JP6824823B2

JP6824823B2 - Ｎｒｆ２遺伝子発現促進剤、カタラーゼ遺伝子発現促進剤、及びグルタチオンペルオキシダーゼ遺伝子発現促進剤

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Publication number: JP6824823B2
Application number: JP2017111722A
Authority: JP
Inventors: 森　俊裕; 俊裕森; 嘉寛徳留
Original assignee: Mandom Corp
Current assignee: Mandom Corp
Priority date: 2017-06-06
Filing date: 2017-06-06
Publication date: 2021-02-03
Anticipated expiration: 2037-06-06
Also published as: JP2018203675A

Description

本発明は、フィチン酸を有効成分とするＮｒｆ２遺伝子発現促進剤に関する。また、フィチン酸を有効成分とするカタラーゼ遺伝子発現促進剤に関する。また、フィチン酸を有効成分とするグルタチオンペルオキシダーゼ遺伝子発現促進剤に関する。

細胞内における活性酸素やフリーラジカル等の活性酸素種は、生体への紫外線の照射により生じる。また、呼吸により体内に取り込まれる酸素の副産物として生じることもある。これらの活性酸素種は細胞の構成成分である脂質、タンパク質、核酸等に反応し、細胞機能障害や細胞死の原因となる。例えば、紫外線（ＵＶＢ）が細胞に照射されると細胞内でスーパーオキシドアニオンラジカルが発生し、過酸化水素へと代謝され、Ｆｅ²⁺の存在下におけるフェントン反応により毒性の高いヒドロキシラジカルが生成する（非特許文献１〜３）。そして、生体内の活性酸素種が増加すると、癌、動脈硬化、糖尿病等の疾病や、肌の老化（シミやシワ）を引き起こすことが知られている。

生体には活性酸素種に対する防御機構が存在している。例えば、フリーラジカルや活性酸素の発生を未然に防ぐ予防型の防御機構として、過酸化水素を水と酸素分子に分解する酵素であるカタラーゼ（ＣＡＴ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）等の抗酸化タンパク質の存在が挙げられる（非特許文献４）。また、これらの発現を増強する転写因子であるＮｒｆ２（ＮＦ−Ｅ２ｒｅｌａｔｅｄｆａｃｔｏｒ−２）の存在が挙げられる（特許文献１）。

フィチン酸は玄米等の穀類に多く含まれる有機リン酸化合物である。フィチン酸は高いキレート作用及び抗酸化作用を有するため、食品添加剤として食品の変色防止等の目的に用いられている（特許文献２）。また、フィチン酸は上記のフェントン反応で必要な鉄をキレー卜することによりヒドロキシラジカルの発生を防ぎ、生体においても抗酸化作用を示すことが明らかになっている（非特許文献５）。

特開２０１６−１９６４２９号公報特開２０１３−２１２０６８号公報

ＢａｂｉｏｒＢ．Ｍ．，ＬａｍｂｅｔｈＪ．Ｄ．，ＮａｕｓｅｅｆＷ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３９７，３４２−３４４（２００２）ＭａｃｋｅｒｎｅｓｓＳ．Ａ．Ｈ．ＪｏｈｎＣ．Ｆ．，ＪｏｒｄａｎＢ．，ＴｈｏｍａｓＢ．，ＦＥＥＳＬｅｔｔ．，４８９，２３７−２４２（２００１）ＧｒａｆＥ．，ＭａｈｏｎｅｙＪ．Ｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，３６２０−３６２４（１９８４）ＧｉｌｌＳ．Ｓ．，ＴｕｔｅｊａＮ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍ．，４８，９０９−９３０（２０１０）ＧｒａｆＥ．，ＥｍｐｓｏｎＫ．Ｌ．，ＥａｔｏｎＪ．Ｗ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１１６４７−１１６５０（１９８７）

上述の通り、フィチン酸の生理作用に関する研究は盛んに行われており、その抗酸化作用はフィチン酸そのものによるキレート作用に起因することが報告されていた。このため、フィチン酸が抗酸化に関連する遺伝子の発現を促進する作用を有することについては知られていなかった。

よって、本発明の目的は、抗酸化に関連するＮｒｆ２遺伝子、カタラーゼ遺伝子、及びグルタチオンペルオキシダーゼ遺伝子の発現促進剤を提供することにある。また、これらの遺伝子の発現を促進することにより、抗酸化作用や抗がん作用を発揮する促進剤を提供することにある。

上記の様な事情に鑑み、本発明者らは抗酸化のメカニズムに着目して鋭意研究を重ねた結果、フィチン酸が抗酸化に関連する特定の遺伝子の発現を促進することを見出して本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、フィチン酸を有効成分とするＮｒｆ２遺伝子発現促進剤を提供する。また、フィチン酸を有効成分とするカタラーゼ遺伝子発現促進剤を提供する。また、フィチン酸を有効成分とするグルタチオンペルオキシダーゼ遺伝子発現促進剤を提供する。

本発明によれば、抗酸化に関連する遺伝子（以下、単に「抗酸化関連遺伝子」と称することがある）であるＮｒｆ２遺伝子、カタラーゼ遺伝子、及びグルタチオンペルオキシダーゼ遺伝子の発現を促進する剤（発現促進剤）を提供することができる。また、前記の促進剤は抗酸化関連遺伝子の発現を強力に促進するため、高い抗酸化作用及び抗がん作用を発揮する。

ＨａＣａＴ細胞を使用した、フィチン酸によるＮｒｆ２遺伝子の発現量（２４時間経過後）を示すグラフであるＨａＣａＴ細胞を使用した、フィチン酸によるＮｒｆ２遺伝子の発現量（４８時間経過後）を示すグラフであるＨａＣａＴ細胞を使用した、フィチン酸によるカタラーゼ遺伝子の発現量（２４時間経過後）を示すグラフであるＨａＣａＴ細胞を使用した、フィチン酸によるカタラーゼ遺伝子の発現量（４８時間経過後）を示すグラフであるＨａＣａＴ細胞を使用した、フィチン酸によるグルタチオンペルオキシダーゼ遺伝子の発現量（２４時間経過後）を示すグラフであるＨａＣａＴ細胞を使用した、フィチン酸によるグルタチオンペルオキシダーゼ遺伝子の発現量（４８時間経過後）を示すグラフであるＮＨＥＫを使用した、フィチン酸によるＮｒｆ２遺伝子の発現量を示すグラフであるＮＨＥＫを使用した、フィチン酸によるカタラーゼ遺伝子の発現量を示すグラフである

本発明は、フィチン酸を有効成分とするＮｒｆ２遺伝子発現促進剤、フィチン酸を有効成分とするカタラーゼ遺伝子発現促進剤、及びフィチン酸を有効成分とするグルタチオンペルオキシダーゼ遺伝子発現促進剤に関する。なお、これらの遺伝子発現促進剤を「本発明の促進剤」と称する場合がある。また、Ｎｒｆ２遺伝子を単に「Ｎｒｆ２」と、カタラーゼ遺伝子を単に「ＣＡＴ」と、グルタチオンペルオキシダーゼ遺伝子を単に「ＧＰｘ」と称することがある。

本発明の促進剤は、フィチン酸を有効成分とすることを特徴とする。フィチン酸は、ＩＮＣＩ名（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｓｍｅｔｉｃＩｎｇｒｅｄｉｅｎｔＤｉｃｔｉｏｎａｒｙａｎｄＨａｎｄｂｏｏｋ，第１６版，第２巻，２０１６年，ｐ．２７２４）で「ＰｈｙｔｉｃＡｃｉｄ」と表記される化合物である。フィチン酸は塩を形成していても良く、フィチン酸塩としては、例えば、フィチン酸ナトリウム、フィチン酸カリウム等のフィチン酸アルカリ金属塩等が挙げられる。フィチン酸は市販品を用いることもでき、例えば、商品名「フィチン酸」（築野ライスファインケミカルズ（株）製）、商品名「５０％フィチン酸溶液」（和光純薬工業（株）製）が挙げられる。

本発明の促進剤は抗酸化関連遺伝子であるＮｒｆ２遺伝子、カタラーゼ遺伝子、及びグルタチオンペルオキシダーゼ遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の発現を促進する。本発明の促進剤は、経口、注射、外用のいずれでも効能を発揮するが、外用剤に配合して用いられることが好ましく、特に皮膚外用剤に配合して用いられることがより好ましい。皮膚外用剤には、皮膚用化粧料、皮膚洗浄剤、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。

本発明の促進剤を含有する外用剤の剤形は特に限定されないが、例えば、液状、ミスト状、霧状、乳液状、クリーム状、ジェル状、ワックス状、フォーム状等の各種剤形に調製して使用できる。また、前記外用剤は、所望の効果の発現が阻害されない範囲であれば、例えば、水、低級アルコール、多価アルコール、糖アルコール、紫外線吸収剤、香料、防腐剤、キレート剤、抗菌剤、酸化防止剤、保湿剤、清涼剤、ビタミン類、界面活性剤、油性原料、カチオン性ポリマー、ノニオン性ポリマー、両性ポリマー、アニオン性ポリマー、植物抽出液、噴射剤、ｐＨ調整剤、アミノ酸、抗炎症剤、収斂剤、色素、増粘剤等のその他の成分と混合し、攪拌すること等により調製することができる。具体的には、化粧水、柔軟化粧品、収れん化粧水、ふき取り用化粧水、アフターシェーブローション、スキンローション、スキンクリーム、マッサージクリーム、マッサージクリーム、クレンジングクリーム、ミルキーローション、リップクリーム、洗顔料、シェービングフォーム、シェービングクリーム、ボディソープ、乳液類、制汗剤、デオドラント剤などの種々の形態の外用剤とすることができ、製剤化については、一般に知られている方法により製造すればよい。

本発明の促進剤を外用剤（特に皮膚外用剤）に使用する場合、外用剤におけるフィチン酸の濃度はその使用態様に応じて適宜調整されるが、遺伝子の発現促進の観点からは０．０１ｍＭ以上であることが好ましく、０．０５〜３．０ｍＭであることが好ましく、０．１〜２．０ｍＭであることが更に好ましい。

本発明の促進剤を外用剤（特に皮膚外用剤）に使用する場合、フィチン酸の配合量はその使用態様に応じて適宜調整されるが、遺伝子の発現促進の観点からは、外用剤全体に対して０．０００６質量％以上配合することが好ましく、０．００３〜０．２質量％の範囲で配合することがより好ましく、０．００６〜０．１５質量％の範囲で配合することが更に好ましい。

本発明の促進剤は、抗酸化関連遺伝子であるＮｒｆ２遺伝子、カタラーゼ遺伝子、及びグルタチオンペルオキシダーゼ遺伝子の少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは全ての遺伝子の発現を促進する剤である。

以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

［使用試薬］
本実施例にて用いた、Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓｍｏｄｉｆｉｌｅｄｅａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、エタノール、クロロホルム、２−プロパノール、Ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅｔｒｅａｔｅｄｗａｔｅｒ（ＤＥＰＣｗａｔｅｒ）、及び５０％フィチン酸溶液は和光純薬工業（株）より購入した。また、ＰｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｄｓａｌｔｓｗｉｔｈｏｕｔＣａａｎｄＭｇ（ＰＢＳ（−））、ＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ、ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥＸＴａｑ（ＴｌｉＲＮａｓｅＨＰｌｕｓ）、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＲｅａｇｅｎｔＫｉｔはタカラバイオ（株）より購入した。また、Ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）はｂｉｏｗｅｓｔ社より購入した。また、ＨａＣａＴ細胞（ヒト表皮角化細胞）はコスモ・バイオ（株）より購入した。また、Ｎｏｒｍａｌｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ（ＮＨＥＫ；正常ヒト表皮角化細胞）、ＮＨＥＫ培養培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２特注ＧＣ別添）は倉敷紡績（株）より購入した。

［遺伝子発現量測定］
（ＨａＣａＴ細胞を用いた測定）
ＨａＣａＴ細胞を、３７℃、５％ＣＯ₂の条件下で１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いて培養した。得られたＨａＣａＴ細胞を、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭが２ｍＬ注入された６ウェルプレート（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−ｏｎｅＧｍｂＨ）に４．０×１０⁵細胞／ウェルとなるように播種した。これを２４時間培養した後に、培地中のフィチン酸濃度が０．１、１．０、及び５．０ｍＭとなるようにフィチン酸（５０％フィチン酸溶液をＮＨＥＫ培養培地で１０ｍＭに希釈したもの）をそれぞれ添加し、２４時間追培養後、及び４８時間追培養後に総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡの逆転写後、リアルタイムＰＣＲによりＮｒｆ２、ＣＡＴ、及びＧＰｘの遺伝子発現量の測定を行い、その結果を図１〜６に記載した。なお、フィチン酸を添加することなく同様の操作を行ったものをコントロールとした。ＲＮＡ抽出、ＲＮＡ逆転写、リアルタイムＰＣＲ等の操作については後述の通りに行った。

（ＮＨＥＫを用いた測定）
ＮＨＥＫを、３７℃、５％ＣＯ₂の条件下でＮＨＥＫ培養培地を用いて培養した。得られたＮＨＥＫを、ＮＨＥＫ培養培地が２ｍＬ注入された６ウェルプレート（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−ｏｎｅＧｍｂＨ）に４．０×１０⁵細胞／ウェルとなるように播種し、８０％コンフルエントになるまで培養した。これに培地中のフィチン酸濃度が０．０５、０．１、１．０、及び５．０ｍＭとなるようにフィチン酸（５０％フィチン酸溶液をＮＨＥＫ培養培地で１０ｍＭに希釈したもの）をそれぞれ添加し、４８時間追培養後に総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡの逆転写後、リアルタイムＰＣＲによりＮｒｆ２、及びＣＡＴの遺伝子発現量を測定・算出し、その結果を図７及び８に記載した。なお、フィチン酸を添加することなく同様の操作を行ったものをコントロールとした。ＲＮＡ抽出、ＲＮＡ逆転写、リアルタイムＰＣＲ等の操作については、以下の通りに行った。

（ＲＮＡ抽出）
ＮＨＥＫをＰＢＳ（−）により洗浄した後、２５０μＬのＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓを添加し、その細胞表面全体に均等になじませ細胞を剥離させた。これをサンプリングチューブ（５０９−ＧＲＤ−Ｑ、ビーエム（株）製）に回収し、室温で５分間静置することにより、核酸から核タンパク質を遊離させた。その後、５０μＬのクロロホルムを加え、乳白状になるまでよく振り交ぜ、再び室温で５分間静置し、１２０００×ｇ、４℃、１５分間の条件でテーブルトップマイクロ冷却遠心機３５００（久保田商事（株）製）にて遠心した。得られた上清６０〜８０μＬを新しいサンプリングチューブに回収し、２５０μＬの２−プロパノールを加えて混合した後、室温で１０分間静置し、１２０００×ｇ、４℃、１０分間の条件で遠心した。遠心により生じたペレットに、オートクレーブ処理水で調整した７５％冷エタノールを加えて洗浄し、７５００×ｇ、４℃、５分間の条件で遠心した。その後、上清を捨てて乾燥し、２０μＬのＤＥＰＣｗａｔｅｒで溶解することにより、総ＲＮＡを抽出した。

（ＲＮＡ逆転写）
逆転写反応はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＲｅａｇｅｎｔＫｉｔを用いて行った。まず抽出したＲＮＡの濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ１０００ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（サーモフィッシャーサイエンス（株）製）により測定し、ＤＥＰＣｗａｔｅｒにて５００ｎｇ／６．５μＬに調整した。得られた調整液６．５μＬに、２μＬの５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＢｕｆｆｅｒ（ｆｏｒＲｅａｌＴｉｍｅ）、０．５μＬのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＥｎｚｙｍｅＭｉｘＩ、０．５μＬのＯｌｉｇｏｄＴＰｒｉｍｅｒ（５０μＭ）、０．５μＬのＲａｎｄｏｍ６ｍｅｒ（１００μＭ）を加え、１０μＬの逆転写反応溶液を調製した。なお、これらの調製は氷上で行った。調製した反応液はＶｅｒｉｔｉ９６−ｗｅｌｌサーマルサイクラー（サーモフィッシャーサイエンス（株）製）により３７℃・１５分、８５℃・５秒の条件で逆転写反応を行い、ｃＤＮＡ溶液を調製した。

（リアルタイムＰＣＲ）
リアルタイムＰＣＲはＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥＸＴａｑを用いて行い、インターカレーター法により増幅するｃＤＮＡをリアルタイムに検出した。各抗酸化関連遺伝子に対して使用したＦｏｒｗａｒｄプライマー、及びＲｅｖｅｒｓｅプライマーを表１に示す。

１０μＬのＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（×２）、０．４μＬのＦｏｒｗａｒｄプライマー（１０μＭ）、０．４μＬのＲｅｖｅｒｓｅプライマー（１０μＭ）、０．４μＬのＲＯＸＲｅｆｅｒｅｎｃｅ（５０×）、１μＬのｃＤＮＡ溶液、及び６．８μＬのｄＨ₂０を混合することにより、反応液を調製した。この反応液をＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＲｅａｌ−ＴｉｍｅＣｙｃｌｅｒ（サーモフィッシャーサイエンス（株）製）によりリアルタイムＰＣＲを行った。この時の反応条件はＨｏｌｄｉｎｇｓｔａｇｅ：９５℃・３０秒、Ｃｙｃｌｉｎｇｓｔａｇｅ：９５℃・５秒、６０℃・３０秒を４０サイクル、ＭｅｌｔＣｕｒｖｅｓｔａｇｅ：９５℃・１５秒、６０℃・６０秒、９５℃・１５秒で行い、その解析はΔΔＣｔ法を用いた相対定量で行った。

すべての結果は平均と標準偏差値で示し、統計ソフトウェア（ＳＡＳＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＥｄｉｔｉｏｎ（ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅ））を用いたＤｕｎｎｅｔｔの検定で統計処理を行った。

［結果］
図１〜８に示される通り、フィチン酸が抗酸化関連遺伝子であるＮｒｆ２遺伝子、カタラーゼ遺伝子、及びグルタチオンペルオキシダーゼ遺伝子の発現を促進することが明らかになった。このため、フィチン酸は、１種だけではなく２種以上の抗酸化関連遺伝子の発現を促進することが可能であることから、抗酸化力の向上に繋がることが示唆される。

特に、正常ヒト表皮角化細胞であるＮＨＥＫを用いた抗酸化関連遺伝子の発現量測定において、フィチン酸の濃度が０．１〜１．０ｍＭの間である場合にＮｒｆ２遺伝子及びカタラーゼ遺伝子の発現量の増加が認められた（ｐ＜０．００１）。なお、フィチン酸の濃度が５．０ｍＭである場合は、フィチン酸のキレート剤としての効力により、細胞中のカルシウムイオン濃度が低下し、その結果、遺伝子発現量が減少したと考えられる。したがって、上記のフィチン酸の濃度範囲が抗酸化関連遺伝子の発現促進に特に好ましいことが理解できる。

以上より、本発明の促進剤は、抗酸化に関連する遺伝子であるＮｒｆ２遺伝子、カタラーゼ遺伝子、及びグルタチオンペルオキシダーゼ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を促進することが明らかとなった。

Claims

フィチン酸を有効成分とするＮｒｆ２遺伝子発現促進剤。