JP6797151B2 - 細胞容積モル浸透圧濃度を調節するための組成物および方法 - Google Patents
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Description
(a)(i)浸透圧保護性タンパク質または浸透圧保護性ペプチドをコード化する核酸分子または調節核酸分子と、(ii)プロモーターに作動可能に連結した第2の対象のタンパク質をコード化するポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドを細胞に導入すること、および
(b)浸透圧保護性タンパク質もしくは浸透圧保護性ペプチド、または浸透圧保護性調節核酸および対象のタンパク質が発現し、それにより、高重量モル浸透圧濃度の条件下の細胞を保護し、第2の対象のタンパク質の発現を可能にするように細胞を培養すること
を含む方法を提供する。
(a)(i)発現タンパク質に有益な特性を付与するタンパク質をコード化する核酸分子と、(ii)プロモーターに作動可能に連結した、第2の対象のタンパク質をコード化するポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドを細胞に導入すること、および
(b)前記細胞を高重量モル浸透圧濃度の条件下で増殖させる場合に、(i)の核酸分子の発現が、(ii)のポリヌクレオチドによりコード化されるポリペプチドに前記有益な特性を与えるように細胞を培養すること
を含む方法を提供する。
(a)TonEBPをコード化するタンパク質コード化核酸分子と、
(b)第2のOR−TREに作動可能に連結した、第2の対象のタンパク質をコード化するポリヌクレオチドと
を含むポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み、上昇した重量モル浸透圧濃度の条件下で(a)の核酸分子が発現し、それによりTonEBPタンパク質を発現させ、TonEBPタンパク質がTonEBPおよび前記第2の対象のタンパク質の発現を正に調節する、方法を提供する。これは、正のフィードバックループシステムを創出する。これらの実施形態では、第2の対象のタンパク質は、例えば、浸透圧保護性タンパク質(例えば、プロリンもしくはグリシンベタイン、タウリン輸送体、グリシンベタイン−γ−アミノ酪酸輸送体、ナトリウム−ミオイノシトール共輸送体、熱ショックタンパク質、アクアポリン、アルドースレダクターゼまたは神経障害標的エステラーゼ(NTE));前記細胞によって発現されるポリペプチドに有益な特性を付与するタンパク質(例えば、抗アポトーシスタンパク質;細胞に酸化ストレスに対する抵抗性を付与するタンパク質;タンパク質の折りたたみの促進に関与するシャペロンタンパク質;タンパク質の細胞外分泌に関与するタンパク質;解糖系酵素;細胞周期調節タンパク質;グリコシル化酵素;またはそれらの任意の組合せ)であってよい。いくつかの実施形態では、該方法は、プロモーターに作動可能に連結した第3の対象のタンパク質の発現を含むことができ、有益な特性を付与するタンパク質は第3の対象のタンパク質に作用する。
本発明は、浸透圧保護性タンパク質もしくは浸透圧保護性ペプチド;抗アポトーシスタンパク質;細胞に酸化ストレスに対する抵抗性を付与するタンパク質;タンパク質の折りたたみの促進に関与するシャペロンタンパク質;タンパク質の細胞外分泌に関与するタンパク質;解糖系酵素;細胞周期調節タンパク質;グリコシル化酵素;またはそれらの任意の組合せに作動可能に連結した本発明の少なくとも1つの浸透圧応答転写調節エレメントを含む浸透圧応答核酸を提供する。
本発明は、哺乳類細胞の含水量および/または浸透ポテンシャルを好都合に生じさせるタンパク質をコード化する浸透圧応答核酸を提供する。例えば、本発明の核酸は、哺乳類細胞の含水量および/または浸透ポテンシャルを生じさせるタンパク質、例えば、プロリンおよびグリシンベタインおよび/または糖などの他の浸透活性溶質のレベルに影響を及ぼすタンパク質の生合成をコード化する核酸を浸透圧応答的に発現することができる。
本発明は、浸透圧応答転写調節エレメント(OR−TRE)、浸透圧応答核酸、および発現カセット、ベクター、組換えウイルス、プラスミド、ファージ、ファージミド、人工ホルモンならびにそれらを含むクローニング媒体を含む核酸を提供する。本発明は、科学および特許文献に十分に記述されている当技術分野で公知の方法またはプロトコールまたは装置と併せて実施することができる。
本発明を実施するために用いる核酸は、本発明の浸透圧応答転写調節エレメント(OR−TRE)、浸透圧応答核酸、またはRNA、iRNA、調節核酸(抑制、安定化または上方制御機能もしくは作用を有する核酸)、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、ウイルスまたはそれらのハイブリッドを本発明を実施するために用いるかどうかにかかわりなく、遺伝子工学により改変され、増幅され、かつ/または組換えにより発現/生成した様々な源から単離することができる。
本発明の核酸配列は、タンパク質コード化配列に作動可能に連結したプロモーターおよびエンハンサーまたはRNA合成/発現を誘導もしくは調節するための調節核酸、例えば、抑制性、安定化もしくは上方制御核酸分子を含む。例えば、一態様では、本発明は、真核細胞において転写活性のあるプロモーター配列の上流側(その5’側)にあり、それに作動可能に連結した少なくとも1つの張性エンハンサー結合タンパク質(TonEBP)応答転写エンハンサー配列を提供する。付加的なエンハンサー配列も本発明の浸透圧応答転写調節エレメント(OR−TRE)に作動可能に連結させることができる。
本発明は、本発明の核酸(本発明の浸透圧応答転写調節エレメント(OR−TRE)を含む)および/または本発明の浸透圧調節核酸を含む、本発明の浸透圧応答核酸を含む発現カセット、ベクター、組換えウイルス、プラスミド、ファージ、ファージミド、人工染色体およびクローニング媒体を提供する。ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスDNA(例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病およびSV40の派生体)、P1ベースの人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体および対象の特定の宿主(哺乳類細胞など)に特異的な他のベクターは、本発明を実施するのに用いることができる。一態様では、本発明を実施するのに用いる発現カセット、ベクター、組換えウイルス、プラスミド、ファージ、ファージミド、人工染色体およびクローニング媒体は、染色体、非染色体および合成DNA配列を含み得る。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、市販されている。
一態様では、本発明を実施するのに用いる発現カセット、ベクター、組換えウイルス、プラスミド、ファージ、ファージミド、人工染色体およびクローニング媒体は、本発明の核酸を含む、宿主細胞、例えば、哺乳類細胞の選択を可能にする1つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子を含む。
本発明は、例えば、本発明の浸透圧応答転写調節エレメント(OR−TRE)などの本発明の核酸構築物、または本発明の浸透圧応答もしくは浸透圧調節核酸を含む、形質転換したまたはトランスフェクト細胞も提供する。この宿主細胞は、例えば細菌細胞、真菌の細胞、イースト細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞または植物細胞のような原核細胞、真核細胞を含めた当業者によく知られている任意の宿主細胞であってよい。例示的な細菌細胞には、エシェリキア属、バシラス属、ストレプトマイセス属、サルモネラ属、シュードモナス属およびブドウ球菌属内の任意の種が含まれ、例えば、Escherichia coli、Lactococcus lactis、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Salmonella typhimurium、Pseudomonas fluorescensが含まれる。例示的な真菌の細胞には、アスペルギルス属の任意の種が含まれる。例示的な酵母細胞には、ピチア属、サッカロミケス属、分裂酵母属またはシュバニオミケス属(Schwanniomyces)の任意の種が含まれ、Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiaeまたはSchizosaccharomyces pombeが含まれる。例示的な昆虫細胞には、スポドプテラ(Spodoptera)またはショウジョウバエの任意の種が含まれ、Drosophila S2およびSpodoptera Sf9が含まれる。例示的な動物細胞には、CHO、COSまたはボーズ黒色腫または任意のマウスもしくはヒト細胞株が含まれる。適切な宿主の選択は、当業者の能力の範囲内である。多種多様な高等植物種を形質転換するための技術は周知であり、技術的および科学的文献に記載されている。例えばWeising、(1988)、Ann.Rev.Genet.、22巻:421〜477頁、米国特許第5,750,870号を参照のこと。
一実施形態では、本発明は、少なくとも1つの調節核酸(例えば、抑制性、安定化または上方制御核酸分子)を含む浸透圧応答および浸透圧調節核酸を提供する。一実施形態では、ある遺伝子メッセージ(例えば、泌乳刺激遺伝子または泌乳刺激遺伝子メッセージ)を標的とする配列が、使用される。一実施形態では、その配列は抑制性であり、例えば短鎖干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスRNAおよび/またはリボザイム活性を有するRNAを含んでいる。したがって代替実施形態では、本発明は、遺伝子、メッセージ(mRNA)またはタンパク質の発現および/または活性を増加、促進、減少、または無効化する遺伝子、メッセージ(mRNA)またはタンパク質を「標的」とすることができる核酸を含めた調節(抑制性、安定化または上方制御)核酸の使用を提供する。
本発明は、遺伝子メッセージを標的とする少なくとも1つの配列(例えば、泌乳刺激遺伝子または泌乳刺激遺伝子メッセージを標的とする配列)を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するための戦略は、科学および特許文献中によく記載されており、その当業者は、本発明の新規な試薬を使用して、タンパク質をコード化する(例えば、泌乳刺激タンパク質をコード化する)オリゴヌクレオチドを設計できる。例えば、有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングするための遺伝子歩行/RNA地図作成手順は当業者において、周知であり、RNA地図作成アッセイに関して記載があり(例えば、Ho、(2000)、Methods Enzymol.、314巻:168〜183頁を参照のこと)、そのアッセイは強力なアンチセンス配列を選択するための簡便かつ信頼性の高い方法を提供するための標準的な分子技術に基づいている。Smith、(2000)、Eur.J.Pharm.Sci.、11巻:191〜198頁も参照のこと。
本発明は、例えば、泌乳刺激タンパク質をコード化するメッセージに結合できる転写産物(メッセージ)になることができるリボザイムを提供する。一実施形態では、これらのリボザイムは、例えばmRNAを標的とすることによって、タンパク質活性(例えば、泌乳刺激タンパク質活性)を調節(例えば、阻害)することができる。リボザイムを設計し、ターゲティングのために泌乳刺激タンパク質に特異的なアンチセンス配列を選択するための戦略は、科学および特許文献中によく記載されており、その当業者は、本発明の新規な試薬を使用してこれらのリボザイムを設計できる。リボザイムは、リボザイムの標的RNA結合部分を介して標的RNAに結合することによって、作用し、標的RNA結合部分は、標的RNAを切断するRNAの酵素部分と近接して保持される。それにより、リボザイムは相補的な塩基対合よって標的RNAを認識して結合し、一旦正しい部位に結合すると、酵素的に作用して、標的RNAを切断し不活性化する。このような方法での標的RNAの切断は、その切断がコード化配列内で起こる場合、コード化されているタンパク質の合成を指示するそのRNAの能力を破壊することになる。リボザイムはその標的RNAに結合して切断した後、標的RNAから遊離して、繰り返し新しい標的に結合し切断できる。
1つの態様では、本発明は、泌乳刺激タンパク質コード化配列のようなタンパク質コード化配列を標的とするための、RNA調節(例えば、抑制性、安定化または上方制御)分子(例えば、「RNAi」分子)を提供する。このRNAi分子としては、二本鎖RNA(dsRNA)分子、例えば、siRNA、miRNAおよび/または低分子ヘアピン型RNA(shRNA)分子を挙げることができる。このRNAi分子、例えばsiRNA(阻害的低分子RNA)は、タンパク質コード化遺伝子(例えば、泌乳刺激タンパク質コード化遺伝子)の発現を阻害することができ、かつ/またはmiRNA(マイロRNA)はタンパク質メッセージ(例えば、泌乳刺激タンパク質メッセージ)の翻訳を阻害する。1つの態様では、RNAi分子、例えば、siRNAおよび/またはmiRNAは、長さが約11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29またはそれより長い二本鎖ヌクレオチドである。
本発明は、例えば、非ヒト動物中で浸透圧調節を研究するために、本発明の浸透圧応答転写調節エレメント(OR−TRE)を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する。非ヒトトランスジェニック動物は、当業者にとって公知の任意の方法を使用して設計し作成でき、例えば、形質転換細胞および卵およびトランスジェニックマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、ヤギ、魚、ウシの作成と使用に関して記載している米国特許第6,211,428号、米国特許第6,187,992号、米国特許第6,156,952号、米国特許第6,118,044号、米国特許第6,111,166号、米国特許第6,107,541号、米国特許第5,959,171号、米国特許第5,922,854号、米国特許第5,892,070号、米国特許第5,880,327号、米国特許第5,891,698号、米国特許第5,639,940号、米国特許第5,573,933号、米国特許第5,387,742号、米国特許第5,087,571号を参照のこと。例えば、トランスジェニック酪農動物の乳での組換えタンパク質生産に関して記載しているPollock、(1999)、J.Immunol.Methods、231巻:147〜157頁、トランスジェニックヤギの生産を実証しているBaguisi、(1999)、Nat.Biotechnol.、17巻:456〜461頁も参照のこと。
代替実施形態では、本発明の組成物および方法を使用して任意のインプラント、人工器官または培養系(例えば、バイオリアクター、インプラント、人工器官または単純な細胞培養プレート、ビン、ディッシュ、チューブもしくはフラスコで)における細胞の健康および生存率を維持できる。組成物および方法を使用して、培養条件における細胞の健康および生存率を維持する、例えばこれらの細胞が産物(例えば組換えタンパク質または多糖産物、または「産生細胞株」の場合にはウイルス性産物(例えば、ウイルス粒子)(例えば、米国特許第5,837,484号、米国特許第6,566,118号を参照のこと)、またはポリケチドなどの有機分子)を生成するように設計されているとき、本発明の組成物(例えば、本発明の発現カセット、ベクター、組換えウイルス、プラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、人工染色体もしくはクローニング媒体、または本発明の浸透圧応答転写調節エレメント(OR−TRE)を含む任意のキメラ核酸)を組み込むことによりこれらの細胞がさらに健康でより生存可能になるので、より多くのこの所望の産物が作られる。
本発明は、本発明の細胞を含むインプラントおよび人工器官、バイオリアクター系、細胞培養系、プレート、ディッシュ、チューブ、ビンおよびフラスコも提供する。任意のインプラント、人工器官、バイオリアクター系、細胞培養系、細胞培養プレート、ディッシュ(例えば、ペトリ皿)、細胞培養チューブおよび/または細胞培養フラスコ(例えば、ローラービン)を使用して、本発明を実施できる。
本発明は、転写調節配列に作動的に連結した(例えば最小プロモーター、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターなどのプロモーターに作動的に連結した)少なくとも1つのTonEBP応答またはNFATc応答転写エンハンサー配列を含む、少なくとも1つの浸透圧応答転写調節エレメント(OR−TRE)を提供する。TonEBP応答およびNFATc応答転写エンハンサー配列、およびそこに結合するTonEBPおよびNFATcタンパク質は、当業者に周知である。
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一態様では、本発明の組成物または方法は、浸透圧応答転写エンハンサーに結合するタンパク質も表し、例えば、本発明の組成物(構築物)は、本発明の構築物中で使用される浸透圧応答転写エンハンサーに結合する少なくとも1つのタンパク質をコード化する核酸配列を含む。本発明の構築物および/または方法が、誘導可能な核酸および/またはポリペプチド発現系として使用される場合、この別の例は本発明の態様において、特に有効であり、本発明のこの構築物自体が、構成的にまたは誘導的に(例えば、浸透圧応答に)供給(製造)されることができ、浸透圧応答転写エンハンサーに結合して、浸透圧応答転写エンハンサー配列の転写活性化を「促進する」追加的なまたは新規なタンパク質は、本発明の構築物中に存在する。
本発明は、本発明の細胞、標的配列、トランスフェクション試薬、遺伝子導入試薬、説明書(本発明の方法に関する)またはそれらの任意の組合せを含めた本発明の組成物および方法を含むキットを提供する。このように、キット、細胞、ベクターなどが本明細書において提供される。
浸透圧感受混成転写調節エレメントの設計
本発明は、浸透圧応答転写調節エレメント(ORTRE)を提供する。
浸透圧応答プロモーターPOR1の構築
浸透圧応答プロモーターPOR1を、oligo OLM155 5’−TTGACTAGTTGGAAAATCACCAGAATGGGATTTAGAGAGGTGGGGTTCCTGACTCATTGCTAGCTCGAGCTCGGTACCCGGGTCGAGTAGGCGTGTACGGTGGGAG−3’(配列番号8)、およびアニーリング配列OLM165 5’−GGTGGTTTAATCGATAGAACC−3’(配列番号10)を用いてヒトCMVプロモーターをPCR増幅することによって、クローニングしたが、ただしTonEおよびAP1結合部位を太字で、これら結合部位およびそれらの間の配列を、浸透圧応答エレメント(OR)とみなし、アニーリング配列をイタリックで、SpeIおよびNheIクローニング部位を浸透圧応答エレメント(OR)の5’側および3’側にそれぞれ導入し、これらクローニング部位に下線を引いている。このPCR産物をtopoクローニングし、それによりpLM216を得た。この混成プロモーターを、そのすぐ3’側のイントロンと一緒に(SpeI/ClaI)を用いてpLM216から切り出し、STIgMA−FCスタークレス(Stalkless)発現プラスミド(SpeI/ClaI)部位にクローニングし、それによりpOsmo1(POR1−Intron−STIgMA−Fc−pA、POR1、OR−Pfragment CMV)を得た。
チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO−K1 DUX−B11(dhfr−)を、無血清低タンパク質(ヒト組換えインスリン)培地中で、懸濁培養した。最適化したLIPOFECTAMINE(商標)(Invitrogen、Carlsbad、CA)トランスフェクション手順を使用して、この細胞に高効率一過性トランスフェクションを行った。一過性にトランスフェクトした細胞を、トランスフェクト後6時間に採取し、6ウェルプレート中の重量モル浸透圧濃度が増加する血清含有培地に播種した。塩濃度の増加に伴ってリン酸緩衝食塩水を固定容量添加することによって、この培地の重量モル浸透圧濃度を各ウェルで調整した。ELISAを用いて一過性にトランスフェクトした細胞を、48時間後にFc融合遺伝子発現について常法に従って分析した。
生物薬剤産生およびストレス応答遺伝子工学のための哺乳動物の遺伝子調節系の設計に関する浸透圧応答エレメントの潜在力を分析するために、TonE部位を含むマウスアルドースレダクターゼプロモーター(配列−1053〜−1007)の浸透圧応答エレメントとヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーターの5’側部分であるAP−1部位(活性化タンパク質−1)(例えば、上記Daoudalら、1997を参照のこと)を融合させ、それにより浸透圧応答プロモーター1 POR1を構築した。
これら細胞の生理は高重量モル浸透圧濃度に影響を受け、それにより全体のタンパク質産生量が減少するにもかかわらず、構成的駆動および例示的なPOR1駆動Fc融合発現レベルの比較から、高浸透圧培地において、本発明の例示的なPOR1はCMVプロモーターよりも高いタンパク質発現レベルを駆動することが明らかになる。これらの結果は、本発明の浸透圧応答転写調節エレメントが、CHO−K1 DUX−B11(dhfr−)細胞にトランスフェクトされたときに、浸透圧依存的様式でトランス活性化され得ることを実証している。したがってこれらの結果は、このPOR1駆動導入遺伝子発現により例証されるように、本発明の転写調節エレメントがリアルタイム重量モル浸透圧濃度センサとして使用できることを実証している。
1組の浸透圧応答転写調節エレメントの設計
この実施例は、本発明の1組の浸透圧応答転写調節エレメントの設計および試験に関して記載する。重量モル浸透圧濃度を増加させたときに、本発明の構築物中の浸透圧応答エレメントの数の増加が、この組換え型タンパク質の発現ウインドウに及ぼす影響を試験した。図3は、本発明の3つの例示的な合成浸透圧応答転写調節エレメントをどのように構築したかの概略を示す図である。
浸透圧応答プロモーターの構築
pOsmo1(SpeI/ClaI)からPOR1を切り出し、pOsmo1(NheI/ClaI)にクローニングし、それにより2つの浸透圧応答エレメントを含む浸透圧応答混成プロモーターを得た:pLM217(POR2ーIntron)。同様に、pLM217(SpeI/ClaI)からPOR2−Intronを切り出し、pOsmo1(NheI/ClaI)への挿入することによって、POR3を構築し、それによりpOsmo2(POR3−Intron−STIgMA−Fc−pA、POR3、OR−OR−OR−Pfragment CMV)を得た。pLM217(SpeI/ClaI)からPOR2−Intronを切り出し、pLM217(NheI/ClaI)にクローニングし、それによりpLM218:POR4−Intron(POR4、OR−OR−OR−OR−Pfragment CMV)を得た。pLM218(SpeI/ClaI)からPOR4−Intronを切り出し、pOsmo2(NheI/ClaI)にライゲーション、それによりpOsmo3(POR7−Intron−STIgMA−Fc−pA、POR7、OR−OR−OR−OR−OR−OR−OR−Pfragment CMV)を得た。
チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO−K1 DUX−B11(dhfr−)を、無血清低タンパク質(ヒト組換えインスリン)培地中で、懸濁培養した。最適化したLIPOFECTAMINE(商標)(Invitrogen、Carlsbad、CA)トランスフェクション手順を使用して、この細胞に高効率一過性トランスフェクションを行った。一過性にトランスフェクトした細胞を、トランスフェクションの6時間後に採取し、6ウェルプレート中の重量モル浸透圧濃度が増加する血清含有培地に播種した。塩濃度の増加に伴ってリン酸緩衝食塩水を固定容量添加することによって、この培地の重量モル浸透圧濃度を各ウェルで調整した。ELISAを用いて一過性にトランスフェクトした細胞を、48時間後にFc融合遺伝子発現について常法に従って分析した。
ヒトサイトメガロウイルスプロモーター断片の5’側の浸透圧応答エレメントの数の増加が及ぼす影響を評価するために、3つまたは7つの浸透圧応答エレメントを並べてクローニングしたさらに2つの浸透圧応答プロモーターを構築した:図3に例示したようにPOR3およびPOR7。CHO−K1 DUX−B11(dhfr−)細胞に、ヒトサイトメガロウイルス構成的プロモーターまたは浸透圧応答プロモーター3、POR3、または浸透圧応答プロモーター7、POR7で駆動されるFc融合発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの6時間後に、この細胞を採取し、重量モル浸透圧濃度が増加する培地に播種した。このレポーター遺伝子の構成的発現は、300mOsm〜400mOsmの重量モル浸透圧濃度で著しい影響を受けず、次いで、図4に例示した通り、Fc融合発現レベルは重量モル浸透圧濃度の増加につれて減少し、図4は図3に例示した本発明の例示的な浸透圧応答転写調節エレメント(OR−TRE)のin vivo浸透圧保護性効果の概略を示す図であり、図5の正規化したデータも参照のこと。
より多くの(よりたくさんの)浸透圧応答エレメントが、本発明の浸透圧応答転写調節エレメント(OR−TRE)(「混成浸透圧応答プロモーター」とも呼ばれる)内にコード化され(挿入され)るほど、等張培地における導入遺伝子発現レベルはより少なくなり、−しかしそれらの誘導因子(等張発現レベルによるその最大発現レベルの比率)はより高くなる。それにより、様々な導入遺伝子発現ウインドウおよび誘導因子をもたらす1組の浸透圧応答プロモーターを構築し、本発明は、この構築物に改変された1つまたは複数の浸透圧応答エレメントを有する様々な浸透圧応答転写調節エレメント(OR−TRE)を提供し、例えば、1つまたは複数の張度エンハンサー結合タンパク質(TonEBP)−応答転写エンハンサー配列(TonEBP−結合モチーフ)を有し、代替実施形態として、任意選択で1つまたは複数のAP−1タンパク質結合部位(AP−1結合モチーフ)をさらに有する。
データ分析
等張から高張における発現の構成的発現レベルの相対的な減少は、細胞増殖および生存率の阻害に起因するタンパク質産生の浸透圧相関的減少を示している。したがって、構成的発現レベルを用いてPOR3駆動およびPOR7駆動発現レベルを正規化した。図4を参照のこと。
この実施例は、本発明の構築物にコード化される浸透圧応答エレメント(本発明の浸透圧応答転写調節エレメント(OR−TRE)または「浸透圧応答プロモーター」)の数の増加が、浸透圧応答エレメントの数に依存的な様式でどの程度等張発現レベルの低下を招くかを実証するデータを提示している。この実施例も、本発明の例示的な構築物によるこれらプロモーターの実際のトランス活性化レベルが、350mOsm〜700mOsmの重量モル浸透圧濃度の間で直線的に増加することを実証するデータを提示している。
浸透圧感受性の転写および転写後遺伝子調節
この実施例は、複合させた浸透圧感受転写および転写後遺伝子調節を有する本発明の例示的な構築物に関して記載する。例えば、本発明の例示的な構築物は、浸透圧ストレスを受けた(例えば、高塩濃度)条件下でメッセージおよびポリペプチドの転写および転写後発現レベルの両方をそれぞれ正に上方制御することが可能である。
重量モル浸透圧濃度が増加するにつれて、構成的プロモーターにより駆動される組換えタンパク質生成の収量は徐々に減少する。構成的プロモーターへ浸透圧応答エレメントを導入すると、この構成的プロモーターをさらにトランス活性化し、組換えタンパク質生産における高張性の負の効果と釣り合う可能性があると結論される。この仮説を試験するために、1つ、3つまたは、7つの浸透圧応答配列を、ヒトCMVプロモーターのエンハンサーおよびPfragment CMVの間に導入した。
浸透圧応答プロモーターの構築
ヒトCMVプロモーターのエンハンサーを、oligo OLM401を用いてPCR増幅した:5’−CAAGCTTGACTAGTCAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCAT−3’(配列番号38)、およびOLM400:5’−AGCTAGCACACCGTACACGCCTACCG−3’(配列番号39)(制限部位を太字、アニーリング配列をイタリックで示す)。このPCR産物をHindIIIおよびNheIで消化し、中間プラスミドからPOR1−Intronを切り出し(SpeI/EcoRI)、両方のDNA断片を別の中間プラスミド(HindIII/EcoRI)にクローニングし、それにより:PconstOR1−Intron:EhCMVOR1Pfragment CMV−Intronを得た。これと同じ戦略を使用して、PconstOR3−Intron:EhCMVOR3Pfragment CMV−IntronおよびPconstOR7−Intron:EhCMVOR7Pfragment CMV−Intronを構築した。
チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO−K1 DUX−B11(dhfr−)を、無血清低タンパク質(ヒト組換えインスリン)培地中で、懸濁培養した。最適化したlipofectaminトランスフェクション手順を使用して、この細胞に高効率一過性トランスフェクションを行った。一過性にトランスフェクトした細胞をトランスフェクションの6時間後に採取し、6ウェルプレート中の重量モル浸透圧濃度が増加する血清含有培地に播種した。塩濃度の増加に伴ってリン酸緩衝食塩水を固定容量添加することによって、この培地の重量モル浸透圧濃度を各ウェルで調整した。一過性にトランスフェクトした細胞を、ELISAを用いて実施するFc融合遺伝子発現アッセイで常法に従って分析した。
ヒトサイトメガロウイルスプロモーターのエンハンサーの3’側およびヒトサイトメガロウイルスプロモーター断片の5’側の浸透圧応答エレメントの導入数の増加が及ぼす影響を評価するために、1つ、3または7つの浸透圧応答エレメントを並べてクローニングし、3つのプロモーターを構築した:PconstOR1、PconstOR3、PconstOR7。CHO−K1 DUX−B11(dhfr−)細胞に、ヒトサイトメガロウイルス構成的プロモーターまたはこれら設計したプロモーターのうちの1つで駆動されるFc融合発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの6時間後にこの細胞を採取し、重量モル浸透圧濃度が増加する培地に播種した。
ヒトCMVプロモーター内に1つの浸透圧応答エレメントを導入することにより、300mOsm/Kgで、組換えタンパク質発現レベルが2倍になった。これは、予想外の結果であった。
Claims (18)
- 異種転写調節因子に作動可能に連結した配列番号7の核酸配列を含む少なくとも1つの浸透圧応答転写調節エレメント(OR−TRE)と、該転写調節因子に作動可能に連結した異種タンパク質をコードする核酸分子とを含むベクターであって、転写調節因子が、プロモーターを含み、かつ少なくとも1つのOR−TREが前記プロモーターの5’に位置するベクター。
- プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス即時早期プロモーターである、請求項1に記載のベクター。
- OR−TREを3つ含む、請求項1に記載のベクター。
- OR−TREを7つ含む、請求項1に記載のベクター。
- 転写調節因子が、前記異種タンパク質をコードする核酸分子の5’に位置するヒトサイトメガロウイルスイントロンをさらに含む、請求項1に記載のベクター。
- 異種タンパク質が、浸透圧保護性タンパク質又はペプチドである、請求項1に記載のベクター。
- 浸透圧保護性タンパク質又はペプチドが、プロリン又はグリシン−ベタイン、タウリン輸送体、グリシンベタイン−γ−アミノ酪酸輸送体、ナトリウム−ミオ−イノシトール共輸送体、熱ショックタンパク質、アクアポリン、アルドースレダクターゼ、又は神経病標的エステラーゼ(NTE)である、請求項6に記載のベクター。
- 異種タンパク質が、TonEBPポリペプチドである、請求項1に記載のベクター。
- 異種タンパク質が、抗アポトーシスタンパク質、細胞に対する酸化ストレスに対する抵抗性を与えるタンパク質、タンパク質のフォールディングの促進に関与するシャペロンタンパク質、タンパク質の細胞外分泌に関与するタンパク質、解糖酵素、細胞周期調節タンパク質、グリコシル化酵素、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載のベクター。
- 抗アポトーシスタンパク質が、Bcl−2、Bcl−xL、Mcl−1、BHRF1、X−IAP、IAP1、IAP2 IEX−1L、Bfl−1、又はBcl−wである、請求項9に記載のベクター。
- 細胞に対する酸化ストレスに対する抵抗性を与えるタンパク質が、スーパーオキシドディスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ペルオキシレドキシン、スルフレドキシン、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、チオレドキシンペルオキシダーゼ、チオールトランスフェラーゼ、グルタレドキシン、又はグルタチオンレダクターゼである、請求項9に記載のベクター。
- タンパク質のフォールディングの促進に関与するシャペロンタンパク質が、結合免疫グロブリンタンパク質(BiP)、カルネキシン、カルレティキュリン、ERp57又はタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)である、請求項9に記載のベクター。
- 解糖酵素が、ピルビン酸カルボキシラーゼ又はピルビン酸キナーゼである、請求項9に記載のベクター。
- 細胞周期調節タンパク質が、サイクリン若しくはサイクリン依存性キナーゼ、又はサイクリン若しくはサイクリン依存性キナーゼの阻害剤である、請求項9に記載のベクター。
- ベクターがプラスミドである、請求項1に記載のベクター。
- さらなる異種転写調節因子に作動可能に連結した配列番号7の核酸配列を含む少なくとも1つのさらなるOR−TREと、該さらなる転写調節因子に作動可能に連結したさらなる異種タンパク質をコードする核酸分子とを含む、請求項1に記載のベクター。
- 請求項1−16のいずれか一項に記載のベクターを含む哺乳動物細胞。
- チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項17に記載の哺乳動物細胞。
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