JP6257294B2 - 顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡装置に関するものである。

従来、標本の高輝度領域と低輝度領域の両方を観察する顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照）。特許文献１に記載の顕微鏡装置は、標本に照射するレーザ光の強度を高強度から低強度の順に変更して蛍光強度が異なる複数の画像を生成し、これらの画像を合成することにより、広いダイナミックレンジの合成画像を取得して標本の高輝度領域と低輝度領域の両方を観察可能にするようになっている。また、特許文献２に記載の顕微鏡装置は、標本の画像におけるピクセル輝度ごとにゲイン補正することにより、標本の高輝度領域と低輝度領域の両方を観察可能にするようになっている。

特開２０１２−１２８３５４号公報 米国特許出願公開第２０１２／０２０５５１９号明細書

しかしながら、特許文献１に記載の顕微鏡装置のように、標本に対してレーザ光を複数回照射して複数の画像を生成するのでは、画像取得に時間がかかるとともに蛍光が褪色し観察精度が低下するという不都合がある。また、特許文献２に記載の顕微鏡装置では、細胞を識別しないため、観察対象ごとに最適な撮像条件を設定することが困難であり、また、本来は観察対象でないゴミなどのノイズを標本の一部と誤認して観察対象にしてしまうおそれがある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、観察対象としての複数の標本あるいは標本内の複数の観察対象を最適な観察条件で精度よく観察することができる顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、照明光を発生する光源と、該光源から発せられた照明光を標本上で２次元的に走査させる観察光学系と、該観察光学系により前記照明光が走査されることにより前記標本において発生する蛍光を検出して該標本の画像を生成する画像生成部と、これらの光源および画像生成部を所定の照射条件または所定の画像生成条件に従い制御する制御部と、前記画像生成部により生成された画像を解析して一画像上で前記標本における複数の観察対象を抽出する画像解析部と、該画像解析部により抽出された観察対象ごとの画像上の実際の輝度と所望の輝度との相違に基づいて、前記観察対象ごとに画像上の実際の輝度が所望の輝度を満たすように、一画像内で前記観察対象ごとに前記照射条件および／または前記画像生成条件を変更する条件変更部とを備え、前記制御部が、前記条件変更部により前記観察対象ごとに前記照射条件および／または前記画像生成条件が変更された場合に、一画像において、前記観察対象ごとに変更後の前記照射条件で前記照明光を発生させるよう前記観察対象ごとに前記照射条件を切り替えながら前記光源を再駆動し、および／または、前記観察対象ごとに変更後の前記画像生成条件で前記画像を生成させるよう前記観察対象ごとに前記画像生成条件を切り替えながら前記画像生成部を再駆動する顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、制御部により、所定の照射条件で光源から照明光が発せられて標本に照射され、画像生成部により標本からの蛍光が検出されて所定の画像生成条件で画像が生成される。そして、画像解析部により画像上で抽出される標本における観察対象ごとに、画像上の実際の輝度が所望の輝度を満たすように条件変更部により変更された照射条件および／または画像生成条件に従い、制御部により光源および画像生成部が再駆動される。

したがって、観察対象としての標本ごとに明るさが異なる場合や標本内の観察対象ごとに明るさが異なる場合であっても、画像上で観察対象ごとに所望の輝度で表示し観察し易くすることができる。また、画像解析部により、ゴミなどのノイズを標本の一部と誤認して観察対象としてしまうのを防ぐことができる。これにより、観察対象としての複数の標本あるいは標本内の複数の観察対象を最適な観察条件で精度よく観察することができる。

上記構成においては、前記制御部が、前記観察対象単位、画像上の画素単位、または、複数の画素を含む複数画素領域単位で変更後の前記照射条件および／または前記画像生成条件を採用することとしてもよい。

標本の位置や周囲の密度、標本の構成部分の蛍光特性や蛍光たんぱくの発現量等により、蛍光の明るさが異なる。そこで、このように構成することで、観察目的あるいは観察態様に応じて所望の範囲を選択的に最適な観察条件で観察することができる。

上記構成においては、前記条件変更部が、前記観察対象と前記所望の輝度とを対応付けたテーブルまたは計算式に基づいて前記照射条件および／または前記画像生成条件を変更することとしてもよい。

このように構成することで、テーブルまたは計算式を予め用意しておくだけで、観察中は照射条件および画像生成条件を迅速かつ簡易に変更することができる。これにより、所望の観察タイミングを逃すのを抑制することができる。
上記構成においては、前記照射条件がレーザパワー値であってもよいし、前記画像生成条件が、画像信号を増幅するゲイン値であってもよい。

本発明によれば、観察対象としての複数の標本あるいは標本内の複数の観察対象を最適な観察条件で精度よく観察することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置の概略を示すブロック図である。 図１の顕微鏡装置により観察する標本の一例としての細胞を示す図である。 図１の顕微鏡装置による標本の観察を説明するフローチャートである。 （ａ）は細胞の細胞体の事前撮影時の輝度と本撮影時の輝度とを示す図であり、（ｂ）は細胞のいずれかの神経突起の事前撮影時の輝度と本撮影時の輝度とを示す図であり、（ｃ）は細胞の他の神経突起の事前撮影時の輝度と本撮影時の輝度とを示す図である。 （ａ）は事前撮影で得られた画像を示す図であり、（ｂ）は（ａ）の画像中で認識された細胞を示す図であり、（ｃ）は（ｂ）において認識された細胞の輝度を補正した様子を示すである。 細胞の画像上の輝度を補正する前と補正した後の様子を示す図である。 事前撮影により得られた画像における各細胞の輝度を示す図である。 複数の画素を含む領域単位を示す図である。 細胞の神経突起の一部に相当する１画素を示す図である。 （ａ）は細胞の核や核周辺を示す図であり、（ｂ）は細胞の枝分かれした神経突起を示す図である。 観察対象としての細胞を含む領域内と細胞を含まない領域外とでレーザパワーを変更する様子を示す図である。 標本の輝度とレーザパワー値およびゲイン値とを対応付けたテーブルの一例を示す図である。

以下、本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置について、図面を参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１は、図１に示すように、レーザ光（照明光）を発生する光源３と、光源３から発せられたレーザ光が照射されることにより細胞のような標本Ｓ（図２等参照。）において発生する蛍光を検出して標本Ｓの画像を生成する画像生成部５と、光源３および画像生成部５を制御する制御部７と、画像生成部５により生成された画像を表示するモニタ９と、画像生成部５により生成された画像を解析する画像解析部１１と、画像解析部１１の解析結果に基づいて光源３の照射条件および画像生成部５の画像生成条件を変更する条件変更部１３とを備えている。また、顕微鏡装置１には、光源３から発せられたレーザ光を標本Ｓ上で２次元的に走査させるスキャナを有する観察光学系（図示略）が備えられている。

画像生成部５としては、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅｄ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）が用いることができ、生成した画像の画像信号をモニタ９および画像解析部１１に送るようになっている。

制御部７は、所定の照射条件および所定の画像生成条件に従い光源３および画像生成部５を制御して標本Ｓの画像を取得させる事前撮影と、条件変更部１３により変更された照射条件および画像生成条件に従い光源３および画像生成部５を再駆動して標本Ｓの画像を際取得させる本撮影とを行わせるようになっている。例えば、本撮影の前日や１時間前等に事前撮影を行うこととすればよい。

照射条件は、例えばレーザ光の強度を示すレーザパワー値であり、画像生成条件は、例えば画像生成部５から出力される画像信号を増幅するゲイン値である。事前撮影は、本撮影と比較して、例えば、低いレーザパワー値または低いゲイン値により粗い画像を取得するようになっている。事前撮影において取得した画像上の標本Ｓの平均輝度が所定値以下の場合は撮り直しすることとしてもよい。

画像解析部１１は、例えば、大きさ、形状、輝度等により、図２に示すような標本Ｓとしての細胞を認識し、ゴミなどのノイズと区別するようになっている。これにより、ゴミなどのノイズを標本Ｓの一部と誤認して観察対象としてしまうのを防ぐようになっている。

また、画像解析部１１は、例えば、認識した細胞における細胞体Ｂや複数の神経突起Ｌ（Ｌ１，Ｌ２）等をそれぞれ個々の観察対象として抽出するようになっている。また、画像解析部１１は、抽出した観察対象の細胞に細胞番号を付けて識別するようになっている。また、画像解析部１１は、抽出したこれらの観察対象ごとに位置と平均輝度とを検出するようになっている。神経突起Ｌ１，Ｌ２については、大きさや太さまたは長さ等も検出することとしてもよい。

条件変更部１３は、画像解析部１１により抽出された観察対象ごとに画像上の実際の輝度と所望の輝度とを比較し、その比率に基づいて画像上の実際の輝度が所望の輝度を満たすように、観察対象ごとに照射条件および画像生成条件を変更するようになっている。

この条件変更部１３は、例えば、観察対象ごとの所望の輝度を示したテンプレートデータを有しており、観察対象ごとにテンプレートデータに示されている輝度が満たされるように照射条件としてのレーザパワー値および画像生成条件としてのゲイン値を実数倍するようになっている。例えば、複数の神経突起Ｌ１，Ｌ２は一定の輝度に規格化することとしてもよい。

このように構成された顕微鏡装置１の作用について、図３のフローチャートを参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１により標本Ｓを観察するには、まず、標本Ｓの事前撮影を行う（ステップＳ１）。
制御部７により、光源３から所定のレーザパワーでレーザ光を発生させて標本Ｓに照射し、標本Ｓにおいて発生する蛍光を画像生成部５により検出して標本Ｓの画像を生成する。事前撮影により取得された画像は、細胞体Ｂと比較して神経突起Ｌ１，Ｌ２の輝度が低く見え難いことがある。

画像生成部５により、生成した画像の画像信号が所定のゲインで増幅され、画像解析部１１に送られる。画像解析部１１においては、画像生成部５から送られてきた画像信号が解析されて標本Ｓとしての細胞が認識され、図２に示すような細胞体Ｂと神経突起Ｌ１，Ｌ２とがそれぞれ観察対象として抽出される（ステップＳ２）。そして、画像解析部１１により、細胞体Ｂと神経突起Ｌ１，Ｌ２のそれぞれの位置と平均輝度が検出されて条件変更部１３に送られる。

条件変更部１３においては、テンプレートデータから細胞体Ｂと神経突起Ｌ１，Ｌ２の所望の輝度が読み出される。そして、条件変更部１３により、例えば、細胞体Ｂの画像上の実際の平均輝度Ｘ１と所望の輝度Ｙ１、神経突起Ｌ１の画像上の実際の平均輝度Ｘ２と所望の輝度Ｙ２、神経突起Ｌ２の画像上の実際の平均輝度Ｘ３と所望の輝度Ｙ３とがそれぞれ比較され、Ｙ１／Ｘ１、Ｙ２／Ｘ２、Ｙ３／Ｘ３によりそれぞれの明るさ比が算出される。また、画像解析部１１は、細胞体Ｂと神経突起Ｌの２種類に分類して、テンプレートデータから細胞体Ｂの所望の輝度値と神経突起Ｌの所望の輝度値を読み出してもよい。

次いで、条件変更部１３により、細胞体Ｂ、神経突起Ｌ１，Ｌ２ごとに所定の照射条件としてのレーザパワー値および所定の画像生成条件としてのゲイン値に対してそれぞれ対応する明るさ比が乗算され、細胞体Ｂ、神経突起Ｌ１，Ｌ２ごとに新たな照射条件および画像生成条件が決定される（ステップＳ３）。そして、条件変更部１３により、細胞体Ｂ、神経突起Ｌ１，Ｌ２ごとに決定した新たな照射条件および画像生成条件が設定される（ステップＳ４）。

次いで、制御部７により、条件変更部１３により細胞体Ｂ、神経突起Ｌ１，Ｌ２ごとに変更された照射条件および画像生成条件で光源３および画像生成部５が再駆動される。この場合、細胞体Ｂ、神経突起Ｌ１，Ｌ２ごとに、それぞれ変更後の照射条件で発せられたレーザ光が観察光学系により走査され、これらの細胞体Ｂ、神経突起Ｌ１，Ｌ２からの蛍光に基づいてそれぞれ変更後の画像生成条件で画像が生成される（ステップＳ５）。

そして、図４（ａ），（ｂ），（ｃ）に示すように、細胞体Ｂ、神経突起Ｌ１，Ｌ２ごとに画像上の輝度が所望の輝度に補正され、モニタ９に表示される。図４（ａ），（ｂ），（ｃ）において、縦軸は輝度を示し、横軸は断面位置を示している。また、二点鎖線は事前撮影時の輝度を示し、実線は本撮影時の輝度を示している。これにより、細胞体Ｂ、神経突起Ｌ１，Ｌ２がそれぞれ所望の輝度で表示された画像によって標本Ｓを観察することができる。

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡装置１によれば、輝度が高い細胞体Ｂと輝度が低い神経突起Ｌ１，Ｌ２のように、標本Ｓ内の観察対象ごとに明るさが異なる場合であっても、画像上で観察対象ごとに所望の輝度で表示し観察し易くすることができる。また、画像解析部１１により、ゴミなどのノイズを標本Ｓの一部と誤認して観察対象としてしまうのを防ぐことができる。これにより、標本Ｓ内の複数の観察対象を最適な観察条件で精度よく観察することができる。また、標本Ｓに対してレーザ光を複数回照射して複数の画像を生成する必要がなく、画像取得かかる時間を短縮し蛍光が褪色するのを抑制することができる。

本実施形態においては、観察対象として標本Ｓにおける細胞体Ｂおよび神経突起Ｌ１，Ｌ２を例示して説明したが、例えば、複数の細胞をそれぞれ観察対象とし、細胞単位で照射条件および画像生成条件を調整して所望の輝度に補正することとしてもよい。

この場合、画像解析部１１により、図５（ａ）に示すような事前撮影で得られた画像を解析し、大きさや形状等の相違により、図５（ｂ）に示すように標本Ｓとしての細胞Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３を認識してこれらを観察対象として抽出することとすればよい。これにより、ゴミ等のノイズを観察対象から除去することができる。

次いで、条件変更部１３により、細胞Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３のそれぞれ画像上の実際の輝度と所望の輝度を比較してそれぞれの明るさ比を算出し、細胞Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３ごとに照射条件および画像生成条件を変更して本撮影することとすればよい。そして、図５（ｃ）に示すように、細胞Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３ごとに細胞単位で画像上の輝度を所望の値に規格化してモニタ９に表示することとすればよい。

このようにすることで、観察対象としての細胞Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３ごとに明るさが異なる場合において、これら複数の標本Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３をそれぞれ最適な観察条件で精度よく観察することができる。これにより、図６に示すように、本来は暗く表示される細胞Ｓ２であっても、細胞Ｓ２が有する粒や皺のような細かい特徴や構造まで詳細に表示させ、より正確な観察を行うことができる。また、図７に示すように細胞Ｓ２，Ｓ３の明るさとバックグラウンドの明るさとの差が小さく見え難い場合であっても、細胞Ｓ２，Ｓ３の明るさとバクグラウンドとの明るさの差を細胞Ｓ１のように明確にして観察し易くすることができる。図７において、縦軸は輝度を示し、横軸は細胞の位置を示している。

また、図８に示すように、複数の画素を含む領域単位で照射条件および画像生成条件を変更して観察することとしてもよい。また、図９に示すように、画像上の画素単位で照射条件および生成条件を変更して観察することとしてもよい。図９は、神経突起Ｌの一部に相当する画素の照射条件および生成条件を補正して表示した場合を示している。

このようにすることで、位置や周囲の細胞密度により細胞ごとに環境が異なる場合や、細胞の構成部分の蛍光特性や蛍光たんぱくの発現量等にばらつきがある場合のように、観察対象ごとに画像上の輝度が異なる場合であっても、観察目的あるいは観察態様に応じて所望の範囲を選択的に最適な観察条件で観察することができる。

また、例えば、図１０（ａ）に示すように、標本Ｓとしての細胞を細胞質、小器官、核、各周辺等に細かく分けて、それぞれを個々の観察対象にしてもよいし、図１０（ｂ）に示すように、神経突起Ｌを枝ごとに分けて、枝ごとに個々の観察対象としてもよい。

また、観察対象の位置を細かく分けることとしてもよい。例えば、図１１に示すように、観察対象としての細胞を含む領域内と細胞を含まない領域外とで照射条件および画像生成条件を変更することとしてもよい。この場合、例えば、細胞を含む領域内では照射条件としてのレーザパワー値を高くし、細胞を含まない領域外ではレーザパワー値を０にすることとしてもよい。図１１において、縦軸はレーザパワーを示し、横軸はレーザ光の走査範囲を示している。
また、複数の細胞ごとに照射条件および画像生成条件を一括で変更することとしてもよい。

また、本実施形態においては、画像生成条件としてゲイン値を例示して説明したが、例えば、画像生成部５の露光時間や印加電圧（ＨＶ）を画像生成条件としてもよい。

また、本実施形態においては、条件変更部１３が、テンプレートデータに代えて、例えば標本Ｓの輝度とレーザパワー値およびゲイン値とを対応付けた図１２に示すようなテーブルを有し、このテーブルに従い、画像上の各観察対象の輝度に対応してレーザパワー値およびゲイン値を変更することにより、観察対象ごとに所望の輝度に補正することとしてもよい。

また、本実施形態においては、条件変更部１３が、観察対象の画像上の実際の輝度と所望の輝度との比率に基づいて照射条件および画像生成条件を変更することとしたが、これに代えて、観察対象の画像上の実際の輝度と所望の輝度との差分を算出し、算出した差分に基づいて照射条件および画像生成条件を変更することとしてもよい。この場合、差分の分だけ光源３のレーザパワーを増加したり、画像生成部５のゲインを増加したりすることとすればよい。
また、本実施形態においては、条件変更部１３が、照射条件と画像生成条件の両方を変更することとしたが、いずれか一方を変更して観察対象の輝度を補正することとしてもよい。

１ 顕微鏡装置
３ 光源
５ 画像生成部
７ 制御部
１１ 画像解析部
１３ 条件変更部
Ｓ 標本

Claims (5)

1. 照明光を発生する光源と、
   該光源から発せられた照明光を標本上で２次元的に走査させる観察光学系と、
   該観察光学系により前記照明光が走査されることにより前記標本において発生する蛍光を検出して該標本の画像を生成する画像生成部と、
   これらの光源および画像生成部を所定の照射条件または所定の画像生成条件に従い制御する制御部と、
   前記画像生成部により生成された画像を解析して一画像上で前記標本における複数の観察対象を抽出する画像解析部と、
   該画像解析部により抽出された観察対象ごとの画像上の実際の輝度と所望の輝度との相違に基づいて、前記観察対象ごとに画像上の実際の輝度が所望の輝度を満たすように、一画像内で前記観察対象ごとに前記照射条件および／または前記画像生成条件を変更する条件変更部とを備え、
   前記制御部が、前記条件変更部により前記観察対象ごとに前記照射条件および／または前記画像生成条件が変更された場合に、一画像において、前記観察対象ごとに変更後の前記照射条件で前記照明光を発生させるよう前記観察対象ごとに前記照射条件を切り替えながら前記光源を再駆動し、および／または、前記観察対象ごとに変更後の前記画像生成条件で前記画像を生成させるよう前記観察対象ごとに前記画像生成条件を切り替えながら前記画像生成部を再駆動する顕微鏡装置。
2. 前記制御部が、前記観察対象単位、画像上の画素単位、または、複数の画素を含む複数画素領域単位で変更後の前記照射条件および／または前記画像生成条件を採用する請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 前記条件変更部が、前記観察対象と前記所望の輝度とを対応付けたテーブルまたは計算式に基づいて前記照射条件および／または前記画像生成条件を変更する請求項１または請求項２に記載の顕微鏡装置。
4. 前記照射条件がレーザパワー値である請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡装置。
5. 前記画像生成条件が、画像信号を増幅するゲイン値である請求項１から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡装置。

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