JP6824748B2 - 顕微鏡パラメータの設定方法および観察方法 - Google Patents
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Description
本発明は、顕微鏡パラメータの設定方法および観察方法に関するものである。
従来、蛍光の試料による散乱のため、試料の深い位置で発生した蛍光に基づく蛍光画像が、試料の浅い位置で発生した蛍光に基づく蛍光画像よりも暗くなる不都合を解消するために、取得される蛍光画像の輝度条件が励起光の集光位置の深さ毎にほぼ同一となるように光源、走査部または蛍光検出部の少なくとも１つの顕微鏡パラメータを調節する走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
取得された蛍光画像に対しては、多くの場合、例えば、細胞の核の数を数える等の定量解析が行われるので、設定される顕微鏡パラメータとしては、定量解析を行うのに適した蛍光画像を取得可能な顕微鏡パラメータであることが必要となる。しかしながら、定量解析に適した蛍光画像であるか否かの判断は容易ではなく、試料の深さ毎に取得される蛍光画像の輝度条件を揃えるだけの特許文献１の顕微鏡では、定量解析に適した蛍光画像の取得は困難である。
また、定量解析に適した顕微鏡パラメータが設定されないままの状態で顕微鏡画像が取得された後に、高精度の定量解析が困難であると判定される場合には、再度、顕微鏡画像を取得する必要があり、手間がかかるとともに、試料の褪色等の問題が発生する。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、定量解析に適した顕微鏡パラメータを容易に設定することができる顕微鏡パラメータの設定方法および観察方法を提供することを目的としている。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、定量解析に適した顕微鏡パラメータを容易に設定することができる顕微鏡パラメータの設定方法および観察方法を提供することを目的としている。
上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、標本に対する焦点位置を設定するステップと、顕微鏡パラメータを調整するステップと、調整された前記顕微鏡パラメータを用いて、設定された前記焦点位置における前記標本の画像を取得するステップと、取得された前記画像内における観察対象の形状を認識するステップと、認識された前記観察対象の形状を前記画像に重畳して表示するステップと、重畳表示された前記画像および前記観察対象の形状に基づいて前記顕微鏡パラメータの適否を判定するステップと、適正であると判定された前記顕微鏡パラメータを前記焦点位置と対応づけて記憶するステップとを含む顕微鏡パラメータの設定方法を提供する。
本発明の一態様は、標本に対する焦点位置を設定するステップと、顕微鏡パラメータを調整するステップと、調整された前記顕微鏡パラメータを用いて、設定された前記焦点位置における前記標本の画像を取得するステップと、取得された前記画像内における観察対象の形状を認識するステップと、認識された前記観察対象の形状を前記画像に重畳して表示するステップと、重畳表示された前記画像および前記観察対象の形状に基づいて前記顕微鏡パラメータの適否を判定するステップと、適正であると判定された前記顕微鏡パラメータを前記焦点位置と対応づけて記憶するステップとを含む顕微鏡パラメータの設定方法を提供する。
本態様によれば、標本に対する焦点位置が設定され、顕微鏡パラメータが調整された状態で、調整された顕微鏡パラメータを用いて設定された焦点位置における標本の画像が取得されると、取得された画像内の観察対象の形状が認識され、認識された形状が取得された画像に重畳して表示される。これにより、取得された画像が、観察対象の形状を精度よく認識し得る適正な画像であるか否かが判定されるので、適正な画像であると判定された場合には、その画像を取得した際の顕微鏡パラメータと焦点位置とが対応づけられて記憶される。これにより、その後に行われる定量解析のための画像取得の際に、各焦点位置について対応づけて記憶されている顕微鏡パラメータを用いて画像を取得することにより、精度よく定量解析を行うことができる。
上記態様においては、前記顕微鏡パラメータが適正であると判定されたときに、該判定の基礎となった前記画像を前記焦点位置と対応づけて記憶するステップを含んでいてもよい。
このようにすることで、顕微鏡パラメータが適正であると判定した際には、判定の基礎となった適正な画像が既に取得されているので、その画像を定量解析のために再度取得する手間を省き、定量解析に要する時間を短縮することができる。
このようにすることで、顕微鏡パラメータが適正であると判定した際には、判定の基礎となった適正な画像が既に取得されているので、その画像を定量解析のために再度取得する手間を省き、定量解析に要する時間を短縮することができる。
本発明の他の態様は、標本に対する焦点位置を設定するステップと、顕微鏡パラメータを調整するステップと、調整された前記顕微鏡パラメータを用いて、設定された前記焦点位置における前記標本の画像を取得するステップと、取得された前記画像内における観察対象の形状を認識するステップと、認識された前記観察対象の形状を前記画像に重畳して表示するステップと、重畳表示された前記画像および前記観察対象の形状に基づいて前記顕微鏡パラメータの適否を判定するステップと、適正であると判定された前記顕微鏡パラメータを前記焦点位置と対応づけて記憶するステップと、前記焦点位置について対応づけて記憶されている前記顕微鏡パラメータを用いて観察用の画像を取得するステップと、取得された前記観察用の画像に基づいて定量解析を実行するステップとを含む観察方法を提供する。
本態様によれば、標本に対する焦点位置が設定され、顕微鏡パラメータが調整された状態で、調整された顕微鏡パラメータを用いて設定された焦点位置における標本の画像が取得されると、取得された画像内の観察対象の形状が認識され、認識された形状が取得された画像に重畳して表示される。これにより、取得された画像が、観察対象の形状を精度よく認識し得る適正な画像であるか否かが判定されるので、適正な画像であると判定された場合には、その画像を取得した際の顕微鏡パラメータと焦点位置とが対応づけられて記憶される。
そして、記憶されている顕微鏡パラメータを用いて取得された観察用の画像に基づいて定量解析が行われる。これにより、定量解析のための観察用の画像取得前に適正な顕微鏡パラメータを設定するので、観察用の画像取得後に顕微鏡パラメータが不適切であったことが判明して観察用の画像を取得し直さなければならない不都合の発生を未然に防止することができる。
本発明によれば、定量解析に適した顕微鏡パラメータを容易に設定することができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係る顕微鏡パラメータの設定方法および観察方法について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡パラメータの設定方法は、図１に示される顕微鏡システム１において実施されるものである。
本実施形態に係る顕微鏡パラメータの設定方法は、図１に示される顕微鏡システム１において実施されるものである。
この顕微鏡システム１は、顕微鏡本体２と、顕微鏡本体２を制御する制御部３と、制御部３に対して作業者が入力を行う入力部４と、制御部３に接続された記憶部５と、顕微鏡本体２により取得された画像を処理する画像処理部６と、該画像処理部６により処理された画像を表示する表示部７とを備えている。
顕微鏡本体２は、照明光を射出する光源８と、標本Ｘを搭載して３次元的に移動させるステージ９と、光源８からの光を標本Ｘに集光する対物レンズ１０を含む照明光学系１１と、標本Ｘにおいて発生し対物レンズ１０により集光された光を検出する光検出器１２を含む検出光学系１３とを備えている。図中、符号１７は、光源８からの照明光を標本Ｘに向けて反射し、標本Ｘからの光を透過するダイクロイックミラーである。
画像処理部６は、光検出器１２により検出された光の強度情報に基づいてライブ画像（画像）を生成する画像生成部１４と、画像生成部１４により生成されたライブ画像を解析して観察対象の形状を認識する形状認識部１５と、画像生成部１４により生成されたライブ画像に形状認識部１５により認識された観察対象の形状を重畳した合成画像を生成する合成部１６とを備えている。
例えば、標本Ｘとして生体組織を採用する場合には、観察対象として細胞の核を挙げることができ、定量解析としては細胞の核の数を計数することが行われる。
この場合には、形状認識部１５においては、ライブ画像を解析して細胞の核の形状を認識し、合成部１６においては、認識された核の形状がライブ画像に重畳された合成画像が生成されるようになっている。
この場合には、形状認識部１５においては、ライブ画像を解析して細胞の核の形状を認識し、合成部１６においては、認識された核の形状がライブ画像に重畳された合成画像が生成されるようになっている。
入力部４は、作業者が、３次元方向の画像取得位置を入力するとともに、観察に必要な顕微鏡パラメータとして、光源８から発生する照明光の強度、照明光学系１１および検出光学系１３の設定値の少なくとも１つを調節するための入力を行うようになっている。また、入力部４は、表示部７に表示された合成画像により、顕微鏡パラメータが適正であるか否かの入力を行うようになっている。また、顕微鏡パラメータとして、対物レンズ１０の補正環を採用してもよい。この場合、標本Ｘの屈折率と対物レンズ１０の液浸媒体の屈折率とには差があるため、球面収差の発生量が標本Ｘの観察深さによって異なるので、観察深さに応じた調整を好適に実行することができる。
入力部４により入力される３次元方向の画像取得位置としては、顕微鏡パラメータ設定モードにおいては、例えば、所定の水平２次元方向の観察範囲と、該観察範囲についての鉛直方向、すなわち、対物レンズ１０の光軸Ｓ方向に間隔をあけた複数の焦点位置とを挙げることができる。
また、観察モードにおいては、入力部４により入力される３次元方向の画像取得位置としては、例えば、所定の水平２次元方向の観察範囲と、該観察範囲について撮影を行う焦点位置の鉛直方向の送り量とを挙げることができる。
また、観察モードにおいては、入力部４により入力される３次元方向の画像取得位置としては、例えば、所定の水平２次元方向の観察範囲と、該観察範囲について撮影を行う焦点位置の鉛直方向の送り量とを挙げることができる。
制御部３は、入力部４により設定された画像取得位置および調整された顕微鏡パラメータに基づいて顕微鏡本体２を制御するようになっている。また、制御部３は、入力部４により顕微鏡パラメータが適正である旨の入力がなされたときには、その顕微鏡パラメータが設定された画像取得位置、特に、照明光の焦点位置と顕微鏡パラメータとを対応づけて記憶部５に記憶するようになっている。
また、制御部３は、観察モードにおいては、焦点位置と対応づけて記憶されている顕微鏡パラメータを記憶部５から読み出して、各焦点位置における顕微鏡パラメータを自動的に設定するようになっている。記憶部５に記憶されている焦点位置については対応づけて記憶されている顕微鏡パラメータを設定し、記憶部５に記憶されていない焦点位置については、記憶されている顕微鏡パラメータを補間することにより設定するようになっている。
このように構成された顕微鏡システム１を用いた本実施形態に係る顕微鏡パラメータの設定方法について以下に説明する。
顕微鏡パラメータを設定するには、図２に示されるように、制御部３を顕微鏡パラメータ設定モードで作動させ、まず、作業者が、入力部４から顕微鏡パラメータを設定しようとする対物レンズ１０の焦点位置を設定し（ステップＳ１）、当該焦点位置における顕微鏡パラメータを適宜調整して設定する（ステップＳ２）。また、作業者は入力部４から、水平方向の画像取得範囲を設定する。
顕微鏡パラメータを設定するには、図２に示されるように、制御部３を顕微鏡パラメータ設定モードで作動させ、まず、作業者が、入力部４から顕微鏡パラメータを設定しようとする対物レンズ１０の焦点位置を設定し（ステップＳ１）、当該焦点位置における顕微鏡パラメータを適宜調整して設定する（ステップＳ２）。また、作業者は入力部４から、水平方向の画像取得範囲を設定する。
制御部３は、設定された焦点位置および画像取得範囲となるように照明光学系１１およびステージ９を作動させ、調整された顕微鏡パラメータとなるように光源８、照明光学系１１および検出光学系１３を制御して、ライブ画像を取得する（ステップＳ３）。
取得されたライブ画像は、画像処理部６に送られて、形状認識部１５により細胞の核の形状が認識され（ステップＳ４）、認識された形状をライブ画像に重畳した合成画像が合成部１６において生成される（ステップＳ５）。生成された合成画像は表示部７に表示される（ステップＳ６）。
取得されたライブ画像は、画像処理部６に送られて、形状認識部１５により細胞の核の形状が認識され（ステップＳ４）、認識された形状をライブ画像に重畳した合成画像が合成部１６において生成される（ステップＳ５）。生成された合成画像は表示部７に表示される（ステップＳ６）。
作業者は表示部７に表示された合成画像を確認することにより、細胞の核の形状を認識するための適正な顕微鏡パラメータであったか否かを判定する（ステップＳ７）。例えば、図３および図４に異なる顕微鏡パラメータによって取得されたライブ画像例を示す。これらのライブ画像を比較した場合、一見すると図３に示される明るいライブ画像の方が、図４に示される暗いライブ画像よりも定量解析に適しているかのように見える。
しかしながら、図５および図６に示されるように、図３および図４のライブ画像にそれぞれのライブ画像に基づいて細胞の核の形状を認識した結果を重畳した合成画像を比較すると、明るいライブ画像に基づく核の形状は、図５の矢印に示されるように複数の核が単一の核であるかのように認識されてしまっている。これに対し、図６の矢印に示すように、比較的暗いライブ画像に基づく核の形状は、全ての核が別々に認識されている。その結果、図４のライブ画像を取得した際の顕微鏡パラメータの方が精密な定量解析には適していると容易に判断することができる。
ステップＳ７における判定の結果、適正な顕微鏡パラメータではないと判定された場合にはステップＳ２からの工程が繰り返される。
ステップＳ７における判定の結果、適正な顕微鏡パラメータであると判定された場合には、当該顕微鏡パラメータと焦点位置とを対応づけて記憶部５に記憶する（ステップＳ８）。
ステップＳ７における判定の結果、適正な顕微鏡パラメータであると判定された場合には、当該顕微鏡パラメータと焦点位置とを対応づけて記憶部５に記憶する（ステップＳ８）。
他の焦点位置についても顕微鏡パラメータを設定するか否かが判定され（ステップＳ９）、設定する場合にはステップＳ１からの工程が繰り返され、設定しない場合には終了する。
このように本実施形態に係る顕微鏡パラメータの設定方法によれば、取得されたライブ画像から観察対象である細胞の核の形状を認識する処理を実施して、認識結果をライブ画像に重畳して表示することにより、作業者が顕微鏡パラメータの適否を感覚的にではなく、客観的に判定することができ、精密な定量解析を行うことができる顕微鏡パラメータを簡易に設定することができるという利点がある。
そして、本実施形態に係る観察方法によれば、観察モードにおいて、このようにして複数の焦点位置において設定された適正な顕微鏡パラメータを用いて観察用の画像を取得し、取得された観察用の画像により、精密な定量解析を行うことができる。これにより、定量解析のための観察用の画像を取得する前に適正な顕微鏡パラメータを設定するので、観察用の画像取得後に顕微鏡パラメータが不適切であったことが判明して観察用の画像を取得し直さなければならない不都合の発生を未然に防止することができる。
なお、本実施形態においては、顕微鏡パラメータ設定モードにおいて取得して記憶しておいた複数点の焦点位置と顕微鏡パラメータとの対応付けに基づいて、観察パラメータにおいては、全ての焦点位置における顕微鏡パラメータを補間により算出して観察用の画像の取得を行い、取得された画像に基づいて定量解析を行うこととした。これに代えて、顕微鏡パラメータ設定モードにおいて、顕微鏡パラメータが適正であると判定した場合には、設定に使用したライブ画像についても焦点位置に対応づけて記憶し、定量解析用の画像取得の際には、記憶されている焦点位置における画像取得を省略してもよい。
これにより、画像取得に要する時間を短縮し、定量解析結果を迅速に得ることができるとともに、標本Ｘへの照明光の照射を低減して、標本Ｘに与えるダメージを低減することができる。
また、本実施形態においては、観察対象として生体組織の細胞の核を例示したが、これに代えて他の任意の観察対象を定量解析する際に用いることにしてもよい。
また、顕微鏡観察方法としては、蛍光観察に限定されるものではなく他の任意の観察方法に適用してもよい。
また、本実施形態においては、観察対象として生体組織の細胞の核を例示したが、これに代えて他の任意の観察対象を定量解析する際に用いることにしてもよい。
また、顕微鏡観察方法としては、蛍光観察に限定されるものではなく他の任意の観察方法に適用してもよい。
Ｓ１，Ｓ３，Ｓ４，Ｓ５，Ｓ６，Ｓ７，Ｓ８ ステップ
Ｘ 標本
Ｘ 標本
Claims (4)
- 標本に対する焦点位置を設定するステップと、
顕微鏡パラメータを調整するステップと、
調整された前記顕微鏡パラメータを用いて、設定された前記焦点位置における前記標本の画像を取得するステップと、
取得された前記画像内における観察対象の形状を認識するステップと、
認識された前記観察対象の形状を前記画像に重畳して表示するステップと、
重畳表示された前記画像および前記観察対象の形状に基づいて前記顕微鏡パラメータの適否を判定するステップと、
適正であると判定された前記顕微鏡パラメータを前記焦点位置と対応づけて記憶するステップとを含む顕微鏡パラメータの設定方法。 - 前記顕微鏡パラメータが適正であると判定されたときに、該判定の基礎となった前記画像を前記焦点位置と対応づけて記憶するステップを含む請求項１に記載の顕微鏡パラメータの設定方法。
- 標本に対する焦点位置を設定するステップと、
顕微鏡パラメータを調整するステップと、
調整された前記顕微鏡パラメータを用いて、設定された前記焦点位置における前記標本の画像を取得するステップと、
取得された前記画像内における観察対象の形状を認識するステップと、
認識された前記観察対象の形状を前記画像に重畳して表示するステップと、
重畳表示された前記画像および前記観察対象の形状に基づいて前記顕微鏡パラメータの適否を判定するステップと、
適正であると判定された前記顕微鏡パラメータを前記焦点位置と対応づけて記憶するステップと、
前記焦点位置について対応づけて記憶されている前記顕微鏡パラメータを用いて観察用の画像を取得するステップと、
取得された前記観察用の画像に基づいて定量解析を実行するステップとを含む観察方法。 - 前記観察対象は、細胞の核であり、
前記定量解析は、前記細胞の核の数を計数することである、請求項３に記載の観察方法。
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