KR20230047879A - 탈리도마이드계 화합물을 포함하는 세포 부유성 억제용 조성물 및 암 전이 억제용 약학 조성물 - Google Patents

탈리도마이드계 화합물을 포함하는 세포 부유성 억제용 조성물 및 암 전이 억제용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탈리도마이드계 화합물을 포함하는 세포 부유성 억제용 조성물 및 암 전이 억제용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 탈리도마이드계 화합물을 포함하는 조성물은 세포 부유성에 관여하는 인자의 발현을 억제함으로써 암세포의 부유를 억제하고 이로 인해 발생하는 암 전이 또한 억제할 수 있어, 항전이 효과를 기대할 수 있다.

Description

탈리도마이드계 화합물을 포함하는 세포 부유성 억제용 조성물 및 암 전이 억제용 약학 조성물{Composition for inhibiting cell-suspension and pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis comprising analogue of thalidomide}
본 발명은 탈리도마이드계 화합물을 포함하는 세포 부유성 억제용 조성물 및 암 전이 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.
암은 증식과 사멸을 반복하는 세포의 항상성이 무너져 비정상적인 세포 증식으로 유발되는 질병으로, 양성종양(benign tumor)과 악성종양(malignant tumor)로 구분된다. 양성종양은 비교적 성장속도가 느리고 종양의 원발생 부위에서 다른 조직으로 전파되는 전이(metastasis)가 이루어지지 않는 것에 반해 악성종양은 원발부를 떠나 다른 조직으로 침윤(invasion)되어 빠르게 성장하는 특징을 가짐으로써 생명을 위협하며 사망에 이르게 한다. 일부 혈액암을 제외하고 대부분의 암은 상피세포에서 발생하는 고형암의 형태로, 고형암 전이는 부착된 암세포가 떨어져나와 혈관이나 림프관으로 이동하여 원거리의 다른 조직에 정착하고 지속적인 증식을 통해 발생하게 된다.
상피-중간엽 전이(Epithelial-mesenchymal transition)란 상피세포의 특성을 가지는 암세포가 세포 극성 및 세포간 부착의 특성을 잃고, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)가 될 수 있는 이동성 및 침습성의 특성을 얻는 일련의 과정을 의미하며, 이는 암 전이의 초기 과정에서 확인되는 것으로 알려져 있다. 암 전이는 초기에 세포끼리 또는 세포와 세포외기질 간의 접착에 관여하는 세포부착분자(cell adhesion molecule)의 발현과 관련이 있다. 먼저 암세포는 세포부착분자의 일종인 E-cadherin 억제에 의해 세포 부착성을 상실하게 되고, 증가된 침투성에 의해 기저막을 파괴하고 혈관내로 침입한 뒤 혈관을 부유하는 순환암세포(circulating tumor cell)가 되어 혈류를 나가 미세전이암을 형성하고 성장하는 과정을 통해 전이가 완성하게 된다.
한편 암으로 진단받은 환자 중 약 1/3은 진단 당시에 전이암도 같이 발견되고 있으며, 다른 1/3의 환자에서는 여러 진단적 검사로 발견되지 않는 미세한 전이가 이루어진 상태로 치료를 받지 않거나 원발암에 대한 국소적 치료만 이루어진 경우 결국 전이암으로 진행되어 발견된다. 따라서 실제로 암 환자의 약 2/3에 해당하는 많은 환자들에게서 암 전이가 발생하며, 이를 해결하기 위해서는 외과적 수술 이후의 암 전이를 방지함과 동시에 암 전이를 제어할 수 있는 효과적인 치료제가 절실히 요구되고 있다.
대한민국 등록특허 제10-1820515호 대한민국 등록특허 제10-2269666호
본 발명은 세포 부유성 억제용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 암 전이 억제용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 암 전이를 근본적으로 방지할 수 있도록 암세포의 이동을 억제하는 약물에 관해 연구한 결과, 다발성골수종 치료제의 일종인 탈리도마이드계 화합물이 세포의 부착 의존성에 관여하는 유전자 또는 단백질의 발현을 조절하여 암세포의 세포간 부착 특성을 유지함으로써 암세포의 부유를 억제하고 암세포 부유에 의한 암 전이 또한 억제할 수 있음을 확인하여 세포 부유성 억제용 조성물 및 암 전이 억제용 조성물에 관한 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 양상은 포말리도마이드를 유효성분으로 포함하는 세포 부유성 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 “세포 부유성”은 세포가 기질(substrate) 등에 고정하지 않은 채로 체액 또는 배양액에서 부유(floating)하는 특성을 의미하는 것으로, 이와 반대로 세포가 기질에 고정하거나 세포간 결합하는 특성을 “세포 부착성”이라 한다. 본 발명에서 사용된 “세포 부유성 억제용 조성물”은 부유 세포가 부유성을 상실하고 부착되도록 처리하는 조성물을 의미하며, 이러한 조성물에 의해 세포의 부착 의존성에서 변화가 나타지만 세포의 생존성, 분화, 성장, 증식 등 기타 생물학적 기능에 대해서는 정상적이거나, 또는 생존에 큰 영향을 미칠 정도로 감소하지 않도록 한다.
본 발명에서 사용된 “탈리도마이드계 화합물(analogue of thalidomide)”은 주로 다발성골수종 치료에 사용되는 탈리도마이드 또는 이의 유사체를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 탈리도마이드계 화합물은 포말리도마이드 또는 레날리도마이드인 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 “포말리도마이드(pomalidomide)” 및 “레날리도마이드(lenalidomide)”는 재발 또는 난치성 다발골수종에 쓰이며 다른 종류의 암치료제로도 연구 중에 있다. 포말리도마이드 및 레날리도마이드는 면역체계를 조정하여 암세포를 죽이도록하는 면역조절제로 작용하며 암 성장에 필요한 혈관형성도 억제하는 것으로 알려져 있으나, 세포의 부착 의존성을 조절하는 기능에 대해서는 알려지거나 연구된 바가 없었다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 세포는 고형암 유래 부유 세포 또는 부유성 세포인 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 “고형암(solid tumor)”은 암세포, 혈관 및 결합성 조직으로 이루어져 일정한 경도와 형태를 지니는 암을 총칭하는 것으로, 특정 형태 없이 혈구세포나 림프세포에서 기원하는 혈액암과 구별된다.
보다 구체적으로, 상기 고형암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프 종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 요도암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 난소암, 질암, 전립선암, 고환암, 음경암 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 고형암은 유방암 또는 췌장암인 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 “부유(성) 세포”는 기질 등에 고정하지 않은 채로 체액 또는 배양액에서 부유하는 특성을 가지는 세포를 의미하며, 부유 배양을 통해 세포의 생존성, 분화, 성장, 증식, 기타 생물학적 기능이 정상적으로 유지될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 포말리도마이드 또는 레날리도마이드에 의한 세포 부유성 억제를 확인하기 위해 부착 특성을 가지는 세포인 SUIT2 (췌장암 세포주)에 부유성 세포에서 배타적으로 발현하는 유전자 조합을 인위적으로 도입하여 세포 부유성을 유도하였다. 여기서 사용된 유전자 조합은 부착-부유 전이(adherent-suspension transition, AST)에 관여하는 인자로서 KZF1, KLF1, IRF8, BTG2, SPIB, GATA1, IKZF3, TAL1, EAF2, POU2F2, KLF2, SPl1, NFE2, AKNA, IRF5, TCF7, RHOXF2, MYB, BCL11A 및 GFI1B로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상으로, 예를 들면 IKZF1, SPIB 및 BTG2의 조합, 또는 IKZF1, SPIB, KLF1, IRF8 및 BTG2의 조합일 수 있다. 이와 같은 방법으로 부유성이 유도된 세포 SUIT2에서는 포말리도마이드 또는 레날리도마이드 처리에 의해 IKZF1, SPIB 등의 단백질 발현이 억제되었고, 세포 부유성이 사라져 부착 배양되는 것을 확인하였다.
이와 같은 본 발명에 따른 세포 부유성 억제용 조성물은 포말리도마이드 또는 레날리도마이드에 의한 세포의 부착 의존성 조절 효과를 향상시킬 수 있는 물질을 더 포함할 수 있으며, 이러한 물질은 종래 항암제일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 항암제를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 “항암제”는 암세포의 증식 및 전이를 억제할 뿐만 아니라 재발 방지 및 암환자의 생존기간 연장이나 증상 완화를 위해 사용하는 모든 치료제를 의미하며, 세포의 성장과 분열을 억제하는 화학항암제 (1세대). 암세포의 특정 기전을 공격하는 표적항암제 (2세대) 및 인체의 면역체계를 이용하는 면역항암제 (3세대)를 포함할 수 있다. 본 발명에서의 항암제는 당업계에 공지된 항암제 중 포말리도마이드와 함께 세포 부유성을 유도하는 인자의 발현 억제 및/또는 부착 배양 유도를 나타내는 것이라면 제한없이 이용 가능하다.
보다 구체적으로, 상기 항암제로는 MAPK 억제제인 베무라페닙(Vemurafenib), 다브라페닙(Dabrafenib) 및 트라메티닙(Trametinib), CDK 억제제인 팔보시클립(Palbociclib), Bcr-Abl 억제제인 이매티닙(Imatinib) 및 닐로티닙(Nilotinib), 및 mTOR 억제제인 라파마이신(Rapamycin), 템시로리무스(Temsirolimus) 및 토린(Torin), 덱사메타손(Dexamethasone) 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 항암제 또는 억제제로서 베무라페닙, 다브라페닙, 트라메티닙, 팔보시클립, 이매티닙, 닐로티닙, 라파마이신, 템시로리무스, 토린 및 덱사메타손으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 세포 부유성이 유도된 SUIT2_3AST 세포 및 HEK293A_5AST 세포에 포말리도마이드를 단독 처리 시 일부 세포가 부착하는 것을 확인하였으나 부유성 관련 인자의 발현 억제는 확인할 수 없었다. 하지만 포말리도마이드와 함께 팔보시클립, 베무라페닙, 베무라페닙 및 라파마이신, 또는 베무라페닙 및 팔보시클립을 병용 처리한 경우에는 세포 부유성과 관련된 IKZF1, SPIB, IRF8 및 KLF1 단백질의 발현이 강하게 억제됨을 확인하였다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 IKZF1, SPIB, IRF8, KLF1 및 NFE2로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 단백질 발현을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예 따르면, 상기 포말리도마이드와 억제제를 포함하는 조성물은 1 : 1 : 0.001 ~ 1000의 비율로 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 억제제는 1종 이상, 바람직하게는 1 내지 3종일 수 있으며, 예를 들면, 억제제가 1종인 경우 베무라페닙, 다브라페닙, 트라메티닙, 팔보시클립, 이매티닙, 닐로티닙, 라파마이신, 템시로리무스, 토린 또는 덱사메타손일 수 있으며, 2종인 경우 베무라페닙 및 라파마이신, 베무라페닙 및 팔보시클립, 또는 팔보시클립 및 라파마이신일 수 있으며, 3종인 경우 베무라페닙, 팔보시클립 및 라파마이신을 모두 포함할 수 있다. 이러한 1종 이상의 억제제는 그 중량의 합이 포말리도마이드 대비 1 : 0.001 ~ 1000, 1 : 0.01 ~ 1000, 1 : 0.1 ~ 1000, 1 : 1 ~ 1000, 1 : 0.001 ~ 100, 1 : 0.01 ~ 100, 1 : 0.1 ~ 100, 1 : 1 ~ 100, 1 : 0.001 ~ 10, 1 : 0.01 ~ 10, 1 : 0.1 ~ 10, 또는 1 : 1 ~ 10의 중량비일 수 있다.
본 발명에 따른 세포 부유성 억제용 조성물은 탈리도마이드계 화합물 또는 탈리도마이드계 화합물과 항암제를 포함함으로써 암세포의 부유를 억제하고 세포의 이동성을 방해할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 탈리도마이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 전술한 내용과 중복되는 경우, 과도한 복잡성을 회피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 탈리도마이드계 화합물은 포말리도마이드 또는 레날리도마이드인 것일 수 있다.
본 발명에 사용된 “암(cancer 또는 tumor)”은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격성(aggressive), 주위 조직에 침투하는 침투성(invasive) 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이성(metastatic)을 가지는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이며, "암 전이"는 원발부에서 떨어져나온 전이성 세포가 원거리의 다른 조직에 정착 및 증식하여 전이암을 형성하는 것을 의미한다. 본 발명에서 사용된 “암 전이 억제용 약학 조성물”은 인간을 포함한 동물을 대상으로 암세포의 이동성 및/침습성을 억제 또는 지연시키며, 이로 인해 암환자의 생존 기간을 연장시키는 것을 목적으로 사용하는 물질을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 암은 고형암인 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프 종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 요도암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 난소암, 질암, 전립선암, 고환암, 음경암 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 유방암 동물모델에 포말리도마이드를 3주간 또는 레날리도마이드 2주간 투여하였을 때 암 전이가 상당히 억제되었으며, 이로 인해 생존기간 또한 비처리군에 비해 약 2주 이상, 최대 5주까지 증가한 것을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 약학 조성물은 베무라페닙, 다브라페닙, 트라메티닙, 팔보시클립, 이매티닙, 닐로티닙, 라파마이신, 템시로리무스, 토린 및 덱사메타손으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 IKZF1, SPIB, IRF8, KLF1 및 NFE2로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 단백질 발현을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 암 전이 억제용 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로, 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여량은 상기 약학 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 상기 약학 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들면, 1일 0.001 내지 1000 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg, 또는 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 약학 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 상기 약학 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 그 방식에 있어 특별히 제한되지 않고, 목적하는 해당 부위에 상기 약학 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 상기 약학 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 상기 비경구 투여 방식으로는 예를 들면, 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등이 포함되며, 상기 약학 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 탈리도마이드계 화합물을 포함하는 조성물은 세포 부유성에 관여하는 인자의 발현을 억제함으로써 암세포의 부유를 억제하고 이로 인해 발생하는 암 전이 또한 억제할 수 있어, 항전이 효과를 기대할 수 있다.
도 1은 포말리도마이드/레날리도마이드 및 억제제의 SUIT2_3AST 세포 부유성 억제를 보여주는 것으로, IKZF1, SPIB 및 BTG2가 도입된 SUIT2 세포 (SUIT2_3AST 세포)에 포말리도마이드, 다브라페닙, 베무라페닙, 트라메티닙, 팔보시클립, 이매티닙, 닐로티닙, 라파마이신 및/또는 토린을 처리한 후 1 및 2일차에 관찰한 (a) 세포 이미지 및 (b) 웨스턴 블롯 결과이고, SUIT2_3AST 세포에 레날리도마이드를 처리한 후 2일차에 관찰한 (c) 배지 내 또는 플레이트상 세포 이미지 및 (d) 면역형광법으로 IKZF1 발현을 확인한 세포 이미지이다.
도 2는 포말리도마이드/레날리도마이드 및 억제제의 SUIT2_3AST TetR 세포 부유성 억제를 보여주는 것으로, TetR 유전자 및 IKZF1, SPIB 및 BTG2가 도입된 SUIT2 세포 (SUIT2_3AST TetR 세포)에 포말리도마이도 또는 레날리도마이드, 베무라페닙, 팔보시클립 및/또는 덱사메타손을 2일간 처리한 후 독시사이클린을 2일간 처리하여 관찰한 (a) 세포 이미지 및 (b) 웨스턴 블롯 결과이다.
도 3은 포말리도마이드 및 억제제의 SUIT2_5AST 세포 부유성 억제를 보여주는 것으로, IKZF1, SPIB, KLF1, IRF8 및 BTG2가 도입된 SUIT2 세포 (SUIT2_5AST 세포)에 (a) 포말리도마이드 단독 및 (b) 포말리도마이드, 베무라페닙, 팔보시클립 및 라파마이신 간의 병용 처리한 후 3일차에 관찰한 세포 이미지이다.
도 4는 포말리도마이드 및 억제제의 HEK293A_5AST 세포 부유성 억제를 보여주는 것으로, IKZF1, SPIB, KLF1, IRF8 및 BTG2가 도입된 HEK293A 세포 (HEK293A_5AST 세포)에 (a) 포말리도마이드, 베무라페닙 및/또는 라파마이신을 처리한 후 3일차에 관찰한 (a) 세포 이미지 및 (b) 웨스턴 블롯 결과이다.
도 5는 포말리도마이드 및 억제제의 DU4475 세포 부유성 억제를 보여주는 것으로, 피브로넥틴이 코팅된 플레이트에 DU4475 세포를 분주한 후 포말리도마이드를 9일간 처리하여 관찰한 (a) 세포 이미지이고, (b)는 DU4475 세포에 포말리도마이드 단독 또는 베무라페닙과의 병용 처리한 후 9일차에 단백질 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 결과이고, (c)는 DU4475 세포에 포말리도마이드 및 팔보시클립을 병용 처리한 후 8일차에 관찰한 세포 이미지이다.
도 6은 포말리도마이드 및 억제제의 DU4475 세포 부유성 억제를 보여주는 것으로, 아가로스 겔 상에서 DU4475 세포를 4주간 배양하여 형성된 colony를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 관찰한 세포 이미지이다.
도 7은 포말리도마이드 및 억제제의 세포 부유 억제를 보여주는 것으로, (a) SUIT2 세포 또는 (b) MDA-MB-231 세포에 포말리도마이드, 라파마이신, 베무라페닙 및/또는 팔보시클립을 처리한 후 3일차에 측정한 배지 내 또는 플레이트상 세포 수, 및 세포 이미지이다.
도 8은 포말리도마이드/레날리도마이드의 암 전이 억제를 보여주는 것으로, LM2 세포에 포말리도마이드 또는 레날리도마이드를 처리한 후 3일차에 (a) 형광현미경을 이용하여 세포를 관찰하고, (b) 부유 세포 및 (c) 부착 세포에 대해 세포 생존능 분석을 실시한 결과이다.
도 9는 유방암 모델을 이용한 포말리도마이드/레날리도마이드의 암 전이 억제를 보여주는 것으로, (a, d) 포말리도마이드 또는 레날리도마이드의 투여 일정과 이의 결과로서 (b, e) 폐 전이 상태 및 (c, f) 모델의 생존율 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
1. 재료 및 방법
1-1. 세포주
세포주 HEK293A는 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen, 15140122) 및 10% FBS (Hyclone, 1)를 포함하는 DMEM (Hyclone, SH30022) 배지에서 배양하였다. 세포주 SUIT2 (췌장암), DU4475 (유방암), MDA-MB-231 (유방암) 및 LM2 (유방암)는 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen, 15140122) 및 10% FBS (Hyclone, 1)를 포함하는 RPMI (Hyclone, SH) 배지에서 배양하였다. 모든 세포는 5% CO2, 37℃의 가습 인큐베이터에서 유지하였다.
1-2. AST 또는 TetR 발현 벡터 제작
TetR 유전자는 숙주세포 내에서 독시사이클린에 의해 선택적으로 발현되어 AST 인자의 발현을 조절하기 위해 사용하였다.
인간 AST 유전자 (3AST - IKZF1, SPIB 및 BTG2; 5AST - IKZF1, SPIB, KLF1, IRF8 및 BTG2) 또는 Tet 억제 단백질(Tet Repressor Protein, TetR) 유전자를 V5 및 FLAG로 태깅하고 Gateway 삽입 벡터인 pENTR4 벡터 (Addgene)에 서브클로닝하였다. 서브클로닝된 pENTR4 벡터를 LR 재조합 효소 (Invitrogen, 1179019)를 이용하여 목적 벡터인 pLentiCMV 벡터와 재조합함으로써 AST 또는 TetR 발현용 렌티바이러스 벡터를 제작하였다. 모든 컨스트럭트(construct)는 시퀀싱을 통해 구조를 검증하였다.
1-3. 바이러스 감염 및 세포 부유성 유도
부착 배양 특성을 가지는 HEK293A 또는 SUIT2 세포주를 Polyplus 시약 (Merck)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 pMD2G 및 psPAX2를 코딩하는 플라스미드와 각 컨스트럭트가 클로닝된 렌티바이러스 벡터로 형질감염시켰다. 바이러스 입자를 함유한 배지를 형질감염 48시간 뒤에 수집하고 0.45 μm 필터로 여과한 8 μg/ml 폴리브렌(polybrene)을 첨가하여 사용하였다. 감염 24시간 뒤에, 형질감염된 세포를 신선한 배지에서 24시간 동안 배양하고 퓨로마이신(puromycin) (1 μg/ml) 및 블라스티시딘(blasticidin) (10 μg/ml)으로 선별하였다.
선별된 세포를 5x105/well으로 6웰 플레이트(6 well plate)에 분주하고 AST 유전자 또는 TetR 유전자를 코딩하는 바이러스 입자를 함유하는 배지를 첨가하였다. 감염 2일 후, 형질감염된 세포를 트립신화하고 새로운 플레이트에 다시 분주한 다음 퓨로마이신 (4 mg/ml)을 처리하여 선별하였다.
1-4. 화합물 처리
화합물로는 탈리도마이드계 화합물인 포말리도마이드(Pomalidomide, Pom) 및 레날리도마이드(Lenalidomide, Len)를, MAPK 억제제인 베무라페닙(Vemurafenib, Vem), 다브라페닙(Dabrafenib, Dab) 및 트라메티닙(Trametinib, Tra), CDK 억제제인 팔보시클립(Palbociclib, Pal), Bcr-Abl 억제제인 이매티닙(Imatinib) 및 닐로티닙(Nilotinib), mTOR 억제제인 라파마이신(Rapamycin, Rapa), 템시로리무스(Temsirolimus, Tem) 및 토린(Torin), 및 덱사메타손(Dexamethasone, DMS)을 DMSO에 용해하여 사용하였다. 그리고 세포외기질로서 피브로넥틴(fibronectin) 및 독시사이클린(Doxycycline, Dox)을 사용하였다.
AST 인자가 도입된 세포를 1x105/well (12웰 플레이트) 또는 4x106/well (6웰 플레이트)으로 플레이트에 분주한 후 포말리도마이드, 레날리도마이드 및/또는 억제제를 1 ~ 9일간 처리하였다. 처리 후 광학현미경 하에서 세포 형태를 관찰하거나 형광형미경을 이용하여 형광 발현을 확인하였고, 웨스턴 블롯 또는 AST 분석을 실시하였다.
TetR 유전자 및 AST 인자가 도입된 세포를 1x105/well (12웰 플레이트)으로 플레이트에 분주한 후 포말리도마이드 또는 레날리도마이드, 베무라페닙, 팔보시클립 및/또는 덱사메타손을 처리하였다. 처리 2일 후 독시사이클린 10 μg/ml을 처리하고 다시 2일 후 광학현미경 하에서 세포 형태를 관찰하였고, 웨스턴 블롯을 실시하였다.
1-5. 웨스턴 블롯
세포에 세포용해 완충제(lysis buffer)를 넣고 5분 동안 반응시킨 후 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 획득한 상층액을 단백질 샘플로 사용하였다. 각 단백질 샘플은 BSA(bovine serum albumin)로 단백질 정량한 다음 동일한 양의 단백질을 8%의 SDS-PAGE(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리한 후 PVDF(polyvinylidene fluoride) 막으로 옮겨서 1차 항체와 반응시켰다. 이후 막을 세척한 후 2차 항체와 반응시켰고, 단백질 밴드를 ECL 용액(enhanced chemiluminescence solution)으로 발색하여 확인하였다.
여기서 1차 항체로는 p-ERK (Cell Signaling Technology, 4377), p-AKT (Cell Signaling Technology, 13038), p-mTOR (Cell Signaling Technology, 2971), p-SMAD2/3 (Cell Signaling Technology, 8828), p-S6K (Cell Signaling Technology, 9234), p-RB (Cell Signaling Technology, 9307), p-FAK (Cell Signaling Technology, 3283), IKZF1 (Cell Signaling Technology, 9034), SPIB (Cell Signaling Technology, 14323), KLF1 (NOVUS, NBP2-37380), IRF8 (Abcam, ab28696), NFE2 (NOVUS, NBP1-82580), YAPXP (Cell Signaling Technology, 14074) 및 GAPDH (Santa Cruz, F0316)를, 2차 항체로는 Goat Ab-anti Rabbit IgG (Gene Tex, 44167) 및 Goat Ab-anti Mouse IgG (Gene Tex, 43574)를 사용하였다.
1-6. AST 분석
세포수를 측정하기 위한 AST 분석을 실시하였다. 먼저, 세포를 6웰 플레이트에 4x106/well으로 분주한 후 90% 자랐을때 배지를 교체하면서 화합물 (포말리도마이드, 레날리도마이드 및/또는 억제제)를 처리하였다. 처리 3일 후, 제조사 지침에 따라 CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega, G7570)를 사용하여 플레이드 바닥에 붙은 세포와 배지 내 떠있는 세포 (AST 세포)를 각각 분리하여 세포 수를 측정하였다.
1-7. 면역형광법(Immunofluorescence)
세포를 슬라이드 위에 분주한 후 0.01 M PBS로 각 15분씩 두 번 세척하고, 5% FBS 및 PBS에 녹인 0.3% 트리톤(Triton) X-100을 함유하는 블로킹 용액과 1시간 동안 반응시켰다. 이후 블로킹 용액으로 1:100으로 희석한 IKZF1 항체 (Cell Signaling Technology, 9034)와 슬라이드를 하룻밤 동안 반응시켰다. 1차 항체와의 반응 후에 1:50으로 희석한 토끼 TRICT-표지 항체 Rb-488 (Invitrogen, A11034)와 슬라이드를 30분간 반응시켰다. 이후 슬라이드를 DAPI로 염색하였고, 공초점 레이저-스캐닝 현미경(Flouview FV 1000)으로 관찰하였다.
1-8. 소프트 한천 콜로니 형성 분석(Soft agar colony formation assay)
6웰 플레이트에 1% 아가로스 겔(agarose gel)과 RPMI 배지를 1 : 1의 비율로 혼합한 0.5% 아가로스 겔을 1.5 ml/well 깔아주고 하루 굳힌 뒤, 0.7% 아가로스 겔과 RPMI 배지를 1 : 1의 비율로 혼합한 0.35% 아가로스 겔 1.5 ml에 DU4475 세포 2x104를 섞어 1.5 ml/well로 깔아주고 하루 굳혔다. 다음날 아가로스 겔 위에 RPMI 배지 1 ml/well를 부어주고 4일에 한번씩 Pomalidomide 및/또는 억제제가 포함된 RPMI 배지를 교체해주며 4주간 colony를 키운 후 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
1-9. 유방암 모델 제작
7주령 암컷 NSG 마우스의 지방패드(fat-pad)에 LM2 세포 1X106를 주입하였다. 3주 또는 2주 후 원발암이 형성된 것을 확인하고 포말리도마이드 또는 레날리도마이드 10 mg/kg을 3일에 한번씩 4주 동안 복강내 주사하였다.
1-10. 통계 분석
모든 실험은 최소 3회 반복되었으며, 데이터는 평균±표준편차로 표시하였다. 두 평균 간 통계적 차이는 양측 독립표본 스튜던트 t-검정으로 평가하였다. P<0.05인 경우 통계적 유의성을 가지는 것으로 간주하였다. 분석에서 제외된 시료는 없으며, 데이터는 정상적인 분포를 보였고, 비교된 그룹 간 유사한 분산을 가졌다. 표본 크기를 결정하기 위한 통계적 방법은 사용하지 않았으며, 표본 크기는 선행 연구에서 경험한 실험적 다양성에 기반하여 결정하였다.
2. 결과
2-1. 포말리도마이드/레날리도마이드 및 억제제의 세포 부유성 억제
화합물 처리에 의한 세포의 부착성 변화를 확인하기 위해, AST 인자 IKZF1, SPIB 및 BTG2가 도입되어 부유 배양 특성을 가지는 SUIT2 세포에 포말리도마이드 또는 레날리도마이드 및/또는 억제제를 2일간 처리하여 세포 형태 변화를 관찰하고 단백질 발현 수준을 측정하였다. 그 결과, SUIT2_3AST 세포에 포말리도마이드를 처리한 경우 2일째부터 세포가 부착 배양하는 것으로 나타났으며, 억제제로 베무라페닙, 다브라페닙, 트라메티닙, 팔보시클립, 이매티닙, 닐로티닙, 라파마이신, 템시로리무스 또는 토린을 처리한 경우에도 일부 세포가 부착 배양하는 것으로 나타났다 (도 1의 a). 그리고 포말리도마이드 (5 μM) 단독 또는 억제제 (베무라페닙 3 μM, 라파마이신 50 nM, 팔보시클립 5 μM)와의 병용으로 처리 시 2일차에 세포 부유를 유도하는 IKZF1 단백질의 발현 억제가 명확히 나타났다 (도 1의 b). 또한 SUIT2_3AST 세포는 배지 내 부유 상태이며 IKZF1이 핵 내부에 존재하지만, 레날리도마이드를 처리한 경우에는 세포가 부착 배양하며 IKZF1이 핵 밖으로 이동한 것으로 나타났다 (도 1의 c 및 d).
세포의 부착성을 조절하기 위해, TetR 유전자 및 AST 인자 (IKZF1, SPIB, BTG2)가 도입되어 독시사이클린 반응성 부유 배양 특성을 가지는 세포 (SUIT2_3AST TetR)에 포말리도마이드 또는 레날리도마이드 및/또는 억제제 (베무라페닙 10 μM, 팔보시클립 10 μM, 덱사메타손 3 μM)를 2일간 처리한 후 독시사이클린 (10 μg/ml)을 2일간 처리하여 세포 형태 변화를 관찰하고 단백질 발현 수준을 측정하였다. 그 결과, 독시사이클린 단독 처리 시 부유성을 획득하는 대조군과 달리 포말리도마이드/레날리도마이드 또는 억제제와 독시사이클린을 병용처리한 경우에는 독시사이클린 반응에 의한 부유 현상이 나타나지 않는 것을 확인하였고, 독시사이클린 반응에 의한 AST 인자들의 발현도 포말리도마이드 및/또는 덱사메타손 병용처리군에서는 발현이 현저히 낮은 것을 확인 하였다.
또한, AST 인자 IKZF1, SPIB, KLF1, IRF8 및 BTG2가 도입되어 부유 배양 특성을 가지는 SUIT2 세포 또는 HEK293A 세포에 포말리도마이드 및/또는 억제제를 3일간 처리하여 세포 형태 변화를 관찰하였다. 그 결과, SUIT2_5AST 세포에서도 포말리도마이드 단독 또는 병용에 의해 부착 배양이 관찰되었으며, 특히 포말리도마이드, 라파마이신 및 베무라페닙을 동시 처리할 경우 세포의 부착 특성이 더욱 강하게 나타났다 (도 3).
HEK293A_5AST 세포에서도 포말리도마이드에 의해 세포 부착성이 나타났으며 억제제와의 병용에 의해 세포 부창성이 강하게 나타났다 (도 4의 a). 그리고 베무라페닙에 의해 SPIB, KLF1 및 IRF8의 발현이 억제되었으며, 포말리도마이드, 베무라페닙 및 라파마이신을 모두 처리할 경우 IKZF1를 포함한 SPIB, KLF1 및 IRF8의 발현이 강하게 억제되었다 (도 4의 b).
한편, 부유성 유방암 세포주인 DU4475는 포말리도마이드를 9일간 처리하였을 때 부착 배양 특성이 나타나지 않았으나, 피브로넥틴 코팅된 플레이트에서 배양한 경우 포말리도마이드 (100 μM) 처리 시 플레이트에 부착되었고 (도 5의 a). 포말리도마이드 (100 μM)와 베무라페닙 (0.1 μM)을 병용 처리한지 9일 후에 세포 부유를 유도하는 SPIB, IRF8 및 NFE2 단백질의 발현이 억제된 것으로 나타났다 (도 5의 b). 또한 DU4475 세포에 포말리도마이드 (30 μM)와 팔보시클립 (5 μM)을 병용 처리한지 8일 후에 세포 부착이 관찰되었다 (도 5의 c). 그리고 아가로스 겔에서 DU4475 세포에 포말리도마이드 (100 μM), 팔보시클립 (10 μM), 베무라페닙 (0.1 μM) 및/또는 덱사메타손 (3 μM)을 처리하여 콜로니 형성 분석을 진행하였다. 그 결과 포말리도마이드, 베무라페닙, 포말리도마이드와 베무라페닙 병용처리, 포말리도마이드와 덱사메타손 병용처리한 경우에는 대조군과 큰 차이가 없는 반면 포말리도마이드와 팔보시클립의 병용처리군에서는 콜로니의 수와 크기가 현저하게 감소되는 것을 확인하였다 (도 6).
2-2. 포말리도마이드의 세포 부유 억제
포말리도마이드가 암세포의 부유성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 부착성을 가지는 SUIT2 세포 또는 MDA-MB-231 세포에 포말리도마이드 및/또는 억제제를 3일간 처리한 후 배지 내 또는 플레이트에 부착된 세포 수를 측정하였다. 그 결과, 포말리도마이드를 처리한 경우에는 포말리도마이드를 처리하지 않은 경우에 비해 배지 내 부유하는 세포 수가 감소하였으며, 베무라페닙, 팔보시클립 또는 라파마이신을 병용 처리한 경우 세포수가 현저히 감소한 것으로 나타났다 (도 7).
2-3. 포말리도마이드/레날리도마이드의 암 전이 억제
포말리도마이드/레날리도마이드에 의한 암 전이 억제를 확인하기 위해 유방암 동물모델을 이용한 실험을 실시하였다.
먼저, 암을 유도하기 위한 GFP 발현 LM2 세포를 100 mm 배양 디쉬(culture dish)에 분주한 후 90% 찼을 때 배지를 교체하고 포말리도마이드 레날리도마이드를 처리하였다. 처리한지 3일 후 PI 염색하여 형광현미경 하에서 세포 상태를 육안으로 관찰하였고 (도 8의 a), 배지 내 부유 세포 (AST 세포)와 플레이트 상에 부착된 세포를 구분하여 AST 분석을 실시한 결과, 부유 세포는 포말리도마이드 또는 레날리도마이드의 농도 의존적으로 세포 수가 현저히 감소한 반면, 부착 세포에서는 화합물 처리에 따른 큰 차이가 없었다 (도 8의 b 및 c).
정상 마우스에 LM 세포를 주입하여 원발성 유방암을 형성한 후 포말리도마이드 또는 레날리도마이드 (10 mg/kg)를 투여하였다 (도 9의 a 및 d). 그 결과, 원발암(primary tumor)에서는 화합물 처리 여부에 따른 두드러진 차이가 나타나지 않았으나, 폐 전이(lung metastasis)에서는 포말리도마이드 또는 레날리도마이드를 처리한 경우 화합물을 처리하지 않은 대조군에 비해 암 전이가 관찰되지 않았다 (도 9의 b 및 e). 그리고 포말리도마이드를 투여한 경우에는 대조군에 비해 마우스의 생존기간이 연장되는 것으로 나타났다 (도 9의 c 및 f).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

  1. 탈리도마이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 세포 부유성 억제용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 탈리도마이드계 화합물은 포말리도마이드 또는 레날리도마이드인 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포는 고형암 유래 세포 또는 부착성 암세포인 것인 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 고형암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프 종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 요도암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 난소암, 질암, 전립선암, 고환암, 음경암 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 베무라페닙, 다브라페닙, 트라메티닙, 팔보시클립, 이매티닙, 닐로티닙, 라파마이신, 템시로리무스, 토린 및 덱사메타손으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것인 조성물.
  6. 탈리도마이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 탈리도마이드계 화합물은 포말리도마이드 또는 레날리도마이드인 것인 약학 조성물.
  8. 청구항 6에 있어서,
    상기 암은 고형암인 것인 약학 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 고형암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프 종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 요도암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 난소암, 질암, 전립선암, 고환암, 음경암 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 약학 조성물.
  10. 청구항 6에 있어서,
    상기 약학 조성물은 베무라페닙, 다브라페닙, 트라메티닙, 팔보시클립, 이매티닙, 닐로티닙, 라파마이신, 템시로리무스, 토린 및 덱사메타손으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것인 약학 조성물.
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