。

本発明は、特定の化合物の転移性卵巣癌、そして子宮内膜癌と乳癌の治療用医薬の製造における用途を提供することを目的とする。

１．下記化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む、転移性卵巣癌、子宮内膜癌もしくは乳癌の予防または治療用の薬学的組成物。

２．前記項目１において、前記転移性卵巣癌、前記子宮内膜癌もしくは前記乳癌は、その癌細胞の少なくとも一部がスフェロイド形態である、薬学的組成物。

３．前記項目１において、前記化学式１の前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、癌細胞のスフェロイド（spheroid）形態を分解する、薬学的組成物。

４．前記項目１において、前記転移性卵巣癌は、卵巣癌３期または４期である、薬学的組成物。

５．前記項目１において、前記転移性卵巣癌、前記子宮内膜癌もしくは前記乳癌は、化学抗癌剤抵抗性癌である、薬学的組成物。

６．前記項目１において、前記薬学的組成物は、化学抗癌剤と併用投与されるものである、薬学的組成物。

７．前記項目６において、前記化学抗癌剤は、有糸分裂阻害剤またはアルキル化剤またはシスプラチンである、薬学的組成物。

８．前記項目６において、前記化学抗癌剤は、パクリタキセルである、薬学的組成物。

９．前記項目１において、前記薬学的組成物は、有糸分裂阻害剤またはアルキル化剤である化学抗癌剤をさらに含む、薬学的組成物。

１０．前記項目１において、前記薬学的組成物は、パクリタキセルをさらに含む、薬学的組成物。

１１．下記化学式１の化合物またはその食品学的に許容可能な塩を含む、転移性卵巣癌、子宮内膜癌もしくは乳癌に対する抗癌補助剤。

１２．前記項目１１において、前記転移性卵巣癌、前記子宮内膜癌もしくは前記乳癌は、化学抗癌剤抵抗性癌である、抗癌補助剤。

１３．前記項目１１において、前記抗癌補助剤は、化学抗癌剤と併用投与する、抗癌補助剤。

１４．前記項目１３において、前記化学抗癌剤は、有糸分裂阻害剤またはアルキル化剤である、抗癌補助剤。

１５．前記項目１３において、前記化学抗癌剤は、パクリタキセルである、抗癌補助剤。

１６．下記化学式１の化合物またはその食品学的に許容可能な塩を含む、転移性卵巣癌、子宮内膜癌もしくは乳癌の予防または改善用の健康機能食品。

１７．前記項目１６において、前記転移性卵巣癌、前記子宮内膜癌もしくは前記乳癌は、その癌細胞の少なくとも一部がスフェロイド形態である、健康機能食品。

１８．前記項目１６において、前記転移性卵巣癌は、卵巣癌３期または４期である、健康機能食品。

１９．前記項目１６において、前記化学式１の化合物またはその食品学的に許容可能な塩は、癌細胞のスフェロイド（spheroid）形態を分解する、健康機能食品。

２０．下記化学式１の化合物またはその薬学的に許容される塩を個体に投与することを含む、転移性卵巣癌、子宮内膜癌もしくは乳癌の治療方法。

２１．前記項目２０において、前記転移性卵巣癌、前記子宮内膜癌もしくは前記乳癌は、その癌細胞の少なくとも一部がスフェロイド形態である、方法。

２２．前記項目２０において、前記転移性卵巣癌は、卵巣癌３期または４期である、方法。

２３．前記項目２０において、前記化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を投与して癌細胞のスフェロイド（spheroid）形態を分解する、方法。

２４．前記項目２０において、前記転移性卵巣癌、前記子宮内膜癌もしくは前記乳癌は、化学抗癌剤抵抗性癌である、方法。

２５．前記項目２０において、前記化学式１の前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を化学抗癌剤と併用投与する、方法。

２６．前記項目２５において、前記併用投与前に前記個体の癌の化学抗癌剤抵抗性を確認し、抵抗性の獲得が確認された個体に前記化学抗癌剤を併用投与する、方法。

２７．前記項目２５において、前記化学抗癌剤は、有糸分裂阻害剤またはアルキル化剤である、方法。

２８．前記項目２５において、前記化学抗癌剤は、パクリタキセルである、方法。

２９．転移性卵巣癌、子宮内膜癌もしくは乳癌の予防または治療用医薬の製造における下記化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩の用途。

３０．前記項目２９において、前記転移性卵巣癌、前記子宮内膜癌もしくは前記乳癌は、その癌細胞の少なくとも一部がスフェロイド形態である、用途。

３１．前記項目２９において、前記転移性卵巣癌は、卵巣癌３期または４期である、用途。

３２．前記項目２９において、前記化学式１の前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、癌細胞のスフェロイド（spheroid）形態を分解する、用途。

３３．前記項目２９において、前記転移性卵巣癌、前記子宮内膜癌もしくは前記乳癌は、化学抗癌剤抵抗性癌である、用途。

本発明の薬学組成物は、スフェロイドで存在する癌細胞を効果的に死滅できるので、転移性卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌に対する新しい医薬品として有用に使用することができる。

図１は、２次元単層培養（２Ｄ ＭＣ）及び３次元球形培養（３Ｄ ＳＣ）後、培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１卵巣癌細胞の形態を顕微鏡で観察した結果を示す図である。 図２は、２次元単層培養（ＭＣ）及び３次元球形培養（ＳＣ）後、培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１卵巣癌細胞における細胞生存に関するシグナル伝達分子の発現を確認した結果を示す図である。 図３は、２次元単層培養（２Ｄ ＭＣ）（Ａ）及び３次元球形培養（３Ｄ ＳＣ）（Ｂ）後、培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１卵巣癌細胞にパクリタキセル（ＰＴＸ）、ＢＧＪ３９８、ＴＡＥ６８４およびイマチニブを濃度を変えて処理し、それによる細胞の生存率を確認した結果を示す図である。 図４は、２次元単層培養（２Ｄ ＭＣ）及び３次元球形培養（３Ｄ ＳＣ）後、培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１卵巣癌細胞にパクリタキセル（ＰＴＸ）、ＢＧＪ３９８、ＴＡＥ６８４およびイマチニブを濃度を変えて処理し、それによる細胞の生存率をクリスタルバイオレット染色により確認した結果を示す図である。 図５は、２次元単層培養（２Ｄ ＭＣ）及び３次元球形培養（３Ｄ ＳＣ）後、培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１卵巣癌細胞にＢＧＪ３９８、ＴＡＥ６８４およびイマチニブを処理し、それによる細胞の形態を確認した結果を示す図である。 図６は、２次元単層培養（ＭＣ）及び３次元球形培養（ＳＣ）後、培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１卵巣癌細胞にＢＧＪ３９８を処理した後、細胞生存シグナル分子であるＡＫＴ及びＳＴＡＴ３のリン酸化の変化有無を確認した結果（Ａ）、および、球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１を５μＭ ＢＧＪ３９８（ＢＧＪ）、３μＭ ＴＡＥ６４８（ＴＡＥ）、および５μＭイマチニブ（ＩＭＴ）で処理し、ＡＫＴ及びＳＴＡＴ３のリン酸化の変化を確認した結果（Ｂ）、（Ｃ）を示す図である。 図７は、２次元単層培養（２Ｄ ＭＣ）及び３次元球形培養（３Ｄ ＳＣ）後、培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１卵巣癌細胞にＡＧ４９０を濃度別に処理した後、細胞死滅効果を確認した結果（Ａ）、および、３次元球形培養（３Ｄ ＳＣ）後、培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１卵巣癌細胞にＢＧＪ３９８（ＢＧＪ）及びＡＧ４９０（ＡＧ）を処理した後、ＡＫＴ及びＳＴＡＴ３のリン酸化程度の変化を確認した結果（Ｂ）を示す図である。 図８は、３次元球形培養（３Ｄ ＳＣ）後、培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１卵巣癌細胞にパクリタクセル単独（ＰＴＸ）、パクリタキセルとＢＧＪ３９８を併用処理し、それによる細胞生存率を確認した結果を示す図である。 図９は、ＨＥＣ１Ｂ子宮内膜癌細胞株を３次元球形培養（３Ｄ ＳＣ）した後、細胞にＢＧＪ３９８を処理し、それによる細胞の形態を顕微鏡で確認した結果を示す図である。 図１０は、ＨＥＣ１Ｂ子宮内膜癌細胞株にパクリタキセル抗癌剤を濃度別に処理し、ＢＧＪ３９８の併用処理による細胞の死滅効果を確認した結果をクリスタルバイオレット染色とグラフで表した図である。 図１１は、ＨＥＣ１Ｂ子宮内膜癌細胞株にパクリタキセル抗癌剤を濃度別に処理し、ＢＧＪ３９８の併用処理による細胞の形態変化を顕微鏡で確認した結果を示す図である。 図１２は、Ｈｓ５７８Ｔ乳癌細胞株を３次元球形培養（３Ｄ ＳＣ）した後、細胞にＢＧＪ３９８を処理し、それによる細胞の形態を顕微鏡で確認した結果を示す図である。 図１３は、Ｈｓ５７８Ｔ乳癌細胞株にパクリタキセル抗癌剤を濃度別に処理し、ＢＧＪ３９８の併用処理による細胞の死滅効果を確認した結果をクリスタルバイオレット染色とグラフで表した図である。 図１４は、Ｈｓ５７８Ｔ乳癌細胞株にパクリタキセル抗癌剤を濃度別に処理し、ＢＧＪ３９８の併用処理による細胞の形態変化を顕微鏡で確認した結果を示す図である。 図１５は、ＳＫＯＶ３とＳＫＯＶ３−ＴＲのパクリタキセルに対する抵抗性を示すものである。 図１６は、抗癌剤パクリタキセル抵抗性卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３−ＴＲにおける、様々なリン酸化酵素阻害剤ＢＧＪ３９８、ＴＡＥ６４８、ＡＧ４９０による抗癌剤抵抗性の変化を示すものである。ＳＫＯＶ３−ＴＲ卵巣癌細胞にパクリタキセル（ＰＴＸ）を濃度別に処理した後、ＢＧＪ３９８、ＴＡＥ６８４及びＡＧ４９０を併用処理し、それによる細胞の生存率をクリスタルバイオレット染色で可視化したものである。 図１７は、パクリタキセル抵抗性卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３−ＴＲ細胞にパクリタキセル単独、ＢＧＪ３９８単独またはパクリタキセルとの併用投与時のパクリタキセルに対するＢＧＪ３９８の濃度依存的な細胞の生存率抑制効果をクリスタルバイオレット染色で可視化し、グラフで数値化して比較したものである。 図１８は、パクリタキセル抵抗性卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３−ＴＲ細胞の２Ｄ平面培養と３Ｄ球形培養において、パクリタキセル単独またはパクリタキセルとＢＧＪ３９８の併用投与時のＢＧＪ３９８に対するパクリタキセルの濃度依存的な細胞の生存率抑制効果をクリスタルバイオレット染色で可視化して比較したものである。 図１９は、パクリタキセル抵抗性卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３−ＴＲ細胞にパクリタキセル単独またはパクリタキセルとＢＧＪ３９８の併用投与時のＢＧＪ３９８に対するパクリタキセルの濃度依存的な細胞の生存率抑制効果をクリスタルバイオレット染色で可視化し、グラフで数値化して比較したものである。 図２０は、パクリタキセル抵抗性卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３−ＴＲ細胞にパクリタキセル単独、ＢＧＪ３９８単独またはパクリタキセルとの併用投与時の細胞毒性による形態変化を顕微鏡分析で示すものである。 図２１は、ＳＫＯＶ３ｉｐ１卵巣癌細胞株に漸進的なパクリタキセル濃度増加処理を行って作成したパクリタキセル抵抗性細胞株ＳＫＯＶ３ｉｐ１−ＴＲを用いて、様々な濃度のパクリタキセル単独またはＢＧＪ３９８の併用投与時の細胞毒性による形態変化を顕微鏡分析で示すものである。 図２２は、パクリタキセル抵抗性卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３−ＴＲ細胞にパクリタキセル単独、ＢＧＪ３９８単独またはパクリタキセルとの併用投与時の細胞毒性による細胞死滅効果を、ＦＡＣＳを用いたＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ変化の測定により示すものである。 図２３は、図２１で行ったＦＡＣＳ分析をＳｕｂ−Ｇ１、Ｇ１、Ｓ／Ｍ、Ｇ２細胞周期でグラフ化して細胞死滅の程度（Ｓｕｂ−Ｇ１）を比較したものである。 図２４は、ＳＫＯＶ３−ＴＲ卵巣癌細胞にパクリタキセル単独、ＢＧＪ３９８単独またはパクリタキセルとの併用投与時の時間による細胞死滅効果をｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰとＡｃｔｉｎの免疫染色法で確認したものである。 図２５は、ＳＫＯＶ３−ＴＲ卵巣癌細胞にパクリタキセル単独、ＢＧＪ３９８単独またはパクリタキセルとの併用投与時のＢＧＪ３９８の濃度依存的な細胞死滅効果をｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰとＡｃｔｉｎの免疫染色法で確認したものである。 図２６は、ＳＫＯＶ３−ＴＲ卵巣癌細胞にパクリタキセル単独またはＢＧＪ３９８のパクリタキセルとの併用投与時のＡＫＴのリン酸化阻害、ＰＡＲＰ ｃｌｅａｖａｇｅの誘導をＰａｔｈＳｃａｎ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ａｒｒａｙ Ｋｉｔ（Cell Signaling Technology）で確認したものである。 図２７は、ＳＫＯＶ３−ＴＲ卵巣癌細胞にパクリタキセル単独またはＢＧＪ３９８のパクリタキセルとの併用投与時、細胞内でＡＫＴ活性変化による細胞死滅調節の下流調節因子として知られているＢＡＤのリン酸化、ＸＩＡＰの発現量、ＣＡＳＰ９の発現量、ｐ４２／４４のリン酸化を免疫染色法で確認したものである。 図２８は、ＳＫＯＶ３−ＴＲ卵巣癌細胞にパクリタキセル単独またはＡＫＴ選択的阻害剤であるウォルトマンニン（ＣＡＳ １９５４５−２６−７）を併用投与時のＡＫＴ阻害によるパクリタキセルの細胞死滅効果をクリスタルバイオレット染色法で確認したものである。 図２９は、ＳＫＯＶ３ｉｐ１とＳＫＯＶ３−ＴＲにシスプラチン単独、ＢＧＪ３９８単独またはシスプラチンとの併用投与による変化をクリスタルバイオレット染色分析法で分析したものである。 図３０は、ＳＫＯＶ３ｉｐ１とＳＫＯＶ３−ＴＲにシスプラチン単独、ＢＧＪ３９８単独またはシスプラチンとの併用投与による変化をクリスタルバイオレット染色分析法で分析したものである。 図３１は、ＳＫＯＶ３ｉｐ１とＳＫＯＶ３−ＴＲにシスプラチン単独、ＢＧＪ３９８単独またはシスプラチンとの併用投与による変化をクリスタルバイオレット染色分析法で分析したものである。

本発明は、下記化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む転移性卵巣癌、子宮内膜癌もしくは乳癌の予防または治療用の薬学的組成物に関する。

化学式１の化合物であるＢＧＪ３９８（CAS Number：872511-34-7）は、ＦＧＦＲ阻害剤であり、ＦＧＦＲ１〜４のすべてを標的とすることができる。その化学式は、Ｃ_２６Ｈ_３１Ｃｌ_２Ｎ_７Ｏ_３であり、３−（２，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−１−［６−［４−（４−ｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１ｙｌ）ａｎｉｌｉｎｏ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−４−ｙｌ］−１−ｍｅｔｈｙｌｕｒｅａの名称を持つ。

本発明に係る化学式１の化合物の薬学的に許容可能な塩において、塩の種類は、化合物の生物学的有効性および特性を保有する様々な塩を制限なく含むことができる。例えば、薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸及び有機酸、例えば、アセテート、アスパルテート、ベンゾエート、ベシレート、バイカーボネート、カーボネート、バイスルファート、スルファート、カンファースルホネート、クロライド、ヒドロクロライド、クロルテオ フィリネート、シトレート、エタンジスルホネート、フマレート、オキサレート、パルミテート、パモエート、ホスフェート、水素ホスフェート、二水素ホスフェート、プロピオネート、ステアレート、スクシナート、サリチレート、タルトレート、トシレート、およびトリフルオロアセテート塩などを含む。塩を誘導できる無機酸は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などを含む。本発明のＢＧＪ３９８またはその薬学的に許容可能な塩の好ましい一例としては、リン酸塩が挙げられる。

本明細書で「転移性卵巣癌」（metastatic ovarian cancer）とは、卵巣表面上皮に由来して付着する原発性卵巣癌とは異なり、癌細胞が腹腔に転移した卵巣癌を意味する。末期転移性卵巣癌細胞は、腹水中で球形体（スフェロイド；spheroid）形態で存在することを特徴とする。

卵巣癌の病期を転移程度によって定義すると、「卵巣癌３期」は、腹腔内に癌が転移した状態であって、腹腔内に位置している肝臓、大腸、小腸、膀胱、腹腔、腹膜内リンパ節などに転移がある状態を言う。「卵巣癌４期」は、癌細胞が腹腔外に広がって肺、骨、首、脳の周囲のリンパ節などの他の臓器に転移した状態を言い、これを遠隔転移ともいう。

本明細書で「子宮内膜癌」（endometrial cancer）とは、子宮内の空間を覆っている子宮内膜に発生する癌を意味するものである。子宮内膜癌の病期を転移程度によって定義すると、「子宮内膜癌３期」は、癌が子宮周囲の組織に広がっているが、骨盤外には転移せず、膀胱や直腸を浸透していない状態であって、漿膜、卵巣、卵管、膣、骨盤壁、大動脈周囲のリンパ腺などに転移がある状態を言う。「子宮内膜癌４期」は、癌が膀胱や直腸を浸透しているか、骨盤の外に転移した状態を言う。

本明細書で「乳癌」（breast cancer）とは、乳房に発生した癌を意味するものである。乳癌の病期を転移程度によって定義すると、「乳癌３期」は、脇の下のリンパ節に転移があり、しかもリンパ節が互いにがっちりと癒着していたり周辺の組織に固定している状態、または鎖骨の上下にあるリンパ節に転移がある状態を言う。「乳癌４期」は、骨、肺、肝臓、脳などの臓器に遠隔転移がある状態を言う。

本発明に係る化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、癌細胞のスフェロイド（spheroid）形態を分解することができる。

本明細書で癌細胞のスフェロイド形態とは、癌細胞が形成した球形の塊である球形体を意味するものであり、細胞が三次元的な３Ｄ集合体を成している構造を言う。本明細書で「スフェロイド」とは、スフィア、球形体、球形と相互交換して使用することができ、楕円体、球体なども制限なく含む意味で使用することができる。本発明者らは、癌細胞を、転移性癌のような状態に誘導するために３Ｄ培養したとき、癌細胞がスフェロイド形態を形成して浮遊形態をなすことを確認した。また、このスフェロイド凝集形態を維持する癌細胞は、他の抗癌剤を処理した場合とは異なり、化学式１の化合物の処理によって正常の凝集形態を維持せず、スフェロイド形態が分解されることを確認した。したがって、本発明の薬学的組成物は、癌細胞の少なくとも一部がスフェロイド形態をなす癌に対して薬効を示す薬学的組成物であり得る。

化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、腹水中にスフェロイド形態で浮遊する微細環境を有する転移性卵巣癌細胞を反映できる３Ｄ培養された卵巣癌細胞において、スフェロイド形態の維持を阻害し、細胞生存性シグナル伝達経路を抑制することにより、一般的な付着型原発性卵巣癌よりも転移性卵巣癌に特異的な抗癌効果を示すことができる。したがって、本発明の薬学的組成物は、例えば３期または４期の卵巣癌の予防または治療用に使用することができる。

また、化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、ＡＫＴ及びＳＴＡＴ３のリン酸化を抑制できるため、ＦＧＦＲ（fibroblast growth factor receptor）のリン酸化が増加していることを特徴とする転移性卵巣癌を予防または治療することができる。

本発明では、３Ｄ球形培養により実現した転移性卵巣癌細胞では、細胞増殖ではない細胞生存性シグナルが増加していることを確認し、特に、細胞生存シグナル分子であるＡＫＴ及びＳＴＡＴ３のリン酸化が非常に高く示されることを確認した。また、このリン酸化の増加は、一般的な２Ｄ単一培養を通じて確認した付着培養卵巣癌細胞では確認されず、転移性卵巣癌の細胞生存にＡＫＴ及びＳＴＡＴ３シグナル機序が用いられていることを確認した。この増加したＡＫＴ及びＳＴＡＴ３リン酸化およびＦＧＦＲリン酸化は、化学式１の化合物の処理により減少し、これにより、転移性癌細胞の細胞死滅効果を奏することができる。

したがって、本発明は、化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩がＡＫＴ及びＳＴＡＴ３のリン酸化を抑制することを特徴とする、卵巣癌の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。前記転移性卵巣癌は、ＦＧＦＲ（fibroblast growth factor receptor）のリン酸化が増加していることを特徴とする、卵巣癌の予防または治療用の薬学的組成物を提供することができる。

また、本発明において、前記転移性卵巣癌、子宮内膜癌もしくは乳癌は、化学抗癌剤に対する抵抗性癌であってもよく、この抵抗性は、化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩の処理によって減少することができる。

化学抗癌剤は、当該分野で広く使用されるものとして、例えば、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、リツキシマブ、エルロチニブ、トラスツズマブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、スニチニブ、カルボプラチン、ソラフェニブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ビスカムアルバム、アスパラギナーゼ、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ダサチニブ、エストラムスチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、ヘプタプラチン、メチルアミノレブリン酸、アムサクリン、アレムツズマブ、プロカルバジン、アルプロスタジル、硝酸ホルミウムキトサン、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、ペメトレキセド、テガフール、カペシタビン、ギメラシン、オテラシル、アザシチジン、シタラビン、フルダラビン、エノシタビン、デシタビン、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、カルモフール、ラルチトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、ベロテカン、トポテカン、ビノレルビン、エトポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、グリセオフルビン、テニポシド、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ペプロマイシン、テモゾロミド、ブスルファン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、アルトレタミン、ダカルバジン、チオテパ、ニムスチン、クロラムブシル、ミトラクトール、タキソテレ、グリベック、タキソール、ハーセプチン、タルセバ、アバスチン、ゾラデックス、アドリアマイシン、イリノテカン（irinotecan）、１００５８‐Ｆ４、シスプラチン（cisplatin）、シクロホスファミド（cyclophosphamid）、ニトロソウレア‐基盤抗癌剤、メトトレキサート（Methotrexate）、ドキソルビシン（doxorubicin）などであってもよい。

具体的には、化学抗癌剤は、有糸分裂阻害剤またはアルキル化剤であってもよい。有糸分裂阻害剤は、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、コルヒチン、グリセオフルビンであってもよい。アルキル化剤は、例えばシスプラチンであってもよい。より具体的には、パクリタキセルであってもよい。

本明細書で「抵抗性」とは、化学抗癌剤を処理した場合に、期待される程度の癌細胞死滅の効果が示されないことを意味する。癌細胞の少なくとも一部がスフェロイド（spheroid）形態である場合には、そうでない付着性癌細胞と比較して、化学抗癌剤に高い抵抗性を示し得る。前述のように、化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、癌細胞のスフェロイド形態を分解することができ、この化学抗癌剤抵抗性癌に対しても優れた薬効を示すことができる。必要に応じて、本発明の薬学的組成物は、化学抗癌剤と併用投与することができる。前述のように、本発明の薬学的組成物は、化学抗癌剤耐性癌に対しても優れた薬効を示すため、化学抗癌剤と併用してその薬効を最大限にすることができる。併用する化学抗癌剤としては、前述した化学抗癌剤の少なくとも１種が挙げられる。

併用時の投与順序は特に限定されず、化学抗癌剤と同時または順次に投与することができる。

本発明の組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。本発明の薬学的組成物に含まれて許容される担体は、製剤時に通常使用されるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイル、生理食塩水、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）または培地などを含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の薬学的組成物は、前記成分に加えて潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでいてもよい。

本発明の薬学的組成物は、経口または非経口投与することができ、好ましくは経口投与することができる。

本発明の薬学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、疾病症状の程度、食物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性などの要因によって多様に処方されてもよい。

また、本発明は、化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む転移性卵巣癌、子宮内膜癌もしくは乳癌に対する抗癌補助剤に関する。

本明細書で「抗癌補助剤」とは、化学抗癌剤と併用使用して抗癌剤の薬効を補助／改善するものである。前述のように、化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、癌細胞の抗癌剤抵抗性／耐性を遮断することができ、化学抗癌剤と併用使用して抗癌の薬効を最大化することができる。

併用する化学抗癌剤としては、前述した化学抗癌剤の少なくとも１種を例示することができる。併用時の投与順序は特に限定されず、化学抗癌剤と同時または順次に投与することができる。

また、本発明は、化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む転移性卵巣癌、子宮内膜癌もしくは乳癌の予防または改善用の健康機能食品に関する。

本明細書で「健康機能食品」とは、病気の予防または改善、生体防御、免疫、病後の回復、老化抑制などの生体調節機能を有する食品を言い、長期服用しても人体に無害なものでなければならない。

本発明の健康機能食品を適用できる転移性卵巣癌、子宮内膜癌もしくは乳癌は、前述と同様である。

化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、それ自体として健康機能食品に製剤化してもよく、食品に添加してもよい。

食品に添加する場合には、それをそのまま添加するか、他の食品または食品成分と共に使用することができ、通常の方法によって適宜使用できる。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）によって適宜決定することができる。一般的に、食品または飲料の製造時、化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、原料に対して１５重量％以下、好ましくは１０重量％以下の量で添加される。しかし、健康および衛生を目的にするか、または健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記範囲以下であってもよく、安全性の面で何ら問題がないので、有効成分は、前記範囲以上の量でも使用することができる。

前記食品の種類は、特に制限されない。前記物質を添加できる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料およびビタミン複合剤などがあり、通常の意味での健康食品をすべて含む。

本発明の健康飲料組成物は、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。前述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖などのモノサッカライド、マルトース、スクロースなどのジサッカライド、およびデキストリン、シクロデキストリンなどの天然甘味剤や、サッカリン、アスパルテームなどの合成甘味剤などを使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、一般的に本発明の組成物１００ｍｌあたりに約０．０１〜１０ｇ、好ましくは約０．０１〜０．１ｇである。

前記の他、本発明の健康機能食品は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含むことができる。

その他、本発明の健康機能食品は、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料、および野菜飲料を製造するための果肉を含むことができる。これらの成分は、独立にまたは組み合わせて使用することができる。これらの添加剤の割合は、大きく重要ではないが、本発明の健康機能食品１００重量部あたりに０．０１〜０．１重量部の範囲で選択するのが一般的である。

また、本発明は、化学式１の化合物またはその薬学的に許容される塩を個体に投与することを含む、転移性卵巣癌、子宮内膜癌もしくは乳癌の治療方法に関する。

個体は、好ましくはヒトを含む哺乳類であり、癌治療を必要とする患者であって、癌治療中の患者、癌治療を受けたことがある患者、癌治療を受ける必要がある患者のすべてを含み、癌治療のために癌を摘出する外科的手術を受けた患者も含まれる。

本発明の治療方法を適用できる転移性卵巣癌、子宮内膜癌もしくは乳癌は、前述と同様である。

本発明の治療方法は、前記化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を化学抗癌剤と併用投与することができる。

本発明の治療方法が適用される癌は、化学抗癌剤抵抗性癌であり得る。化学抗癌剤の併用投与を決定する前に、個体の癌が化学抗癌剤抵抗性癌であるかどうかを確認し、化学抗癌剤抵抗性癌と確認された場合、前記化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を化学抗癌剤と併用投与することができるが、これに限定されるものではない。

併用できる化学抗癌剤としては、前述した化学抗癌剤の少なくとも１種が挙げられる。併用時の投与順序は特に限定されず、化学抗癌剤と同時または順次に投与することができる。

化学式１の化合物またはその薬学的に許容される塩は、前述したように、有効成分以外の成分と共に組成物として投与することができる。これは経口または非経口投与であってもよく、好ましくは経口投与であってもよい。

適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、疾病症状の程度、食物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性などの要因によって多様に処方されてもよい。

また、本発明は、転移性卵巣癌、子宮内膜癌もしくは乳癌の予防または治療用医薬の製造における化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩の用途に関する。

本発明の用途における転移性卵巣癌、子宮内膜癌もしくは乳癌は、前述と同様である。

前述のように、化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、転移性卵巣癌、子宮内膜癌もしくは乳癌に対して優れた薬効を示し、その予防または治療用医薬の製造に使用することができる。

本発明に係る医薬は、前述した薬学的組成物であってもよい。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明の内容を限定するものではない。

すべての統計的分析は、３回の独立した実験により行った。各群間の差をｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ-ｔｅｓｔを用いて計算し、ｐ≦≦０．０５を有意なものと見なした。すべてのグラフは、平均および標準偏差で示した。

実施例１．２Ｄ単層培養モデルおよび３Ｄ球形培養モデルにおけるＳＫＯＶ３ｉｐ１卵巣癌細胞の比較
１．１ ２Ｄ単層培養（2D mono‐layer culture）および３Ｄ球形培養（3D Sphere culture）の方法
卵巣癌細胞株としては、ＳＫＯＶ３卵巣癌細胞株を母細胞とするＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞株を使用した。ＳＫＯＶ３細胞株は、ヒトの卵巣の腹水から分離した転移性卵巣癌の特徴を持ち、動物モデルとして使用されるヌードマウスの腹腔内で１次増殖された後に分離された細胞株であって、腹腔転移能力が非常に高い細胞株である。ＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞株は、Ｓｏｏｄ ＡＫ教授（University of Texas MD Anderson Cancer Center、USA）から提供され、以降の実験で使用した。

２Ｄ単層培養は、以下のような方式で行った：細胞は、１０％牛胎児血清（Gibco、NY、USA）及び１０Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）が補充されたＲＰＭＩ １６４０（Corning、NY、USA）培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２加湿化された雰囲気で培養した。

３Ｄ球形培養（sphere culture）のために、ＳＫＯＶ３ｉｐ１ ｃｅｌｌｓ（１×１０^６）を、超低付着６−ウェルプレート（Corning NY、USA）に分注し、１０％牛胎児血清（Gibco、NY、USA）及び１０Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）が補充されたＲＰＭＩ １６４０培地を用いて、５％ＣＯ_２培養器で培養した。
１．２ 培養方法による形態学的分析
ＳＫＯＶ３ｉｐ１卵巣癌細胞を２Ｄ単層培養（２Ｄ ＭＣ）と３Ｄ球形培養（３Ｄ ＳＣ）に分けて培養し、培養方式によって異なる形態を示すかどうかを観察するために顕微鏡分析を行った。その結果を図１に示す。

図１に示すように、２Ｄ単層培養では凝集体が形成されなかったが、３Ｄ球形培養の７２時間後には、ＳＫＯＶ３ｉｐ１卵巣癌細胞が緩いシート状の凝集体を形成し、稠密なスフェロイド形態で蓄積されることを確認した。この結果は、２Ｄ単層培養と３Ｄ球形培養は、異なる形態の細胞を誘導できること、および３Ｄ球形培養の場合には、付着した状態ではなく、腹腔内の腹水中に浮遊する形で存在する転移した状態の卵巣癌の形態を反映できることを示す。

１．３ 培養方法による細胞生存シグナル変化の分析
２Ｄ単層培養（２Ｄ ＭＣ）と３Ｄ球形培養（３Ｄ ＳＣ）によって、細胞の生存に関与するシグナル伝達経路の変化が示されるかどうかを確認するために免疫染色法を行った。より具体的には、ＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞（１×１０^６）をそれぞれ１．１の２Ｄ単層培養または３Ｄ球形培養方法によって培養した後、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ３、ｐ４２／４４ ＥＲＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫを含む細胞性シグナル分子の発現を確認し、単層及び球形培養細胞における活性化状態を比較した。単層培養または球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞を収穫し、ｉｃｅ−ｃｏｌｄ １Ｘ リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄し、１００μｌ ｉｃｅ−ｃｏｌｄ ＲＩＰＡ緩衝液（20mM Tris‐Cl、pH8.0、125mM NaCl、100mM phenylmethylsulfonyl fluoride、1mM ethylene diamine tetraacetic acid、1％ Triton X‐100、0.5％ sodium deoxycholate、0.1％ sodium dodecyl sulfate、1X complete protease inhibitor cocktail（Roche、Mannheim、Germany））を用いて、氷上で溶解させた。タンパク質濃度をブラッドフォードタンパク質分析キット（Biorad、CA、USA）を用いて分析し、同じ量のタンパク質（３０μg）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移動させた後、ホースラディッシュ過酸化接合二次抗体および特異的抗体を用いた免疫染色法を行った。免疫活性化バンドは、フュージョン ソロ ケミルミネッセンス アナライザー（Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｏｌｏ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎａｌｙｚｅｒ）（Vilber Rourmat Marne la Vallee、France）を用いたスーパーシグナル ウエスト ピコ ケミルミネッセンス基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Thermo、IL、USA）によって検出した。ＳＴＡＴ３（Ｈ−１９０）、Ｔｙｒ ７０５でリン酸化されたＳＴＡＴ３（Ｂ−７）およびＡｃｔｉｎ（Ｃ−２）に対する抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入して使用した。ＡＫＴ、Ｓｅｒ ４７３でリン酸化されたＡＫＴ（Ｄ９Ｅ）、Ｔｙｒ ６５３／６５４でリン酸化されたＦＧＦＲ１、ｐ４２／４４ ＭＡＰＫ、リン酸化されたｐ４２／４４ ＭＡＰＫ、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＴｙｒ １８０／１８２でリン酸化されたｐ３８ＭＡＰＫに対するウサギ単クローン抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（MA、USA）から購入して使用した。ＨＲＰと接合されたゴート抗マウス及びウサギ二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入して使用した。実験に使用されたＢＧＪ３９８（against FGFR1／2／3）は、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（USA）から購入して使用した。

ＡＫＴ、ＳＴＡＴ３、ｐ４２／４４ ＥＲＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫを含む細胞増殖に関与する細胞性シグナル分子の発現を確認し、単層および球形培養細胞で活性化状態を比較した結果を図２に示す。

図２に示すように、免疫染色法を行った結果、ｐ４２／４４ ＥＲＫ、ＡＫＴ及びＳＴＡＴ３のリン酸化は、２Ｄ単層培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞より、球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞において活性化されていることを確認した。また、リン酸化されたＦＧＦＲ１は、球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞で上向き調節されたことを確認した。この結果は、球形培養条件がＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞で生存性シグナル伝達経路（pro−survival signaling pathway）を上向き調節することを示し、卵巣癌細胞株の転移微小環境を実現した球形増殖環境がＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞株の細胞生存（cell survival）を維持するのにＡＫＴとＳＴＡＴ３のシグナル機序を利用していることを示すものである。

３Ｄ球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞で生存性シグナル伝達経路が上向き調節されたということは、増殖状態ではなく生存性の状態で存在する転移した状態の卵巣癌の状態を反映することであり、先に確認した実施例１．２の形態学的特性とも一致する結果である。

実施例２．ＢＧＪ３９８による球形培養ＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞の生存率減少
ＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞に選択的なｐａｎ−ＦＧＦＲ阻害剤ＢＧＪ３９８の処理が影響を与えるがどうかを確認するために、それぞれの培養環境で培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞にＢＧＪ３９８を処理し、それによる細胞生存率を確認した。また、チロシンキナーゼ阻害剤ＴＡＥ６８４（NVP−TAE684、CAS761439−42−3）とグリベックとも知られているイマチニブ（imatinib）、そして標準抗卵巣癌化学治療剤であるパクリタキセルを用いて、ＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞で抗腫瘍活性を比較した。実験に使用されたＴＡＥ６８４（against ALK）およびイマチニブ（imatinib）（against Abl）は、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（USA）から、ＡＧ４９０（against JAK、CAS133550‐30‐8）は、Ｔｏｃｒｉｓ（Bristol、UK）から購入した。

単層培養および球形培養された細胞モデルにおける細胞生存率を確認するために、クリスタルバイオレット染色法を行った。単層培養されたモデルでクリスタルバイオレット染色を行うために、ＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞（５×１０^４）を常用の２４ウェルプレートに分注し、一晩培養した。その後、薬物を各ウェルに実験に必要な濃度だけ注入し、７２時間追加培養した。３００マイクロリットルの０．２％クリスタルバイオレット溶液を各ウェルに添加し、穏やかに攪拌しながら２０分間追加培養した。染色された細胞をきれいな背景が確認できるまで蒸留水で洗浄した。比色計で分析するために、クリスタルバイオレット染色剤を１％ＳＤＳ／ＰＢＳで抽出し、吸光度を５７０ｎｍの波長でＥＭａｘ ＰＬＵＳ マイクロプレートリーダー（Molecular Device、USA）で測定した。

球形培養された細胞における細胞生存率を分析するために、ＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞（５×１０^４）を超低付着の２４ウェルプレートに分注し、一晩培養した。各ウェルの細胞を収穫し、常用の２４ウェルプレートに移動させて１２時間追加培養した。付着した可視化された細胞を０．２％クリスタルバイオレット溶液で穏やかに攪拌しながら２０分間染色した。染色された細胞を蒸留水で洗浄し、比色計で分析するために、クリスタルバイオレット染色剤を１％ＳＤＳ／ＰＢＳで抽出し、吸光度を５７０ｎｍの波長でＥＭａｘ ＰＬＵＳ マイクロプレートリーダー（Molecular Device、USA）で測定した。

単層または球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞を様々な濃度のチロシンキナーゼ阻害剤およびパクリタキセルで７２時間処理した。細胞生存率は、クリスタルバイオレット比色計を用いて確認した。結果を図３に示す。

図３に示すように、単層培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞生存率は、パクリタキセルとＴＡＥ６４８によって容量依存的に減少した。しかし、単層培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１の細胞生存率は、ＢＧＪ３９８およびイマチニブによっては影響を受けなかった。特に球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１の細胞は、明らかに、単層培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞よりもパクリタキセルにさらに抵抗性を示すことを確認した。ＴＡＥ６４８抵抗性は、球形培養ＳＫＯＶ３ｉｐ１において確認されなかった。イマチニブもまた、球形培養ＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞の生存率に影響を与えなかった。ＢＧＪ３９８は、単層培養であるか、球形培養であるかによって、ＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞の生存率に異なる効果を示した。ＢＧＪ３９８は、球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞特異的に非常に低い濃度でも細胞死滅効果を示しただけでなく、容量依存的に細胞生存率を減少させた。

また、パクリタキセルまたは各種の阻害剤を処理してから７２時間後の細胞生存率をクリスタルバイオレット染色により可視化した結果を図４に示す。クリスタルバイオレット染色された細胞を観察した図４の結果もまた、比色分析の結果を裏付けている。

ＢＧＪ３９８を単層培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞に処理した場合、５μＭまで濃度を高めても細胞毒性を示さなかったが、３次元球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞では、３日目で１ｕＭの処理だけで細胞毒性が現れ、濃度依存的に細胞毒性が増加する結果を確認した。つまり、ＢＧＪ３９８は、付着性癌を反映する２Ｄ単層培養の卵巣癌細胞では抗癌活性を示さないが、３Ｄ球形培養された卵巣癌細胞、すなわち、転移性卵巣癌細胞では特異的に高い抗癌活性を示す。

また、単層培養（２Ｄ ＭＣ）または３Ｄ球形培養（３Ｄ ＳＣ）と５μＭ ＢＧＪ３９８（ＢＧＪ）、３μＭ ＴＡＥ６４８（ＴＡＥ）、および５μＭ イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）（ＩＭＴ）の処理によるＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞の凝集形態を確認した結果を図５に示す。

図５に示すように、ＢＧＪ３９８処理された球形培養ＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞では、正常な凝集状態が維持されなかった。これに対し、ＴＡＥ６８４およびイマチニブで処理された球形培養ＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞では、スフェロイドの分解が観察されなかった。この結果は、ＢＧＪ３９８がスフェロイドを形成する転移性卵巣癌ＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞に対する潜在的な化学抗癌治療剤になり得ることを示し、卵巣癌の転移微小環境を反映する球形培養で特異的に細胞毒性を誘導できることを示す。

実施例３．ＢＧＪ３９８のＡＫＴ及びＳＴＡＴ３リン酸化抑制効果の確認
実施例２から、ＢＪＧ３９８が転移微小環境である球形培養で特異的に優れた抗癌活性を示すことを確認した。そこで、ＢＪＧ３９８がどのような細胞シグナル機序を用いて、スフィア培養環境で特異的に細胞毒性を誘導するのかを調べるために、細胞の生存と増殖に関連する様々な因子の発現及び活性をウエスタンブロットにより確認した。

球形培養ＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞において、細胞生存シグナル分子であるＡＫＴ及びＳＴＡＴ３が活性化されていることを前記の実施例１から確認した。そこで、ＢＧＪ３９８が、球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞においてＡＫＴ及びＳＴＡＴ３の状態を変化させることができるかどうかを確認するために、単層（ＭＣ）または球形培養（ＳＣ）されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞にＢＧＪ３９８を５μＭ処理し、それによるリン酸化程度の変化を確認した。

また、球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１を５μＭ ＢＧＪ３９８（ＢＧＪ）、３μＭ ＴＡＥ６４８（ＴＡＥ）、および５μＭ イマチニブ（ＩＭＴ）で処理し、７２時間後に細胞溶解物を得た。これに対して免疫染色法を行い、ＡＫＴ及びＳＴＡＴ３の活性化細胞性発現をそれに対する抗体で分析した。また、ＦＧＦＲ１のリン酸化レベルをＢＧＪ処理群の陽性対照群で示した。アクチンは、ローディング対照群として用いた。結果を図６に示す。免疫染色分析方法は、実施例１と同様に行った。

図６に示すように、免疫染色分析の結果は、ＢＧＪ３９８が球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞でリン酸化されたＡＫＴをＳｅｒ ４７３残基で抑制させることを示す（Ａ）。これに対し、ＴＡＥ６８４およびイマチニブは、このような効果を示さなかった（Ｂ）。この結果は、ＢＧＪ３９８が単層培養ではなく、球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞で活性化されたＡＫＴ及びＳＴＡＴ３シグナル伝達経路を特異的に抑制することを示す。つまり、ＢＧＪ３９８を球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１に処理した場合、球形培養で活性化されたＡＫＴとＳＴＡＴ３のリン酸化が再び抑制されていることを確認した。これは卵巣癌転移環境で活性化されたＡＫＴ、ＳＴＡＴ３のリン酸化がＢＧＪ３９８によるＦＧＦＲシグナル機序の阻害により再び抑制されていることを示すものである。２次元単層培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１の場合には、増加されるＡＫＴとＳＴＡＴ３のリン酸化も観察されず、ＢＧＪ３９８によるリン酸化の減少および細胞毒性も示さなかった。

球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞の細胞生存がＢＧＪ３９８処理により抑制されるので、この細胞生存率の抑制がＪＡＫ／ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路を介して媒介されるかどうかを追加的に確認した。そのために、選択的なＪＡＫチロシンキナーゼ阻害剤ＡＧ４９０を単層または球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞に、濃度を３．１２５〜５０μＭまで変化させて処理した。７２時間後、細胞生存率およびＡＫＴとＳＴＡＴ３の状態の活性化に影響するかどうかを、クリスタルバイオレット染色および免疫染色分析法により確認した。その結果を図７に示す。アクチンは、ローディング対照群として使用した。

図７に示すように、ＡＧ４９０の処理は、球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞の細胞成長を抑制しなかった（Ａ）。また、ＡＫＴ及びＳＴＡＴ３のリン酸化もまた、球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞でＡＧ４９０の処理により抑制されなかった（Ｂ）。この結果は、ＢＧＪ３９８がＪＡＫ／ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路とは無関係に、主な生存シグナル分子ＡＫＴ及びＳＴＡＴ３活性化の抑制により、球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１の細胞成長を効果的に抑制することを示す。

実施例４．癌細胞株別のＢＧＪ３９８の薬効の確認
下記表１の癌細胞株に対して、追加的にパクリタキセルおよびＢＧＪ３９８の相乗効果を確認した。前述の実施例と同様に、各細胞株を２Ｄ単層培養と３Ｄ球形培養に分けて培養し、ＢＧＪ３９８の投与による変化を形態学的分析、クリスタルバイオレット染色分析法で分析した。本実験のすべての細胞株は、ＡＴＣＣから購入して使用した。この詳細は、表１に示す。

子宮内膜癌細胞株ＨＥＣ１Ｂの結果は図９、１０、１１に、卵巣癌細胞株Ｈｓ５７８Ｔの結果は図１２、１３、１４に示す。

図９〜１２を参照すると、球形培養された子宮内膜癌細胞株および乳癌細胞株において、ＳＫＯＶ（卵巣癌）細胞株と同様に、ＢＧＪ３９８投与時の細胞死滅を確認することができる。

実施例５．癌細胞株別のパクリタキセルおよびＢＧＪ３９８の相乗効果の確認
５．１ ＳＫＯＶ３ｉｐ１
ＢＧＪ３９８が３次元球形培養卵巣癌細胞に効果的な抗癌剤として作用できることを確認した。そこで、既存の卵巣癌の一次的抗癌治療剤として使用されるパクリタキセルと共に投与した場合に、パクリタキセルに対する球形培養された細胞の抵抗性を克服し、抵抗性を改善できるかどうかを確認した。つまり、ＢＧＪ３９８およびパクリタキセルの組み合わせが、球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞の死滅に相乗効果を示すかどうかを確認するために、連続希釈されたパクリタキセルと投与量を０、１．２５及び５μＭに変更したＢＧＪ３９８との組み合わせを球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１に処理し、７２時間後にクリスタルバイオレット比色分析を行った。その結果を図８に示す。

図８に示すように、パクリタキセルとＢＧＪ３９８を併用処理した球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞は、パクリタキセル単独で処理した細胞と比較して高い細胞死滅が確認された。より具体的には、３次元培養ＳＫＯＶ３ｉｐ１に濃度別にパクリタキセルのみを処理したグループと、ＢＧＪ３９８を１．２５と５μＭで処理したグループの２つのグループを比較したところ、ＢＧＪ３９８を処理したグループが処理していないグループに比べて、パクリタキセルに対する敏感性を濃度依存的に高めていることを確認した。これにより、パクリタキセルとＢＧＪ３９８を併用投与した場合、球形培養されたＳＫＯＶ３ｉｐ１卵巣癌細胞を効果的に死滅できることを確認した。これは、卵巣癌の転移微小環境である３次元球形培養で、ＢＧＪ３９８を用いた繊維芽細胞増殖因子の活性抑制が転移性卵巣癌の増殖抑制に非常に効果的であることを示すものである。つまり、ＢＧＪ３９８は、転移性卵巣癌の状態を反映できる球形培養された卵巣癌細胞において、効果的な抗癌効果を示すことができる。

５．２ その他の細胞株
下記表２の癌細胞株に対して、追加的にパクリタキセルおよびＢＧＪ３９８の相乗効果を確認した。前述の実施例と同様に、各細胞株を２Ｄ単層培養と３Ｄ球形培養に分けて培養し、ＢＧＪ３９８単独またはパクリタキセルとの併用投与による変化を形態学的に分析した。子宮内膜癌細胞株ＨＥＣ１Ｂと乳癌細胞株Ｈｓ５７８Ｔ細胞株の３Ｄ球形培養の両方において、細胞スフィアが崩れ、単一細胞化が誘導される細胞毒性が観察された。図１０及び１３に示すように、子宮内膜癌細胞株ＨＥＣ１Ｂと乳癌細胞株Ｈｓ５７８Ｔ細胞株の２Ｄ単層培養でパクリタキセルとの併用投与によるパクリタキセルの抗癌効果がＢＧＪ３９８によって増進されることが確認された。

ＨＥＣ１Ｂの結果は図９、１０、１１に、Ｈｓ５７８Ｔの結果は図１２、１３、１４に示す。

図９〜１３を参照すると、球形培養された子宮内膜癌細胞株、乳癌細胞株において、ＳＫＯＶ（卵巣癌）細胞株と同様に、ＢＧＪ３９８単独投与時の細胞死滅が確認された。図１０、１１および図１３、１４から分かるように、パクリタキセルと併用投与時に細胞死滅がさらに増加した。

前述の結果をまとめると、ｐａｎ−ＦＧＦＲ阻害剤であるＢＧＪ３９８は、転移性卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌に対して非常に効果的な治療剤として使用でき、卵巣癌細胞のスフェロイドの維持にＦＧＦＲが特異的な生存促進の役割を果たすことをターゲットにして転移性卵巣癌のスフェロイドの分解を促進した。これにより、転移性卵巣癌を死滅できることが分かった。

実施例６．ＳＫＯＶ３／ＳＫＯＶ３−ＴＲに対するパクリタキセルおよびＢＧＪ３９８の相乗効果の確認
６．１ ＳＫＯＶ３／ＳＫＯＶ３−ＴＲのパクリタキセル抵抗性の比較
ＳＫＯＶ３−ＴＲ（Taxol Resistant）は、ＳＫＯＶ３卵巣癌細胞株を母細胞にし、パクリタキセルの漸進的な濃度増加処理で長期間培養して作成したパクリタキセル抵抗性の卵巣癌細胞株である。ＳＫＯＶ３−ＴＲ細胞株は、ＭＤ−Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ（USA）のＳｏｏｋ ＡＫから分譲を受けて使用した。

ＳＫＯＶ３とＳＫＯＶ３−ＴＲのパクリタキセルに対する抵抗性を、前述の方法によりクリスタルバイオレット比色分析で細胞生存率を測定することによって確認した。実験は３回行った。結果の差は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔで計算した。

図１５を参照すると、ＳＫＯＶ３−ＴＲ細胞株のパクリタキセルに対する抵抗性がＳＫＯＶ３細胞株に比べて顕著に高いことが確認できる。

６．２ パクリタキセル抵抗性細胞株ＳＫＯＶ３−ＴＲにおけるＢＧＪ３９８のパクリタキセルの抗癌増進効果
前述の実施例と同様に、各細胞株を２Ｄ単層培養と３Ｄ球形培養に分けて培養し、パクリタキセル単独、ＢＧＪ３９８単独またはパクリタキセルとの併用投与による変化を形態学的分析、クリスタルバイオレット染色分析法で分析した。

図１６は、ＳＫＯＶ３−ＴＲ卵巣癌細胞にパクリタキセル（ＰＴＸ）単独またはＢＧＪ３９８、ＴＡＥ６８４およびＡＧ４９０を併用して処理し、それによる細胞の生存率を可視化したものである。これを参照すると、パクリタキセル単独処理時に比べてＢＧＪ３９８との併用処理時に顕著に改善された抗癌活性を確認することができる。

図１７は、パクリタキセル抵抗性細胞株ＳＫＯＶ３−ＴＲを２Ｄ単層培養と３Ｄ球形培養に分けて培養し、卵巣癌細胞にパクリタキセル単独、ＢＧＪ３９８単独またはパクリタキセルとの併用投与時の細胞生存率を示すものである。これを参照すると、両培養法とも、ＢＧＪ３９８のパクリタキセルとの併用処理時において、さらに改善された抗癌活性を示すことを確認することができる。

図１８は、ＳＫＯＶ３−ＴＲ卵巣癌細胞にパクリタキセル処理によるＢＧＪ３９８の濃度依存的な抗癌効果があるかを調べたものであり、パクリタキセル単独、ＢＧＪ３９８単独またはパクリタキセルとの併用投与時の細胞生存率を示す。これを参照すると、パクリタキセル単独処理時には抗癌活性が微々たるものであるが、ＢＧＪ３９８を併用処理すると抵抗性が遮断され、ＢＧＪ３９８の処理濃度が高くなるほど抗癌活性を示すことを確認することができる。

図１９は、ＳＫＯＶ３−ＴＲ卵巣癌細胞にＢＧＪ３９８処理によるパクリタキセルの濃度依存的な抗癌効果があるかを調べたものであり、パクリタキセル単独、ＢＧＪ３９８単独またはパクリタキセルとの併用投与時の細胞生存率を示す。これを参照すると、パクリタキセル単独処理時には、抗癌活性が微々たるものであるが、ＢＧＪ３９８を併用処理すると抵抗性が遮断され、パクリタキセルの処理濃度が高くなるほど抗癌活性を示すことを確認することができる。

図２０は、ＳＫＯＶ３−ＴＲ卵巣癌細胞にパクリタキセル単独、ＢＧＪ３９８単独またはパクリタキセルとの併用投与による細胞形態学的変化を顕微鏡で分析したものである。ＳＫＯＶ３−ＴＲ細胞において、２．５μＭのＢＧＪ３９８の処理と５０ｎＭのパクリタキセルの処理は、細胞毒性が微々たるもので形態的な変化が観察されなかったが、２つの薬物の併用処理時は、細胞毒性により解離（ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ）現象と不定形細胞化が示されることを確認することができる。

図２１は、ＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞株から漸進的なパクリタキセルの濃度上昇処理により、本研究室で作成したパクリタキセル抵抗性卵巣癌細胞株を示す。ＳＫＯＶ３ｉｐ１−ＴＲ卵巣癌細胞における、パクリタキセル単独、ＢＧＪ３９８単独またはパクリタキセルとの併用投与による細胞の形態変化を示すものであり、ＢＧＪ３９８を併用処理すると、パクリタキセル抵抗性が遮断され、抗癌活性が高くなることを確認することができる。

図２２は、ＳＫＯＶ３−ＴＲ卵巣癌細胞にパクリタキセル単独、ＢＧＪ３９８単独またはパクリタキセルとの併用投与による細胞毒性の程度をＦＡＣＳ分析で表したものであり、細胞内のＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔをプロピジウムヨウ化物（propidium iodide、ＰＩ）で染色してＦＡＣＳで確認すると、細胞死滅の程度を確認することができる。細胞死滅が起こると、細胞内の誘電体の破壊によってＧ１の下のＳｕｂ−Ｇ１部位が増加することになる。これを参照すると、ＢＧＪ３９８とパクリタキセルの併用処理時にＧ１の下の部位が急激に高くなり、アポトーシスを起こした細胞の数が増加したことを確認することができる（Ｓｕｂ−Ｇ１の細胞の増加）。

図２３は、前記と同じ実験でＦＡＣＳの結果をそれぞれの細胞周期ごとに区分してグラフで表したものである。これを参照すると、ＳＫＯＶ３−ＴＲ細胞において２．５μＭのＢＧＪ３９８と５０ｎＭのパクリタキセルとの併用処理時に、５０ｎＭのパクリタキセルの単独処理時に比べて約２．５倍のＳｕｂ−Ｇ１の細胞の増加が示されることを確認し、抗癌活性が高くなることを確認した。

図２４、２５は、ＳＫＯＶ３−ＴＲ卵巣癌細胞にパクリタキセル単独、ＢＧＪ３９８単独またはパクリタキセルとの併用投与によるｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰとＡｃｔｉｎ（アクチン）の発現を、前述のような免疫染色法で確認したものである。ＢＧＪ３９８とパクリタキセルの併用処理時に、濃度および時間依存的にｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰとＡｃｔｉｎの発現が増加したことを確認することができる。

図２６は、ＳＫＯＶ３−ＴＲ卵巣癌細胞にパクリタキセル単独またはＢＧＪ３９８とパクリタキセルとの併用投与時のＡＫＴのリン酸化阻害、ＰＡＲＰ ｃｌｅａｖａｇｅの誘導をパススキャン イントラセルラー シグナリング アレイ キット（ＰａｔｈＳｃａｎ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ａｒｒａｙ Ｋｉｔ）（Cell Signaling Technology）で確認したものである。ＢＧＪ３９８のパクリタキセルとの併用投与時にセリン（ｓｅｒｉｎｅ）４７３へのＡＫＴのリン酸化が減少し、ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰが増加したことを確認することができる。

図２７は、ＳＫＯＶ３−ＴＲ卵巣癌細胞にパクリタキセル単独またはＢＧＪ３９８のパクリタキセルとの併用投与時における、細胞内での細胞の生存と死滅に関連するＡＫＴ下流のシグナル機序を確認するために、ＡＫＴ、リン酸化ＡＫＴ、ＢＡＤ、リン酸化ＢＡＤ、ＸＩＡＰ、ＣＡＳＰ９、ｐ４２／４４、リン酸化ｐ４２／４４の発現有無を確認した。これを参照すると、ＳＫＯＶ３−ＴＲ細胞において、ＢＧＪ３９８の処理により細胞内リン酸化ＡＫＴのレベルが非常に阻害され、特異的にＸＩＡＰの発現が減少していることを確認した。これは、細胞内でＸＩＡＰの発現レベルが阻害され、パクリタキセルの感受性を高めることによると考えられる。

図２８は、ＳＫＯＶ３−ＴＲ細胞にＰＩ３Ｋ／ＡＫＴの阻害剤として知られているウォルトマンニンを濃度別に処理してパクリタキセルの抗癌効果が高くなるかを確認したものである。これを参照すると、ＳＫＯＶ３−ＴＲ細胞において、ウォルトマンニンの処理によりパクリタキセルの抗癌効果が多少濃度依存的に高くなることを確認した。これはＳＫＯＶ３−ＴＲ細胞において、パクリタキセル抗癌剤抵抗性を克服するのにＡＫＴシグナル機序が非常に重要な調節因子であることを示すものである。

実施例７．ＳＫＯＶ３ｉｐ１／ＳＫＯＶ３−ＴＲに対するシスプラチンおよびＢＧＪ３９８の相乗効果の確認
前述の実施例と同様に、各細胞株を２Ｄ単層培養してシスプラチン単独、ＢＧＪ３９８単独またはシスプラチンとの併用投与による変化をクリスタルバイオレット染色分析法で分析した。

図２９を参照すると、ＳＫＯＶ３ｉｐ１とＳＫＯＶ３−ＴＲは、すべてシスプラチンに対する感受性を示すことを確認することができる。図３０、３１を参照すると、ＢＧＪ３９８とシスプラチンとの併用投与時に抗癌活性が改善されることを確認することができる。

前記の実験で使用された細胞株は、下記表３に示す。

Claims (21)

1. 下記化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む、転移性卵巣癌の予防または治療用の薬学的組成物。
   
2. 前記転移性卵巣癌は、その癌細胞の少なくとも一部がスフェロイド形態である、請求項１に記載の薬学的組成物。
3. 前記化学式１の前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、癌細胞のスフェロイド（spheroid）形態を分解する、請求項１に記載の薬学的組成物。
4. 前記転移性卵巣癌は、卵巣癌３期または４期である、請求項１に記載の薬学的組成物。
5. 前記転移性卵巣癌は、化学抗癌剤抵抗性癌である、請求項１に記載の薬学的組成物。
6. 前記薬学的組成物は、化学抗癌剤と併用投与されるものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
7. 前記化学抗癌剤は、有糸分裂阻害剤またはアルキル化剤である、請求項６に記載の薬学的組成物。
8. 前記化学抗癌剤は、パクリタキセルである、請求項６に記載の薬学的組成物。
9. 前記薬学的組成物は、有糸分裂阻害剤またはアルキル化剤である化学抗癌剤をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
10. 前記薬学的組成物は、パクリタキセルをさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
11. 下記化学式１の化合物またはその食品学的に許容可能な塩を含む、転移性卵巣癌、子宮内膜癌もしくは乳癌に対する抗癌補助剤であって、
    前記転移性卵巣癌、前記子宮内膜癌もしくは前記乳癌は、パクリタキセル抵抗性癌であることを特徴とする抗癌補助剤。
    
12. 前記抗癌補助剤は、パクリキタセルと併用投与する、請求項１１に記載の抗癌補助剤。
13. 下記化学式１の化合物またはその食品学的に許容可能な塩を含む、転移性卵巣癌の予防または改善用の健康機能食品。
    
14. 前記転移性卵巣癌は、その癌細胞の少なくとも一部がスフェロイド形態である、請求項１３に記載の健康機能食品。
15. 前記転移性卵巣癌は、卵巣癌３期または４期である、請求項１３に記載の健康機能食品。
16. 前記化学式１の前記化合物またはその食品学的に許容可能な塩は、癌細胞のスフェロイド（spheroid）形態を分解する、請求項１３に記載の健康機能食品。
17. 転移性卵巣癌の予防または治療用医薬の製造における下記化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩の使用。
    
18. 前記転移性卵巣癌は、その癌細胞の少なくとも一部がスフェロイド形態である、請求項１７に記載の使用。
19. 前記転移性卵巣癌は、卵巣癌３期または４期である、請求項１７に記載の使用。
20. 前記化学式１の前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、癌細胞のスフェロイド（spheroid）形態を分解する、請求項１７に記載の使用。
21. 前記転移性卵巣癌は、化学抗癌剤抵抗性癌である、請求項１７に記載の使用。