JP6817259B2 - 癌の検出のための血漿ｄｎａ中のサイズ及び数異常の使用 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、Ｌｏらによって２０１５年１月１３日に出願された「Ｕｓｉｎｇ Ｓｉｚｅ Ａｎｄ Ｎｕｍｂｅｒ Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ Ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ」と題する米国特許出願第６２／１０２，８６７号（代理人整理番号８００１５−０１５８００ＵＳ）、及びＬｏらによって２０１５年２月３日に出願された「Ｕｓｉｎｇ Ｓｉｚｅ ａｎｄ Ｎｕｍｂｅｒ Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ」と題する同第６２／１１１，５３４号（代理人整理番号８００１５−０１５８０１ＵＳ）に対する優先権を主張し、これらの開示の全体が、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。

循環無細胞ＤＮＡの分析は、癌の検出及び監視のためにますます使用されている（１〜３）。コピー数異常（４〜７）、メチル化変化（８〜１１）、単一ヌクレオチド変異（４、１２〜１５）、癌由来ウイルス配列（１６、１７）、及び染色体再配置（１８、１９）を含む、異なる癌関連分子特徴が、様々な種類の癌を有する患者の血漿中に検出され得る。臨床用途の急速な拡大にも関わらず、癌患者における循環ＤＮＡの多くの基本的な分子特徴は不明なままであり、そのためそのような分析の最も効果的な臨床使用を限定してしまっている。

特に、癌患者における循環ＤＮＡのサイズについての以前の研究は、一貫しない結果をもたらした。研究は、悪性病態を有さない対象と比較して、循環ＤＮＡの全体的完全性（サイズの測定値）が癌患者において増加することを実証している（２０〜２３）。異なる増幅産物サイズを有するＰＣＲを使用して、より長いＤＮＡの割合が癌患者においてより高いことが示された。ＤＮＡ完全性のこの異常は治療後に可逆的であることが示され、そのような変化の持続は不良な予後に関連付けられた（２０、２４）。他方、腫瘍組織に由来する循環ＤＮＡが非悪性細胞に由来するものよりも短くあり得るという、一見矛盾した証拠もまた存在するようである。例えば、癌関連変異を担持するＤＮＡ分子の割合は、それらの変異がより短い増幅産物を有するＰＣＲを使用して検出されるときに、より高いことが示されている（１２、２５）。

更に、腫瘍由来血漿ＤＮＡは、血漿中、非腫瘍由来背景ＤＮＡとは容易には区別することができないため、肝細胞癌（ＨＣＣ）患者の血漿中の腫瘍由来ＤＮＡのサイズプロファイルの研究は、困難な努力である。癌特異的変異の検出は、腫瘍性血漿ＤＮＡから非腫瘍性血漿ＤＮＡを区別するための遺伝子型手段をもたらす。しかしながら、ゲノムにわたって存在する癌特異的変異は比較的少ない（２９〜３２）。したがって、特に腫瘍由来ＤＮＡのサイズ分布についての広範、詳細、かつ更に対費用効果の高い一覧を生成する目的での、血漿中の腫瘍由来ＤＮＡを正確に特定することは困難であり得る。

そのような困難は、腫瘍性ＤＮＡと非腫瘍性ＤＮＡとの混合物を含有する可能性がある試料中で、正確な測定値を得る上での障壁をもたらす。

実施形態は、領域が癌に関連付けられ得る異常（例えば、増幅または欠失）を呈するかどうかを決定するためのシステム及び方法を提供することができる。例えば、実施形態は、カウントに基づく分析を使用して、ある領域を、異常を有する可能性があるものとして特定し、サイズに基づく分析を使用して、その領域か確かに異常を有するかどうかを確認することができる。

他の実施形態において、異常を呈する領域は、既知の種類の癌に対応する基準パターンと比較され得る。ある種類の癌は、十分な数の領域が一致する異常を有するときに特定され得る。そのような一致領域は、腫瘍ＤＮＡの分析のため、例えば、サイズ分析のため、癌に関するものとして更に特定され得る。

更に他の実施形態において、試料（例えば、腫瘍ＤＮＡ及び非腫瘍ＤＮＡの両方を含有する可能性がある混合物）中のＤＮＡ断片のサイズ分析は、試料中の腫瘍ＤＮＡの測定された画分に依存し得る。例えば、健常な対照よりも長いＤＮＡ断片は、低い腫瘍ＤＮＡ画分の初期段階の癌を示し得、健常な対照よりも短いＤＮＡ断片は、より高い腫瘍ＤＮＡ画分のより後期の癌を示し得る。

他の実施形態は、本明細書に記載される方法に関連付けられるシステム及びコンピュータ可読媒体を対象とする。

以下の発明を実施するための形態及び添付の図面を参照することで、本発明の実施形態の性質及び利点についてのより良好な理解を得ることができる。

本発明の実施形態に従って、染色体領域を、異常を呈するものとして特定する方法１００を図示するフローチャートである。 本発明の実施形態に従って、代表的な肝細胞癌（ＨＣＣ）患者の血漿及び組織試料中、増幅及び欠失を呈する領域を特定するＣｉｒｃｏｓプロット２００を示す。 本発明の実施形態に従う、様々な対象の血漿コピー数異常（ＣＮＡ）結果を示す。 本発明の実施形態に従う、ＨＣＣ患者、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）保因者、肝硬変症を有する患者、及び健常な対象の血漿中のＣＮＡの検出性を示す表４００である。 １２人のＨＣＣ患者の腫瘍及び対応する血漿中に検出されたＣＮＡの表５００を示す。 本発明の実施形態に従って、ある生物の生体試料を分析して、生体試料が第１の種類の癌を呈するかどうかを決定する方法を図示するフローチャートを示す。 実施形態に従う、表７００中の異なる種類の癌について異なるパターンを呈する染色体腕を示す。 異なる種類の癌の染色体領域のパターンの表８００を示す。 異なる種類の癌の染色体領域のパターンの表８００を示す。 異なる種類の癌の染色体領域のパターンの表８００を示す。 本発明の実施形態に従って、ある生物の生体試料を分析する方法を図示するフローチャートを示す。 血漿中の腫瘍ＤＮＡ画分に対して、（Ａ）１５０塩基対よりも短い、（Ｂ）１５０〜１８０塩基対、及び（Ｃ）１８０塩基対よりも長い、血漿ＤＮＡ断片の割合のプロットを示す。 癌患者における血漿ＤＮＡサイズ分析の原理の模式図である。 代表的な事例Ｈ２９１の増幅した８ｑ及び欠失した８ｐに起源を持つ血漿ＤＮＡのサイズ分布を示す。（Ａ）８ｐ（赤色）及び８ｑ（緑色）の血漿ＤＮＡのサイズ分布。（Ｂ）８ｐ（赤色）及び８ｑ（緑色）の血漿ＤＮＡサイズの累積度数のプロット。（Ｃ）ＨＣＣ事例Ｈ２９１の累積度数の差。 ８ｑと８ｐとの間のサイズの累積度数の差（ΔＳ）を示す。（Ａ）血漿中の８ｐ及び８ｑについて異なるＣＮＡを有する全てのＨＣＣ事例のサイズに対する、ΔＳのプロット。（Ｂ）異なる群におけるΔＳ_１６６の値。 代表的なＨＣＣ患者の、サイズに対する１ｑと１ｐとの間のΔＳの値のプロットである。 健常な対照対象、ＨＢＶ保因者、硬変症患者、及びＨＣＣ患者の、１ｑと１ｐとの間のΔＳ_１６６の値のプロットである。 本発明の実施形態に従って、染色体腕レベルのｚスコア分析（ＣＡＺＡ）及びサイズ分析を実行して、ある生物の生体試料を分析する方法を図示するフローチャートである。 本発明の実施形態に従って、ある生物の生体試料を分析する方法を図示するフローチャートである。 血漿中、異なる画分濃度の腫瘍由来ＤＮＡを有するＨＣＣ患者における、血漿ＤＮＡ断片のサイズ分布を示す。 （Ａ）健常な対照、（Ｂ）慢性ＨＢＶ保因者、及び（Ｃ）硬変症患者の血漿ＤＮＡのサイズプロファイルを示す。 健常な対照対象、血漿中２％未満の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者、及び６％超の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者の、短い断片の割合のボックスプロットを示す。 Ｐ（＜１５０）を適用して、健常な対照対象から２％未満の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者を鑑別するための、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。 Ｐ（＜１５０）を適用して、６％超の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者と健常な対象とを鑑別するための、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。 健常な対照対象、及び血漿中２％未満の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者の、長い断片の割合のボックスプロットを示す。 Ｐ（＞１８０）を使用して、健常な対照対象から２％未満の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者を鑑別するためのＲＯＣ曲線である。 健常な対照対象、２％未満の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者、及び６％超の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者の断片サイズ中央値のボックスプロットを示す。 断片サイズ中央値を使用して、２％未満の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者と健常な対照対象とを鑑別するためのＲＯＣ曲線である。 断片サイズ中央値を使用して、６％超の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者と健常な対照対象とを鑑別するためのＲＯＣ曲線である。 ６％超の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者の染色体１ｑ、及び健常な対照対象の染色体１ｑに整列させた、１５０塩基対未満の短い血漿ＤＮＡ断片の割合のボックスプロットを示す。 １５０塩基対未満の短い血漿ＤＮＡ断片の割合を使用して、６％超の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者と健常な対照対象とを鑑別するためのＲＯＣ曲線である。 ＨＣＣ患者のΔＳ対腫瘍サイズのプロットである。 腫瘍サイズに対する特定のサイズのＤＮＡ断片のパーセンテージのプロットである。 本発明の実施形態に従うシステム及び方法とともに使用することができる、例示的なコンピュータシステム１０のブロック図を示す。

用語
本明細書で使用される場合、「生体試料」という用語は、ある対象（例えば、妊婦などのヒト）から取得され、対象となる１つ以上の核酸分子（複数可）を含有する任意の試料を指す。例としては、血漿、唾液、胸水、汗、腹水、胆汁、尿、血清、膵液、便、子宮頚部洗浄水、及び子宮頸部スメア試料が挙げられる。

「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖もしくは二本鎖の形態の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）及びそのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、基準核酸と類似した結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似した様式で代謝される、天然のヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を網羅する。別段示されない限り、ある特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾された変異形（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型（ＳＮＰ）、ならびに相補的配列及び明示的に示される配列を暗に網羅する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択される（または全ての）コドンの第３の位置が、混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ＭＡ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ１９９１；１９：５０８１、Ｏｈｔｓｕｋａ Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ１９８５；２６０：２６０５−２６０８、及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ＧＭ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ１９９４；８：９１−９８）。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、小分子非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ、及び遺伝子または座位によってコードされる低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と互換的に使用される。

「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。それは、コード領域に先行及び後続する領域（リーダー及びトレーラー）、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含み得る。

本明細書で使用される場合、「座位（ｌｏｃｕｓ）」またはその複数形「座位（ｌｏｃｉ）」は、ゲノムにわたる変動を有する任意の長さのヌクレオチド（または塩基対）の位置またはアドレスである。

「配列決定されたタグ」（配列読み取りとも呼ばれる）は、核酸分子、例えば、ＤＮＡ断片の全てまたは一部から得られた配列を指す。一実施形態において、その断片のうちの一方の終端のみ、例えば、約３０塩基対が配列決定される。その後、配列決定されたタグは基準ゲノムに整列され得る。あるいは、その断片の両方の終端を配列決定して、２つの配列決定されたタグを生成してもよく、これは、整列のより大きな正確性を提供し、断片の長さを提供することができる。更に別の実施形態において、直鎖状ＤＮＡ断片が、例えば、連結によって環状化されてもよく、連結部位に及ぶ部分が、配列決定されてもよい。

画分腫瘍ＤＮＡ濃度は、腫瘍ＤＮＡ割合及び腫瘍ＤＮＡ画分という用語と互換的に使用され、ある腫瘍に由来する試料中に存在するＤＮＡ分子の割合を指す。

「サイズプロファイル」という用語は一般に、生体試料中のＤＮＡ断片のサイズに関する。サイズプロファイルは、様々なサイズのＤＮＡ断片の量の分布を提供するヒストグラムであってもよい。様々な統計パラメータ（サイズパラメータまたは単にパラメータとも呼ばれる）を使用して、１つのサイズプロファイルと別のサイズプロファイルとを区別することができる。１つのパラメータは、全てのＤＮＡ断片に対する、または別のサイズまたは範囲のＤＮＡ断片に対する、ある特定のサイズまたはサイズの範囲のＤＮＡ断片のパーセンテージである。

本明細書で使用される場合、「パラメータ」という用語は、定量的データセットを特徴付ける数値、及び／または定量的データセット間の数的関連性を意味する。例えば、第１の核酸配列の第１の量と第２の核酸配列の第２の量との比率（またはある比率の関数）は、パラメータである。

本明細書で使用される場合、「分類」という用語は、ある試料のある特定の特性に関連付けられる任意の数（複数可）または他の特徴（複数可）（単語を含む）を指す。例えば、「＋」記号は、試料が欠失または増幅（例えば、重複）を有するものとして分類されることを示し得る。「カットオフ」及び「閾値」という用語は、ある操作において使用される所定の数を指す。例えば、カットオフサイズは、それを超えると断片が除外されるサイズを指し得る。閾値は、それを超えるか、またはそれ未満であると特定の分類が適用される値であり得る。これらの用語のいずれも、これらの文脈のいずれにおいても使用され得る。

「癌のレベル」という用語は、癌が存在するかどうか、癌の段階、腫瘍のサイズ、関与する染色体領域の欠失もしくは増幅の数（例えば、重複もしくは三重複）、及び／または癌の重症度についての他の尺度を指し得る。癌のレベルは、数または他の特徴であってもよい。レベルは、ゼロであってもよい。癌のレベルはまた、欠失または増幅に関連付けられる前悪性または前癌性の病態を含む。

「亜染色体領域」は、染色体よりも小さい領域である。亜染色体領域の例は、１００ｋｂ、２００ｋｂ、５００ｋｂ、１Ｍｂ、２Ｍｂ、５Ｍｂ、または１０Ｍｂである。亜染色体領域の別の例は、１つ以上のバンドもしくは亜バンドに対応するもの、または染色体の腕のうちの１つである。バンドまたは亜バンドは、細胞遺伝学的分析において観察される特色である。亜染色体領域は、基準ヒトゲノム配列に対するそのゲノム座標によって呼ばれ得る。

癌はしばしば、その個人の正常なゲノムと比較してコピー数異常（増幅または欠失）を有する領域を有する。技術は、腫瘍ＤＮＡ断片及び非腫瘍ＤＮＡ断片を含む試料（例えば、血漿または血清）中の無細胞ＤＮＡ断片をカウントすることができる。カウントは、過剰提示される領域（増幅を示す）または過小提示される領域（欠失を示す）を特定することができる。しかし、そのようなカウントに基づく技術は統計的性質があるため、不正確な表示が発生し得る。実施形態は、カウントに基づく分析を使用して、コピー数異常（異常とも呼ばれる）を有する可能性があるものとしてある領域を特定し、サイズに基づく分析を使用して、その領域か確かに異常を有するかどうかを確認することができる。そのような確認は、異常を有する領域を特定する上で追加の正確性を提供する。

異常を有する領域を使用して、試料を得た生物における癌の存在を特定することができる。しかし、癌の存在は癌の種類は伝えない。この問題に対処するために、実施形態は、既知の癌を有する試料に由来する領域内の異常の基準パターンを使用することができる。どの領域が異常であるかについての試験パターンを、試験される所与の試料について決定することができ、試験パターンを基準パターンと比較して、癌の種類を決定することができる。特定の種類の癌に対応する基準パターンと同一の欠失または増幅を呈する試験パターンの領域の量を決定することができ、その量を閾値と比較して、特定の種類の癌が存在するかどうかについての分類を決定することができる。ある領域が、異常を有するものとして、及び特定の種類の癌に対応するものの両方として特定されると、その領域を腫瘍ＤＮＡについて分析する上でより大きな信頼となり得る。例えば、その領域を使用して、試料中の腫瘍ＤＮＡ画分を測定することができる。

更に、様々な研究が、無細胞腫瘍ＤＮＡ断片の長さについて一貫しない結果を示しており、腫瘍ＤＮＡについてより長い断片を示ものもあれば、腫瘍ＤＮＡについてより短い断片を示すものもある。以下の分析は、その両方が正しくあり得るが、これは異なる腫瘍ＤＮＡ画分についてであることを示す。実施形態は、測定された腫瘍ＤＮＡ画分に基づくサイズ分析において異なるサイズ閾値を使用することができ、これは、異常を有するものとして特定された領域内のＤＮＡ断片のカウントを使用して決定することができる。したがって、いくつかの実装例は、例えば、（ａ）超並列配列決定によって可能となる血漿ＤＮＡの全ゲノム高解像度サイズプロファイル化、及び（ｂ）（例えば、異常を有するものとして特定された領域を使用して）癌患者の血漿中の非腫瘍性背景ＤＮＡから腫瘍由来ＤＮＡを区別するための効率的アプローチを通して、これらの明らかな非一貫性を一致させることができる。

Ｉ．導入
試料中の数百万または数十億の個々の血漿ＤＮＡ分子全ての長さを、超並行配列決定を使用して測定することが可能となっている（２６、２７）。したがって、血漿ＤＮＡサイズを、全ゲノム様式かつ単一塩基解像度で研究することができる。このアプローチを使用して、循環ＤＮＡのサイズは一般にモノヌクレオソームＤＮＡのサイズに似ていることが示されており、これはアポトーシスを通して血漿ＤＮＡが生成され得ることを示す（２６、２７）。妊婦において、胎児に由来する血漿ＤＮＡは、母親に由来するＤＮＡのそれよりも短いことが示されている（２６）。循環胎児ＤＮＡと循環母方ＤＮＡとの間のサイズ差は、母方血漿中の胎児ＤＮＡを定量化し、血漿ＤＮＡのサイズ分析を通して染色体異数性を検出するための新しい概念的基盤を提供している（２８）。更に、移植器官に由来する循環ＤＮＡと患者自身の組織に由来する循環ＤＮＡとのサイズ分布の差が、実質臓器または骨髄移植のレシピエントで観察されている（２７）。

癌患者の血漿は、腫瘍由来ＤＮＡと非腫瘍由来ＤＮＡとの混合物を含有する。以下の実施例は、肝細胞癌（ＨＣＣ）を有する癌患者における血漿ＤＮＡのサイズ分布を分析する。ＨＣＣ患者、慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染を有する患者、肝硬変症を有する患者、及び健常な対象における血漿ＤＮＡのサイズ分布もまた分析される。実施形態は、特定の異常領域を使用して、ＨＣＣ患者の血漿中の腫瘍由来ＤＮＡのサイズプロファイルを分析することができる。そのような異常領域の使用は、血漿中、腫瘍由来血漿ＤＮＡが非腫瘍由来背景ＤＮＡとは容易には区別されないという困難を克服することができる。

いくつかの実施形態は、コピー数異常（ＣＮＡ）の影響を受ける染色体腕を使用して、腫瘍由来血漿ＤＮＡと非腫瘍由来血漿ＤＮＡとのサイズ分布の差を推測する。腫瘍組織中で増幅される染色体腕について、腫瘍由来ＤＮＡから血漿ＤＮＡへの比例的な寄与は増加する一方で、腫瘍中で欠失される染色体腕について、寄与は低下する。したがって、増幅及び欠損される染色体腕のサイズプロファイルの比較は、血漿中の腫瘍由来ＤＮＡと非腫瘍由来ＤＮＡとの間のサイズ差を反映するだろう。染色体腕全体または染色体腕の大きな主要部に関与するＣＮＡは、比較的一般的である（３３）。染色体１ｐ及び８ｐの欠失ならびに染色体１ｑ及び８ｑの増幅は一般に、ＨＣＣ組織中に観察される（３４〜３６）。したがって、分析は、血漿ＤＮＡのＣＮＡ分析及びサイズプロファイル化分析のため、染色体１及び８に集中する。

ＩＩ．異常領域を特定するためのカウント分析
異常領域は、増幅または欠失を含む。増幅とは、領域内のある配列が、それが基準配列内で発生するよりも頻繁に発生するため、その配列が増幅されていることを意味する。増幅は、典型的には、１つの染色体コピー（ハプロタイプ）中のみで発生する。欠失とは、領域内のある配列が基準配列と比較して欠失していることを意味し、二倍体生物について、典型的には１つの染色体コピーのみが欠損を有する。領域は、（互いに分離される）少なくとも２つの座位によって定義することができ、これらの座位のＤＮＡ断片を使用して、その領域についての集団的価値を得ることができる。

Ａ．カウントによる異常領域の検出
ある領域の異常は、その領域に由来するＤＮＡ断片（分子）の量をカウントすることによって決定することができる。例として、量は、ＤＮＡ断片の数、ＤＮＡ断片がオーバーラップする塩基の数、または領域内のＤＮＡ断片の他の測定値であり得る。その領域のＤＮＡ断片の量は、ＤＮＡ断片を配列決定して配列読み取りを得、配列読み取りを基準ゲノムに整列させることによって決定することができる。一実施形態において、その領域の配列読み取りの量を別の領域の配列読み取りの量と比較して、過剰提示（増幅）または過小提示（欠失）を決定することができる。別の実施形態において、１つのハプロタイプについて配列読み取りの量を決定し、別のハプロタイプの配列読み取りの量と比較することができる。

したがって、（例えば、その領域に整列される配列決定されたタグをカウントすることによって決定される）１つの染色体領域に由来するＤＮＡ断片の量を、（基準染色体領域から、別のハプロタイプ上の領域から、または健常であることが既知である別の試料中の同一の領域から決定され得る）基準値と比較することができる。この比較は、その量が基準値とは統計的に異なる（例えば、基準値超または基準値未満）かどうかを決定することができる。母集団に見られる値の分布に見られるように、例えば、３つの標準偏差（ＳＤ）に対応する差の閾値を使用してもよい。

比較の一部として、タグカウントは比較前に正規化され得る。ある特定の領域の配列読み取り（タグ）の正規化された値は、その領域に整列する配列決定された読み取りの数を、ゲノム全体に整列可能な配列決定された読み取りの総数で割ることによって算出することができる。この正規化されたタグカウントは、１つの試料からの結果を別の試料の結果と比較することを可能にする。例えば、正規化された値は、特定の領域に由来することが期待される配列読み取りの割合（例えば、パーセンテージまたは画分）であり得る。しかし、当業者に明らかであるように、多くの他の正規化が可能である。例えば、１つの領域のカウントの数を、基準領域のカウントの数（上記の場合、基準領域は単にゲノム全体である）で割ることによって、または同一の数の配列読み取りを常に使用することによって正規化することができる。その後、この正規化されたタグカウントが、癌を呈さない１つ以上の基準試料から決定され得る閾値に対して比較され得る。

いくつかの実施形態において、閾値は、基準値であってもよい。他の実施形態において、基準値は正規化に使用される他の値であってもよく、この比較は基準値及び閾値を含んでもよい。例えば、領域の量を基準値で割って、パラメータを得ることができ、これを閾値と比較して、統計的に有意な差が存在するかどうかを確認する。別の例として、領域の量を、基準値プラス閾値と比較してもよい。

一実施形態において、この比較は、特定の染色体領域の事例のｚスコアを算出することによってなされる。ｚスコアは、以下の等式、ｚスコア＝（事例の正規化されたタグカウント−平均値）／標準偏差、を使用して算出することができ、式中、「平均値」は、基準試料の特定の染色体領域に整列する平均の正規化されたタグカウントであり、標準偏差は、基準試料の特定の領域に整列する正規化されたタグカウントの数の標準偏差である。したがって、ｚスコアは、試験される事例の染色体領域の正規化されたタグカウントが、１つ以上の基準対象の同一の染色体領域の平均の正規化されたタグカウントから離れている、標準偏差の数に対応し得る。このｚスコアを、閾値（例えば、増幅は３及び欠損は−３）と比較してもよい。増幅される染色体領域は、閾値を超える正の値のｚスコアを有するだろう。欠失される染色体領域は、閾値未満である負の値のｚスコアを有するだろう。

ｚスコアの規模は、いくつかの要因によって決定することができる。１つの要因は、生体試料（例えば、血漿）中の腫瘍由来ＤＮＡの画分濃度である。試料（例えば、血漿）中の腫瘍由来ＤＮＡの画分濃度が高いほど、試験される事例及び基準事例の正規化されたタグカウントの差はより大きくなるだろう。したがって、より大きな規模のｚスコアが生じるだろう。

別の要因は、１つ以上の基準事例における正規化されたタグカウントの変動である。試験される事例の生体試料（例えば、血漿）中に染色体領域の同程度の過剰提示があると、基準群における正規化されたタグカウントのより小さな変動（すなわち、より小さな標準偏差）は、より高いｚスコアをもたらすだろう。同様に、試験される事例の生体試料（例えば、血漿）中に染色体領域の同程度の過小提示があると、基準群における正規化されたタグカウントのより小さな標準偏差は、より負のｚスコアをもたらすだろう。

別の要因は、腫瘍組織中の染色体異常の規模である。染色体異常の規模は、特定の染色体領域のコピー数変化（増加または減少）を指す。腫瘍組織中のコピー数変化が大きいほど、血漿ＤＮＡ中の特定の染色体領域の過剰提示または過小提示の程度はより高くなるだろう。例えば、染色体の両方のコピーの減少は、染色体の２つのコピーのうちの１つの減少よりも、血漿ＤＮＡ中の染色体領域の大きな過小提示をもたらし、したがって、より負のｚスコアをもたらすだろう。典型的には、癌には複数の染色体異常が存在する。各癌における染色体異常は、その性質（すなわち、増幅または欠失）、その程度（単一または複数コピーの増加または減少）、及びその範囲（染色体長の観点での異常のサイズ）によって更に異なり得る。

正規化されたタグカウントの測定の精度は、分析される分子の数の影響を受ける。例えば、画分濃度がそれぞれ、約１２．５％、６．３％、及び３．２％であるとき、１つのコピー変化（増加または減少のいずれか）を有する染色体異常を検出するためには、１５，０００、６０，０００、及び２４０，０００個の分子が分析される必要があり得る。異なる染色体領域の癌を検出するためのタグカウントの更なる詳細は、Ｌｏらによる「Ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ Ｆｅｔａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」と題する米国特許公開第２００９／００２９３７７号、及びＬｏらによる「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ｃａｎｃｅｒ」と題する米国特許第８，７４１，８１１号に記載され、これらの開示の全体が、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。

Ｂ．方法
図１は、本発明の実施形態に従って、ある染色体領域を、潜在的に増幅を呈するものとして特定する方法１００を図示するフローチャートである。方法１００及び本明細書に記載される他の方法は、全体的または部分的にコンピュータシステムを使用して実行することができる。

ステップ１１０では、ある生物の複数の染色体領域が特定され得る。各染色体領域は、複数の座位を含み得る。ある領域はサイズが１Ｍｂであっても、いくらかの他の等しいサイズであってもよい。その時、ゲノム全体は、それぞれが所定のサイズ及び位置である約３，０００の領域を含み得る。そのような所定の領域は、ある長さの特定の染色体または使用されるある特定の数の領域、及び本明細書で言及される任意の他の基準を収容するように変動し得る。領域が異なる長さを有する場合、例えば、本明細書に記載されるように、そのような長さを使用して結果を正規化することができる。

ステップ１２０〜１４０は、染色体領域のそれぞれについて実行され得る。ステップ１２０では、各染色体領域について、核酸分子のそれぞれの群が、染色体領域に由来するものとして特定され得る。特定は、基準ゲノムにおける核酸分子の位置の特定に基づいてもよい。例えば、無細胞ＤＮＡ断片を配列決定して配列読み取りを得ることができ、配列読み取りを基準ゲノムにマッピング（整列）させることができる。生物がヒトである場合、基準ゲノムは、潜在的に特定の亜集団に由来する基準ヒトゲノムである。別の例として、無細胞ＤＮＡ断片は（例えば、ＰＣＲまたは他の増幅に従う）異なるプローブで分析することができ、各プローブは異なるゲノム位置に対応する。いくつかの実施形態において、無細胞ＤＮＡ断片の分析は、配列読み取りまたは無細胞ＤＮＡ断片に対応する他の実験データを受信し、その後、コンピュータシステムを使用して実験データを分析することによって実行することができる。

ステップ１３０では、コンピュータシステムが、核酸分子のそれぞれの群のそれぞれの量を算出し得る。それぞれの値は、それぞれの群の核酸分子の特性を定義する。それぞれの値は、本明細書で言及される値のうちのいずれであってもよい。例えば、値は、その群における断片の数またはその群における断片のサイズ分布の統計値であってもよい。それぞれの値はまた、正規化された値、例えば、領域のタグカウントを、試料のタグカウントの総数または基準領域のタグカウントの数で割ったものであってもよい。それぞれの値はまた、別の値に由来する差または比率であるために、その領域の差の特性を提供してもよい。

ステップ１４０では、それぞれの量を基準値と比較して、染色体領域が異常（すなわち、増幅または欠失）を呈するかどうかについての分類を決定することができる。いくつかの実施形態において、染色体領域は異常を呈さないものとして分類され得る。この比較は、それぞれの量及び基準値に基づいてｚスコアを決定することを含み得る。一例として、基準値は、本明細書に記載される任意の閾値または基準値であり得る。例えば、基準値は、正常な試料について決定される閾値であってもよい。別の例として、基準値は別の領域のタグカウントであってもよく、この比較は、差または比率（またはその関数）を取得し、その後、その差または比率が閾値よりも大きいかどうかを決定することを含み得る。

基準値は、他の領域の結果に基づいて変動し得る。例えば、隣接する領域もまた（閾値と比較すると小さくあるものの、例えば、３のｚスコアなどの）偏差を示す場合、より低い閾値が使用され得る。例えば、３つの連続する領域が全て第１の閾値を超える場合、癌の可能性がより高くあり得る。したがって、この第１の閾値は、非連続領域に由来する癌を特定するのに必要とされる別の閾値よりも低くあり得る。小さな偏差ですらそれを有する３つの領域（または４つ以上）を有することで、感度及び特異性が保存され得るという偶然効果の十分に低い確率を有し得る。

Ｃ．染色体腕レベルのＺスコア分析（ＣＡＺＡ）
いくつかの実施形態において、染色体は多くの亜染色体領域（例えば、１Ｍｂ領域）に分割され得る。この高い解像度は、感度及び特異性を最大化しない可能性がある。他の実施形態は、染色体を２つの腕、すなわち、ｐ及びｑに分割し得る。２つの腕の分析は、そのような精細な解像度によって引き起こされるノイズを低減することによって、特異性を改善することができる。染色体腕レベルのｚスコア分析の一例が、これより提供される。

我々は、９０人のＨＣＣ患者、６７人の慢性ＨＢＶ感染を有する患者、３６人のＨＢＶ関連肝硬変症を有する患者、及び３２人の健常な対象からの、合計２２５個の血漿ＤＮＡ試料を分析した。各血漿試料から、３１００万個の読み取りの中央値（範囲：１７００〜７９００万）を得た。健常な対照の平均値の、標準偏差３つ下（ｚスコア＜−３）及び標準偏差３つ上（ｚスコア＞３）である染色体腕に起源を持つ配列読み取りの量をそれぞれ、それらの染色体腕に由来する血漿ＤＮＡの有意な過小提示及び過剰提示を示すものと見なした。これらの定量的血漿ＤＮＡ異常は一般に、腫瘍中のコピー数減少及びコピー数増加（ＣＮＡ）の存在を反映した（４）。

図２は、本発明の実施形態に従って、代表的な肝細胞癌（ＨＣＣ）患者の血漿及び組織試料中、増幅及び欠失を呈する領域を特定するＣｉｒｃｏｓプロット２００を示す。内側から外側へ：（１Ｍｂ解像度における）腫瘍組織中のＣＮＡ、腫瘍組織中の腕レベルのＣＮＡ、（１Ｍｂ解像度における）血漿ＣＮＡ、腕レベルの血漿ＣＮＡ。増加及び減少を有する領域を、それぞれ緑色及び赤色で示す。２つの連続する水平線間の距離は、５のｚスコアを表す。染色体の表意文字（プロットの外側）は、ｐ末端からｑ末端へと時計回りの方向に配向される。

図３は、ＣＡＺＡの一実施形態を使用する、全ての研究された対象の血漿コピー数異常（ＣＮＡ）結果を示す。ＨＣＣにおいて頻繁にＣＮＡの影響を受ける４つの染色体腕（１ｐ、１ｑ、８ｐ、及び８ｑ）を分析した。赤色及び緑色の線はそれぞれ、血漿中の対応する染色体腕の過小提示及び過剰提示を表す。各垂直線は、一事例のデータを表す。

図４は、本発明の実施形態に従う、ＨＣＣ患者、ＨＢＶ保因者、肝硬変症を有する患者、及び健常な対象の血漿中のＣＮＡの検出性を示す表４００である。表４００は、最左列に患者のカテゴリを示す。残りの列は、患者の数、及び異なる染色体腕について血漿中にＣＮＡが検出されたパーセンテージを示す。９０人のＨＣＣ患者のうち７６（８４．４％）人が、血漿中の染色体１及び８上に、少なくとも１つの染色体腕レベルのＣＮＡを有した。１２人のＨＣＣ患者の腫瘍組織が、血漿ＤＮＡの発見を確証するために利用可能であった。組織試料を配列決定し、ＣＮＡパターンを図５に示す。

図５は、１２人のＨＣＣ患者の腫瘍及び対応する血漿中に検出されたＣＮＡの表５００を示す。表５００において、患者事例数が第１列に列挙される。患者は、第２列に見られるように、血漿中の腫瘍ＤＮＡ画分について降順に配置される。第３列は、腫瘍サイズを示す。残りの列は、異なる染色体腕について腫瘍及び血漿中に検出されたＣＮＡを示す。「Ｇａｉｎ」は、コピー数増加を示す。「Ｌｏｓｓ」は、コピー数減少を示す。「Ｎｉｌ」は、検出可能なＣＮＡがないことを示す。１２人の患者の合計４８個の染色体腕を分析した。腫瘍と血漿との間に一致した結果及び不一致の結果を有する染色体腕の数（及びパーセンテージ）を示す。

１２人の患者で分析された４８個の染色体腕のうち、血漿及び腫瘍組織中で一致した変化は、３０個（６３％）の腕について観察された。ＣＮＡは、１０個（２１％）の腕について腫瘍中でのみ観察されたが、血漿中では観察されなかった。これらの事例は、血漿中でより低い腫瘍ＤＮＡ画分を有する傾向があった。ＣＮＡは、７個（１５％）の腕について血漿中で観察されたが、腫瘍では観察されなかった。一事例（ＨＯＴ４２８）において、腫瘍中で１ｑの増加が観察されたが、血漿中では減少が観察された。これらのデータは、血漿ＤＮＡを寄与する他の病巣または癌細胞のクローンが存在し得る、腫瘍不均一性の存在を示し得る。

肝硬変症を有する及び有さないＨＢＶ保因者において、これらのＣＮＡの検出率はそれぞれ２２．２％及び４．５％であった。血漿中にＣＮＡは呈したが、採血の時点でＨＣＣを有することが既知ではなかった、肝硬変症を有する１人の患者及び硬変症を有さない１人の慢性ＨＢＶ保因者が、それぞれ３ヶ月及び４ヶ月後にＨＣＣを有するものと診断された。全てのＨＢＶ保因者及び硬変症患者を、少なくとも６ヶ月間経過観察した。血漿中にいかなるＣＮＡも有さない対照対象では、経過観察中、彼らのうちのいずれもＨＣＣを発症することはなかった。３２人の健常な対象のうちのいずれも、血漿中に染色体１または８上に、ＣＡＺＡにより検出可能なＣＮＡは有さなかった。ＨＣＣ患者において、ＣＮＡの存在による血漿中の配列読み取りの不釣合な増加または低下は、血漿試料中の腫瘍ＤＮＡの画分濃度を反映する。ＨＣＣ患者の血漿中の腫瘍由来ＤＮＡの画分濃度中央値は、２．１％（範囲：０％〜５３．１％、四分位範囲：１．２％〜３．８％）であった。

ＣＡＺＡは、腫瘍関連ＣＮＡを非侵襲的に検出するための方法を提供する。ＨＣＣにおいて、染色体１及び８は一般に、ＣＮＡの影響を受ける（３４〜３６）。実際、我々のデータは、９０人のＨＣＣ患者のうち７６人（８４．４％）が、血漿中、染色体１及び８上のいずれかの腕に関与する少なくとも１つのＣＮＡを有する一方で、３２人の健常な対象のいずれも、血漿中、これらの２つの染色体についていかなるＣＮＡも呈さないことを示した。染色体１及び８に関与する血漿ＣＮＡはまた、硬変症患者のうちの２２．２％、及びＨＢＶ保因者のうちの４．５％においても検出された。１人のＨＢＶ保因者及び１人の肝硬変症を有する患者において、採血の直後にＨＣＣが診断された。採血の時点で癌が存在しており、血漿中のＣＮＡに関連付けられた可能性があるため、これは実施形態の早期スクリーニング性能を示す。ＨＣＣ患者における血漿ＣＮＡの比較的高い検出率は、このアプローチが、ＨＢＶ保因者のスクリーニングにおいて将来的価値を有し得ることを示す。更に、ＣＮＡはほぼ全ての種類の癌において存在する（３３）。したがって、このアプローチは、対象となる癌の特異的なＣＮＡパターンに適合する一般的な腫瘍マーカとして適用することができる。

ＩＩＩ．異常領域のパターンに基づく癌の種類の検出
いくつかの実施形態は、（増幅または欠失であるかどうかとともに）ある種類の癌の既知の異常領域を使用して、試料中に特定される異常によって関係付けられる潜在的な癌を特定することができる。上記の例において、ＨＣＣの既知の異常領域を使用して、ＨＣＣの試料をスクリーニングした。このスクリーニングは、（増幅または欠失であるかどうかを含む）特定された異常領域を、既知のセットの異常領域と比較することができる。十分に高い一致が決定されると、その種類の癌が可能性のある試験結果としてフラグ立てされ得る。

一致基準は、試料中で同様に特定されるそのセットの領域のパーセンテージであってもよい。一致基準は、特定の領域が異常であることを必要とし得る。例えば、１ｐ、１ｑ、または８ｑが異常であるとき、またはこれらの染色体腕のうちの２つ以上が異常であるときに、ＨＣＣの一致が特定され得る。したがって、同一の一致が必要とされる特定のサブセットが存在し得るが、サブセットはある種類の癌の既知の異常領域の完全なセットよりも小さくてもよい。

したがって、ある試験試料の異常領域のパターンを、特定の種類の癌を有することが既知である患者から決定され得る、特定の種類の癌の異常領域のパターンと比較することができる。特に腫瘍が小さくあり得る（例えば、サイズ２ｃｍ未満）場合、実施形態を使用して癌をスクリーニングし、関与する癌の種類を特定することができる。撮像技術は、サイズ２ｃｍ未満の腫瘍を特定する上で困難を有する。そのような技術はまた、治療後の患者の進展を追跡するためにも使用することができる。

Ａ．方法
図６は、本発明の実施形態に従って、ある生物の生体試料を分析して、生体試料が第１の種類の癌を呈するかどうかを決定する方法６００を図示するフローチャートである。生体試料は、正常細胞、及び潜在的に癌に関連付けられる細胞に起源を持つ核酸分子（断片とも呼ばれる）を含む。試料中、これらの分子のうちの少なくともいくつかは無細胞であり得る。

本方法及び本明細書に記載される任意の他の方法の一実施形態において、生体試料は無細胞ＤＮＡ断片を含む。血漿ＤＮＡの分析を使用して、本出願に記載される異なる方法を説明したものの、これらの方法はまた、正常なＤＮＡと腫瘍由来ＤＮＡとの混合物を含有する試料中の腫瘍関連染色体異常を検出するためにも適用することができる。他の試料の種類としては、唾液、涙、胸水、腹水、胆汁、尿、血清、膵液、便、及び子宮頸部スメア試料が挙げられる。

ステップ６１０において、生物の複数の染色体領域が特定される。複数の染色体領域は亜染色体であり、オーバーラップしなくてもよい。カウントされる染色体領域は、制限を有し得る。例えば、少なくとも１つの他の領域と近接している領域のみがカウントされ得る（または、近接している領域は、ある特定のサイズ、例えば、４つ以上の領域であることが必要とされ得る）。領域が等しくない実施形態について、数はまたそれぞれの長さも説明し得る（例えば、数は異常領域の全長であり得る）。いくつかの実施形態において、領域は染色体の腕に対応する。他の実施形態において、領域は腕よりも小さくあり得る（例えば、１Ｍｂ領域）。

いくつかの実施形態において、染色体領域は、特定のハプロタイプのものであっても（すなわち、特定の染色体コピーに対応しても）よい。相対的ハプロタイプ用量（ＲＨＤＯ）分析を使用する実施形態において、各領域は、少なくとも２つのヘテロ接合性座位を含み得る。ＲＨＤＯについての更なる詳細は、米国特許第８，７４１，８１１号に見出すことができる。

ステップ６２０において、生物の生体試料中の複数の核酸分子のそれぞれについて、生物の基準ゲノムにおける核酸分子の位置が特定され得る。複数の核酸分子は、５００，０００個以上の分子（断片）を含み得る。この位置付けは、（例えば、ランダム配列決定を介して）分子の配列決定を実行して、分子の１つまたは２つの（ペアエンド）配列決定されたタグを得、その後、配列決定されたタグ（複数可）を基準ゲノムに整列させることを含む、様々な方法で実行することができる。そのような整列は、基本的局所整列検索ツール（ＢＬＡＳＴ）などのツールを使用して実行することができる。位置は、染色体の腕における数として特定され得る。

ステップ６３０において、核酸分子のそれぞれの群は、複数の染色体領域のそれぞれについて、特定された領域に基づいて、染色体領域に由来するものとして特定され得る。それぞれの群は、染色体領域の複数の座位のそれぞれに位置付けられた少なくとも１つの核酸分子を含み得る。

ステップ６４０において、コンピュータシステムが、複数の染色体領域のそれぞれについて、核酸分子のそれぞれの群のそれぞれの値を算出し得る。それぞれの値は、それぞれの群の核酸分子の特性を定義し得る。特性は、核酸分子のカウント、パーセンテージ、またはサイズであり得る。それぞれの値は、サイズ分布の平均値、サイズ分布の中央値、サイズ分布の最頻値、またはサイズ閾値未満のサイズを有する核酸分子の割合を含み得る。特性としてのサイズの使用は、第ＩＶ節において詳細に論じる。

ステップ６５０において、それぞれの値をそれぞれの基準値と比較して、染色体領域が欠失または増幅を呈するかどうかについての分類を決定することができる。この比較は、それぞれの値及びそれぞれの基準値に基づいてｚスコアを決定することを含み得る。その後、ｚスコアを１つ以上の閾値と比較して、欠失または増幅が存在するかどうかを決定することができる。欠失及び増幅には、異なる閾値が使用され得る。他の実施形態において、例えば、ｚスコア内の他の値が等式の反対側に移動された場合、基準値は閾値を含み得る。基準値は、健常な試料、別の染色体領域（例えば、異常を呈さないもの）、または他方のハプロタイプ（試験される領域が第１のハプロタイプである場合）において決定される値に対応し得る。

ステップ６６０において、欠失または増幅を呈する染色体領域の試験パターンが決定され得る。試験パターンは、試験される試料中の異常領域のパターンを指す。試験パターンは、欠失、増幅を呈するか、または正常である染色体領域のセットを含み得る。試験パターンはまた、増幅を呈するものとして特定されるセットの第１のサブセットも含み得る。試験パターンは、欠失を呈するものとして特定されるセットの第２のサブセットを更に含み得る。試験パターンはまた、増幅または欠失を呈さないものとして特定されるセットの第３のサブセットも更に含み得る。

ステップ６７０において、試験パターンは、異なる種類の癌の複数の基準パターンと比較され得る。ある種類の癌の基準パターンは、既知のセットの異常領域を含み得る。基準パターンは、無細胞核酸分子の組織及び／または混合物の基準試料から決定することができる。基準パターンは、それぞれが増幅、欠失、または異常なしの定義された状態を有するいくつかの領域を含み得る。この比較は、試験パターンの領域のいずれが、基準パターン内の領域と同一の異常を有するかを決定することができる。例えば、試験パターン及び基準パターンの両方において、同一の領域が増幅、欠失を有するものとして、または正常であるものとして示されるかどうかを決定することができる。

ステップ６８０において、比較に基づいて、第１の種類の癌に対応する第１の基準パターンと同一の欠失または増幅を呈する試験パターンの領域の量が決定され得る。様々な実施形態において、この量は、既知のセットの異常領域と一致する染色体領域の数またはパーセンテージであってもよい。

ステップ６９０において、領域の量を第１の閾値と比較して、生体試料が第１の種類の癌を呈するかどうかについての第１の分類を決定する。第１の閾値は、第１の種類の癌に特異的であっても、複数の種類の癌にわたって使用されてもよい。そのような閾値は、特定される第１の種類の癌の既知のセットの異常領域と一致するのに必要とされる、染色体領域の最小量であってもよい。様々な実施形態において、最小量は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の染色体領域であり得る。いくつかの実施形態において、特定の領域が異常であることが必要とされ得るため、この量と第１の閾値との比較以外の他の基準が使用され得る。そのような特定の領域は、制約であっても、他の領域よりも高く加重されてもよい。特定の異常領域は、ある種類の癌の既知の異常領域の完全なセットのサブセットであってもよい。癌の種類としては、他の癌の中でも、ＨＣＣ、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、または鼻咽頭癌腫が挙げることができる。

分類を決定するのに使用される閾値は、カウントされる領域の位置及びサイズに基づいて変動し得る。例えば、ある特定の種類の癌が関連付けられるかどうかを決定するための基準として、ある特定の染色体上またはある染色体の腕上の領域の量を、その特定の染色体（または腕）の閾値と比較してもよい。複数の閾値を使用してもよい。例えば、ある特定の染色体（または腕もしくはより大きな亜染色体領域）上の一致領域（すなわち、試験パターン及び基準パターン内での同一の異常の分類）の量が、第１の閾値よりも大きくあることが必要とされ得、ゲノムにおける一致領域の総量が第２の閾値よりも大きくあることが必要とされ得る。

一致領域の量の閾値はまた、領域の分類の不均衡がどれほど強いかに依存し得る。例えば、ある種類の癌の分類を決定するための閾値として使用される一致領域の量は、各領域内の異常を検出するために使用される特異性及び感度（異常閾値）に依存し得る。例えば、異常閾値が低い（例えば、２のｚスコア）場合、量閾値は、高くあるように選択され得る（例えば、１５の一致領域または８０％）。しかし、異常閾値が高い（例えば、３のｚスコア）場合、量閾値は、より低くあり得る（例えば、５の一致領域または６０％）。異常を示す領域の量はまた加重値であってもよく、例えば、高い不均衡を示す１つの領域は少しの不均衡のみを示す領域よりも高く加重されてもよい（すなわち、異常について、単に正及び負以上の分類が存在する）。そのような加重は、特定される種類の癌の異常を有することが必要とされる特定の領域と類似した様式で作用し得る。

いくつかの実施形態において、閾値は、他の種類の癌の一致領域の数に基づいて、動的に決定することができる。例えば、閾値は、特定された癌の一致領域の数が、次の最も可能性の高い癌の種類の一致領域よりも、少なくともある特定の数大きくなるようであり得る。そのような閾値は、最小閾値に加えた追加の基準であり得る。したがって、いくつかの例において、十分な数の一致領域が存在しない場合、癌の種類が特定されない可能性がある。

Ｂ．結果
方法６００を複数の癌の種類について試験して、正確性を決定した。方法６００を既知の癌の種類を有する患者で試験した。更に、使用される閾値は、既知の癌の種類の試料を使用して決定することができる。異なる癌の種類には、異なる閾値が使用され得る。

１７人の癌患者（６人のＨＣＣを有する患者、４人の結腸直腸癌（ＣＲＣ）を有する患者、３人の肺癌（ＢｒＣ）を有する患者、２人の肺癌（ＬＣ）を有する患者、及び２人の鼻咽頭癌腫（ＮＰＣ）を有する患者）のそれぞれの血漿ＤＮＡを、配列決定した。各患者について、各染色体腕のコピー数異常（ＣＮＡ）をＣＡＺＡアプローチに基づいて分析した。

図７は、実施形態に従う、表７００中の異なる種類の癌について異なるパターンを呈する染色体腕を示す。事例のうち５０％以上において発生するＣＮＡが、色付けで強調される。コピー数減少が赤色で強調され、コピー数増加が緑色で強調される。

表７００では、最左列に染色体腕が列挙される。他の列のそれぞれは、癌の種類及びその癌の種類の患者数を列挙する。欠失は「−」で特定される。増幅は「＋」で特定される。正常領域は「Ｎｉｌ」で特定される。

血漿試料中に観察されるＣＮＡのパターンは、異なる種類の癌を患う患者で異なる。血漿中に観察されるＣＮＡの最も一般的なパターンに基づいて、実施形態は、血漿中に観察されるＣＮＡを有する患者における癌の潜在的な組織起源を推定することができるが、ＣＮＡの原因は不明である。表７００に列挙されるＣＮＡのパターンは説明目的のものであり、ＣＮＡのより包括的なリストは、はるかにより大きい数の臨床試料を分析することによって確立され得る。

ＣＮＡの基準パターンはまた、腫瘍組織の分析からも決定することができる。例として、１ｑ、６ｐ、８ｑ、及び１７ｑの増加ならびに４ｑ、８ｐ、１３ｑ、１６ｑ、及び１７ｐの減少は一般に、ＨＣＣ腫瘍組織中に検出される（Ｍｏｉｎｚａｄｅｈ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ２００５；９２：９３５−９４１）。５ｐ、８ｑ、９ｐ、１３ｑ、及び２０ｑの増加ならびに８ｐ、９ｐ、１７ｐ、及び１８ｑの減少は一般に、ＣＲＣ腫瘍組織中に検出される（Ｆａｒｚａｎａ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ２０１２；２：２３１９６８及びＬｉｐｓ ＥＨ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐａｔｈｏｌ２００７；２１２：２６９−７７）。５ｐ、７ｐ、７ｑ、８ｑ、１４ｑ、１７ｑ、及び２０ｑの増加ならびに３ｐ、８ｐ、９ｐ、１３ｑ、及び１８ｑの減少は一般に、非小細胞肺癌組織中に検出される一方で、３ｑ、５ｐ、１４ｑ、及び１９ｑの増加ならびに３ｐ、４ｐ、４ｑ、５ｑ、１０ｐ、１０ｑ、１３ｑ、１５ｑ、１７ｐ、及び２２ｑの減少は一般に、小細胞肺癌組織中に検出される（Ｚｈａｏ Ｘ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ２００５；６５：５５６１−７０）。１ｑ、８ｑ、１７ｑ、及び２０ｑの増加ならびに４ｐ、５ｑ、８ｐ、１１ｑ、及び１３ｑの減少は、乳癌組織中において一般的である（Ａｎｄｒｅ Ｆ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ２００９；１５：４４１−５１）。ここに記載されるＣＮＡのパターンは説明的な例としての役割を果たし、本明細書に記載される方法において使用され得る唯一のパターンであることは意図されない。

この実施例のＣＮＡパターンに基づいて、癌スクリーニングの目的で、患者ＢｒＣ２に対して血漿ＤＮＡ配列決定を実行したと想定する。１ｑ、３ｑ、８ｑ、及び１４ｑのコピー数増加ならびに２ｐ、２ｑ、３ｐ、４ｐ、７ｑ、８ｐ、９ｐ、１１ｐ、１２ｐ、１２ｑ、１６ｑ、及び１７ｐのコピー数減少を含むＣＮＡが観察された。彼女の血漿中のＣＮＡは、１３の乳癌の典型的なＣＮＡに一致した。対照的に、彼女のＣＮＡは、それぞれ３、６、４、及び１つの、ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＬＣ、及びＮＰＣの典型的なＣＮＡに一致したにすぎなかった。したがって、彼女の血漿ＤＮＡのＣＮＡパターンに基づいて、彼女が有する可能性が最も高い癌は乳癌であると推定される。選択される閾値を使用して、観察されるＣＮＡの数が、特定の癌の種類の典型的なＣＮＡと適合するかどうかを決定することができる。この例において、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の閾値を使用して、ＣＮＡを乳癌と適合するものとして分類することができる。一致領域のパーセンテージもまた使用され得る。例えば、一般的に異常な領域に一致する領域のパーセンテージが使用され得る。一般的に異常な領域は、基準試料の５０％超において特定の異常を有する領域として定義され得る。

他の実施形態において、他の統計的アプローチ（例えば、階層的クラスター化などであるが、これに限定されない）を使用して、患者が有する可能性が最も高い癌の種類を推定することができる。例えば、各基準試料に、各次元が異なる領域に対応する多次元的なデータ点を割り当ててもよい。一実装例において、各次元を、−１（欠失）、０（正常）、または１（増幅）に割り当ててもよい。異なるレベルの増幅では、より大きな数が可能であり得る。特定の癌の種類の試料はともにクラスター化され、新しい試料はクラスターに割り当てられ得る。閾値は、（存在する場合）新しい試料がどのクラスターに割り当てられるべきかを決定するために使用される測定基準に対応してもよく、割り当てられたクラスターは、その試料の特定された癌の種類に対応する。例えば、クラスターは、そのクラスターの少なくとも所定の数の基準パターンによって共有されるクラスターの基準パターンの領域に対応する重心を有し得る。クラスターは、どの試験パターンがそのクラスター内に位置するかを画定する境界を含み得る。境界は、単なる球状を超えた様々な形状を有し得る。どの基準パターンがどのクラスターに属するかを決定するとき、境界は、クラスター化分析の一部として決定することができ、クラスター内ではあるが重心から最遠の基準パターンが、境界を確定し得る。ある試験パターンがあるクラスターの一部であるかどうかを決定するための閾値は、重心から試験パターンへの方向での、重心から境界までの距離と見なすことができる。

更に別の実施形態において、異なる種類の癌を有する相対尤度が決定され得る。患者のＣＮＡパターンが、各種類の癌のＣＮＡの尤度に対して比較され得る。例えば、１ｑの増加を有する患者は、異なる種類の癌の１ｑの増加の確率に対して比較されるだろう。説明目的で、我々は、７０％のＨＣＣ患者、２０％のＬＣ患者、及び１％のＣＲＣ患者において１ｑの増加が発生し得ると想定する。これらの尤度により、ＣＮＡを有する異なる癌の種類を有する患者の相対的パーセンテージに基づいて、オッズ比を決定することができる。例えば、１ｑの増加に基づいて、患者は、ＨＣＣを有する可能性がＬＣを有する可能性よりも３．５倍高く、ＨＣＣを有する可能性がＣＲＣを有する可能性よりも７０倍高いと見なされ得る。ＨＣＣ対ＬＣ対ＣＲＣのオッズ比は、７０：２０：１であり得る。当業者は、このオッズ比が、いくつかの異なりはするが等価である形態で表され得ることを理解するだろう。１ｑ以外の染色体腕の異なるＣＮＡのオッズ比もまた、決定され得る。その後、個々のＣＮＡの尤度またはオッズ比により、全体的オッズ比を算出することができる。換言すると、ある患者に由来するＣＮＡパターン、及び所与のＣＮＡパターンを有する異なる種類の癌の尤度を考慮すれば、異なる種類の癌の尤度を、全体的オッズ比において互いに比較することができる。この例は異なる染色体腕のＣＮＡの尤度を使用したものの、染色体腕以外の異なる亜染色体領域のＣＮＡの尤度を使用してもよい。いくつかの実施形態において、患者において染色体腕または他の亜染色体領域にＣＮＡが見出されない場合、異なる種類の癌について、ＣＮＡなしのパターンが染色体腕または亜染色体領域にＣＮＡを発見しない尤度に対して比較され得る。その後、ある患者に由来するＣＮＡを有さない領域のパターンを使用して、異なる種類の癌の尤度を決定することができる。更に、ＣＮＡを有する領域及びＣＮＡを有さない領域の分析の組み合わせを使用して、１種類の領域のみが使用される場合よりも潜在的に高い正確性で、ある種類の癌の尤度または相対尤度を決定することができる。

別の例において、患者ＮＰＣ１の血漿ＤＮＡを配列決定したと想定する。２ｑ、１２ｑ、及び２２ｑのコピー数増加ならびに６ｑ及び１８ｑのコピー数減少を含むＣＮＡが観察された。この患者のＣＮＡパターンは、ＮＰＣの典型的なＣＮＡのうちの４つに一致した。比較すると、このＣＮＡパターンは、ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＢｒＣ、及びＬＣのパターンの、０、２、０、及び０の典型的なＣＮＡに一致した。別の実施形態において、ある癌の種類の典型的なＣＮＡの欠如もまたカウントされ得る。例えば、ＮＰＣの典型的なＣＮＡのうちのいずれも、この患者には不在ではなかった。対照的に、ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＢｒＣ、及びＬＣの７、１６、１３、及び８の典型的なＣＮＡは、この患者には不在であった。したがって、この患者のＣＮＡパターンは、ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＢｒＣ、及びＬＣは示さない。

図８Ａ、８Ｂ、及び８Ｃは、表８００のより高い解像度のＣＮＡ分析を使用することによって、どのようにしてこのアプローチの正確性を更に高めることができるかを示す。１Ｍｂ領域を冒すＣＮＡが、この癌患者のコホートにおいて特定された。表８００では、最左列に１ＭＢ領域のゲノム座標が列挙される。他の列のそれぞれは、癌の種類及びその癌の種類の患者数を列挙する。欠失は「−」で特定される。増幅は「＋」で特定される。正常領域は「Ｎｉｌ」で特定される。

この例において、１Ｍｂに及び、かつ同一の癌の種類を有する全ての患者において存在したＣＮＡが特定された。より高い解像度により、高い割合の同一の種類の癌を有する患者において存在する亜染色体ＣＮＡを特定することができる。これらの癌種類特異的ＣＮＡは、腕に基づく分析においては特定されない。例えば、３０〜３１Ｍｂの座標及び４４〜４５Ｍｂの座標に及ぶ染色体１８のコピー数増加は、肺癌を有する３人の患者全てにおいて特定されたが、他の癌の種類を有する患者においては一般的ではなかった。上記に論じられるように、異なる統計試験を使用して、どの癌特異的ＣＮＡパターンが試験される事例に最も類似しているかを決定することができる。異なる統計試験としては、例えば、異なる癌関連ＣＮＡパターン内の典型的なＣＮＡの数のカウント、及び階層的クラスター化を挙げることができる。

ＩＶ．血漿中の腫瘍由来ＤＮＡ断片のサイズ分析
ＤＮＡ断片のサイズ分布における統計的に有意な差を使用して、カウントの数と類似した様式で、異常を特定することができる。総（すなわち、腫瘍性プラス非腫瘍性）血漿ＤＮＡのサイズ分布が、癌患者において増加することが報告されている（Ｗａｎｇ ＢＧ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００３；６３：３９６６−８）。しかしながら、（ＤＮＡの総（すなわち、腫瘍プラス非腫瘍）量の代わりに）腫瘍由来ＤＮＡを特に研究している場合、腫瘍由来ＤＮＡ分子のサイズ分布が、非腫瘍細胞に由来する分子のサイズ分布よりも短いことが観察されている（Ｄｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００５；１０２：１６３６８−７３）。したがって、循環ＤＮＡのサイズ分布を使用して、癌関連染色体異常が存在するかどうかを決定することができる。

サイズ分析は、本明細書及び米国特許第８，６２０，５９３号に言及される様々なパラメータを使用することができる。例えば、上記からのＱ値またはＦ値を使用してもよい。これらの値は読み取りの数には対応しないため、そのようなサイズ値は他の領域からのカウントによる正規化を必要としない。領域の深さ及び緻密さに関与する技術が使用されてもよい。いくつかの実施形態において、２つの領域を比較するとき、特定の領域のＧＣバイアスを考慮してもよい。いくつかの実装例において、サイズ分析は、ＤＮＡ分子のみを使用する。

Ａ．方法
図９は、本発明の実施形態に従って、ある生物の生体試料を分析する方法９００を図示するフローチャートである。生体試料は、正常細胞、及び潜在的に癌に関連付けられる細胞に起源を持つ核酸分子を含み得る。生体試料中、核酸分子のうちの少なくともいくつかは無細胞であり得る。一態様において、方法９００は、第１の染色体の断片のサイズ及び１つ以上の基準染色体の断片のサイズの分離値（例えば、差または比率）に基づいて、配列不均衡の分類を決定することを対象とし得る。

ステップ９１０において、生体試料中の複数の核酸分子のそれぞれについて、核酸分子のサイズが測定され得る。核酸分子のサイズの取得は、Ｌｏらによって２０１３年３月７日に出願された「Ｓｉｚｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｆｅｔａｌ ＤＮＡ Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｔｅｒｎａｌ Ｐｌａｓｍａ」と題する米国特許公開第２０１３／０２３７４３１号に記載され、その内容が、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。

ステップ９２０において、生物の基準ゲノムにおける核酸分子の位置が特定され得る。ステップ１２０及び他に記載されるように、この位置はゲノムのどの部分であってもよい。例えば、複数の核酸分子のそれぞれがどの染色体に由来するのかが特定される。この決定は、基準ゲノムに対するマッピングによってなされ得る。

ステップ９３０において、複数の染色体領域のそれぞれについて、特定された位置に基づいて、核酸分子のそれぞれの群が第１の染色体領域に由来するものとして特定され得る。第１の染色体領域は、複数の第１の座位を含み得る。

ステップ９４０において、コンピュータシステムが、核酸分子の第１の群のサイズ分布の第１の統計値を算出し得る。実施形態において、第１の統計値は、特定のサイズの第１の曲線下面積を算出することによって決定することができる。第１の曲線は、あるサイズの範囲にわたる第１の染色体領域の核酸分子の累積度数のプロットであってもよい。一実施形態において、第１の統計値は、第１の染色体に対応する断片のサイズ分布の代表値、平均値、中央値、または最頻値であってもよい。別の実施形態において、第１の統計値は、ある種類のカットオフであり得る、第１のサイズ未満の断片の長さの合計を含み得る。例えば、２００塩基対よりも小さい断片のそれぞれでは、それらの長さが合計され得る。この合計を、第１の染色体に対応する全ての断片の長さの合計、または（第１のサイズと同一であり得る）第２のサイズカットオフよりも大きい断片の長さの合計などの別の数で割ってもよい。例えば、第１の統計値は、断片の全長に対する第１のサイズカットオフ未満の断片の全長の比率であっても、大きい断片の全長に対する、小さい断片の全長の比率であってもよい。

ステップ９５０において、第１の統計値を第１の基準値と比較して、第１の染色体領域が異常を呈するかどうかについての分類を決定することができる。実施形態において、第１の基準値は、第２の染色体領域の核酸分子の第２の群のサイズ分布の統計値であり得る。第２の染色体領域は、基準染色体領域と見なすことができる。第１の基準値は、特定のサイズの第２の曲線下面積を算出することによって決定することができる。第２の曲線は、サイズの範囲にわたる第２の染色体領域の核酸分子の累積度数のプロットであってもよい。一実施形態において、第１の基準値は、複数の基準染色体の統計値であってもよい。一実装例において、統計値を組み合わせることで、統計値を１つ以上の第２の染色体のものとしてもよい。別の実施形態において、複数の基準染色体の統計値が個々に比較されてもよい。この比較は、第１の染色体領域が欠失または増幅を呈するかどうかについての分類を決定することができる。

第１の統計値及び第１の基準値を比較して、分離値を得ることができる。一実施形態において、分離値は、第１の統計値と第１の基準値との間の差であってもよいが決定される。別の実施形態において、分離値は、第１の基準値に対する第１の統計値の比率であってもよい。更に別の実施形態において、各基準染色体について算出され得る複数の分離値（例えば、各基準値の分離値）が決定され得る。

分離値は、以下の等式を使用する、第１の染色体領域と基準染色体領域との間の、短いＤＮＡ断片の割合の差であってもよい。
式中、Ｐ（≦１５０ｂｐ）_試験は、１５０塩基対以下のサイズを有する第１の染色体領域に起源を持つ、配列決定された断片の割合を表し、Ｐ（≦１５０ｂｐ）_基準は、１５０塩基対以下のサイズを有する基準染色体領域に起源を持つ、配列決定された断片の割合を表す。他の実施形態において、他のサイズ閾値（例えば、１００塩基対、１１０塩基対、１２０塩基対、１３０塩基対、１４０塩基対、１６０塩基対、及び１６６塩基対などであるが、これらに限定されない）が使用されてもよい。他の実施形態において、サイズ閾値は、塩基、またはヌクレオチド、または他の単位で表すことができる。いくつかの実装例において、基準染色体領域は、第１の染色体領域を除く全ての亜染色体領域として定義することができる。他の実装例において、基準領域は単に、第１の染色体領域を除く亜染色体領域の一部分であってもよい。

カウントに基づく分析において使用されたものと同一の対照群が、サイズに基づく分析において使用され得る。試験される領域のサイズに基づくｚスコアは、対照のΔＦの平均値及び標準偏差値を使用して算出することができる。

分離値は、１つ以上のカットオフ値と比較され得る。一実施形態において、この比較は、複数の分離値のそれぞれについて実行され得る。例えば、第１の統計値と各基準値との間で、異なる分離値が決定され得る。様々な実装例において、各分離値は、同一または異なるカットオフ値と比較され得る。別の実施形態において、分離値を２つのカットオフ値と比較して、その分離値がある特定の範囲内にあるかどうかを決定する。この範囲は、非正常データ点が発生するかどうか（例えば、異常）を決定するための１つのカットオフを含み得、第２のカットオフは、データ点が測定値または分析の誤差によって引き起こされる可能性があるかどうか（例えば、罹患試料についてすら、分離値がこれまで期待されていたよりも大きいかどうか）を決定するために使用され得る。

第１のゲノム位置について、配列不均衡（例えば、異常）が存在するかどうかについての分類は、この比較に基づいて決定される。一実施形態において、単一の分離値について、複数のカットオフ（例えば、Ｎカットオフ）が使用されてもよい。そのような実施形態において、Ｎ＋１分類が決定され得る。例えば、２つのカットオフを使用して、染色体領域が正常もしくは健常であるか、未定であるか、または異常（例えば、増幅もしくは欠失）であるかどうかの分類を決定することができる。複数の比較（例えば、各分離値の比較）が実行される別の実施形態において、分類は、比較のそれぞれに基づいてもよい。例えば、規則に基づく方法は、比較のそれぞれから生じる分類に目を向けることができる。一実装例において、決定的分類は、分類のうちの全てが一貫するときにのみもたらされる。別の実装例において、多数決分類が使用される。更に別の実装例において、分離値のそれぞれが、それぞれのカットオフ値にどれほど接近しているかに基づく、より複雑な式が使用されてもよく、これらの接近値を分析して、分類を決定することができる。例えば、接近値は（正規化などの他の要因とともに）合計されてもよく、結果が別のカットオフ値と比較されてもよい。他の実施形態において、方法９００の変動はまた、第１の染色体の統計値と、基準試料に由来し得るカットオフ値との直接比較にも適用され得る。

Ｂ．サイズと癌との相関性
更なる分析のため、我々は、３つの異なるサイズ群、すなわち、１５０塩基対未満のもの、１５０〜１８０塩基対のもの、及び１８０塩基対超のものの、血漿ＤＮＡ分子を別々に調査した。１５０塩基対未満のＤＮＡ断片の割合と血漿中の腫瘍ＤＮＡ画分との間には、正の相関性（ピアソンのｒ＝０．６、ｐ値＜０．００１）が存在する（図１０Ａ）。図１０Ａ、１０Ｂ、及び１０Ｃの腫瘍ＤＮＡ画分は、対数目盛りで示される。１５０〜１８０塩基対のサイズを有するＤＮＡ断片の割合と血漿中の腫瘍ＤＮＡ画分との間には、相関性（ｒ＝−０．０７、ｐ値＝０．９５）は観察されなかった（図１０Ｂ）。１８０塩基対超のＤＮＡの割合と血漿中の腫瘍ＤＮＡ画分との間には、負の相関性（ｒ＝−０．４１、ｐ値＜−０．００１）が観察された（図１０Ｃ）。

より低い腫瘍ＤＮＡ画分は初期段階の癌で発生する可能性がより高く、より高い腫瘍ＤＮＡ画分はより後期の段階の癌で発生する可能性がより高い。したがって、ＤＮＡ断片にとって正常であるよりも大きい平均サイズ（または他の統計値）の存在は、初期の癌を示し得、ＤＮＡ断片にとって正常であるよりも小さい平均サイズの存在は、より後期の段階の癌を示し得る。

他の実施形態において、腫瘍ＤＮＡ画分が測定され得る。腫瘍ＤＮＡ画分が特定の閾値未満である場合、サイズ分析を実行して、サイズ分布の統計値が閾値よりも大きいかどうかを決定（すなわち、ＤＮＡ断片が長いかどうかを試験）し得る。腫瘍ＤＮＡ画分が特定の閾値を超える場合、サイズ分析を実行して、サイズ分布の統計値が閾値未満であるかどうかを決定（すなわち、ＤＮＡ断片が短いかどうかを試験）し得る。

サイズ分析の方法、及びサイズと癌との関連性に関するデータは、Ｌｏらによって２０１１年１１月３０日に出願された「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ ｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｃａｎｃｅｒ」と題する米国特許公開第２０１３／００４０８２４号に論じられ、その内容が、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。

Ｖ．サイズ分析によるＣＮＡ異常の確認
我々は、超並行配列決定を使用して、全ゲノム様式での単一塩基解像度での血漿ＤＮＡ試料のサイズプロファイルを研究した。我々は、ＣＡＺＡを使用して腫瘍由来血漿ＤＮＡを特定して、それらの特異的サイズプロファイルを研究した。

この研究において、我々は、ＣＡＺＡアプローチを使用して、腫瘍関連ＣＮＡの存在を示す血漿ＤＮＡの定量的異常を示す染色体腕を特定した。増幅または欠失を有する染色体腕を特定した後、我々は、腫瘍由来血漿ＤＮＡ（増幅した領域に富む）と非腫瘍由来血漿ＤＮＡ（欠失した領域に富む）とを比較するための戦略として、これらの領域に集中した。我々は、このアプローチが、癌関連変異の検出に基づくよりも、サイズプロファイル化分析のために腫瘍性ＤＮＡを特定するための、より頑建な手段を提供し得るものと考える。後者では、癌ゲノムにおいて、平均で約数千の点変異が存在すると報告されている（２９〜３２、３９）。他方、ＣＡＺＡでは、総計約数十メガベースに及ぶ、ＣＮＡを呈するゲノム領域に由来する無数の血漿ＤＮＡ分子のうちのいずれも有用であるだろう。

Ａ．複合分析
図１１は、癌患者における血漿ＤＮＡサイズ分析の原理の模式図を示す。図１１は、段階１１１０〜２１５０を示す。段階１１１０は、血漿中の組織の細胞を示す。上記のように、腫瘍細胞は、様々な領域において増幅及び／または欠失を含み得る。実施例は、ある特定の染色体上で増幅される１つの領域、及び欠失される別の領域を示す。

段階１１２０では、血漿は、様々な領域からの寄与とともに示される。ＤＮＡ断片は、血漿試料中に示される。癌患者において、血漿ＤＮＡは、腫瘍細胞（赤色の分子）及び非腫瘍細胞（青色の分子）の両方に由来する。腫瘍組織中で増幅されるゲノム領域は、より腫瘍性のＤＮＡを血漿に寄与するだろう。腫瘍組織中で欠失されるゲノム領域は、より少ないＤＮＡを血漿に寄与するだろう。

段階１１３０では、ペアエンド配列決定が実行される。ペアエンド配列決定を使用して、血漿試料中のＤＮＡ断片のサイズを決定することができる。

段階１１４０では、カウントに基づく分析を使用して、異常領域を特定し得る。示される実施例において、ＣＡＺＡ分析を使用して、染色体腕が血漿ＤＮＡ中で過剰提示または過小提示されるかどうか（これは、腫瘍中の染色体腕の増幅または欠失の存在を示す）を決定した。大きな正のｚスコアは、染色体腕の増幅の存在を示し得る一方で、大きな負のｚスコアは、染色体腕の欠失の存在を示し得る。腕以外の他の領域のサイズが使用されてもよい。

段階１１５０では、試験領域のサイズ分布が分析され得る。上記に説明されるように、腫瘍ＤＮＡ断片は、健常な細胞のＤＮＡ断片よりも短い。異常領域のＤＮＡ断片を試験して、サイズ分析もまた同一の異常を示すことを確認することができる。示される実施例において、増幅を呈する領域のサイズ分布が、欠失を呈する領域のサイズ分布と比較される。したがって、いくつかの実施形態において、以下により詳細に記載されるように、過小提示される染色体腕（非腫瘍ＤＮＡに富む）及び過剰提示される染色体腕（腫瘍由来ＤＮＡに富む）に起源を持つ血漿ＤＮＡ分子のサイズプロファイルが比較され得る。

Ｂ．２つの領域間のサイズ差
腫瘍組織及び非腫瘍組織に起源を持つ血漿ＤＮＡのサイズプロファイルを比較するために、我々は、ＣＮＡを有する染色体腕に由来する血漿ＤＮＡ断片を分析した。先行研究（３４〜３６）、及びこの研究における我々の発見に基づくと、ＨＣＣに関連付けられる典型的なＣＮＡは、１ｐ及び８ｐの欠失ならびに１ｑ及び８ｑの増幅を含む。血漿中５３％の腫瘍由来ＤＮＡを有するＨＣＣ事例（Ｈ２９１）を使用して、原理を説明する。この事例は、血漿中８ｐの欠失及び８ｑの増幅を示した。したがって、腫瘍は、８ｐの欠失した領域よりも、８ｑの増幅した領域から多くの血漿ＤＮＡを放出するだろう。結果として、ＣＮＡを有さない領域と比較して、８ｑは腫瘍由来ＤＮＡに比較的富み、８ｐは腫瘍ＤＮＡが比較的枯渇する（換言すると、非腫瘍ＤＮＡに比較的富む）だろう。８ｐ及び８ｑの血漿ＤＮＡのサイズプロファイルを、図１２Ａに示す。８ｑのサイズプロファイルは、８ｐのサイズプロファイルの左側にあり、８ｑの血漿ＤＮＡのサイズ分布が８ｐの血漿ＤＮＡのサイズ分布よりも短かったことを示した。８ｑは腫瘍ＤＮＡに富むため、このデータは、腫瘍によって放出されるＤＮＡが、腫瘍に起源を持たないＤＮＡよりも短い傾向があることを示す。

短縮化の程度を定量化するために、各血漿試料について、８ｐ及び８ｑのサイズプロファイルの累積度数プロット（図１２Ｂ）を構築した。これらのプロットは、試料中の全ての血漿ＤＮＡ分子の割合として、短いサイズから長いサイズまでのＤＮＡ分子の進行性蓄積を示す。その後、２つの曲線の差ΔＳ（図１２Ｃ）を、
として算出し、式中、ΔＳは、特定のサイズの８ｐと８ｑとの間の累積度数の差を表し、Ｓ_８ｐ及びＳ_８ｑはそれぞれ、８ｐ及び８ｑ上の、特定のサイズ未満の血漿ＤＮＡ断片の割合を表す。特定のサイズでのΔＳの正の値は、８ｐと比較して、８ｑ上の、その特定のサイズよりも小さいＤＮＡのより高い存在量を示す。この方法を使用して、我々は、血漿中８ｐ及び８ｑ上にＣＮＡを呈した全てのＨＣＣ事例について、５０塩基対〜２５０塩基対のΔＳ値を探査した。ＨＣＣ事例Ｈ２９１の８ｑと８ｐとの間の累積度数の差ΔＳを、図１２Ｃに赤色線としてプロットする。健常な対照（灰色線）と比較すると、これら全てのＨＣＣ事例は、８ｐ（非腫瘍ＤＮＡに富む）よりも、８ｑ（腫瘍ＤＮＡに富む）に起源を持ち、２００塩基対よりも短い血漿ＤＮＡの、より高い存在量を示した（図１３Ａ）。図１３Ａは、血漿中の８ｐ及び８ｑについて異なるＣＮＡを有する全てのＨＣＣ事例のサイズに対する、ΔＳのプロットを示す。血漿中、異なる範囲の画分腫瘍ＤＮＡ濃度を有する事例を、異なる色で示す。画分腫瘍ＤＮＡ濃度が増加するにつれて、ΔＳが増加し、これは、より短いＤＮＡ断片のより高い存在量を示す。これらのデータは、腫瘍由来ＤＮＡが非腫瘍由来ＤＮＡのそれよりも短かったことを更に支持する。

ΔＳの値は１６６塩基対で最大値に達し、これは、腫瘍組織に由来する血漿ＤＮＡと非腫瘍組織に由来する血漿ＤＮＡとの間の重要な差は、１６６塩基対未満及び１６６以上のＤＮＡの相対的存在量であることを示した。我々は、この値をΔＳ_１６６として表す。ＨＢＶ保因者及び肝硬変症を有する患者を含むこの研究の全ての対象について、ΔＳ_１６６をプロットした（図１３Ｂ）。ＨＣＣ群について、血漿ＣＡＺＡ分析によって決定される、８ｐ及び８ｑ上で異なるＣＮＡを有する及び有さない患者をそれぞれ、赤色及び黒色の点で表す。非ＨＣＣ対象のうちのほぼ全てで、ΔＳ_１６６値は０に接近しており、これは、８ｐ及び８ｑに由来するＤＮＡのサイズ分布が類似することを示した。ΔＳ_１６６（またはいくらかの他の特定のサイズの値）は閾値と比較され得、差が閾値を超える場合、領域のうちの少なくとも１つが異常を呈するものとして特定され得る。一方の領域が（例えば、ＣＮＡ分析から）異常を有さないことが既知である場合、差が閾値を超えるときに、他方の領域が異常を呈するものとして特定されるだろう。そのような実施形態において、差の符号は異常の種類を示し得る。例えば、第１の領域が増幅を有し、第２の領域が増幅を有さない場合、差は正の数であるだろう。第１の領域が欠失を有し、第２の領域が欠失を有さない場合、差は負の数であるだろう。異常が決定される場合、両方の領域が潜在的に異常を有するものとして特定され得、符号は各領域が有し得る異常の種類を示す。差が十分に大きくある場合、それは、一方の領域が増幅を有し、他方の領域が欠失を有する（または増幅の量が異なる）ことを示し得、これは、その時、正常領域と比較して、差が増幅した領域よりも大きいためである。コピー数分析は、好適な閾値が選択され得るように、領域の初期分類を提供することができる。

１ｐ及び１ｑの血漿ＤＮＡサイズプロファイルに基づくサイズ分析もまた実行され（図１４及び１５）、同一の動向を示した。図１５において、ＨＣＣ群について、血漿ＣＡＺＡ分析によって決定される、１ｐ及び１ｑ上で異なるＣＮＡを有する及び有さない患者をそれぞれ、赤色及び黒色の点で表す。このサイズ分析は、正常領域内の増幅した領域、または正常領域及び欠失した領域を使用して実行することができる。

別の実施形態において、増幅または欠失した領域のサイズ分布が、癌を有することまたは健常であることが既知である１人以上の基準対象のサイズ分布と比較され得る。サイズ分布は、値、例えば、統計値（平均値またはサイズ中央値など）によって表すことができる。

したがって、染色体領域の異常を使用して、サイズ分析のために特定の領域を選択することができる。その後、選択された領域のサイズ分析を使用して、癌のレベルの分類を決定することができる。ＣＮＡ及びサイズ分析を使用する組み合わせは、より大きな正確性を提供することができる。ＣＮＡ分析は時折、偽陽性、すなわち、癌を有さないが、コピー数異常を有する領域を有する患者をもたらすことがある。したがって、その時、異常を呈する十分な数の領域のために癌を有すると特定される患者が、サイズ分析を使用して確認され得る。一実施形態において、選択された領域は、増幅を有する領域である。

この研究は、高解像度かつ包括的な様式でＨＣＣ患者の血漿ＤＮＡサイズプロファイルを調査する意図を持って設計され、これは、腫瘍組織による血漿ＤＮＡの生成または放出に関する機序に光を当てることができる。この研究の別の目標は、癌関連血漿ＤＮＡサイズプロファイルに関する文献に存在した、明らかな非一貫性のうちのいくつかを解決することであった。研究は、癌患者の血漿中のより長いＤＮＡの存在を報告（２０〜２３）している一方で、他の研究は、より短い血漿ＤＮＡ分子における癌関連ＤＮＡ変異のより高い有病率を報告（１２、２５）している。これらの研究目標を達成するために、２ステップアプローチを採用した。第１に、我々は、ペアエンド超並行配列決定を使用することによって、募集した対象の血漿試料中の全てのＤＮＡ分子の長さを測定した。このアプローチは、最大で単一塩基解像度まで、個々の血漿ＤＮＡ分子の長さを決定することを可能にする。更に、ゲノムにわたる血漿ＤＮＡ分子が分析され得、異なるサイズのＤＮＡ間の相対量が高精度で決定され得る。したがって、血漿ＤＮＡサイズプロファイルの広範かつ深い調査を得ることができる。第２に、我々は、増幅または欠失に関連付けられるゲノム位置に起源を持つ血漿ＤＮＡ中の、腫瘍性ＤＮＡ含有量の相対差、ＣＡＺＡアプローチを、腫瘍由来血漿ＤＮＡを特定して詳細に分析するための手段として利用した。

この研究は、血漿ＤＮＡの放出に関与し得る生物学的機序へのいくつかの洞察を提供する。ＨＢＶ保因者、肝硬変症またはＨＣＣを有する患者を含む、全ての募集した対象の血漿ＤＮＡは、１６６塩基対で顕著なピークを呈した（図１４及び１６）。このパターンは、妊婦及び臓器移植レシピエントの血漿における観察に類似する（２６、２７）。研究された患者の全ての群の血漿ＤＮＡサイズプロファイルにおける１６６塩基対の特徴の存在は、妊婦、移植レシピエント、ＨＣＣ、肝硬変症、または慢性ＨＢＶを有する患者のものを含む、ヒト血漿中の循環ＤＮＡ分子のうちのほとんどがモノヌクレオソーム単位に似ており、アポトーシスのプロセスに起源を持つ可能性があることを示す。

腫瘍関連ＣＮＡを有する血漿ＤＮＡ分子のサイズプロファイルの研究は、そのような分子がそのような符号を担持しないものよりも短いことを示す（図１３）。これは、血漿中の腫瘍ＤＮＡの増加する画分濃度とともに、血漿ＤＮＡのサイズプロファイルは左に向かって移動するという我々の観察と一貫する。しかしながら、血漿中の腫瘍ＤＮＡの低画分濃度を有するＨＣＣ患者が健常な対照よりも明らかに長いサイズ分布を有したという事実は、腫瘍関連ゲノム符号を担持しない血漿ＤＮＡの追加の構成要素が存在したことを示す。この構成要素は、腫瘍のまわりの非腫瘍性肝臓組織に由来する可能性がある。これらの長いＤＮＡ分子は、アポトーシスの代わりに壊死に由来し得る。壊死に関連付けられる細胞死が、典型的なオリゴヌクレオソームＤＮＡ断片に加えて、より長いＤＮＡ断片を生成し得ることが報告されている（３７、３８）。将来の研究にとって、これらのより長いＤＮＡ分子のＤＮＡメチル化プロファイルを研究して、それらが、肝臓について期待されるものに対する類似点を有するかどうかを確認することが興味深くあるだろう。

我々は、異常に短い及び長いＤＮＡ分子の母集団が、肝細胞癌を有する患者の血漿中で共存することを示した。短いＤＮＡ分子は、腫瘍関連コピー数異常を選択的に担持した。

まとめると、我々は、単一ヌクレオチド解像度で、ＨＣＣを有する患者における血漿ＤＮＡのサイズ分布をプロファイル化した。我々は、腫瘍組織及び非腫瘍組織に由来する血漿ＤＮＡのサイズの差を実証した。

ΔＳと腫瘍サイズとの間の関連性もまた、分析した。血漿中８ｐの欠失及び８ｑの増幅を有する１０人のＨＣＣ患者の血漿ＤＮＡ試料を、ΔＳ分析を使用して分析した。８ｐ及び８ｑに対してマッピングする血漿ＤＮＡ断片間のサイズ差について、ΔＳを決定した。ΔＳの正の値は、８ｐと比較して、８ｑの、１５０塩基対未満の短いＤＮＡ断片のより多い存在量を示す。図３０において、ΔＳの値を、ＨＣＣ患者の腫瘍の最長寸法に対してプロットした。

ΔＳと腫瘍サイズとの間の正の相関性が、観察された（ｒ＝０．８７６、ピアソン相関性）。この観察は、異なる種類のＣＮＡを呈する領域に由来する血漿ＤＮＡ断片のサイズ分布を使用して、ＨＣＣ患者における腫瘍のサイズを反映させることができることを示す。

これらの１０人のＨＣＣ患者について、総血漿ＤＮＡの全体的サイズ分布もまた分析した。各事例について、１５０塩基対未満（Ｐ（＜１５０））の血漿ＤＮＡ断片のパーセンテージを決定し、図３１において腫瘍サイズに対してプロットした。短い断片の割合は、最大寸法が３ｃｍ超のより大きな癌を有する患者において有意により高かった。一実施形態において、短い断片の割合を使用して、癌のサイズ及び重症度を反映させることができる。他の実装例において、サイズの他のカットオフ（例えば、１００塩基対、１１０塩基対、１２０塩基対、１３０塩基対、１４０塩基対、１６０塩基対、及び１６６塩基対などであるが、これらに限定されない）が使用されてもよい。

較正関数を使用して、腫瘍のサイズと統計値との間の関連性を提供してもよい。較正関数は、既知のサイズの腫瘍を有する生物に由来する基準試料の較正データ点から決定することができる。較正データ点は、腫瘍のサイズの測定値、及び染色体領域に由来する核酸分子のサイズの対応する統計測定値を含み得る。新しい対象から新しい試料が得られるとき、統計値が決定され得、較正関数を使用して統計値を腫瘍サイズに変換し得る。較正関数の一例は、図３０に示される線形フィットに類似した線形フィットである。最小二乗フィットなどの他の種類の回帰分析を使用して、較正関数を生成してもよい。

較正関数は、様々な方法で、例えば、特定の関数の複数の係数（線形関数または非線形関数など）として定義される。他の実施形態は、較正関数が生成され得るように、複数の較正データ点（例えば、較正関数のデータ点）を記憶し得る。更に、そのような較正データ点間に内挿を実行して、較正関数を得てもよい。較正関数は、コンピュータメモリ内に記憶され、そこから読み出され得る。

Ｃ．方法
図１６は、本発明の実施形態に従って、ＣＡＺＡ及びサイズ分析を実行して、ある生物の生体試料を分析する方法１６００を図示するフローチャートである。

ステップ１６０５において、生物の複数の染色体領域が特定され得る。各染色体領域は、複数の座位を含み得る。複数の染色体領域のうちの１つが、第１の染色体領域として選択され得る。複数の染色体領域の特定は、図６のステップ６１０に類似し得る。

ステップ１６１０において、複数の核酸分子のそれぞれについて、生物の基準ゲノムにおける核酸分子の位置が特定され得る。核酸分子の位置の特定は、図６のステップ６２０に類似した様式で実行され得る。

ステップ１６１５において、生体試料中の複数の核酸分子のそれぞれについて、核酸分子のサイズが測定され得る。核酸分子のサイズが、図９のステップ９１０に類似した様式で測定され得る。

ステップ１６２０において、核酸分子のそれぞれの群は、複数の染色体領域のそれぞれの染色体領域について、特定された位置に基づいて、染色体領域に由来するものとして特定され得る。それぞれの群は、染色体領域の複数の座位のそれぞれに位置付けられた少なくとも１つの核酸分子を含み得る。核酸分子のそれぞれの群の特定は、図１のステップ１２０に類似し得る。

ステップ１６２５において、コンピュータシステムが、核酸分子のそれぞれの群のそれぞれの量を算出し得る。それぞれの量の算出は、図１のステップ１３０における算出に類似し得る。

ステップ１６３０において、それぞれの量をカウント基準値と比較して、染色体領域が増幅を呈するかどうかについてのカウント分類を決定することができる。比較に基づいて、第１の染色体領域は、潜在的に異常を呈するものとして特定され得る。ステップ１６２０〜１６３０は、図１のステップ１２０〜１４０または図６のステップ６３０〜６５０に様式した様式で実行され得る。

ステップ１６４０において、核酸分子の第１の群が、第１の染色体領域に由来するものとして特定され得る。

ステップ１６４５において、コンピュータシステムが、核酸分子の第１の群の第１のサイズ分布の第１の統計値を算出し得る。第１の統計値は、特定のサイズの第１の曲線下面積を算出することによって決定することができる。第１の曲線は、あるサイズの範囲にわたる第１の染色体領域の核酸分子の累積度数のプロットであってもよい。ステップ１６４５における第１の統計値の算出は、図９のステップ９４０における第１の統計値の算出に類似し得る。

ステップ１６５０において、第１の統計値をサイズ基準値と比較して、第１の染色体領域が異常を呈するかどうかについてのサイズ分類を決定することができる。サイズ基準値は、特定のサイズの第２の曲線下面積を算出することによって決定することができる。第２の曲線は、サイズの範囲にわたる第２の染色体領域の核酸分子の累積度数のプロットであってもよい。この比較は、２つの曲線間の差に基づいてもよい。いくつかの実施形態において、第１の統計値とサイズ基準値との比較は、図９のステップ９５０に類似し得る。

ステップ１６５５において、第１の染色体領域が異常を呈するかどうかについての最終分類が決定され得る。例えば、サイズ分類及びカウント分類のうちの少なくとも１つを使用して、第１の染色体領域に異常が存在するかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態において、最終分類は、カウント分類及びサイズ分類が同一の異常を示すときにのみ、第１の異常が存在することであり得る。したがって、第１の統計値とサイズ基準値との比較は、第１の染色体領域が異常を呈するかどうかを確認することができる。いくつかの実施形態において、対応するカウント分類に基づいて、異常であると特定された染色体領域のセットについて、サイズ分類のセットが決定され得る。サイズ分類のセットに基づいて、染色体領域のそれぞれを、異常であるもとして、または異常ではないものとして確認することができる。

いくつかの実施形態において、第１の染色体領域が異常を呈するどうかについての最終分類は、複数のカウント基準値及び複数のサイズ基準値に基づいてもよい。カウント基準値のそれぞれは、異なるカウント分類（例えば、レベル１とレベル２との間、またはレベル２とレベル３との間などの特有のカウント分類ペア間の弁別）に対応し得る。同様に、サイズ基準値のそれぞれは、異なるサイズ分類に対応し得る。サイズ分類とカウント分類との特定の組み合わせから、最終分類が決定され得る。

サイズ分類は、サイズ分布の統計値に応じて複数の分類を含み得る。例えば、統計値とサイズ基準値との間の大きな差は、高い異常の尤度に対応するサイズ分類をもたらし得る一方で、統計値とサイズ基準値との間の小さな差は、低い異常の尤度に対応するサイズ分類をもたらし得る。同様に、カウント分類は、核酸分子の群の量に応じて複数の分類を含み得る。例えば、カウント基準値と比較して、核酸分子の群の量間の大きな差は、高い異常の尤度に対応するカウント分類をもたらし得る一方で、小さな差は、低い異常の尤度に対応するカウント分類をもたらし得る。

したがって、最終分類は、異なるサイズ分類及びカウント分類について異なる閾値に基づいてもよい。例えば、ある特定の、可能性としては低い、異常の尤度を示すカウント分類を考慮すれば、高い異常の尤度を示すサイズ分類は、異常を示す最終分類をもたらし得る。サイズ分類またはカウント分類のうちの１つによって示される異常の尤度が増加するにつれて、他の分類によって示される尤度の閾値は低下する。場合によっては、一方の分類が高い第１の種類の異常の尤度を示し得、他方の分類が低い第２の種類の異常の尤度を示し得、最終分類が第１の種類の異常が存在することを示し得る。場合によっては、最終分類は、ある異常の尤度または確率に対応し得る。

Ｄ．例示的事例
癌関連ＣＮＡの検出の特異性は、以下の２つの事例に示されるように、血漿ＤＮＡサイズ分析によって改善することができる。事例１は、Ｂ型肝炎関連硬変症を有する患者であり、事例２はＢ型肝炎感染の慢性保因者であった。彼らの両方とも、募集時点ではいかなる癌を有することも既知ではなかった。彼らを募集から２年間臨床的に経過観察し、癌は検出されなかった。募集時に２人の対象のそれぞれから静脈血を採取した。血漿ＤＮＡを配列決定した。これらの２人の患者のそれぞれにおいて、ＣＮＡ関与染色体１ｑが検出された。事例１では、１ｐ及び１ｑのｚスコアはそれぞれ−２．３及び１５．５であった。これらの結果は、１ｑの増幅の解釈と一貫する。血漿ＤＮＡ断片サイズ分析において、ΔＳは−０．０１９であった。ΔＳの負の値は、１ｐと比較して、１ｑにおいて短いＤＮＡ断片の存在量がより低かったことを示す。カウントに基づく分析が、１ｑが増幅されたことを示すように、サイズに基づく分析結果は、我々が癌関連ＣＮＡについて期待していたものとは逆であった。癌患者において、コピー数増加を有する領域は、増幅を有する領域またはいかなるＣＮＡも有さない領域と比較して、より多くの癌由来の短い断片の存在ために、全体的により短いサイズ分布を示すことが期待される。したがって、この事例におけるサイズ分析は、血漿ＤＮＡ中に癌関連ＣＮＡの存在を示さない。

事例２について、１ｐ及び１ｑのｚスコアはそれぞれ０．４及び−４．４であった。これらの結果は、１ｑの欠失の解釈と適合する。血漿ＤＮＡ断片サイズ分析において、ΔＳは０．０４４であった。ΔＳの正の値は、１ｐと比較して、１ｑにおいて短いＤＮＡ断片の存在量がより高かったことを示す。カウントに基づく分析が、１ｑが欠失されたことを示すように、サイズに基づく分析結果は、我々が癌関連ＣＮＡについて期待していたものとは逆であった。癌患者において、コピー数減少を有する領域は、増幅を有する領域またはいかなるＣＮＡも有さない領域と比較して、より少ない癌由来の短い断片の存在ために、全体的により長いサイズ分布を示すことが期待される。したがって、この事例におけるサイズ分析は、血漿ＤＮＡ中に癌関連ＣＮＡの存在を示さない。

ＶＩ．癌の段階の決定
上記に言及されるように、ＤＮＡ断片のサイズは癌の段階を示し得る。より後期の段階の癌は、増幅を呈する領域についてより小さな断片を呈する。

固有の生物学的関心以外に、血漿ＤＮＡサイズプロファイル化はまた、血漿中の癌関連変化を検出するための診断アプローチの開発にも有用であり得る。例えば、血漿に由来する腫瘍性ＤＮＡの富化は、短いＤＮＡ断片の分析に集中することによって達成され得る。更に、我々は、短いＤＮＡ分子の割合が、血漿中の腫瘍由来ＤＮＡの画分濃度と正の関連性を有することを観察した。サイズプロファイルの変化を使用して、治療過程の患者を監視することができる。更に、ＨＣＣを有する及び有さない患者の血漿中の長いＤＮＡ分子の母集団の存在は、更なる研究を保証する。これらのＤＮＡ分子の放出を支配する組織源または病理学的プロセスがより良く理解されるとき、血漿中の長いＤＮＡの割合の測定が、そのような疾患の評価において有用となり得る。

Ａ．ＨＣＣ患者の血漿ＤＮＡサイズ分布
ＨＣＣ患者、ＨＢＶ保因者、硬変症患者、及び健常な対照の血漿ＤＮＡのサイズ分布を、図１８及び１９に示す。図１９において、各個体が異なる色によって表される。一般に、最も顕著なピークは、各対象のサイズ分布プロットの１６６塩基対で観察された。この観察は、妊婦及び移植レシピエントについての以前の報告（２６〜２８）と一貫し、これは、循環ＤＮＡ分子のうちのほとんどがアポトーシスに由来することを示す。興味深いことに、３２人の健常な対照のサイズ中央値分布プロファイル（図１８の黒色の太線）と比較すると、画分腫瘍ＤＮＡ濃度を有するＨＣＣ患者における血漿ＤＮＡのサイズはより長かった。しかしながら、血漿中の腫瘍ＤＮＡの増加する画分濃度とともに、血漿ＤＮＡのサイズ分布は次第に左に移動した（図１８）。

先に記載したように、図１３Ａは、血漿中の８ｐ及び８ｑについて異なるＣＮＡを有する全てのＨＣＣ事例のサイズに対する、ΔＳのプロットである。血漿中の画分腫瘍ＤＮＡ濃度が２％未満から８％超へと増加するにつれて、ΔＳが増加し、これは、より短いＤＮＡ断片のより高い存在量を示す。血漿中の画分腫瘍ＤＮＡ濃度は、癌の段階が進行するにつれて増加し得る。結果として、より短いＤＮＡ断片の量は、より後期の段階の癌を示し得る。図１３Ｂは、非ＨＣＣ対象と比較して、ＨＣＣ患者ではΔＳ_１６６がより高いことを示し、これは、１６６塩基対未満及び１６６塩基対超のＤＮＡの相対的存在量を使用して、癌の存在を示し得ることを示す。したがって、ΔＳ_１６６はまた、癌の段階も示し得る。

図２０は、短い断片の割合を使用して、健常な対照対象からＨＣＣ患者を鑑別することができる場合についての一例を示す。３２人の、健常な対象、血漿中２％未満の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者、及び血漿中６％超の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者について、１５０塩基対未満の血漿ＤＮＡ断片の割合をプロットした。健常な対照対象（ＣＴＲと標識）と比較して、２％未満の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者は、１５０塩基対未満の短いＤＮＡ断片の有意により低い割合を有し（ｐ＝０．０００２、ｔ検定）、６％超の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者は、短いＤＮＡ断片の有意により高い割合を有した（ｐ＝０．００３、ｔ検定）。２％〜６％の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者は、２％未満の腫瘍画分を有するＨＣＣ患者と６％超の腫瘍画分を有するＨＣＣ患者との間の、ＤＮＡ断片の割合を有する。この様式において、２％〜６％の腫瘍画分を有するＨＣＣ患者は、健常な対照対象に類似した分布を有し得る。

図２１は、Ｐ（＜１５０）を適用して、健常な対照対象から２％未満の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者を鑑別するための、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。腫瘍中のコピー数減少と適合する、血漿中で過小提示を呈する染色体領域の過小提示の規模に基づいて、腫瘍画分を決定した。いかなる染色体腕の有意な過小提示も有さない事例について、コピー数増加と適合する領域の過剰提示の規模を使用して、単一コピー増加の想定の下、腫瘍画分を決定した。腫瘍画分は、以下の等式によって決定することができ、
式中、Ｐ_試験は、試験事例の対象となる染色体腕にマッピングされた断片の割合を表し、Ｐ_正常は、健常な対照の染色体腕にマッピングされた断片の平均の割合を表し、ΔＮは、コピー数変化の規模（例えば、１つの重複または１つの欠失のいずれかについて１、及びより高次の増幅についてより大きな数）を表す。曲線下面積（ＡＵＣ）は、０．６７０及び０．８８２の９５％の信頼限界で、０．７７６であった。この結果は、サイズ分析を使用して、血漿中２％未満の腫瘍画分を有するＨＣＣ患者を特定することができることを示す。ＲＯＣ曲線分析は、異なる閾値を選択して、異なる感度及び特異性を達成することができることを示す。

図２２は、図２１と同様に、Ｐ（＜１５０）を有するサイズ分析もまた、血漿中６％超の腫瘍画分を有するＨＣＣ患者を検出することができることを示す。健常な対象からこれらの患者を鑑別するためのＡＵＣは、０．７６１及び１．０００の９５％の信頼限界で、０．８９３であった。

図２３は、図２０が短い血漿ＤＮＡ断片の割合について示したように、長い血漿ＤＮＡ断片の割合を使用して、ＨＣＣを検出することができることを示す。この例において、Ｐ（＞１８０）と表される１８０塩基対よりも大きい断片の割合を、血漿中２％未満の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者及び６％超の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者、ならびに健常な対照対象についてプロットした。この割合は、２％未満の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者において有意により高かった（ｐ＜０．００００１、ｔ検定）。

図２４は、Ｐ（＞１８０）を使用して、健常な対照対象から２％未満の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者を鑑別するためのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは、０．８０５及び０．９６１の９５％の信頼限界で、０．８８３であった。

図２５は、異なる腫瘍ＤＮＡ画分を有するＤＮＡ断片の異なるサイズ分布の別の例を提供する。図２５は、健常な対照対象、２％未満の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者、及び６％超の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者の断片サイズ中央値のボックスプロットを示す。２％未満の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者のＤＮＡ断片のサイズ中央値は、健常な対照対象よりも有意に長かった（Ｐ＜０．００００１、ｔ検定）。対照的に、６％超の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者のＤＮＡ断片のサイズ中央値は、有意により短かった（ｐ＝０．０３、ｔ検定）。図２５は、癌の段階を決定するための方法としての、ＤＮＡ断片サイズの使用を支持する。より長いサイズ中央値はより小さな腫瘍ＤＮＡ画分に関連付けられる一方で、より短いサイズ中央値はより長い腫瘍ＤＮＡ画分に関連付けられる。ある個体が、第１のカットオフ及びサイズ中央値未満かつ長いサイズ閾値超の、より小さな腫瘍ＤＮＡ画分を有する場合、初期段階の癌が確認され得る。他方、ある個体が、第２のカットオフ及びサイズ中央値超かつ短いサイズ閾値未満の、より長い腫瘍ＤＮＡ画分を有する場合、後期の癌が確認され得る。

２％〜６％の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者は、２％未満の腫瘍画分を有するＨＣＣ患者と６％超の腫瘍画分を有するＨＣＣ患者との間の、ＤＮＡ断片サイズ中央値の割合を有する。この様式において、２％〜６％の腫瘍画分を有するＨＣＣ患者は、図２５の健常な対照対象に類似した分布を有し得る。したがって、ある個体が、低カットオフから高カットオフまでの腫瘍ＤＮＡ画分、及び短いサイズ閾値から長いサイズ閾値までのサイズ中央値を有する場合、中期段階の癌が確認され得る。

図２６及び２７は、異なるサイズ閾値を使用して、健常な対照対象からＨＣＣ患者を鑑別することができることを示すＲＯＣ曲線である。図２６は、断片サイズ中央値を使用して、２％未満の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者と健常な対照対象とを鑑別するためのＲＯＣ曲線である。ＡＵＣは、０．７１８及び０．９０７の９５％の信頼限界で、０．８１２であった。

図２７は、断片サイズ中央値を使用して、２％超の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者と健常な対照対象とを鑑別するためのＲＯＣ曲線である。ＡＵＣは、０．６２７及び０．９６３の９５％の信頼限界で、０．７９５であった。

サイズ分布の他の統計的特徴（例えば、中央値、平均値、パーセンタイル）を、ＨＣＣ患者と健常な対象とを鑑別するためのパラメータとして使用してもよい。

全てのゲノム領域から生じる血漿ＤＮＡ断片のサイズ分布の分析に加えて、サイズ分析はまた、特定のゲノム領域から生じるＤＮＡ断片にも集中することができる。特定のゲノム領域は、染色体腕であってもよい。

図２８は、６％超の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者の染色体１ｑ、及び健常な対照対象の染色体１ｑに整列させた、１５０塩基対未満の短い血漿ＤＮＡ断片の割合のボックスプロットを示す。短い断片の割合は、ＨＣＣ患者において有意により高かった（Ｐ＜０．００００１、ｔ検定）。

図２９は、１５０塩基対未満の短い血漿ＤＮＡ断片の割合を使用して、６％超の腫瘍ＤＮＡ画分を有するＨＣＣ患者と健常な対照対象とを鑑別するためのＲＯＣ曲線である。ＡＵＣは、０．８０８及び１．０００の９５％の信頼限界で、０．９１５であった。

Ｂ．方法
図１７は、本発明の実施形態に従って、ある生物の生体試料を分析する方法１７００を図示するフローチャートである。生体試料は、正常細胞、及び癌に関連付けられる細胞に起源を持つ核酸分子を含み得る。生体試料中、核酸分子のうちの少なくともいくつかは無細胞である。

ステップ１７１０において、生体試料中の複数の核酸分子のそれぞれについて、核酸分子のサイズが測定される。核酸分子のサイズが、図９のステップ９１０に類似した様式で測定され得る。

ステップ１７２０において、生物の基準ゲノムにおける核酸分子の位置が特定される。核酸分子の位置の特定は、図６のステップ６２０に類似した様式で実行され得る。

ステップ１７３０において、特定された位置に基づいて、核酸分子の第１の群が、第１の染色体領域に由来するものとして特定される。第１の染色体領域は、複数の第１の座位を含み得る。核酸分子のそれぞれの群の特定は、図１のステップ１２０に類似し得る。

ステップ１７４０において、コンピュータシステムが、核酸分子の第１の群のサイズ分布の第１の統計値を算出し得る。それぞれの量の算出は、図１のステップ１３０における算出に類似し得る。

ステップ１７５０において、癌に関連付けられる細胞に起源を持つ核酸分子の画分が測定され得る。画分は、Ｌｏらによって２０１１年１１月３０日に出願された「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ ｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｃａｎｃｅｒ」と題する米国特許公開第２０１３／００４０８２４号に記載される方法に従って算出され得る。腫瘍核酸分子の画分は、腫瘍（複数可）に由来する試料中の核酸分子の割合に対応する。画分／割合は、任意のパーセンテージまたは小数値として表すことができる。

以下の実施例は、腫瘍核酸の画分を測定するための方法であるが、他の方法が使用されてもよい。腫瘍核酸の画分は、腫瘍組織中のコピー数減少（またはコピー数増加）と適合する有意な過小提示を呈する領域の、血漿中の過小提示（または過剰提示）の規模に基づいて決定することができる。別の例は、コピー数異常の影響を受ける領域、例えば、２つの相同染色体のうちの１つのコピーの減少を有する領域の、２つの相同染色体上のアレル不均衡の程度を決定することである。別の例は、一塩基変異、ヌクレオチド（複数可）の欠失、及び転座を含む、癌関連変異の画分濃度を決定することである。腫瘍画分は、上記の図２１について記載される方法によって決定することができる。

ステップ１７６０において、測定された画分に基づく第１の基準値が選択され得る。一例において、第１の基準値の選択は、測定された画分がカットオフ未満である場合にサイズ閾値を選択することを含み得る。別の例において、第１の基準値の選択は、測定された画分がカットオフ超である場合にサイズ閾値を選択することを含み得る。これらの例において、カットオフ及びサイズ閾値は異なってもよく、測定された画分の値に依存してもよい。

ステップ１７７０において、第１の統計値を第１の基準値と比較して、生体試料の癌の段階を決定することができる。第１の統計値は、本明細書に記載される任意の統計値であり得る。

癌が存在するかどうかは、癌に関連付けられる細胞に起源を持つ核酸分子の測定された画分とともに、サイズ分析に基づいて確認することができる。例えば、測定された画分が低カットオフ未満である場合、サイズ分布が健常な対照でより長いかどうか（例えば、第１の統計値がサイズ閾値を超えるかどうか）を確認することができる。サイズ分布が健常な対照でより長い場合、これは、癌の初期段階を確認することができる。低カットオフの例は、０．０１、０．０１５、０．０２、または０．０２５である。別の例として、測定された画分が高カットオフを超える場合、サイズ分布が健常な対照でより短いかどうか（例えば、第１の統計値がサイズ閾値未満であるかどうか）を確認することができる。サイズ分布が健常な対照でより短い場合、これは、後期の癌を確認することができる。高カットオフの例は、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５、０．０５５、０．０６、０．０６５、または０．０７の分数であり得る。

我々は、ＨＣＣ患者の血漿中、より短い及びより長いＤＮＡ分子の追加の母集団が存在することを示した。これらのデータは、グループが、癌患者の血漿中のより長いまたはより短いＤＮＡ分子における増加のいずれかの存在を報告した文献に存在する、明らかな非一貫性を解決した可能性がある。

ＶＩＩ．材料及び方法
図２〜５の結果を得る上で使用される技術を、これより論じる。そのような技術は、上記の他の実施例において使用することができる。

研究のために募集した対象は、腫瘍切除のためにＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｅ ｏｆ Ｗａｌｅｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに入院する９０人のＨＣＣを有する患者を含んだ。全ての血液試料は、手術前に採取した。６７人のＨＢＶ保因者及び３６人のＨＢＶ関連硬変症を有する患者を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｅ ｏｆ Ｗａｌｅｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇから募集した。全ての患者が書面でのインフォームドコンセントを提出し、研究は機関審査委員会によって承認された。

ＤＮＡを抽出し、配列ライブラリを準備するために、ＥＤＴＡ含有管に末梢血試料を採取した。末梢血試料を、４℃、１，６００ｇで１０分間遠心分離した。血漿部分を、４℃、１６，０００ｇで１０分間再遠心分離して、無細胞血漿を得た。３〜４．８ｍＬの血漿から、ＱＩＡａｍｐ ＤＳＰ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを抽出した。血漿ＤＮＡを、ＳｐｅｅｄＶａｃ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｓａｖａｎｔ ＤＮＡ１２０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、１試料当たり７５μＬの最終体積へと濃縮した。製造業者の説明書に従ってＫａｐａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用することによって、指標付きＤＮＡライブラリを準備した。ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する１４回サイクルのＰＣＲによって、アダプタ連結ＤＮＡを富化した。その後、ライブラリを２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって分析し、Ｋａｐａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって定量化してから、配列決定した。

ＤＮＡを配列決定し、整列させるために、各ＤＮＡライブラリを希釈し、ペアエンド配列決定フローセル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にハイブリダイズした。ＴｒｕＳｅｑ ＰＥ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を有するｃＢｏｔクラスター生成システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上でＤＮＡクラスターを生成させ、その後、ＴｒｕＳｅｑ ＳＢＳ Ｋｉｔ ｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を有するＨｉＳｅｑ２０００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で７６×２回サイクルの配列決定を行った。配列決定は、４重プロトコルを使用して実行した。我々は、追加の７回サイクルの配列決定を実行して、各配列決定されたＤＮＡ分子上の指標配列を解読した。ＨｉＳｅｑ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＨＣＳ）ｖ１．４及びＲｅａｌ Ｔｉｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＴＡ）Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．１３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、実時間画像分析及びベースコーリングを実行し、これにより、自動化マトリクス及びフェージング算出は、ライブラリで配列決定されたスパイクインＰｈｉＸ対照ｖ３に基づいた。ベースコーリング後、アダプタ配列及び低クオリティ塩基（すなわち、クオリティスコア５未満）を取り除いた。

配列決定データ分析のために、６塩基指標配列に基づいて、各レーンの配列を対応する試料に割り当てた。その後、Ｓｈｏｒｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ２（ＳＯＡＰ２）を使用して、配列決定された読み取りを非反復マスクヒト基準ゲノム（ＮＣＢＩ ｂｕｉｌｄ３７／ｈｇ１９）に整列させた（４０）。ペアエンド読み取りの各員について、最大２つのヌクレオチドのミスマッチを許容したが、挿入または欠失は許容しなかった。特有のゲノム位置にマッピングされた読み取りを使用して、下流分析を行った。正しい配向を有し、６００塩基対以下の挿入サイズに及ぶ同一の染色体に整列させたペアエンド読み取りを、下流サイズ分析のために保持した。基準ヒトゲノムに整列させた後、配列読み取りの各ペアの最外終端のヌクレオチドの座標から、各血漿ＤＮＡ断片のサイズを推定することができた。ＣＮＡ分析のために、第１の単一エンド読み取りを使用した。Ｂｏｗｔｉｅ２ソフトウェアを使用して、３０超のマッピングクオリティを有する読み取り（すなわち、１，０００個の整列当たり１個の誤った整列）を許容した（４１）。

ＣＮＡのＣＡＺＡ分析を実行するために、ヒトゲノム全体を、１００ｋｂのビンに分割した。以前に報告されるように、各１００ｋｂのビンについてＧＣ補正読み取りカウントを決定した（４２）。染色体腕上の各１００ｋｂのビンの全ての値を合計することによって、対象となる各染色体腕のＧＣ補正読み取りカウントの数を決定した。ｚスコア統計値を使用して、基準群と比較したときに、染色体腕における血漿ＤＮＡ提示が有意に増加または低下するかどうかを決定した。各染色体腕にマッピングされた配列決定読み取りのパーセンテージを算出し、それぞれの染色体腕について、３２人の健常な対照対象の平均値と比較した。腕レベルのｚスコアを、
として算出し、式中、Ｐ_試験は、試験事例の対象となる染色体腕にマッピングされた断片の割合を表し、Ｐ_正常及び標準偏差_正常はそれぞれ、健常な対照の染色体腕にマッピングされた断片の割合の平均及び標準偏差を表す。−３未満及び３超のｚスコアを有する染色体腕を、血漿中に欠失及び増幅に対応するＣＮＡを有するものとして見なした。

血漿中の腫瘍由来ＤＮＡの画分濃度（Ｆ）は、
として算出することができ、Ｐ_試験は、試験事例の対象となる染色体腕にマッピングされた断片の割合を表し、Ｐ_正常は、健常な対照の染色体腕にマッピングされた断片の平均の割合を表し、ΔＮは、コピー数変化の規模を表し、ΔＮは、コピー数変化を表す。少なくとも１つの染色体腕において欠失を示す事例について、我々は、欠失した染色体腕（複数可）に基づいてＦを算出した。ほとんどの染色体腕欠失は、２つの相同染色体のうちの１つのみに関与した（３３）ため、我々は、我々の分析に単一コピー減少を想定した。染色体腕増幅のみを有し、欠失を有さなかった２４の事例について、単一コピー増加の想定の下、増幅した腕に基づいてＦを算出した。

Ｐｅｒｌ言語及びＲ言語で書かれた生物情報学プログラムを使用することによって、配列決定データ分析を実行した。０．０５未満のｐ値を統計的に有意なものと見なし、全ての確率は両側検定であった。

ＶＩＩＩ．コンピュータシステム
本明細書に言及されるコンピュータシステムのうちのいずれも、いかなる好適な数のサブシステムを利用してもよい。そのようなサブシステムの例を、図３２のコンピュータ装置１０に示す。いくつかの実施形態において、コンピュータシステムは単一のコンピュータ装置を含み、サブシステムはコンピュータ装置の構成要素であり得る。他の実施形態において、コンピュータシステムは、それぞれがシステムであり、内部構成要素を有する複数のコンピュータ装置を含み得る。コンピュータシステムは、デスクトップコンピュータ及びラップトップコンピュータ、タブレット、携帯電話、ならびに他の携帯デバイスを含み得る。

図３２に示されるサブシステムは、システムバス７５を介して相互接続される。プリンタ７４、キーボード７８、記憶デバイス（複数可）７９、ディスプレイアダプタ８２に結合されるモニタ７６、及び他のものなどの追加のサブシステムが示される。Ｉ／Ｏコントローラ７１に結合する周辺機器及び入力／出力（Ｉ／Ｏ）デバイスは、入力／出力（Ｉ／Ｏ）ポート７７（例えば、ＵＳＢ、ＦｉｒｅＷｉｒｅ（登録商標））などの当該技術分野において既知である任意の数の手段で、コンピュータシステムに接続され得る。例えば、Ｉ／Ｏポート７７または外部インターフェース８１（例えば、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ、Ｗｉ−Ｆｉなど）を使用して、Ｉｎｔｅｒｎｅｔなどの広域ネットワーク、マウス入力デバイス、またはスキャンに、コンピュータ装置１０を接続してもよい。システムバス７５を介した相互接続は、中央処理装置７３が各サブシステムと通信し、システムメモリ７２または記憶デバイス（複数可）７９（例えば、ハードドライブもしくは光学ディスクなどの固定ディスク）からの命令の実行、及びサブシステム間の情報交換を制御することを可能にする。システムメモリ７２及び／または記憶デバイス（複数可）７９は、コンピュータ可読媒体を具体化してもよい。別のサブシステムは、カメラ、マイクロホン、及び加速度計などのデータ収集デバイス８５である。本明細書に言及されるデータのうちのいずれも、１つの構成要素から別の構成要素に出力されてもよく、ユーザに対して出力されてもよい。

コンピュータシステムは、外部インターフェース８１によって、または内部インターフェースによってともに接続された、複数の同一の構成要素またはサブシステムを含んでもよい。いくつかの実施形態において、コンピュータシステム、サブシステム、または装置は、ネットワーク上で通信することができる。そのような例において、１つのコンピュータをクライエントとして、及び別のコンピュータをサーバとして見なすことができ、これらのそれぞれは、同一のコンピュータシステムの一部であってもよい。クライエント及びサーバはそれぞれ、複数のシステム、サブシステム、または構成要素を含み得る。

本発明の実施形態のうちのいずれも、ハードウェア（例えば、特定用途向け集積回路もしくはフィールドプログラマブルゲートアレイ）を使用して、かつ／またはモジュラー様式もしくは統合様式で一般にプログラム可能な処理装置とともにコンピュータソフトウェアを使用して、制御論理の形態で実装され得ることを理解されたい。本明細書で使用される場合、処理装置は、シングルコア処理装置、同一の集積チップ上のマルチコア処理装置、または回路基板上もしくはネットワーク化された複数の処理ユニットを含む。本開示及び本明細書に提供される教示に基づいて、当業者は、ハードウェア及びハードウェアとソフトウェアとの組み合わせを使用して本発明の実施形態を実装するための他の手段及び／または方法を理解し、認識するだろう。

本出願に記載されるソフトウェア構成要素または機能のうちのいずれも、例えば、Ｊａｖａ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ−Ｃ、Ｓｗｉｆｔなどの任意の好適なコンピュータ言語、または例えば、従来の技術もしくはオブジェクト指向の技術を使用するＰｅｒｌもしくはＰｙｔｈｏｎなどのスクリプト言語を使用する、処理装置によって実行されるソフトウェアコードとして実装されてもよい。ソフトウェアコードは、記憶及び／または伝送のために、コンピュータ可読媒体上に一連の命令またはコマンドとして記憶され得、好適な媒体としては、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、磁気媒体（ハードドライブもしくはフロッピーディスクなど）、または光学媒体（コンパクトディスク（ＣＤ）もしくはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）など）、及びフラッシュメモリなどが挙げられる。コンピュータ可読媒体は、そのような記憶デバイスまたは伝送デバイスの任意の組み合わせであってもよい。

そのようなプログラムはまた、コードされ、インターネットを含む様々なプロトコルに従う有線、光学、及び／または無線ネットワークを介した伝送に適合した搬送波信号を使用して、伝送されてもよい。したがって、本発明の一実施形態に従うコンピュータ可読媒体は、そのようなプログラムでコードされたデータ信号を使用して作製されてもよい。プログラムコードでコードされたコンピュータ可読媒体は、互換性のあるデバイスでパッケージ化されても、（例えば、インターネットダウンロードを介して）他のデバイスとは別々に提供されてもよい。いかなるそのようなコンピュータ可読媒体も、単一のコンピュータ製品（例えば、ハードドライブ、ＣＤ、またはコンピュータシステム全体）上またはその中に存在してもよく、あるシステムまたはネットワーク内の異なるコンピュータ製品上またはその中に存在してもよい。コンピュータシステムは、モニタ、プリンタ、または本明細書に記載される結果のうちのいずれかをユーザに提供するための他の好適なディスプレイを含み得る。

本明細書に記載される方法のうちのいずれも、全体的または部分的に、ステップを実行するように構成され得る１つ以上の処理装置を含むコンピュータシステムで実行することができる。したがって、実施形態は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかのステップを実行するように構成されたコンピュータシステムを対象とし得、潜在的には異なる構成要素がそれぞれのステップまたはステップのそれぞれの群を実行する。番号付けされたステップとして提示されるものの、本明細書の方法のステップは、同時にまたは異なる順序で実行することができる。更に、これらのステップの部分が、他の方法の他のステップの部分とともに使用されてもよい。また、あるステップの全てまたは部分が任意であってもよい。更に、本方法のうちのいずれかのステップのうちのいずれも、モジュール、回路、またはこれらのステップを実行するための他の手段で実行することができる。

特定の実施形態の具体的な詳細は、本発明の実施形態の趣旨及び範囲から逸脱することなく、任意の好適な様式で組み合わせることができる。しかしながら、本発明の他の実施形態は、個々の各態様、またはこれらの個々の態様の特定の組み合わせに関する特定の実施形態に向けられ得る。

本発明の例示的な実施形態についての上記の記述は、図示及び説明の目的で提示されている。徹底的であること、または本発明を記載されるものと寸分違わぬ形態に限定することは意図されず、上記の教示に照らして、多くの修正及び変更が可能である。

「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」または「その（ｔｈｅ）」の引用は、それとは反対に具体的に示されない限り、「１つ以上」を意味することが意図される。「または」の使用は、それとは反対に具体的に示されない限り、「を除いてまたは」ではなく「を含んでまたは」を意味することが意図される。

全ての特許、特許出願、出版物、及び本明細書に言及される記述の全体が、あらゆる目的で参照により組み込まれる。いかなるものも、先行技術であることは認められていない。

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４２．Ｃｈｅｎ ＥＺ，ｅｔ ａｌ．（２０１１） Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｔｒｉｓｏｍｙ １８ ａｎｄ ｔｒｉｓｏｍｙ １３ ｂｙ ｍａｔｅｒｎａｌ ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（７）：ｅ２１７９１．

Claims (6)

1. 生物の生体試料を分析する方法であって、前記生体試料が、正常細胞に起源を持つ核酸分子、及び癌に関連付けられる細胞に起源を持つ核酸分子を含み、前記生体試料中、前記核酸分子のうちの少なくともいくつかが、無細胞核酸分子であり、前記方法が、
   前記生体試料中の複数の前記核酸分子のそれぞれについて、
   前記核酸分子のサイズを測定すること、及び
   前記生物の基準ゲノムにおける前記核酸分子の位置を特定することを行うことと、
   前記特定された位置に基づいて、核酸分子の第１の群を第１の染色体領域に由来するものとして特定すること、ここで、前記第１の染色体領域が、複数の第１の座位を含み、
   コンピュータシステムによって、核酸分子の前記第１の群のサイズ分布の第１の統計値を算出することと、
   癌に関連付けられる細胞に起源を持つ核酸分子の画分を測定することと、
   前記測定された画分に基づいて、第１の基準値を選択することと、ここで、当該第１の基準値は、１以上の基準試料からの核酸分子の１以上のサイズ分布に基づく、 前記第１の統計値を前記第１の基準値と比較して、前記生体試料の癌の段階を決定することと、
   を含み、
   前記の第１の基準値を選択することが、
   前記測定された画分が低カットオフ未満であるとき、前記第１の基準値として長いサイズ閾値を選択すること、ここで、前記長いサイズ閾値は、正常よりも長いサイズ分布を特定するように構成され、前記第１の統計値が前記長いサイズ閾値を超えるときに初期段階の癌が決定される、
   前記測定された画分が高カットオフを超えるとき、前記第１の基準値として短いサイズ閾値を選択すること、ここで、前記短いサイズ閾値は、正常よりも短いサイズ分布を特定するように構成され、前記第１の統計値が前記短いサイズ閾値未満であるときに後期の癌が決定される、または
   前記測定された画分が高カットオフ未満かつ低カットオフ超であるとき、前記第１の基準値として短いサイズ閾値及び第２の基準値として長いサイズ閾値を選択すること、ここで、前記第１の統計値が前記短いサイズ閾値超かつ前記長いサイズ閾値未満であるときに中期段階の癌が決定される、
   を含む、方法。
2. 前記測定された画分に基づいて、前記第１の基準値を選択することが、前記第１の基準値として長いサイズ閾値を選択することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記測定された画分に基づいて、前記第１の基準値を選択することが、前記第１の基準値として短いサイズ閾値を選択することを含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記測定された画分に基づいて、前記第１の基準値を選択することが、
   前記第１の基準値として短いサイズ閾値及び前記第２の基準値として長いサイズ閾値を選択することを含み、
   当該方法が、更に、前記第１の統計値を前記第２の基準値と比較して、前記生体試料の癌の段階を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
5. コンピュータシステムを制御して、請求項１〜４に記載の方法のうちのいずれかの操作を実行するための複数の命令を記憶するコンピュータ可読媒体を含む、コンピュータプログラム。
6. 請求項５に記載のコンピュータプログラムと、
   前記コンピュータ可読媒体上に記憶された命令を実行するための１つ以上の処理装置と、を含む、システム。