JP6792018B2 - L−α−グリセロホスホリルコリンの純度を決定する方法 - Google Patents
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Description
β−GPCは、市販されておらず、β−GPCが新たな方法により検出可能な種であり得ることを確認するために、以下に示されるスキームに従ってその合成を行った。
この環式ホスフェートの形成は、特許文献3の手順に従うGPCの単離の条件において想定されるものである。この仮説を裏付けるため、以下に示されるスキームに従ってcGPの基準試料を調製した。
特許文献2の実施例2に従うGPCの調製
125gの大豆レシチンに、500mLのメタノールを添加し、完全に溶解するまで撹拌下で保持する。メタノール中30%のナトリウムメチレート20mLを添加する。室温で3時間撹拌を継続する。濾過後、残渣をメタノールで洗浄する(3×10mL)。氷酢酸で濾液を中和し(約6のpH)、次いでそれを約125mLの残留量まで濃縮し、上部の油相を分離する。濃縮された下部相を、メタノール中に含浸させたAmberlyst 15樹脂(酸形態)140mLを含有するカラムで溶離する。溶離は、375mLのメタノール、続いて300mLの水で進行させる。
特許文献3の実施例1に従うGPCの調製
大豆レシチンの抽出により商業的に得られたホスファチジルコリンが濃縮された200gの分画を、600mLのメタノールに溶解する。得られた溶液を、メタノール中に含浸させた塩基形態のDuolite A147樹脂を含有するクロマトグラフィーカラムで溶離する。濃縮された溶液を投入した後、メタノールでGPC溶離を完了させる。溶離液を酢酸で中和し、300mLの残留量まで濃縮し、2つの相の明確な成層を得る。濃縮された下部相を分離し、メタノールで希釈し、200mLのn−ヘプタンで2回抽出する。
GPEで汚染されたGPCの調製
結晶のGPEを、水中のGPCの溶液に添加し、溶液を、15%に等しい残留水含量を有する粘稠性液体まで濃縮する。HPLC−ELSD分析では、0.2%(面積パーセントとして)に等しいGPE含量が示された。
スクロースで汚染されたGPCの調製
結晶のスクロースを、水中のGPCの溶液に添加し、溶液を、15%に等しい残留水含量を有する粘稠性液体まで濃縮する。HPLC−ELSD分析では、2%(面積パーセントとして)に等しいスクロース含量が示された。
エタノールからの結晶化を使用した、手順1により得られたGPCの精製
粘稠性流体の形態の2.5gのGPC(手順1により得られた)を、撹拌下、約50℃の温度で5mLのエタノールに溶解する。溶液を約10℃の温度まで冷却し、いくつかのGPC結晶で誘発すると、数分で沈殿物の形成が観察される。これを約5℃の温度まで冷却し、0℃から5℃の間で1.5時間撹拌下で保持し、ブフナー漏斗を通して結晶を濾過し、エタノールで洗浄する。真空下で乾燥させた後、1.4gのGPCが得られる。
DMSOからの結晶化を使用した、手順1により得られたGPCの精製。
粘稠性流体の形態の2.5gのGPC(手順1により得られた)に、14mLのDMSOを添加し、混合物を撹拌下で約50℃の温度まで加温し、約25℃の温度まで冷却し、いくつかのGPC結晶で誘発する。これを20℃から25℃の間で16時間撹拌下で保持すると、この期間中、沈殿物の形成が観察され、ブフナー漏斗を通して結晶を濾過し、エタノールで洗浄する。真空下で乾燥させた後、1.9gのGPCが得られる。
DMSOからの結晶化を使用した、手順2により得られたGPCの精製。
粘稠性流体の形態の11.2gのGPC(手順2により得られた)に、60mLのDMSOを添加し、混合物を撹拌下で約50℃の温度まで加温し、約25℃の温度まで冷却し、いくつかのGPC結晶で誘発する。これを20℃から25℃の間で16時間撹拌下で保持すると、この期間中、沈殿物の形成が観察され、ブフナー漏斗を通して結晶を濾過し、エタノールで洗浄する。真空下で乾燥させた後、8.2gのGPCが得られる。
DMSOからの結晶化を使用した、GPC(GPEで汚染された)の精製。
粘稠性流体の形態の10.7gのGPC(手順3により得られた)に、20mLのDMSOを添加し、混合物を撹拌下で約70℃の温度まで加温し、80mLのDMSOを添加し、約25℃の温度まで冷却し、いくつかのGPC結晶で誘発する。これを20℃から25℃の間で16時間撹拌下で保持すると、この期間中、沈殿物の形成が観察され、ブフナー漏斗を通して結晶を濾過し、エタノールで洗浄する。真空下で乾燥させた後、8.7gのGPCが得られる。
エタノールからの結晶化を使用した、GPC(GPEで汚染された)の精製
粘稠性流体の形態の11.2gのGPC(手順3により得られた)を、撹拌下、約45℃の温度で20mLのエタノールに溶解する。溶液を約5℃の温度まで冷却し、いくつかのGPC結晶で誘発する。これを0℃から5℃の間で3時間撹拌下で保持すると、この期間中、沈殿物の形成が観察され、ブフナー漏斗を通して結晶を濾過し、エタノールで洗浄する。真空下で乾燥させた後、3.4gのGPCが得られる。
DMSOからの結晶化を使用した、GPC(スクロースで汚染された)の精製
粘稠性流体の形態の11gのGPC(手順4により得られた)に、20mLのDMSOを添加し、混合物を撹拌下で約70℃の温度まで加温し、80mLのDMSOを添加し、約25℃の温度まで冷却すると、この期間中、沈殿物の形成が観察される。これを20℃から25℃の間で16時間撹拌下で保持し、ブフナー漏斗を通して結晶を濾過し、エタノールで洗浄する。真空下で乾燥させた後、7.8gのGPCが得られる。
エタノールからの結晶化を使用した、GPC(スクロースで汚染された)の精製
粘稠性流体の形態の11.0gのGPC(手順4により得られた)を、撹拌下、約45℃の温度で20mLのエタノールに溶解する。溶液を約5℃の温度まで冷却し、いくつかのGPC結晶で誘発する。これを約5℃の温度まで冷却し、0℃から5℃の間で2.5時間撹拌下で保持すると、この期間中、沈殿物の形成が観察される。ブフナー漏斗を通して結晶を濾過し、エタノールで洗浄する。真空下で乾燥させた後、1.1gのGPCが得られる。
HPLC−ELSDによるGPC分析法。
操作パラメータ:
HPLCカラム:YMC(商標)Polyamine II 250×4.6mm(5μm)
炉内温度:35℃
流量:0.7mL/分
溶離液相:相A:85%(アセトニトリル75%、メタノール25%)
15%(50mM酢酸アンモニウム緩衝液pH4.5)
相B:65%(アセトニトリル75%、メタノール25%)
35%(50mM酢酸アンモニウム緩衝液pH4.5)
勾配プログラム:
検出器パラメータ:窒素流量=1.4mL/分;温度=90℃;ゲイン=1
試料調製:メタノール中約20mg/mLへのGPC試料の希釈。
注入容量:20〜40μL
備考:RT約5分までに観察されるベースライン変動が、ブランクにおいて存在する(試料中に存在する物質に起因するものではない)。
31 P−NMRによるGPC分析法
機器 NMR Varian VXR−200または少なくとも同等の機器
試料調製 分析される0.8gのGPCを、0.8mLのD2Oに溶解し、溶液をNMR管に入れる
温度 周囲温度
取得数 400以上
以下の表において、対象となる種の化学シフトに対する基準値が示されている。
Claims (9)
- L−α−グリセロホスホリルコリンの純度を決定するための方法であって、アミノ固定相を有するHPLCカラムを通すL−α−グリセロホスホリルコリンの溶離と、L−α−グリセロホスホリルコリン自体、およびその任意の可能な不純物の、蒸発光散乱検出器型の手段によるその後の検出と含み、前記固定相は、第2級および第3級アミノ基を有することを特徴とする方法。
- 前記固定相は、アミノ基を含有するポリマーコーティングを有する保持体の粒子からなることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記保持体の粒子は、シリカであることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記アミノ基は、第2級および第3級であることを特徴とする請求項2または3に記載の方法。
- 溶離液相は、水溶液、極性有機溶媒、またはそれらの混合物からなることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記水溶液は、3から6の範囲のpHを有することを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記水溶液は、4から5の範囲のpHを有することを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記極性有機溶媒は、C1〜C4アルコール、アセトニトリル、またはそれらの混合物であることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記C1〜C4アルコールは、メタノールであることを特徴とする請求項8に記載の方法。
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